توالی نوکلئوتیدی و آنالیز فیلوژنتیکی ژن گلیکوپروتئینی ویروس سپتی سمی هموراژیک ویروسی (VHS) جداشده از ماهیان قزل‌آلای رنگین‌کمان استان چهار محال و بختیاری

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 عضو باشگاه پژوهشگران جوان و نخبگان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

2 دانشیار بهداشت و بیماری‌های آبزیان، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

3 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: سپتی سمی هموراژیک ویروسی به‌عنوان جدی‌ترین بیماری ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان درصنعت آبزی‌پروری شناخته شده است. در مطالعۀ حاضر ژن گلیکوپروتئینی ویروس سپتی سمی هموراژیک ویروسی (VHS) شناسایی شد، و تعیین توالی و آنالیز فیلوژنتیکی برخی ویروس‌های جداشده از ماهیان قزل‌آلای رنگین‌کمان کشور انجام شد‏. ‏‏
مواد و روش ‏‏ها: نمونه‌های مشکوک به بیماری VHS که از مزارع پرورش قزل‌آلای رنگین‌کمان استان چهارمحال و بختیاری جمع‌آوری شده بود با استفاده از آزمون (RT- PCR) Reverse transcriptase PCR سنجش شد. در این میان هشت نمونه به‌عنوان سویۀ مثبت شناسایی شد. در این تست، ژن گلیکوپروتئینی (G) ویروس ردیابی گردید و جهت تعیین ردیف نوکلئوتیدی تعیین توالی شد. نتایج حاصل از مقایسۀ ردیف نوکلئوتیدی تعیین‌شده در این مطالعه با توالی شناخته‌شدۀ ژن گلیکوپرتئینی سایر ویروس‌ها مطالعۀ فیلوژنتیکی شد. ‏‏
نتایج: نتایج حاصل از مطالعۀ حاضر نشان داد که بین صفر تا 4/7 درصد تنوع ژنتیکی در ژن گلیکوپروتئینی وجود دارد و در این میان بیشترین قرابت با ردیف نوکلئوتیدی ژن گلیکوپروتئینی درآلمان (توالی EU708818) با 100درصد تشابه و کمترین قرابت مربوط به جدایه‌های این ویروس در ژاپن (توالی AB672616) و ترکیه (توالیJF415091) هر کدام با 60/92 درصد قرابت مشاهده شد. ‏
بحث و نتیجه ‏گیری: با توجه به قرابت ژنتیکی ویروس‌های VHS جداشده از ایران با سویه‌های اروپائی به‌ویژه آلمان و فرانسه احتمال وجود ارتباط بین شیوع بیماری VHS ایران و تخم‌های چشم‌زدۀ وارداتی از کشورهای ذکرشده وجود دارد‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of glycoprotein gene of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) isolated from rainbow trout in Chaharmahal and Bakhtiary province

نویسندگان [English]

  • Hosein Momeni 1
  • Firooz Fadaeifard 2
  • Hasan Momtaz 3
  • Manoochehr Momeni 1
1 Member of Young Researchers and Elite Club, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord-Iran
2 Associate Professor of aquatic animal health and disease, Faculty of veterinary medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
3 Professor of microbiology, Faculty of veterinary medicine, Shahrekord Branch, Islamic Azad University, Shahrekord, Iran
چکیده [English]

Introduction: Viral hemorrhagic septicemia (VHS) is known as the most serious disease of rainbow trout in aquaculture industry. In this study, VHS virus glycoprotein genes were identified in farmed rainbow trout by RT-PCR test. Then nucleotide sequencing and phylogenetic analysis were performed on the viral isolates.
Materials and methods: Suspected samples of VHS disease that collected from rainbow trout farms of Chaharmahal and Bakhtiari province were tested by RT-PCR method. Finally, the eight samples were identified as positive VHS strains and nucleotide sequencing was accomplished. Based on phylogenetic analysis, results of nucleotide sequences of glycoprotein gene were compared with other countries.
Results: The results of present study showed that genetic variation in the glycoprotein gene was 0-7.4 percent. There was the highest similarity of glycoprotein gene of Iranian strains up to 100% with Germany strain (EU708818) and the lowest similarity was showed in Japan (AB672616) and Turkey (JF415091) strains with 60/92 percent in each.
Discussion and conclusion: According to the genetic similarity of the VHS virus isolated from Iran with European strains, especially Germany and France, there is possibility of the relationship between the outbreak of VHS and eyed eggs imported from the mentioned countries.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Glycoprotein gene (G)
  • Viral hemorrhagic septicemia virus
  • Phylogenetic analysis
  • RT-PCR

مقدمه.

