سنتز نانوذرات نقره کلوئیدی پایدار با خاصیت ضدباکتریایی با استفاده از عصارۀ گیاه سرخدار (Taxus baccata L.)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دکترای نانوبیوتکنولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 دانشیار ایمنی‌شناسی، دانشگاه اصفهان، ایران

3 استاد بیوشیمی فیزیک، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: مقاومت باکتریایی به آنتی‌بیوتیک‌ها، اهمیت توسعۀ عوامل ضدباکتریایی جدید را افزایش داده است. نانوذرات نقره می‌توانند به‌عنوان یکی از عوامل ضدباکتریایی مهم مطرح باشند. با توجه به نگرانی‌های زیست‌محیطی دربارۀ گسترش کاربرد نانوذرات نقره، استفاده از روش‌های سبز برای سنتز این نانوذرات، ضمن کاهش نگرانی‌ها می‌تواند به تکامل نانوذراتی با خصوصیات برتر نیز منجر شود.
مواد و روش‌ها: عصارۀ اتانلی برگ گیاه سرخدار تهیه شد و در غلظت‌های مختلف برای احیای نیترات نقره و سنتز نانوذرات نقره استفاده شد. نانوذرات حاصل با روش‌های مختلف شامل طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش، میکروسکوپ الکترونی عبوری، طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز، سنجش پراکندگی دینامیکی نور و پتانسیل زتا مشخصه‌یابی شدند. درنهایت خصوصیات ضدباکتریایی نانوذرات با روش‌های انتشار دیسک و کمینه‌غلظت بازدارندگی بررسی شد.
نتایج: عصارۀ گیاه سرخدار قابلیت بالایی در سنتز نانوذرات نقره پایدار و با کیفیت بالا با اندازۀ کمتر از 50 نانومتر داشتند. نانوذرات بر روی هر سه سویۀ باکتری بررسی‌شده شامل Escherichia coli، Staphylococcus aureus و Streptococcus pyogenes، اثر ضدباکتریایی قابلِ‌توجهی نشان دادند. کمینه‌غلظت بازدارندگی برای باکتری S. pyogenes در غلظت 50 میکروگرم در میلی‌لیتر و برای باکتری‌های E. coliو S. aureus در غلظت 25 میکروگرم در میلی‌لیتر حاصل شد.
بحث و نتیجه‌گیری: استفاده از ترکیبات زیستی به‌ویژه عصاره‌های گیاهی به جای استفاده از مواد شیمیایی سمی و خطرناک برای سنتز نانوذرات نقره می‌تواند راهکاری برای کاهش نگرانی‌های زیست‌محیطی این نانوذرات باشد. با توجه به خصوصیات ضدباکتریایی قابلِ‌توجه نانوذرات سنتزشده با این روش، می‌توان از آن‌ها برای کاربردهای مختلف پزشکی، دارویی، غذایی و صنعتی استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Synthesis of stable colloidal silver nanoparticles with antibacterial properties by using Taxus baccata extract

نویسندگان [English]

  • Abolghasem Abbasi Kajani 1
  • Sayyed Hamid Zarkesh-Esfahani 2
  • Abdol-Khalegh Bordbar 3
1 PhD in Nanobiotechnology, University of Isfahan, Iran
2 Associate Professor of Immunology, University of Isfahan, Iran
3 Professor of Biochemical Physics, University of Isfahan, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Bacterial resistance to antibiotics increased the importance of developing novel antibacterial agents. Silver nanoparticles could be considered as one of the most important antibacterial agents. Regarding to the environmental concerns of widespread application of silver nanoparticles, the use of green methods for synthesis of the nanoparticles can lead to less concerns and to develop the nanoparticles with improved properties.
Materials and methods: The ethanolic extract of Taxus baccata leaves was prepared and used in different concentrations for reduction of silver nitrate and synthesis of silver nanoparticles. The resulted nanoparticles were characterized by different methods including UV-Vis spectroscopy, Transmission electron microscopy, FT-IR, DLS, and Zetasizer. The antibacterial activity of silver nanoparticles was finally investigated using disk diffusion assay and minimum inhibitory concentration assay.
Results: The ethanolic extract of T. baccata displayed high potential to synthesize high quality and stable silver nanoparticles with size below 50 nm. The nanoparticles displayed considerable antibacterial effect on all three tested bacteria. Minimum inhibitory concentration of 50 µg/ml obtained for S. pyogenes (ATCC 1447) and 25 µg/ml for E. coli (ATCC 25922) and S. aureus (ATCC 25923).
Discussion and conclusion: The use of biological compounds especially plant extracts instead of dangerous and toxic chemicals for synthesis of silver nanoparticles could be considered as alternatives to reduce the environmental concerns of these nanoparticles. With respect to the considerable antibacterial activity of the nanoparticles synthesized with the present method, the nanoparticles can be used for different medical, food, and industrial applications.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Silver Nanoparticles
  • Taxus baccata
  • Antibacterial
  • Green synthesis
  • Disk diffusion
  • Minimum inhibitory concentration

مقدمه.

