جداسازی کنسرسیوم‏ های میکروبی نمک‌دوست تجزیه‌کنندۀ گازوئیل به‌منظور استفاده در پاکسازی زیستی پسماند‏های حفاری

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: در عملیات حفاری، حجم بالایی از کنده‏های حفاری با آلودگی هیدروکربنی و شوری بالا به محیط رها می‏شوند که آثار زیان‌باری خواهند داشت. پاکسازی زیستییک تکنولوژی کارآمد و دوستدار محیط زیست است که  در پاکسازی پسماندهای حفاری، کاربرد دارد. به‌دلیل شوری بالا و نبودِ فلور میکروبی فعال در کنده‏های خارج‌شده از عمق زمین، به‌کارگیری کنسرسیوم‏های میکروبی نمک‏دوست تجزیه‌کنندۀ هیدروکربن می‏تواند کارایی پاکسازی زیستی را افزایش دهد‏. ‏‏
مواد و روش ‏‏ها: برای دست‌یابی به میکروارگانیسم‏های مناسب برای فرآیند پاکسازی زیستی، از مناطق مختلف ایران چندین نمونه آب و خاک شور آلوده و غیرآلوده به نفت تهیه شد و کنسرسیوم‏های میکروبی تجزیه‌کنندۀ گازوئیل، با روش غنی‏سازی چندمرحله‏ای، از آن‏ها جداسازی شدند. سپس توانمندی کنسرسیوم‏های میکروبی از نظر رشد در حضور گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن به‌روش، پروتئین‌سنجی و شمارش کلنی‌ها روی پلیت سنجیده و منحنی رشد آن‏ها بررسی شد. سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی منتخب نیز به‌روش مولکولی شناسایی شدند. ‏‏
نتایج: در میان کنسرسیوم‏های میکروبی تجزیه‌کنندۀ گازوئیل، حداکثر تعداد باکتری‏ها، مربوط به کنسرسیوم میکروبی جداشده از خاک آلودۀ قم، با تعداد  CFU/mL1015×9/1 بر روی محیط‏ کشت مغذی و محیط پایه معدنی حاوی گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن بود. بررسی منحنی‏های رشد نشان داد که کشت نمونه‏های آلوده به نفت سریع‏تر از نمونه‏های غیرآلوده به فاز لگاریتمی رسیده و مقدار کدورت نهایی آن‏ها نیز بیشتر است. تعیین توالی ژن 16S rRNA سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از خاک‏های آلوده به نفت، نشان داد که این سویه‏ها متعلق به جنس‏های Dietzia، Microbacterium و Salinicola بودند. ‏
بحث و نتیجه ‏گیری: محیط‏های با سابقۀ آلودگی نفتی، به‌علت سازگاری فلور میکروبی به حضور آلاینده‏ها، در مقایسه با نمونه‏های غیرآلوده ظرفیت بالقوۀ بیشتری برای جداسازی کنسرسیوم‏های میکروبی تجزیه‌کننده دارند. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation of halophilic microbial consortia capable of degrading diesel oil for the bioremediation of drilling wastes

نویسندگان [English]

  • Maryam Rezaei somee 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Mahmoud Shavandi 3
  • seyed mohammad mahdi Dastgheib 3
1 M.Sc. of Microbial Biotechnology, Extremophiles Laboratory, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Biotechnology, Microbiology and Biotechnology Group, Research institute of petroleum industry (RIPI), Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: drilling for exploration and production of petroleum requires the use of drilling fluid in order to lubricate and cool the drill bit. Oil based muds (OBMs) containing diesel, are the preferred drilling fluids because of their better lubricity. After mixing with drill cuttings, OBMs form complex industrial wastes containing hydrocarbons and brine. Bioremediation can be considered as a promising alternative to physicochemical methods for cleaning up drilling wastes because of its environmental friendly and cost effective properties. Due to high salinity and lack of active microflora in drill cuttings, developing halophilic consortia could be beneficial for enhancing bioremediation efficiency.
Materials and methods: different oil-polluted and unpolluted saline soil and water samples have been used to enrich halophilic consortia able to degrade diesel hydrocarbons using a multistep enrichment technique. The growth capability of diesel-degrading consortia was evaluated by Bradford protein assay and standard plate count and growth curves were plotted. Furthermore, dominant strains of the consortia which were isolated from oil polluted saline soils were identified by molecular method.
Results: Among 10 microbial consortia isolated from different environments, the best consortium was isolated from Qom oil-polluted soil sample which could grow very well on Bushnell Haas mineral medium containing diesel as the sole source of carbon. The bacterial count of the consortium was increased up to 1.88×1015 CFU/ml after 96h of incubation. Comparison of the growth curves indicated that in comparison to unpolluted samples, polluted ones reached the logarithmic phase more quickly and the final turbidity was more. 16S rRNA gene sequencing analysis revealed that the dominant strains of consortia isolated from oil polluted saline soil samples belonged to the genera of Dietzia, Microbacterium and Salinicola.
Discussion and conclusion: Due to long term exposure of the polluted samples to oil pollution and high salinity, they have naturally been enriched by bacterial communities capable of degrading oil derivatives such as diesel in extreme conditions.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Halophilic consortia
  • Oil-based muds
  • Diesel oil
  • Bioremediation
  • Drill cuttings