ویروس VHS یک پاتوژن رابدوویروسی ماهی است که از تهدیدات بزرگ صنعت آبزی‌پروری در دنیا به شمار می‌رود. این ویروس نه‌تنها در آزاد ماهیان، بلکه در اکثر گونه‌های ماهیان دریایی نیز باعث بیماری می‌شود (1-3). VHS از سوی سازمان[1] OIE  به‌ عنوان بیماری‌های لیست‌شدۀ مهم آزاد ماهیان معرفی شده است. دامنۀ وسیع میزبانی و تفاوت‌های عمده در بیماری‌زایی در این میزبان‌ها باعث بروز مشکل در برنامۀ کنترل VHS شده است (4). تمام جدایه‌های ویروس را  می‌توان به‌وسیلۀ آزمایش‌های ایمنی شیمی و با استفاده از آنتی‌بادی مونوکلنال IP5B1  درحد ژنوتیپ و سروتیپ شناسایی کرد (5 و 10).

ویروس VHS متعلق به خانوادۀ رابدوویریده[2]و جنس نوویرابدوویروس[3] است. ویریون عامل بیماری، فشنگی‌شکل و با قطر تقریبی 70 نانومتر و طول 180 نانومتر است. این ویروس یک RNA تک‌رشته‌ای دارد که تقریباً حاوی 11000 نوکلئوتید است و یک پوشش حاوی گلیکوپروتئین غشائی دارد که یک آنتی‌ژن سطحی خنثی‌کننده[4] است. ژنوم ویروس شش پروتئین را به رمز در می‌آورد. این ویروس به اتر، حرارت و pH اسیدی (برابر یا کمتر از 3) حساس و در مقابل pH برابر با 5 تا 10مقاوم است. تاکنون چهار ژنوتیپ I، II،III وIV برای این ویروس شناسایی شده است. ویروس در سیتوپلاسم سلول میزبان تکثیر می‌یابد و شش mRNA مونوسیسترونیک تولید می‌کند (6). الایزا، خنثی‌سازی سرم[5]، آنتی‌بادی درخشان، ‌ایمونو پراکسیداز و تولید پلاک از آزمایش‌های سرم‌شناسی هستند که در ردیابی ویروس به کار می‌رود و RT-PCR از آزمون‌های مولکولی است. یکی از آزمون‌های جدید معرفی‌شده در پایش این ویروس در محیط‌های طبیعی و آزمایشگاهی، استفاده از تکنیک جدیدی از PCR به‌نام RT-PCR کمی[6] است که در ردیابی سریع ماهیان قبل از تأیید از طریق کشت سلولی و به‌ویژه ردیابی ماهیانی که علائم بالینی بیماری را نشان نمی‌دهند کارایی بالایی دارد (7).

ویروس VHS در اکثر مناطق اروپا به‌صورت بومی درآمده است و از پاتوژن‌های مهم مزارع پرورشی آب‌های شیرین و شور به شمار می‌رود. برخلاف ویروس [7]IHN، بیماری ناشی از VHS در ماهیان قزل آلای بزرگ به‌صورت شاخص بروز می‌کند (7).

با مطالعۀ برخی ماهیان دریایی اطراف نروژ اعم از شگ‌ماهی اطلس[8]، ماهی روغن[9]، ماهی نرم‌باله[10] و ماهی لب‌نقره‌ای[11]ویروس VHS از طریق آزمون RT-PCR ردیابی مولکولی شد و پس از تعیین توالی نمونه‌های مثبت مشخص شد که تمامی نمونه‌ها متعلق به ژنوتیپ Ib است و آنالیز فیلوژنتیکی نیز نشان داد که جدایه‌های ویروسی مربوط به شگ‌ماهی اطلس و ماهی لب‌نقره‌ای خیلی نزدیک به هم هستند (8). در یک مطالعه توالی پروتئین غیرساختمانی(NV) و پروتئین گلیکوپروتئینی جدایه های اروپایی و آمریکایی ویروس VHS تعیین شد و در محاسبۀ درخت‌های فیلوژنتیکی از آن استفاده شد. براساس درصد مشابهت‌های آمینواسیدی یا نوکلئوتیدی جدایه‌های اروپایی و آمریکایی دو گروه ژنتیکی مشخص و جدا از هم تشکیل شد. جدایه‌های آمریکای شمالی خوشه‌های گروه ژنتیکی هموژنی را تشکیل دادند ولی جدایه‌های اروپایی تغییرات ژنتیکی بالایی را از خود نشان دادند. تشکیل زیرگروه در این ویروس‌ها با توجه به همین تنوع می‌تواند با هر دو منشأ جغرافیایی و طبقه‌بندی سرولوژیکی در ارتباط باشد (1).