عفونت‌های باکتریایی یکی از عوامل اصلی مرگ میلیون‌ها انسان در سراسر جهان هستند که یکی از دلایل اصلی آن، ایجاد عوامل بیماری‌زای جدید و تکامل سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک است. عوامل بیماری‌زا، روش‌های مؤثری را برای خنثی‌کردن اثر عوامل ضدباکتریایی ایجاد می‌کنند. به‌همین‌دلیل، گرچه آنتی‌بیوتیک‌های بسیاری ابداع شده‌اند ولی تعداد بسیار کمی از آن‌ها در مقابل سویه‌های مقاوم باکتریایی مؤثر بوده‌اند. بنابراین، طراحی و تکامل آنتی‌بیوتیک‌های جدیدی که بر این محدودیت‌ها غلبه کنند، از اهمیت زیادی برخوردار است(1). نانوذرات به‌تازگی به‌طور موفقیت‌آمیزی برای رهایش عوامل دارویی (2)، شناسایی بیماری‌های مزمن (3)، کاهش عفونت‌های باکتریایی (4)، و نیز در صنایع غذایی و پوشاک (5) به‌عنوان عوامل ضدباکتریایی قوی استفاده شده‌اند. در میان نانوذرات مختلف، نانوذرات نقره به‌دلیل فعالیت ضدباکتریایی قوی و مکانیسم عمل خاص، گزینه‌ای مناسب برای تهیۀ نسل جدیدی از عوامل آنتی‌باکتریال هستند (۵). هرچند برای قرن‌ها از نقره به‌عنوان یک ماده ضدباکتریایی استفاده شده است ولی به‌تازگی دانشمندان توجه زیادی به این عنصر برای حل مشکل مقاومت دارویی در اثر استفادۀ نادرست از آنتی‌بیوتیک‌ها نشان داده‌اند (۶). به نظر می‌رسد که نانوذرات نقره از طریق اتصال به دیوارۀ سلولی باکتری، باعث اختلال در نفوذپذیری دیوارۀ سلولی و آثار سمی بر سلول می‌شوند. نانوذرات نقره احتمالاً به سلول هم نفوذ می‌کنند و با سولفور کاتالیتیک گروه‌های تیول در اسیدهای آمینه سیستئین کمپلکس تشکیل می‌دهند و از این طریق آنزیم‌های حیاتی را غیرفعال می‌کنند. همچنین این نانوذرات باعث تشکیل رادیکال‌های آزاد سمی مثل سوپراکسید، پراکسید هیدروژن و یون‌های هیدروکسیل می‌شوند و بر تنفس سلولی اثر می‌گذارند (4، 6 و 7)، مشخص شده است که نانوذرات نقره، تشکیل بیوفیلم را هم مختل می‌کنند (8).

برای مدت‌های طولانی از روش‌های مختلف شیمیایی و فیزیکی برای سنتز نانوذرات استفاده شده است؛ اما به‌تازگی توجه زیادی به موجودات زنده برای تولید نانوذرات فلزی شده است. روش‌های مبتنی بر موجودات زنده، ضمن سهولت در اجرا، با محیط زیست نیز سازگار هستند و خطر کاربرد مواد شیمیایی خطرناک، سمی و گران را رفع می‌کنند. سنتز زیستی نانوذرات فلزی به‌ویژه نانوذرات طلا و نقره با استفاده از گیاهان (بافت گیاهی غیرفعال‌شده، عصاره‌های گیاهی و یا گیاه زنده) بسیار موردتوجه است (9). در میان موجودات، گیاهان بهترین انتخاب هستند؛ زیرا به‌راحتی در دسترس هستند و برای سنتز نانوذرات در مقیاس وسیع مناسب‌ترند. مولکول‌های زیستی مختلفی در عصاره‌های گیاهی وجود دارند که قابلیت احیای یون‌های فلزی و سنتز نانوذرات را دارند و نیز می‌توانند به‌عنوان عوامل پوشش‌دهنده و پایدارکنندۀ نانوذرات استفاده شوند. روش زیستی مبتنی بر گیاهان بسیار سریع است و می‌تواند به‌آسانی در دما وفشار اتاق انجام شود. به‌علاوه، نانوذرات سنتزشده به‌وسیلۀ گیاهان، پایدارترند و ازلحاظ شکل و اندازه متنوع‌تر هستند (10). در میان گیاهان مختلف، به گیاهان دارویی به‌ویژه گیاهان حاوی ترکیبات با خصوصیات ضدمیکروبی برای سنتز نانوذرات نقره بیشتر توجه شده است. گیاه سرخدار (Taxus sp.)، گروه خاصی از ترکیبات دی‌ترپنوئیدی به نام تاکسان‌ها را سنتز می‌کند که خصوصیات ضدسرطانی بارزی دارند و در تولید یکی از مهم‌ترین داروهای ضدسرطان به نام تاکسول استفاده می‌شوند؛ به‌همین‌دلیل از دهه‌های قبل، به گیاه سرخدار توجه زیادی شده است. سرخدار ایرانی (Taxus baccata)، یکی از گونه‌های مهم سرخدار است که در مناطق وسیعی از جنگل‌های شمال ایران تا رشته‌کوه‌های هیمالیا گسترش یافته است. برگ‌های تازۀ سرخدار ایرانی در طب باستان به‌عنوان داروی سقط جنین، ضدمالاریا، ضدرماتیسم و درمان برونشیت، و برگ‌ها و ساقه‌های خشک آن برای درمان آسم استفاده شده است (11). ترکیبات تاکسانی و لیگنانی خارج‌شده از سرخدار ایرانی، آثار ضدالتهابی، ضددرد و ضدباکتریایی از خود بروز داده‌اند (12). ترکیبات فلاونی جداشده از برگ‌های سرخدار ایرانی، آثار ضدقارچی بارزی در غلظت 100 میکرومولار روی سویه‌های Cladosporium oxysporum و Fusarium culmorum نشان داده‌اند (13). آثار ضدباکتریایی عصاره‌های برگ سرخدار نیز گزارش شده است (14 و 15). سنتز و پوشش‌دهی نانوذرات نقره با کمک ترکیبات آلی این گیاه، ممکن است به سنتز نانوذراتی با خاصیت ضدباکتریایی بالاتر کمک کند. ضمن اینکه پوشش‌دهی نانوذرات نقره با ترکیبات آلی گیاهی می‌تواند تراوش یون‌های سمی نقره به محیط پیرامونی را کم کند و برخی نگرانی‌های زیست‌محیطی مرتبط با کاربرد گستردۀ این نانوذرات را کاهش دهد. در این پژوهش، قابلیت ترکیبات آلی موجود در عصارۀ گیاه سرخدار ایرانی برای سنتز نانوذرات نقره کلوئیدی پایدار با توزیع اندازۀ باریک و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مناسب بررسی شد و خصوصیات ضدباکتریایی نانوذرات حاصل بر روی سه سویۀ استاندارد باکتری‌های Escherichia coli (ATCC 25922)، Staphylococcus aureus (ATCC 25923)، و Streptococcus pyogenes (ATCC 1447) ارزیابی شد.