مقدمه.

در دنیای صنعتی امروز، نفت خام یکی از مهم‏ترین منابع انرژی است که اکتشاف و استخراج آن، نیازمند فرآیند حفاری است. به‌منظور خنک‌کردن و روان‌کردن سر مته و انتقال کنده‏های حفاری، در طول فرآیند حفر چاه، از سیالات حفاری استفاده می‏شود. سیالات حفاری، به‌طور عمده به سه دستۀ سیالات پایه روغنی، پایه سنتزی و پایه آبی، تقسیم می‏شوند که در هر یک، ذرات جامد به‌ترتیب در بستری از هیدروکربن‏ها‏ مانند گازوئیل با دامنۀ ترکیبات 25-11 کربنه‏ (1)، روغن‏های مصنوعی مانند استر‏های گیاهی، و یا آب، معلق هستند. سیالات پایه روغنی، به‌علت فراوانی نسبی هیدروکربن‏های آروماتیک، سمیت بیشتری نسبت به سیالات پایه سنتزی دارند اما به‌علت روان‌کنندگی بهتر و نرخ حفاری بالاتر بر سایر سیالات ترجیح داده می‏شوند (2 و 3).

با توجه به حجم بالای تولید و انتقال نفت خام و مشتقات آن، مقادیر بالایی از آلاینده‏های هیدروکربنی، به‌واسطۀ نشت تصادفی، آزادشدن از خطوط لوله‏ها، نشت از مخازن ذخیره‏سازی زیر‏زمینی و یا دفع گل‏های حفاری بسیار شور به محیط‏های خاکی و آبی رها می‏شوند (4-6).

از طرفی، مخازن نفت تشکیل‌شده اغلب مواقع در نزدیکی محیط‏های آبی شور و تبخیری یافت می‏شود و آبی که در مخازن نفتی وجود دارد، عموماً بسیار شور است (7). عملیات حفاری نیز احتمال در معرض قرارگرفتن نفت را با شورآب‏ها افزایش می‏دهد. به‌علاوه، غلظت بالایی از نمک، به‌منظور ایجاد سد اسمزی و ممانعت از تورم لایۀ حفرشده، به گل‏های حفاری پایه روغنی اضافه می‏شود. بنابراین، حجم زیادی از کنده‏های حفاری، با گل بسیار شور نفتی آغشته می‌شود که تحت شرایط بی‌هوازی در استخر‏های هرزاب حفاری، تجزیۀ زیستی آلودگی هیدروکربنی آن‏ها دشوار است (8).

بنابراین در بسیاری از موارد، همراه با آلاینده‌های هیدروکربنی، غلظت‏های بالایی از نمک نیز در محیط‏های آلوده به نفت وجود دارد که پاکسازی و تجزیۀ آن‏ها را دشوارتر می‏کند (9).

با این حال، هیدروکربن‏ها برای اولین بار به‌واسطۀ فعالیت‏های انسان، وارد محیط زیست نشده‏اند؛ بلکه همواره بخشی از بیوسفر کرۀ زمین بودند و موجودات زندۀ مختلفی مانند باکتری‏ها، فیتوپلانکتون‏ها و گیاهان آن‌ها را تولید کرده‏اند (11). درنتیجه میکروارگانیسم‏ها، در طول تکامل برای تجزیۀ هیدروکربن‏های مختلف، سازگاری کسب کرده‏اند اما ورود بیشتر آن‏ها از طریق آلاینده‏های نفتی، منجر به برهم‌خوردن تعادل فسفر- نیتروژن- کربن محیط می‌شود و از توان خودپالایی طبیعت برای تجزیه خارج می‏شود (10).