در مطالعۀ حاضر علاوه بر شناسایی ویروس VHS در ماهیان قزل‌آلای رنگین‌کمان مشکوک به این بیماری، تعیین توالی نمونه‌های ویروس‌ها و همچنین تعیین قرابت فیلوژنتیکی آن‌ها با سایر ویروس‌های VHS دنیا انجام شد.‏

 

‏‏مواد و روش‏ها.

منطقۀ جغرافیایی: نمونه‌های مربوط به ماهیان قزل‌آلای رنگین‌کمان مشکوک به بیماری VHS در زمستان 1392 و از مزارع پرورشی استان چهارمحال و بختیاری جمع‌آوری شد. انتخاب مزارع براساس گزارش انجام‌شده از تلفات مشکوک به VHS انجام شد. اکثر نمونه‌ها از ماهیان درشت و با وزن بالای 250 گرم برداشت شد. میانگین دمای آب مزارع پرورشی نیز بین 7 تا 12 درجه سانتی‌گراد بوده است. ماهیان مشکوک عموماً از علائمی نظیر تیرگی پوست، بیرون‌زدگی چشم، خونریزی روی پوست و خونریزی‌های منتشره داخل حفره شکمی برخوردار بوده‌اند. نمونه‌ها پس از برداشت درون جعبه یونولیتی قرار داده شده و در کنار یخ جهت تشخیص مولکولی به آزمایشگاه ارسال شد.

عملیات آزمایشگاهی: نمونه‌های ماهی پس از ورود به آزمایشگاه در فریزر منهای 70 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد. سپس برای تعیین میزان ارتباط ژنتیکی ژن گلیکوپروتئینی ویروس VHSبا موارد جداشده از سایر کشورها ابتدا توالی 1523 نوکلئوتیدی ژن گلیکوپروتئینی با استفاده از پرایمرهای RT-PCR تکثیر شد. این پرایمرها براساس بلوک های آمینو اسیدهای محافظت‌شده بین توالی‌های گلیکوپروتئینی ویروس نکروز عفونی مراکز خون‌ساز(IHN) و ویروس VHS طراحی شده‌اند(9). خصوصیات پرایمرهای به‌کاررفته در جدول 1 آمده است. چنان‌که در آن پرایمر معکوس حاوی یک SstI در انتهای 5′ خود است که برای اهداف کلونینگ به کار می‌رود و پرایمر جلوبرنده شامل یک جایگاه برش برای آنزیم  HindIII است.

 

 

جدول 1- مشخصات زوج پرایمرهای به‌کاررفته در جستجوی ویروس VHS

توالی پرایمرها

اندازه باند(جفت باز)

ژن هدف

منبع

R- 5′ACACCTGAGCTCTTCTTTGGAGGGCAAACNATY3

1523

G

(9)

F- 5′ TGCATGAAGCTTCAGTCCCCAGGGATGATGNCC3′

 

 

 

 

 


مراحل تشخیص مولکولی و انجام آزمونRT-PCR: جهت استخراج RNA از نمونه‌های مختلف از کیت Tripure ساخت شرکت Roche applied science طبق دستورالعملی که شرکت سازنده ارائه کرده، استفاده شد. برای ساخت cDNA از نمونه‌های RNA استخراج‌شده در مرحلۀ اول، پنچ میکرولیتر از DEPC- water به‌همراه یک میکرولیتر از Random Hexamer و دو میکرولیتر از RNA مربوط به هر نمونه در یک لوله استریل مخلوط شد و به‌مدت پنج دقیقه در دمای 65 درجه انکوبه شد. پس از پنج دقیقه سردکردن لوله روی یخ، به مخلوط فوق پنج میکرولیتر M-Mulv RT buffer 5X، دو میکرولیتر dNTP 10 mM و یک میکرولیتر آنزیمM-Mulv RT اضافه شد و به‌مدت 5/1 ساعت در دمای 37 درجه قرارداده شد. همچنین جهت انجام آزمایش PCR و تکثیر قطعات ژنی مورد نظر، از دستگاه (Eppendorf) Master Cycler gradient با حجم 50 میکرولیتر حاوی 5 میکرولیتر PCR buffer 10X، یک میلی‌مول MgCl2، 100 میکرومول dNTP ، یک پیکومول از زوج پرایمرهای F و R ، یک واحد آنزیم Taq DNA Polymerase  و 5/2 میکرولیتر از cDNA  مربوط به هر نمونه استفاده شد. برنامۀ حرارتی استفاده‌شده عبارت بود از: یک سیکل 94 درجه به‌مدت 4 دقیقه، 33 سیکل تکراری(94 درجه به‌مدت 30 ثانیه، 60 درجه به‌مدت 30 ثانیه، 72 درجه به‌مدت 90 ثانیه) و یک سیکل انتهایی 72 درجه به‌مدت 10 دقیقه. جهت تأیید وجود قطعات تکثیریافته، 20 میکرولیتر از محصول PCR روی ژل یک درصد آگاروز واجد اتیدیوم بروماید در حضور نشانگر 100 جفت بازی DNA در ولتاژ ثابت80 ولت الکتروفورزشد.