 

مواد و روش‌ها.

مواد: نیترات نقره از شرکت سیگما (کشور آلمان) خریداری شد. حلال‌های استفاده‌شده در استخراج عصارۀ گیاهی از شرکت مرک (کشور آلمان) خریداری شد. مواد و محیط‌های کشت استفاده‌شده در آزمایشات ضدباکتریایی نیز از شرکت مرک (کشور آلمان) تهیه شد. در تمامی آزمایشات برای تهیۀ محلول‌ها و محیط‌های کشت از آب دوبار تقطیر استفاده شد. نمونه‌های تازه و سالم برگ گیاه سرخدار ایرانی از درختچۀ موجود در باغ گل‌های شهر اصفهان جمع‌آوری شد.

استخراج عصارۀ گیاهی و سنتز نانوذرات نقره: قبل از عصاره‌گیری، نمونه‌های برگ سرخدار به‌طور کامل شستشو و خشک شدند. از محلول اتانل 80درصد برای استخراج ترکیبات آلی از پودر آسیاب‌شدۀ برگ گیاه استفاده شد. بدین منظور 2 گرم از پودر برگ گیاه با 50 میلی‌لیتر محلول اتانل 80درصد درون یک ارلن 100 سی‌سی مخلوط شد و به‌مدت یک ساعت تحت امواج اولتراسونیک قرار گرفت. سپس ارلن به‌مدت 24 ساعت با سرعت rpm 150 به هم زده شد و درنهایت عصارۀ گیاهی با استفاده از کاغذ واتمن (شماره 1) فیلتر شد و تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

به‌منظور سنتز نانوذرات نقره، غلظت‌های مختلفی از عصارۀ گیاهی طبق جدول 1 با حجم مناسب آب دوبار تقطیر مخلوط شد و به هر محلول، 5/0 یا 1 میلی‌لیتر محلول استوک نیترات نقره 20 میلی‌مولار به‌صورت قطره‌قطره در شرایطی که محلول تحت امواج اولتراسونیک قرار داشت اضافه شد. بدین ترتیب غلظت نهایی نیترات نقره در محلول واکنش به‌ترتیب 5/0 یا 1 میلی‌مولار و حجم کلی واکنش‌ها 20 میلی‌لیتر بود. سپس محلول‌های واکنش در شرایط اتاق با سرعت
rpm 150 به هم زده شدند و پیشرفت هر واکنش به‌طور متناوب با مشاهدۀ تغییر رنگ آن‌ها و نیز طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش بررسی شد.