در حال حاضر، خاک‏های آلوده به ترکیبات نفتی، با استفاده از سه روش فیزیکی، شیمیایی و زیستی، تیمار می‏شوند. بسیاری از روش‏های فیزیکی یا شیمیایی، پرهزینه هستند و یا آلودگی‏ها را به‌طور کامل حذف نمی‌کنند. به نظر می‏رسد که پاکسازی زیستی[1]، روشی امیدبخش و مقرون‌به‌صرفه برای حذف دامنۀ وسیعی از ترکیبات آلی به‌ویژه هیدروکربن‏های نفت خام است (11).

دو روش عمده برای تسهیل پاکسازی زیستی وجود دارد: تحریک زیستی[2] : تحریک رشد میکروارگانیسم‏های تجزیه‌کنندۀ ذاتی محیط آلوده، از طریق متعادل‌ساختن نسبت‏های فسفر- نیتروژن- کربن (۱۲ و13) و تلقیح زیستی[3]: افزودن میکروارگانیسم یا میکروارگانیسم‏های خارجی تجزیه‌کنندۀ آلاینده‏ها به محیط آلوده. درصورتی‌که میکروارگانیسم‏های ذاتی محیط آلوده، علی‌رغم تحریک زیستی، قادر به حذف کامل آلاینده‏ها نباشند، استفاده از روش تلقیح زیستی توصیه می‌شود (14).

اما در این روش (تلقیح زیستی)، استفاده از کنسرسیوم‏های باکتریایی به کشت خالص آن‏ها ترجیح داده می‏شود؛ زیرا توانمندی آنزیمی کنسرسیوم‏ها، به‌دلیل وجود روابط هم‌افزایی[4] بین جوامع آن‏ها و تولید آنزیم‏های مختلف، بیشتر و کارآمدتر است (15). ازآنجایی‌که ترکیبات آلایندۀ نفتی اغلب با غلظت‏های بالایی از نمک وارد محیط می‏شوند، استفاده از میکروارگانیسم‏های نمک‏دوست که در طی تکامل به زندگی‌کردن در شوری سازگار شده‏اند پیشنهاد می‌شود.

هدف از این مطالعه، جداسازی و غنی‏سازی کنسرسیوم‏های میکروبی نمک‏دوست تجزیه‌کنندۀ گازوئیل از نمونه‏های خاک و آب شور، به‌منظور استفاده در پاکسازی زیستی پسماند‏های حفاری است.

 

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

غنی سازی: همان‌طور که در جدول 1 نشان داده شده است، چهار نمونه خاک شور آلوده، سه نمونه خاک شور غیرآلوده و سه نمونه آب شور غیرآلوده، برای غنی‏سازی چندمرحله‏ای استفاده شد. محیط کشت پایۀ معدنی بوشنل هس[5]  با pH  7، همراه با 7درصد (وزنی/حجمی) نمک NaCl و 5/0درصدگازوئیل استریل‌شده به‌عنوان تنها منبع کربن، به‌منظور غنی‏سازی نمونه‏های خاک و آب در تجزیۀ گازوئیل استفاده شد. ترکیبات این محیط، عبارت بود از (گرم در لیتر آب مقطر):

KH2PO4, 1; K2HPO4, 1;  NH4NO3, 1; MgSO4, 2/0; CaCl2, 02/0; FeCl3, 05/0.

 pH محیط کشت، با استفاده از محلول یک مولار TrisHCl، در 2/7-7 تنظیم شد و در دمای 121درجه سانتی‏گراد و فشار 5/1 اتمسفر اتوکلاو شد. از هر یک از نمونه‏های خاک، یک گرم و از هر یک از نمونه‏های آب، یک میلی‌لیتر برداشته شد و به ارلن‏های 250میلی‌لیتری حاوی 100 میلی‌لیتر محیط کشت بوشنل هس، منتقل شد. ارلن‏ها به‌مدت یک هفته در شیکر انکوباتور در دمای 32 درجه سانتی‌گراد و دور rpm 120، گرماگذاری شد و رشد میکروبی، با دنبال‌کردن کدورت آن‏ها پس از یک هفته کنترل شد. پس از گذشت یک هفته، 1 میلی‌لیتر از هر یک از نمونه‏های غنی‌شده به محیط جدید دارای ۷درصد  NaCl  و۵/۰درصد گازوئیل، انتقال داده شد و مانند مرحلۀ قبل گرمخانه‌گذاری شدند. فرآیند غنی‏سازی چندمرحله‏ای، 7 بار تکرار شد.