تعیین ردیف نوکلئوتیدی: درمرحلۀ بعد فرآوردۀ حاصل ازPCR با کیت خالص‌سازی PCR(Roche Applied Science) و براساس توصیۀ کارخانه سازنده (به شماره کیت 11667157001) خالص شد. محصول PCR تمامی نمونه‌های مثبت جهت تعیین ردیف نوکلئوتیدی ژن تکثیریافته به شرکت Macrogen کشور کره ارسال و به‌روش Sanger Sequencing Method تعیین توالی شد.

تعیین قرابت نوکلئوتیدی: ردیف نوکلئوتیدی ژن G تعیین‌شده در این مطالعه با توالی شناخته‌شدۀ این ژن در سایر کشورها در بانک ژنی NCBI با استفاده از نرم‌افزارClustal X و Njplot مقایسه و ضمن تعیین Sequence Identity Matrix، درخت فیلوژنی مربوطه رسم شد.

 

نتایج.

ردیف نوکلئوتیدی ژن G ویروس سپتی سمی هموراژیک ویروسی مربوط به هشت نمونۀ مثبت‌شده در آزمایش RT-PCR تحت توالی قرار گرفت و با استفاده از نرم‌افزار Clustal X با ردیف نوکلئوتیدی ثبت‌شدۀ این ژن در بانک جهانی(NCBI) (ردیف دسترسی AJ487080)، قرابت فیلوژنتیکی آن مشخص شد. تصویر ژل مربوط به ردیابی این ژن در شکل 1 و توالی نوکلئوتیدی مربوط به یکی از ایزوله‌ها در جدول 2 نشان داده شده است.

 

شکل 1- ژل حاصل از الکتروفورز محصول PCR مربوط به ردیابی ژن G ویروس سپتی سمی هموراژیک ویروسی (ستون =M نشانگر 100جفت بازی DNA، ستون 1= نمونه کنترل منفی، ستون‌های 2 تا 5= نمونه‌های مطالعه‌شدۀ واجد قطعه 1523 جفت بازی)

 

پس از مشاهدۀ شباهت‌ها و تفاوت‌های ردیف نوکلئوتیدی با استفاده از نرم‌افزار Njplot  قرابت فیلوژنتیکی آن‌ها ترسیم شد که به‌ترتیب در شکل 2 درخت فیلوژنتیکی آن به دست آمده است. همان‌طور که مشاهده می‌شود در درخت فیلوژنتیکی ترسیم‌شده ویروس‌های VHS شناسایی‌شده در سه دسته تقسیم شده‌اند که انواع اروپایی در یک دسته، دو ویروس مربوط به آمریکا و کانادا در یک دسته و دو ویروس مربوط به ژاپن و ترکیه نیز دسته سوم را تشکیل داده‌اند آنچه که در درخت ترسیم شده مشهود است استقرار نمونۀ ایرانی در بین ویروس‌های اروپایی است. همچنین در جدول 3 نیز مقایسۀ میزان قرابت ژن گلیکوپروتئینی ویروس VHSدر ایران با سایر کشورها نشان داده شده است. در این جدول میزان قرابت ژنی ویروس‌های شناسایی‌شده با هم مقایسه شد و با توجه به اطلاعات موجود صفر تا 4/7درصد تنوع ژنتیکی در ژن گلیکوپروتئینی وجود دارد و در این میان بیشترین قرابت با ردیف نوکلئوتیدی ژن گلیکوپروتئینی در آلمان (توالیEU708818) با 10۰درصد تشابه و کمترین قرابت مربوط به جدایه‌های این ویروس در ژاپن (توالیAB672616) و ترکیه (توالیJF415091) هرکدام با 60/92درصد قرابت مشاهده شد.