 

جدول 1- ترکیب واکنش‌های مختلف استفاده‌شده در سنتز نانوذرات نقره (بر حسب میلی‌لیتر)

عصارۀ گیاهی

نیترات نقره mM 20

آب دوبار تقطیر

1

5/0

5/18

1

1

18

2

5/0

5/17

2

1

17

3

5/0

5/16

3

1

16

4

5/0

5/15

4

1

15

 

مشخصه‌یابی نانوذرات نقره: از طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش برای ارزیابی اولیۀ خصوصیات نوری نانوذرات نقره پس از 6 ماه نگهداری در شرایط اتاق استفاده شد. بدین منظور طیف جذب محلول کلوئیدی نانوذرات (1 میلی‌لیتر) در ناحیۀ 300 تا 800 نانومتر با استفاده از دستگاه Biochrom WPA اندازه‌گیری شد. از پراکندگی دینامیکی نور (DLS) برای تعیین قطر هیدرودینامیکی نانوذرات و توزیع اندازه آن‌ها استفاده شد. بررسی اولیۀ میزان پایداری نانوذرات از طریق مشاهده میزان رسوب‌دهی نانوذرات با گذشت زمان انجام شد و برای بررسی دقیق‌تر، پتانسیل زتای پایدارترین نمونه‌ها با کمک دستگاه ZEN 3600 Zetasizer اندازه‌گیری شد. برای تعیین شکل و اندازۀ نانوذرات، از تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی عبوری (CM30, Philips) استفاده شد. درنهایت برای بررسی اتصال ترکیبات آلی به سطح نانوذرات، ابتدا نانوذرات با استفاده از سانتریفیوژ رسوب داده شدند و به‌دقت خشک شدند و سپس گروه‌های عاملی سطح نانوذرات به‌کمک طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز (FT/IR-6300 spectrometer, Jasco) بررسی شد.

بررسی خواص ضدباکتریایی: آثار ضدباکتریایی نانوذرات نقره بر روی باکتری گرم‌منفی Escherichia coli (ATCC25922) و باکتری‌های گرم‌مثبتStaphylococcus aureus (ATCC25923) و Streptococcus pyogenes (ATCC1447) با کمک روش‌های انتشار دیسک و کمینه‌غلظت بازدارندگی بررسی شد.

در روش انتشار دیسک، ابتدا دیسک‌های بلانک 6 میلی‌متری به‌مدت 10 دقیقه در محلول کلوئیدی نانوذرات نقره با غلظت 100 میکروگرم/ میلی‌لیتر غوطه‌ور شدند و سپس درون آون در دمای 35 درجه سانتی‌گراد به‌طور کامل خشک شدند. باکتری‌های موردارزیابی با غلظت 5/0 مک‌فارلند کدورت‌سنجی شدند و بر روی محیط مولر هینتون آگار، کشت چمنی داده شدند. سپس دیسک‌های آغشته‌شده به نانوذرات نقره که کاملاً خشک شده بودند، روی محیط کشت قرار داده شد. هالۀ عدم رشد پس از 24 ساعت گرماگذاری در دمای 37 درجه سانتی‌گراد اندازه‌گیری شد.

کمینه‌غلظت بازدارندگی به‌روش براث میکرودیلوشن براساس گزارش‌های قبلی (16) تعیین شد. بدین منظور یک کلنی از هر باکتری در محیط کشت تریپتیک سوی براث تلقیح شد و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بر روی همزن مدور با سرعت 120 دور در دقیقه به‌صورت شبانه گرماگذاری شد و روز بعد با استفاده از محلول 9/0درصد کلرید سدیم تا غلظت 5/0 مک‌فارلند رقیق شد. رقت‌های مختلف از نانوذرات نقره (78/0 تا 100 میکروگرم در میلی‌لیتر) با ضریب رقت 2 تهیه شد. 100 میکرولیتر از نمونه‌های رقیق‌شدۀ نانوذرات و 100 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی باکتریایی به هر چاهک پلیت 96 خانه اضافه شد و به‌مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. برای هر نانوذرۀ موردِآزمایش، دو نمونۀ کنترل شامل نانوذرات نقره به همراه محیط کشت فاقد باکتری (کنترل مثبت) و محیط کشت تلقیح‌شده با باکتری ولی فاقد نانوذرات (کنترل منفی) نیز استفاده شد. با مقایسۀ میزان جذب نمونه‌ها با نمونۀ کنترل، کمینه‌غلظت بازدارندگی تعیین شد. کمترین غلظت نانوذرات که باعث توقف رشد سلول‌های باکتری شود یا به‌عبارتی مقدار جذب نوری چاهک مربوطه کمتر از چاهک کنترل باشد، به‌عنوان کمینه‌غلظت بازدارندگی در نظر گرفته می‌شود.

تجزیه و تحلیل آماری نتایج: تمامی آزمایشات در سه تکرار انجام شد و نتایج به‌صورت میانگین سه تکرار ± انحراف استاندارد بیان شدند. از آزمون تحلیل واریانس (ANOVA) برای بررسی آماری نتایج استفاده شد و فاصلۀ اطمینان 99درصد برای معنی‌داربودن اختلافات در نظر گرفته شد.

 

نتایج.