 

جدول 1- ویژگی‏های نمونه‏های خاک و آب استفاده‌شده در نمونه‏های خاک شور آلوده

مکان نمونه‌بردای

موقعیت جغرافیایی

EC µS/cm*

pH

TPH (mg/g)**

خاک آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران

″7/12´31 ·35  شمالی

″56´24 ·51 شرقی

124500

6/7

84

خاک آلودۀ جزیره خارک

″9/40´13 ·29 شمالی

″5/11 ´18 ·50 شرقی

61500

75/6

53

خاک آلودۀ قم

″5/43´44 ·34 شمالی

″6/43´53 ·50 شرقی

65250

05/8

46

خاک آلودۀ خانگیران

″20´33 ·50 شمالی

″57´47 ·60 شرقی

72200

04/7

59

نمونه‏های خاک و آب شور غیرآلوده

مکان نمونه‌بردای

موقعیت جغرافیایی

EC µs/cm

pH

خاک شور ارومیه

″2/50´60 ·37 شمالی

″6/23´47 ·45شرقی

36700

862/8

خاک شور میغان اراک

″02/50´22 ·34 شمالی

″8/48´82 ·49شرقی

351000

701/8

خاک شور اشتهارد

″09/25´43 ·35 شمالی

″09/28´21 ·50 شرقی

73500

928/7

آب شور ارومیه

″2/50´60 ·37شمالی

″6/23´47 ·45شرقی

442000

573/8

آب شور میغان اراک

″02/50´22 ·34 شمالی

″8/48´82 ·49شرقی

240000

127/8

آب شور اشتهارد

″09/25´43 ·35 شمالی

″09/28´21 ·50 شرقی

55200

649/7

µS/cm*: میکروزیمنس بر سانتی‌متر، نشان‌دهندۀ هدایت الکتریکی است،   mg/g** : میلی‌گرم بر گرم نشان‌دهندۀ مقدار کل هیدروکربن‏های موجود در محیط است.


رسم منحنی رشد کنسرسیوم‏های میکروبی: در مرحلۀ هشتم غنی‌سازی، به‌منظور بررسی نحوۀ رشد کنسرسیوم‏های میکروبی حاصل، بار دیگر مانند مراحل قبل 1 میلی‌لیتر از محیط کشت غنی‏سازی مرحله هفتم هر یک از نمونه‏ها، بر روی محیط‏های تازه تلقیح شد و رشد و کدورت هر یک از نمونه‏ها پس از تلقیح و گرمخانه‌گذاری، از طریق سنجش مقدار جذب آن‏ها  در طول موج 620 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر، در فواصل زمانی مشخص بررسی شد.

تخمین تراکم سلولی کنسرسیوم‏های میکروبی: به‌منظور انتخاب بهترین کنسرسیوم میکروبی در تجزیۀ گازوئیل، تراکم باکتریایی هر یک از کنسرسیوم‏های میکروبی جداسازی‌شده، از طریق دو روش زیر بررسی شد:

1) پروتئین‌سنجی به‌روش بردفورد[6]

به‌منظور تهیۀ معرف بردفورد، 100 میلی‌گرم کوماسی بریلینت بلو [7] G-250 در 50 میلی‏لیتر اتانول 95درصد حل شد و در حین هم‌زدن به آن 100 میلی‌لیتر فسفریک اسید 85درصد اضافه شد و پس از  حل‌شدن رنگ، حجم آن به یک لیتر رسانده شد.

پس از هم‌دما‌شدن معرف بردفورد با محیط، مقدار یک میلی‌لیتر از آن با 25 میکرولیتر از هر یک از نمونه‏های کشت میکروبی، در یک ویال 5/1میلی‌لیتری مخلوط و به‌مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد. سپس جذب نوری هر یک از نمونه‏ها در طول موج 595 نانومتر خوانده شد. برای تهیۀ منحنی استاندارد، غلظت‏های مشخصی از سرم آلبومین گاوی[8] (ازmg/ml 125/0 تا mg/ml 2) در آب مقطر دیونیزه تهیه شد و همانند مرحلۀ قبل، میزان جذب نوری آن‏ها در طول موج 595 نانومتر تعیین شد. سپس مقدار مجهول پروتئین موجود در هر یک از نمونه‏های کشت میکروبی، با استفاده از نمودار استاندارد تعیین شد (16).