 

 

جدول 2- توالی نوکلئوتیدی ژن G ویروس سپتی سمی هموراژیک ویروسی مربوط به یکی از نمونه‌های مثبت‌شده در آزمایش RT-PCR

 

 

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنی مربوط به آنالیز ردیف نوکلئوتیدی ژن گلیکوپروتئینی ویروسVHSدرایران با تعدادی از توالی‌های ثبت‌شدۀ این ژن در بانک جهانی

 

 جدول 3- نتایج حاصل از مقایسۀ ردیف نوکلئوتیدی ژن گلیکوپروتئینی ویروس VHSدرایران با تعدادی از توالی‌های ثبت‌شده این ژن در بانک جهانی (Sequence Identify Matrix)

 


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

اولین گزارش جداسازی و شناسایی این ویروس در سال 1962 به‌عنوان عامل بیماری شایع ویروسی از مزارع قزل‌آلای رنگین‌کمان دانمارک صورت پذیرفت و در سال 1965 عملیات ریشه‌کنی آن در این کشور انجام شد و بعد از آن از اکثر کشورها گزارش شد (11). در دهه‌های اخیر انتشار آن در اکثر مناطق دنیا و همچنین ماهیان دریایی به‌ویژه در نیم‌کرۀ شمالی انجام شده است. VHS عموماً به‌عنوان یک بیماری ویروسی مهم در پرورش قز‌ل‌آلای رنگین‌کمان اروپا محسوب می‌شود و تا سال 1989 عموماً از آزاد ماهیان آب شیرین جدا شده است اما در دهه‌های اخیر از تعداد زیادی از گونه‌های ماهیان دریایی جداسازی شده است. در ابتدا این بیماری تحت عناوین مختلفی از جمله تورم کلیه و فاسدشدن کبد، طاعون قزل آلا[xii] و بیماری اگتود[xiii] خوانده می‌شد (6 و 12). ژنوم ویروس VHS دارای شش ژن است که شش نوع پروتئین مختلف را به رمز در می‌آورد یکی از این پروتئین‌ها غیرساختمانی(Nv) است و عملکرد ناشناخته ای دارد و پنج تای دیگر انواع ساختمانی نوکلئوکپسید(N)، فسفوپروتئین(P)، ماتریکس پروتئین(M)، گلیکوپروتئین(G) و RNA پلیمراز پروتئین(R) هستند. این ژن‌ها در توالی '-N-P-M-G-Nv-L-5'3 مرتب می‌شوند (3). ثابت شده که پروتئین G به‌عنوان مولکول هدف برای آنتی‌بادی‌های خنثی‌کننده و محافظتی به شمار می‌رود؛ البته این از ویژگی‌های سایر رابدوویروس‌ها نیز به شمار می‌رود(13).

مطالعات فیلوژنتیکی قبلی بر روی جدایه‌های ویروس VHS وجود گروه‌های ژنتیکی مجزا را نشان می‌دهد. هرچند گمان می‌رود که ارتباط نزدیکی بین جدایه‌های آب شیرین و دریایی تاکنون مشاهده نشده باشد؛ مطالعات اخیر نشان از ارتباط نزدیک بین جدایه‌های VHS آب شیرین و دریایی اروپا دارد. مطالعۀ تنوع سکانس‌های ژن گلیکوپروتئینی (G) این احتمال را فراهم ساخته که در اروپا سه ژنوتیپ I،IIوIII از این ویروس وجود داشته باشد. طی مطالعه بر خصوصیات مولکولی سویۀ دریاچه‌های بزرگ ویروس (MI03GL)VHS و روابط فیلوژنتیک آن با جدایه‌های اروپایی و آمریکای شمالی از طریق همولوژی توالی نوکلئوتیدی و آنالیز فیلوژنتیکی نشان دادند که ویروس دریاچه‌های بزرگ با سویه‌های ژاپنی JF00Ehi1 تا 96درصد و KRRV9822 تا 95درصد ارتباط نزدیک دارند. در بین سایر نوی رابدوویروس‌ها، ویروس VHS دارای بالاترین همولوژی نوکلئوتیدی (62درصد) با رابدوویروس سرماری[xiv] است (6).