سنتز نانوذرات نقره و مشخصه‌یابی آن‌ها: ازآنجاکه در پژوهش‌های قبلی (17)، محلول 80درصد اتانل به‌عنوان کارآمدترین حلال برای جداسازی ترکیبات تاکسانی با بیشترین بازده از بافت گیاه سرخدار معرفی شده بود، در این پژوهش نیز از حلال مشابه استفاده شد. بدین ترتیب سعی شد تا احتمال شرکت ترکیبات تاکسانی در واکنش احیا یا در پوشش‌دهی نانوذرات افزایش یابد. پس از افزودن محلول نیترات نقره به محلول عصاره، رنگ واکنش به‌آرامی از زرد به سبز تغییر کرد. با توجه به گزارش‌های مختلف (18 و 19)، این تغییر رنگ به‌دلیل سنتز نانوذرات نقره است که خصوصیات تشدید پلاسمون سطح بروز می‌دهند و درنتیجه باعث تغییر رنگ محلول واکنش می‌شوند (شکل 1)؛ بنابراین می‌توان انجام واکنش و سینتیک آن را ازطریق بررسی تغییر رنگ محلول واکنش و طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش مطالعه کرد. از طرف دیگر، با توجه به ارتباط طول موج جذب نانوذرات با شکل و اندازه آن‌ها، می‌توان از طیف جذب محلول کلوئیدی برای پیش‌بینی این خصوصیات استفاده کرد (20). بررسی مخلوط واکنش‌ها با روش طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش این مطلب را تأیید کرد و نشان داد که طیف جذب نانوذرات در محدودۀ 400 تا 600 نانومتر قرار دارد و با افزایش غلظت عصاره به سمت ناحیه قرمز متمایل می‌شود (19) (شکل 2). سرعت واکنش نیز تحتِ‌تأثیر غلظت عصاره قرار داشت چنان که با افزایش غلظت عصاره، سرعت واکنش کاهش یافت و زمان بیشتری برای تغییر رنگ و تکمیل واکنش نیاز بود. نانوذرات حاصل بسیار پایدار بودند و حتی پس از 6 ماه همچنان پایدار باقی ماندند و رسوب در خور ‌ملاحظه‌ای در هیچ‌یک از واکنش‌ها دیده نشد.

 

 

شکل 1- محلول عصاره (سمت چپ) و محلول حاوی نانوذرات نقره پس از افزودن نیترات نقره و انجام واکنش احیا (سمت راست). در شکل سمت راست، محلول شماره 1 حاوی 5/0 میلی‌مولار نیترات نقره و محلول شماره 2 حاوی 1 میلی‌مولار نیترات نقره است.

 

 

شکل 2- طیف جذبی نانوذرات نقرۀ سنتزشده در حضور 1 (a)، 2 (b)، 3 (c) و 4 (d) میلی‌لیتر عصارۀ اتانلی سرخدار.

 

 

مشاهدۀ میزان رسوب نانوذرات در طول زمان نشان داد که افزایش غلظت عصاره باعث افزایش پایداری نانوذرات در محلول کلوئیدی می‌شود و بیشترین پایداری مربوط به واکنش حاوی 4 میلی‌لیتر عصاره و 5/0 میلی‌مولار نیترات نقره بود که پتانسیل زتای آن 4/16- و میانگین قطر هیدرودینامیکی نانوذرات آن 1/75 نانومتر بود (شکل 3). افزایش غلظت نیترات نقره تنها باعث افزایش سرعت واکنش و ناپایداری و رسوب نانوذرات در محلول کلوئیدی شد.

 

 

شکل 3- منحنی توزیع اندازه (بالا) و پتانسیل زتا (پایین) نانوذرات نقرۀ سنتزشده در شرایط بهینه در حضور عصارۀ اتانلی سرخدار.

 

 

بررسی شکل نانوذرات با تصویربرداری میکروسکوپ الکترونی نشان داد که نانوذرات به شکل‌های ناهمسان و بیشتر شش‌ضلعی یا مثلثی‌شکل با گوشه‌های بریده هستند (شکل 4) که با طیف جذبی حاصل از طیف‌سنجی مرئی- ماوراء بنفش نیز هم‌خوانی دارد. همچنین تصاویر میکروسکوپ الکترونی نشان می‌دهد که نانوذرات به‌صورت تک‌دانه است و بیشتر آن‌ها اندازه‌ای در حدود 5 تا 20 نانومتر با توزیع اندازه محدود دارند. این نتایج بر قابلیت بالای ترکیبات آلی گیاه سرخدار در پوشش‌دهی نانوذرات و پایدارسازی آن‌ها در محلول کلوئیدی دلالت دارند. برای تأیید اینکه نانوذرات مشاهده‌شده در میکروسکوپ الکترونی از جنس نقره هستند، نمونۀ مزبور با روش EDS نیز بررسی شد که نتایج آن در شکل 5 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 4- تصویر گرفته‌شده با میکروسکوپ الکترونی عبوری از نانوذرات نقرۀ سنتز‌شده در حضور عصارۀ گیاه سرخدار.

 

 

شکل 5- طیف EDS نانوذرات نقره

 

شکل 6- نتایج طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز نانوذرات نقرۀ سنتزشده در حضور عصارۀ گیاه سرخدار

 