2) شمارش باکتری‌های هتروتروف و تجزیه‌کنندۀگازوئیل

تراکم سلولی محیط‏های غنی‏سازی‌شده و همچنین نمونه‏های اصلی آب و خاک، با استفاده از این روش در روی دو محیط کشت R2A و بوشنل هس حاوی گازوئیل بررسی شدند.

محیط کشت R2A(17) یک محیط کشت کم‌مغذی، با تنوع بالای منابع کربن است. pH محیط، با استفاده از محلول 2 مولار NaOH در4/7-2/7 تنظیم شد. یک گرم و یا یک میلی‌لیتر از هر یک از نمونه‏های آب یا خاک و نیز یک میلی‌لیتر از هر یک از محیط‏های کشت غنی‌شده برداشته شد و در لولۀ حاوی 9 میلی‌لیتر محیط مایع R2A ریخته شد و از هر یک از آن‏ها تا رقت 12-10سریال رقت تهیه شد. سپس 1/0 میلی‌لیتر از هر رقت، بر روی پلیت‏های حاوی محیط R2A ریخته شد و با میلۀ شیشه‏ای پخش شد و سپس پلیت‏ها به‌مدت 72 ساعت در دمای 32 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد.

محیط کشت جامد بوشنل هس (5/1درصد آگار) همراه با ۷درصد NaCl  و دارای منبع کربن گازوئیل نیز به‌عنوان محیط کشت اختصاصی شمارش باکتری‏های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل استفاده شد. در این مورد نیز مانند مرحلۀ قبل، از نمونه‏های خاک و آب و محیط‏های غنی‌شده، تا رقت 12-10سریال رقت تهیه شد با این تفاوت که این بار به‌جای محیط R2A، از 9 میلی لیتر سرم فیزیولوژی در هر یک از لوله‏ها استفاده شد. پس از پخش‌کردن 1/0 میلی‌لیتر از هر یک از رقت‏ها و جذب‌شدن آن‏ها به محیط،  مقدار 1/0 میلی‌لیتر گازوئیل استریل‌شده به‌عنوان منبع کربن، روی آن‏ها ریخته و پخش شد و در دمای 32 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 96 ساعت، گرماگذاری شد. پس از سپری‌شدن زمان گرمخانه‌گذاری، تعداد کلنی‏های ایجاد‌شده بر روی پلیتی که بین 30 تا 300 کلنی داشت، شمارش شد و عدد به‌دست‌آمده در عکس ضریب رقت ضرب شد.

.بررسی ویژگی‏های ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک: برای سویه‏های غالب هر یک از کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از نمونه‏های آلوده به نفت، تعدادی از تست‏های بیوشیمیایی، ریخت‌شناسی و فیزیولوژیک انجام شد. رنگ‌آمیزی گرم براساس روش هوکر[9] انجام شد (18). برای تأیید نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی گرم، از تست  3درصد که بارون[10] توصیه کرده است، استفاده شد. فعالیت پراکسیدازی با استفاده از محلول 3درصد پراکسید هیدروژن و فعالیت اکسیدازی با استفاده از دیسک‏های اکسیداز آمادۀ شرکت پادتن طب تعیین شدند. نمک‏دوست‌بودن یا تحمل‌پذیری نمک سویه‏ها نیز از طریق بررسی رشد آن‏ها در محیط‏های جامد و مایع R2A بدون نمک (۰درصد NaCl وزنی/ حجمی) انجام شد.

.شناسایی مولکولی سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از نمونه‏های آلوده به نفت: به منظور شناسایی سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی منتخب، از طریق توالی ژن 16sr RNA، DNA کلنی‏های تازه‌رشدکرده بر روی محیط R2A agar با استفاده از روش تغییریافتۀ مارمور[11]، استخراج شد (19). تأیید استخراج DNA، از طریق بارگذاری 10درصد  از نمونه همراه با رنگ بارگذاری (با نسبت 6 به 1) بر روی ژل آگاروز (7/0درصد) در دستگاه الکتروفورز افقی انجام شد. برای انجام واکنش زنجیره‏ای پلیمراز[12]، از پرایمر‏های عمومی 27F (5´-AGAGTTTGATCMTGGGTCAG-3´) و 1492R (5´-GGTTACCTTGTTACGACTT-3´) برای باکتری‏ها، استفاده شد (20).