توالی‌های RNA قابلِ‌دسترس ژن‌های گلیکوپروتئینی(G)، نوکلئوپروتئینی (N) و غیر ویریونی (NV) ویروس VHS با حداکثر مشابهت[xv] و روش‌های تحلیل بیزیان[xvi] بررسی شد. درخت‌های فیلوژنتیکی به‌دست‌آمده از گونه‌های این ویروس تا حد زیادی با هم مشابه بود و مشخص شد که گونه‌های مشخص I تا IV مونوفیلتیک متقابل هستند. به نظر می‌رسد که ویروس VHS از یک منشأ دریایی در اقیانوس اطلس شمالی منشأ گرفته شده باشد که در 267 تا 697 سال پیش به دو دسته تقسیم شده‌اند. چنان‌که سویه IV در آمریکای شمالی و سویه‌های I، II و III در منطقۀ شمال شرقی اطلس(اروپا) متمرکز شده‌اند. سویۀ IV نیز خود به سه زیرگونۀ مونوفیلتیک IVa، IVb وIVc متمایز می‌شود؛ چنان‌که  IVa موجب آلودگی آزاد ماهیان شمال شرقی اقیانوس آرام و بسیاری از ماهیان دریایی می‌شود، زیرگونۀ IVb باعث بروز بیماری‌های اندمیک در دریاچۀ بزرگ آب شیرین شد و زیرگونۀ IVc جدیداً در آب‌های دریایی اطلس شمالی شناسایی شده است (14).

همچنین به‌منظور مطالعۀ تکامل ژنتیکی ویروسVHS، ژن G کامل از 74 جدایه بررسی شد. مطالعۀ ویروس VHS در گونه‌های متعدد ماهیان دریایی نشان می‌دهد که دارای یک جد مشترک هستند. براساس میزان تخمین جایگزینی نوکلئوتیدی[xvii]، اجداد تمام جدایه‌های آب شیرین اروپایی به 50 سال پیش بر می‌گردد. این یافته متناسب با گزارش‌های اولیه در سال 1950 بر مشاهدات بالینی VHSدر مزارع قزل‌آلای رنگین‌کمان آب شیرین دانمارک است. همچنین مطالعۀ ذکرشده نشان می‌دهد که ویروس VHSدریایی اروپا و خط دریایی آمریکای شمالی تقریباً در 500 سال پیش از هم جدا شده‌اند. اطلاعات به‌دست‌آمده از این مطالعه نیز فرضیۀ اینکه محیط‌های دریایی مخزن اصلی و ریشه‌ای ویروس هستند را تقویت می‌کنند و تغییر در دامنه میزبانی (از جمله قزل‌آلای رنگین‌کمان) ممکن است چندین بار اتفاق افتاده باشد؛ لذا ویروس موجود در محیط‌های دریایی به‌عنوان تهدیدی برای صنعت پرورش قزل‌آلا به شمار می‌رود (15). تمام جدایه‌های ویروسی VHS به‌دست‌آمده از ماهیان دریایی طی چالش داخل آب قادر به ایجاد بیماری یا تلفات در بچه‌ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان نبودند (16).

به‌دنبال تحقیق بر ویروس VHS، توالی‌های نوکلئوتیدی منطقۀ اختصاصی ژن گلیکوپروتئینی این ویروس در بین 63 سویۀ از ویروس جداشده از ماهیان فرانسه در سال‌های 1971 تا 1999 مقایسه شد. توالی‌های اکثر جدایه‌ها غیر از یک جدایه که در بچه مارماهی شناسایی شده بود و اختلاف بالایی در مقایسه با سایر جدایه‌های فرانسوی داشت یکسان بود. آنالیز فیلوژنتیکی نشان داد که جدایه‌های ویروس VHS به‌جز L59X متعلق به ژنوتیپ I است که قبلاً به‌عنوان سویه‌های ویروسی جداشده از قارۀ اروپا معرفی شده‌اند.در کل نتایج این تحقیق نشان از همبستگی بین منشأ جغرافیایی جدایه‌های مطالعه‌شده و خصوصیات ژنتیکی آن‌ها داشت (17).