نتایج حاصل از طیف‌سنجی تبدیل فوریه مادون قرمز، وجود گروه‌های عاملی مختلفی از جمله هیدروکسیل، کربوکسیل و کربونیل را در سطح نانوذرات نشان داد (شکل 6) که باعث بار منفی سطح نانوذرات شده‌اند. باندهای 1076 و 04/1158 مربوط به پیوندهای ارتعاشی کششی C-O در گروه‌های استری و اسیدی، باند 52/1657 مربوط به گروه آمیدی پروتئین‌ها، و باند 38/1743 مربوط به پیوند ارتعاشی کششی گروه‌های آلدئیدی، کتونی و استری است که به‌فراوانی در ترکیبات ترپنوئیدی مشاهده می‌شوند. باندهای 2/2852 و 56/2923 نیز مربوط به پیوند کششی C-H در ترکیبات آلکانی است. نتایج بر جذب کارآمد ترکیبات آلی همچون ترکیبات آلیفاتیک، آروماتیک و پروتئین‌ها در سطح نانوذرات دلالت دارد. همچنین هنگامی که نانوذرات با استفاده از سانتریفیوژ رسوب‌گیری شدند، محلول رویی کاملاً شفاف و بی‌رنگ بود که نشان‌دهندۀ شرکت تمامی ترکیبات آلی و نمک نقره در واکنش سنتز نانوذرات نقره بود. طیف‌نگاری مرئی- ماوراء بنفش محلول رویی نیز هیچ طیف جذبی را نشان نداد که بر حذف کامل ترکیبات آلی از محلول و اتصال آن‌ها به سطح نانوذرات دلالت داشت.

در کل براساس نتایج می‌توان بیان کرد که ترکیبات آلی موجود در عصارۀ اتانلی سرخدار، علاوه بر اینکه قابلیت احیای نمک‌های فلزی و سنتز نانوذرات فلزی با کیفیت بالا را دارند، در پوشش‌دهی و پایدارسازی نانوذرات نیز نقش بارزی ایفا می‌کنند.

اثر ضدباکتریایی نانوذرات نقره: در پژوهش حاضر، نانوذرات نقرۀ سنتزشده در حضور عصارۀ گیاه سرخدار پس از سانتریفیوژ و توزیع در آب مقطر برای مطالعۀ فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات استفاده شدند. بررسی ما به‌کمک روش انتشار دیسک نشان داد که نانوذرات بر روی هر سه باکتری‌های Escherichia coli، Staphylococcus aureus و Streptococcus pyogenes فعالیت ضدباکتریایی دارند (شکل 7).

 

 

 

 

شکل 7- نتایج آزمایش انتشار دیسک مربوط به نانوذرات نقرۀ سنتزشده در حضور عصارۀ گیاه سرخدار.

 


نتایج حاصل از اندازه‌گیری هاله عدم رشد در جدول 2 نشان داده شده است. به‌منظور تعیین اثر غلظت عصارۀ گیاهی بر خاصیت ضدباکتریایی نانوذرات، از چهار غلظت مختلف شامل 1، 2، 3، و 4 میلی‌لیتر عصارۀ اتانلی (به‌ترتیب شماره‌های 1 تا 4) در واکنش‌های سنتزی جداگانه استفاده و نانوذرات حاصل در آزمایشات استفاده شدند. نتایج نشان می‌دهد که اختلاف معنی‌داری بین چهار دسته نانوذرات از نظر اثر ضدباکتریایی بر سویه‌های موردمطالعه وجود ندارد. به عبارت دیگر، افزایش غلظت عصاره تأثیر معنی‌داری بر فعالیت ضدباکتریایی نانوذرات نداشت. اثر ضدباکتریایی نانوذرات بر روی باکتری‌های مختلف متفاوت بود. هرچند اثر ضدباکتریایی نانوذرات روی سویۀ S. pyogenes کمتر از دو سویۀ دیگر بود ولی بین دو سویۀ E. coliو S. aureusاختلاف معنی‌داری مشاهده نشد.

 

جدول 2- نتایج حاصل از اندازه‌گیری هالۀ عدم رشد نانوذرات نقره بر روی باکتری‌های مختلف

ردیف

E.coli

S. aureus

S. pyogenes

1

56/0 ± 7/9

61/0 ± 77/9

55/0 ± 67/8

2

5/0 ± 56/9

5/0 ± 5/9

42/0 ± 63/8

3

57/0 ± 73/9

25/0 ± 97/9

6/0 ± 83/8

4

57/0 ± 63/9

72/0 ± 7/9

55/0 ± 57/8

 

کمینه‌غلظت بازدارندگی نانوذرات نقره بر روی سه گونۀ موردآزمایش در جدول 3 بیان شده است. نتایج نشان می‌دهد که غلظت عصارۀ موردِاستفاده در سنتز نانوذرات اثری روی کمینه‌غلظت بازدارندگی نانوذرات ندارد که با نتایج حاصل از آزمایشات انتشار دیسک مطابقت دارد. کمینه‌غلظت بازدارندگی برای باکتری S. pyogenes در غلظت 50 میکروگرم در میلی‌لیتر حاصل شد درحالی‌که برای باکتری‌های E. coliو S. aureus در غلظت 25 میکروگرم تعیین شد.

 

جدول 3- کمینه‌غلظت بازدارندگی نانوذرات نقره بر روی باکتری‌های مختلف (بر حسب میکروگرم در میلی‌لیتر)

ردیف

E.coli

S. aureus

S. pyogenes

1

25

25

50

2

25

25

50

3

25

25

50

4

25

25

50

 

بحث و نتیجه‌گیری.

وجود مقادیر بالایی از ترکیبات ترپنوئیدی و فنولی در بافت گیاه سرخدار (21)، قابلیت عصارۀ سلولی این گیاه برای احیای نمک نقره و سنتز نانوذرات نقره پایدار را افزایش می‌دهد. این ترکیبات می‌توانند به سطح نانوذرات نیز متصل شوند و نقش پایدارکننده را ایفا کنند (22). بدین ترتیب نانوذرات پایدارتر است و می‌تواند نقش حامل ترکیبات سطحی خود را نیز ایفا کنند که از این خصوصیت به‌طور ویژه برای انتقال داروها به بافت‌های خاص بدن بیماران استفاده شده است. همچنین خصوصیات زیستی مختلف ترکیبات آلی می‌تواند خصوصیات نانوذره را تحتِ‌تأثیر قرار دهد و در مواردی از طریق آثار هم‌افزایی، به تکامل نانوذراتی با خصوصیات برتر منجر شود که از آن جمله می‌توان به خصوصیات ضدسرطانی و ضدباکتریایی بالاتر اشاره کرد.

در این رابطه، مقاوم‌شدن باکتری‌ها در طول زمان به آنتی‌بیوتیک‌ها، تکامل عوامل ضدباکتریایی جدید را ضروری کرده است. ازآنجاکه نقره و ترکیبات مبتنی بر این عنصر از دیرباز برای کاربردهای گندزدایی و مبارزه با عوامل میکروبی استفاده شده‌اند، می‌توانند گزینه‌ای مناسب برای تکامل نسل جدیدی از عوامل ضدمیکروبی باشند. در این زمینه نانوذرات نقره به‌ویژه نانوذرات سنتزشده با روش‌های زیستی در سال‌های اخیر بسیار موردِتوجه دانشمندان قرار گرفته‌اند (23).

در گزارش‌های قبلی، آثار ضدباکتریایی عصاره‌های مختلف برگ سرخدار ایرانی تهیه‌شده با استفاده از حلال‌های مختلف شامل n-هگزان، دی‌کلرو متان، اتیل استات، اتانل و آب، بر روی 9 گونه باکتری گرم‌منفی و 4 گونه گرم‌مثبت بررسی شده است (14). در پژوهش مزبور، از روش‌های انتشار دیسک و کمینه‌غلظت بازدارندگی برای بررسی آثار ضدباکتریایی عصاره‌ها استفاده شده است. نویسندگان گزارش کردند که عصارۀ اتانلی قابلیت بازدارندگی رشد تمامی 13 گونۀ بررسی‌شده را دارد درحالی‌که عصاره‌های دیگر فعالیت ضدباکتریایی انتخابی نشان دادند. کمترین غلظت بازدارندگی به‌میزان 06/39 میکروگرم در میلی‌لیتر مربوط به عصارۀ اتانلی (بر روی پنج گونه) و عصارۀ آبی (برای یک گونه) بود. نویسندگان در پایان عصاره‌های اتانلی و آبی سرخدار ایرانی را بهترین عصاره‌ها از نظر قدرت ضدباکتریایی معرفی کردند. با توجه به نتایج قبلی، پیش‌بینی می‌شد که استفاده از عصاره‌های گیاه سرخدار در سنتز زیستی نانوذرات نقره باعث دستیابی به نانوذراتی با خصوصیات ضدباکتریایی بالاتر شود. نانوذرات نقرۀ استفاده‌شده در این پژوهش، به‌دلیل استفاده از روش‌های سبز در سنتز آن‌ها، نگرانی‌های زیست‌محیطی کمتری دارند و از طرف دیگر، ترکیبات ضدمیکروبی موجود در عصارۀ گیاه سرخدار می‌توانند بر آثار ضدمیکروبی نانوذرات بیفزایند. نتایج نشان داد که عصارۀ اتانلی گیاه سرخدار قابلیت سنتز نانوذرات نقرۀ بسیار پایدار با اندازۀ کمتر از 20 نانومتر و خصوصیات فیزیکی و شیمیایی مناسب را دارد. همچنین نانوذرات خصوصیات ضدباکتریایی قابلِ‌قبولی روی باکتری‌های مطالعه‌شده نشان دادند. کمینه‌غلظت بازدارندگی به‌دست‌آمده در این پژوهش، به‌مراتب کمتر از مقادیر به‌دست‌آمده در پژوهش‌های قبلی بود (20- 22). با توجه به اینکه روش استفاده‌شده در این پژوهش بر پایۀ ترکیبات آلی گیاهی است و از مواد شیمیایی سمی و خطرناک استفاده نشد، نانوذرات حاصل، نگرانی‌های زیست‌محیطی کمتری را باعث می‌شوند و می‌توانند برای کاربردهای مختلف پزشکی، دارویی، غذایی، منسوجات و صنعت مناسب‌تر باشند.

 

تشکر و قدردانی

بدین وسیله از حمایت‌های مالی معاونت پژوهشی دانشگاه اصفهان در راستای انجام این پژوهش تقدیر و تشکر می‌شود.

(1)              Jena P, Mohanty S, Mallick R, Jacob B, Sonawane A. Toxicity and antibacterial assessment of chitosan-coated silver nanoparticles on human pathogens and macrophage cells. International Journal of Nanomedicine 2012; 7:1805–18.