در سال‌های اخیر و به‌دنبال افزایش تولید ماهی قزل‌آلای رنگین‌کمان در کشورمان از طرفی و کمبود بچه‌ماهی لازم برای تأمین این حجم ماهی خوراکی از طرف دیگر، مدیران و مسؤلان بخش‌های دولتی مرتبط با این موضوع را مجبور به واردات گستردۀ تخم چشم‌زده از کشورهای دیگر به‌ویژه فرانسه، دانمارک، نروژ، آمریکا و... کرد که در کنار این واردات حجیم علی‌رغم اعلام سالم‌بودن آن‌ها از طرف کشور واردکننده و معاینه توسط بخش‌های قرنطینه‌ای سازمان دامپزشکی، نگرانی آلوده‌بودن تخم‌ها به عوامل عفونی به‌ویژه ویروس‌های بیماری‌زا همچون VHS، IPN [xviii] و IHN می‌رفت؛ چنان‌که در سال‌های گذشته بچه ماهیان قزل‌آلای کشور با بیماری IHN  مواجه شدند و تلفات بالایی را تجربه کردند و در سال 1392 نیز متأسفانه اکثر مزارع پرورشی درگیر بیماری VHS شدند و این شیوع وسیع، تلفات شدیدی را به همراه داشته است(18). در این میان استان چهارمحال و بختیاری به‌عنوان بزرگ‌ترین تولیدکنندۀ ماهی سردابی کشور از این رخداد مصون نماندند و متأسفانه بخش اعظمی از ماهیان مزارع آن تلف شدند. از نتایج مطالعۀ حاضر مشخص شد مشابهت بالایی بین ژن گلیکوپروتئینی ویروس VHS ایران با سویه‌های اروپایی به‌ویژه آلمانی و فرانسوی وجود دارد که این اتفاق احتمال بروز این فرضیه که ویروس VHS شایع‌شده در ماهیان ایران از طریق تخم‌های چشم‌زدۀ وارداتی منتشر شده باشد را افزایش می‌دهد. مزارع تکثیر استان چهارمحال و بختیاری از جمله واردکنندگان عمدۀ تخم چشم‌زدۀ فرانسوی به شمار می‌روند و براساس اطلاعات به‌دست‌آمده از آن‌ها عموماً تمایل به نگهداری و پرورش این نوع بچه‌ماهی دارند از طرفی بچه ماهیان تولیدشده از این تخم‌ها پس از رسیدن به اندازۀ انگشت قدی به مزارع دیگر در همان استان یا استان‌های دیگر منتقل می‌شوند که احتمال اشاعۀ ویروس‌های احتمالی را افزایش می‌دهد؛ لذا مراجعی که در صدور مجوز واردات تخم خارجی به کشور نقش مؤثری داشته‌اند باید در شیوۀ واردات و همچنین فرایند قرنطینۀ محموله‌های بیولوژیکی تجدیدنظر کنند و اصول امنیت زیستی در مزراع پرورشی کشور قوانین را به‌طور جدی‌تری رعایت کنند. از این رو، ضروری است مزارع پرورشی نیز با اجرای اصول و قواعد مدیریت بهداشتی و تقدم فرآیند پیشگیری بر درمان به کاهش خطر بروز بیماری‌های عفونی از جمله ویروسی کمک کنند. این مطالعه نشان داد که محتمل‌ترین منشأ ویروس VHS در ماهیان قزل‌آلای رنگین‌کمان کشورمان تخم‌های خارجی وارد شده بود و ازآنجایی‌که مولدهای آلوده قادر به انتقال ویروس به تخم هستند لذا مسئولان مربوط در زمینۀ نحوۀ ورود این گونه محصولات زنده، باید دقت نظر بیشتری به عمل آورند و دیگر اینکه تکثیر بچه‌ماهی از مولدهای بومی را تقویت کنند. همچنین پیشنهاد می‌شود برای کلیۀ مزارع پرورشی شیوه‌نامۀ رعایت اصول بهداشتی تدوین شود و نظارت بخش‌های دولتی و خصوصی دراین‌باره تقویت شود.



[1]- Office International des Épizooties

[2]- Rhabdoviridae

[3]- Novirhabdovirus

[4]- Neutralising surface antigen

[5]- Serum neutralization test

[6]- Quantitative RT-PCR

[7]- Infectious hematopoietic necrosis

[8]- Clupea harengus

[9]- Melanogrammus aeglefinus

[10]- Merlangius merlangus

[11]- Gadiculus argenteus

[xii]- Trout plague

[xiii]- Egtved disease

[xiv]- Snakehead rhabdovirus

[xv]- Maximum Likelihood

[xvi]- Bayesian approaches

[xvii]- Estimated nucleotide substitution rate

[xviii]- Infectious pancreatic necrosis

 

(1)              Basurco B, Vende P, Monnier AF, Winton JR, de Kinkelin P, Benmansour A. Genetic diversity and phylogenetic classification of viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV).Veterinary research.1995; 26(5-6): 460-3.