(2)              Zhang L, Gu FX, Chan JM, Wang a Z, Langer RS, Farokhzad OC. Nanoparticles in medicine: therapeutic applications and developments. Clinical Pharmacology and Therapeutics 2008; 83(5): 761–9.

(3)              Hong B, Kai J, Ren Y, Han J, Zou Z, Ahn CH. Highly Sensitive Rapid, Reliable, and Automatic Cardiovascular Disease Diagnosis with Nanoparticle Fluorescence Enhancer and Mems. Advances in Experimental Medicine and Biology 2008; 614: 265-73.

(4)              Marambio-Jones C, Hoek EM V. A review of the antibacterial effects of silver nanomaterials and potential implications for human health and the environment. Journal of Nanoparticle Research 2010; 12(5): 1531–51.

(5)              Rai MK, Deshmukh SD, Ingle a P, Gade K. Silver nanoparticles: the powerful nanoweapon against multidrug-resistant bacteria. Journal of Applied Microbiology 2012; 112(5): 841–52.

(6)              Agnihotri S, Mukherji S, Mukherji S. Immobilized silver nanoparticles enhance contact killing and show highest efficacy: elucidation of the mechanism of bactericidal action of silver. Nanoscale 2013; 5(16): 7328–40.

(7)              Prabhu S, Poulose EK. Silver nanoparticles: mechanism of antimicrobial action, synthesis, medical applications, and toxicity effects. International Nano Letters 2012; 2(1): 32.

(8)              Reidy B, Haase A, Luch A, Dawson K, Lynch I. Mechanisms of Silver Nanoparticle Release, Transformation and Toxicity: A Critical Review of Current Knowledge and Recommendations for Future Studies and Applications. Materials 2013; 6(6): 2295–350.

(9)              Iravani S. Green synthesis of metal nanoparticles using plants. Green Chemistry 2011; 13(10): 2638.

(10)          Mittal AK, Chisti Y, Banerjee UC. Synthesis of metallic nanoparticles using plant extracts. Biotechnology Advances 2013; 31(2): 346–56.

(11)          Patel P, Patel K, Gandhi T. Evaluation of Effect of Taxus baccata Leaves Extract on Bronchoconstriction and Bronchial Hyperreactivity in Experimental Animals. Journal of Young Pharmacists 2011; 3(1): 41–7.

(12)          Bilge S. Biological activities of lignans from Taxus baccata L. growing in Turkey. Journal of medicinal plant research 2010; 4(12): 1136–40.

(13)          Krauze-Baranowska M, Wiwart M. Antifungal activity of biflavones from Taxus baccata and Ginkgo bilobaZeitschrift fur Naturforschung C 2003; 58(1-2): 65-9.

(14)          Paras K, Manish A, Bharat S. Antimicrobial activity of various extracts from the leaves of Taxus baccata L. Pharmacologyonline 2009; 2: 217-224.

(15)          Erdemoglu N, Sener B, Palittapongarnpim P. Antimycobacterial Activity of Taxus baccataPharmaceutical Biology 2003; 41(8): 614-615.

(16)          Cheng F, Betts JW, Kelly SM, Schaller J, Heinze T. Synthesis and antibacterial effects of aqueous colloidal solutions of silver nanoparticles using aminocellulose as a combined reducing and capping reagent. Green Chemistry 2013; 15(4): 989.

(17)          Li S, Fu Y, Zu Y, Sun R, Wang Y, Zhang L. Determination of paclitaxel and other six taxoids in Taxus species by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2009; 49(1): 81–9.

(18)          Mock JJ, Barbic M, Smith DR, Schultz D., Schultz S. Shape effects in plasmon resonance of individual colloidal silver nanoparticles. The Journal of Chemical Physics 2002; 116(15): 6755.

(19)          Kelly KL, Coronado E, Zhao LL, Schatz GC. The Optical Properties of Metal Nanoparticles: The Influence of Size, Shape, and Dielectric Environment. The Journal of Physical Chemistry B 2003; 107: 668-677.

(20)          Hao E, Hao E, Schatz GC, Schatz GC, Hupp JT, Hupp JT. Synthesis and Optical Properties of Anisotropic Metal Nanoparticles. Journal of Fluorescence, 2004; 14(4): 331-341.

(21)          Abbasi Kajani A, Mofid MR, Abolfazli K, Tafreshi SAH. Encapsulated activated charcoal as a potent agent for improving taxane synthesis and recovery from cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry 2010; 56(2): 71–6.

(22)          Shankar SS, Rai A, Ankamwar B, Singh A, Ahmad A, Sastry M. Biological synthesis of triangular gold nanoprisms. Nature Materials 2004; 3(7): 482–8.

(23)          Prakash P, Gnanaprakasam P, Emmanuel R, Arokiyaraj S, Saravanan M. Green synthesis of silver nanoparticles from leaf extract of Mimusops elengi L. for enhanced antibacterial activity against multi drug resistant clinical isolates. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2013; 108: 255–9.

(24)          Lee H, Ryu D, Choi S, Lee D. Antibacterial Activity of Silver-nanoparticles Against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 2011; 39(1): 77–85.