(2)              Brudeseth BE, Evensen O. Occurrence of viral haemorrhagic septicemia virus (VHSV) in wild marine fish species in the coastal regions of Norway. Diseases of aquatic organisms, 2002 ;52(1):21-28.

(3)              StoneDM, Way K , Dixon PF. Nucleotide sequence of the glycoprotein gene of viral haemorrhagic septicaemia (VHS) viruses from different geographical areas: a link between VHS in farmed fish species and viruses isolated from North Sea cod (Gadus morhua L.), Journal of Virology.1997;78(6): 1319–1326.

(4)              Meyers TR, Sullivan J, Emmeneger E, Follet J, Short S, Batts WN. Identification of viral haemorrhagic septicemia virus isolated from pacific cod, Gadus macocephalus in prince William Sound, Alaska, USA. Diseases of aquatic organisms,1992;12:167-75.

(5)              Lorenzen N, Olesen NJ, Vestergård Jørgensen PE. Production and characterization of monoclonal antibodies to four Egtved virus structural proteins. Diseases of aquatic organisms, 1988;4: 35–42.

(6)              Ammayappan A ,Vakharia VN. Molecular characterization of the Great Lakes viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) isolate from USA. Virology Journal, 2009; 6: 171.

(7)              Hope KM, Casey RN, Groocock GH, Getchell RG, Bowser PR, Casey JW. Comparison of quantitative RT-PCR with cell culture to detect viral hemorrhagic septicemia virus (VHSV) IVb infections in the Great Lakes. Journal of aquatic animal health. 2010; 22(1): 50-61.

(8)              Sandlund N, Gjerset B, Bergh Ø, Modahl I, Olesen NJ. Johansen R. Screening for Viral Hemorrhagic Septicemia Virus in Marine Fish along the Norwegian Coastal Line. Plos One ,e108529. 2014;9(9):1-12. 

(9)              Thiry M, Lecoq-Xhonneux F, Dheur I, Renard A, DeKinkelin P. Sequence of a cDNA carrying the glycoprotein gene and part of the matrix protein M2 gene of viral hemorrhagic septicemia virus, a fish rhabdovirus. Biochimica et biophysicaacta, 1991;1090(3): 345-347.

(10)               Stone DM, Way K, Dixon PF. Nucleotide sequence of the glycoprotein gene of viral haemorrhagic septicaemia (VHS)viruses from different geographical areas: a link betweenVHS in farmed fish species and viruses isolated from north Sea cod (Gadus morhua L.).The Journal of general virology,1997;7(6):1319-1326.

(11)               Jensen MH. Research on the virus of Egtved disease. Annals of the New York Academy of Sciences,1965;126(1): 422–426.

(12)               Schlotfeldt HJ, Ahne W, Vestergard-Jorgensen PE, Glende W.Occurrence of viral haemorrhagic septicaemia in turbot (Scophthalmus maximus)-a natural outbreak. Bulletin of European Association of Fish Pathologists, 1991;11(3):105-7.

(13)               Lorenzen N, Olesen NJ, Koch C. Immunity to VHS virus in rainbow trout. Aquaculture,1999; 172(1-2): 41–61.

(14)                Pierce LR, Stepien CA. Evolution and biogeography of an emerging quasispecies: Diversity patterns of the fish Viral Hemorrhagic Septicemia virus (VHSv). Molecular phylogenetics and evolution. 2012; 63(2): 327-341.

(15)               Einer-Jensen K, Ahrens, Forsberg R, Lorenzen N. Evolution of the fish rhabdovirus viral haemorrhagic septicaemia virus. The Journal of general virology. 2004; 85(5): 1167–1179.

(16)               Skall HF, Slierendrecht WJ, King JA, Olsen NJ. Experimental infection of rainbow trout Oncorhynchus mykiss withviral haemorrhagic septicaemia virus isolates from European marineand farmed fishes. Diseases of aquatic organisms. 2004; 58(2-3): 99-110.

(17)               Thiéry R ,De Boisséson C, Jeffroy J, Castric J, De Kinkelin P, Benmansour A. Phylogenetic analysis of viral haemorrhagic septicaemia virus (VHSV) isolates from France(1971–1999). Diseases of aquatic organisms, 2002; 52(1): 29–37.

(18)               Islamic Republic News Agency(2014) viral haemorrhagic septicaemia has been controlled in the rainbow trout, news cod: 4168132(81267720).