واکنش زنجیره‏ای پلیمراز برای سویه‏های منتخب، به این روش صورت گرفت: واسرشت‏سازی اولیه به‌مدت 6 دقیقه در دمای 94 درجه سانتی‌گراد انجام و سپس، مرحلۀ تکثیر آغاز شد که شامل 30 چرخۀ تکرارشونده با دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه، دمای اتصال 56 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه و دمای سنتز 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 60 ثانیه بود. درانتها، به‌منظور تکمیل نهایی ساختار‏های تکثیرشده، یک مرحله‏ سنتز به‌مدت 7 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد، به مراحل افزوده شد. پس از تکثیر توالی موردنظر با استفاده از پرایمر‏های استفاده‌شده، نمونه محصول PCR برای تعیین توالی به شرکت Bioneer در کره فرستاده شد و توالی‏های به دست‌آمده با نرم‌افزار  Chromas Pro بررسی شد و با توالی‏های ثبت‌شده در پایگاه اطلاعات ژنومیEzTaxon  مقایسه شد و نزدیک‌ترین سویه‌ها با ترادف SrRNA16 مشابه با سویۀ منتخب تعیین شد.

.

نتایج.

غنی‏سازی و رسم منحنی رشد: در هر بار غنی‌سازی، پس از یک هفته در هر 10 نمونۀ شور آلوده و غیرآلودۀ استفاده‌شده، کدورت ناشی از رشد مشاهده شد و وجود باکتری‏ها از طریق رنگ‌آمیزی گرم، تأیید شد (تصاویر میکروسکوپی تعدادی از نمونه‏ها در شکل 1 نشان داده شده است).

 

 

   

1

2

شکل 1- شماره 1، تصویری از مقایسۀ محیط کشت شاهد و محیط نمونۀ آلودۀ قم پس از یک هفته غنی‌سازی؛ شماره 2، تصویر میکروسکوپی رنگ‌آمیزی گرم کنسرسیوم میکروبی نمونۀ خاک آلودۀ قم

 

نحوۀ رشد هر کنسرسیوم‏ میکروبی بررسی شد و منحنی رشد آن براساس جذب در طول موج 620 نانومتر رسم شد. به‌منظور مقایسۀ سرعت و مقدار رشد کنسرسیوم‏های میکروبی جداسازی‌شده از نمونه‏های آلوده با غیرآلوده، منحنی‏های رشد کنسرسیوم‏های 4 نمونۀ خاک آلوده با هر یک از 6 کنسرسیوم میکروبی نمونۀ غیرآلوده، در کنار هم در یک نمودار رسم شدند (شکل 2). همان‌طور که در نمودار‏ مشاهده می‏شود، کنسرسیوم‏های میکروبی به‌دست‌آمده از نمونه‏های آلوده، سریع‏تر به فاز لگاریتمی رسیده و همچنین مقدار تراکم نهایی آن‏ها (مقدار جذب در طول موج 620 نانومتر) بیشتر از نمونه‏های غیرآلوده است (جدول 2).

.تخمین تراکم سلولی هر کنسرسیوم میکروبی:

1-       پروتئین‌سنجی به‌روش بردفورد

همان‏طور که نشان داده شده‏است، مقدار پروتئین محاسبه‌شده در هر یک از کنسرسیوم‏های میکروبی، با یکدیگر در یک نمودار آورده شد (شکل 3). در این نمودار می‏توان با مقایسۀ غیرمستقیم تراکم سلولی هر یک از کنسرسیوم‏های میکروبی، توانمندی آن‏ها برای رشد در حضور گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن و تجزیۀ این آلاینده را تخمین زد. در بین کنسرسیوم‏های میکروبی، کشت‏های غنی‌شده از نمونه‏های خاک آلودۀ خارک و قم، به‌ترتیب با mg/ml 213/0 و mg/ml 192/0 بیشترین مقدار محتوای پروتئین را نشان دادند.

 

 

 

شکل 2- مقایسۀ منحنی‏های رشد کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده

جدول 2- نتایج شمارش باکتری‏های هتروتروف و تجزیه‌کنندۀ گازوئیل در کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده و نمونه‏های اصلی بر روی محیط R2A و بوشنل هس

نام نمونه

کنسرسیوم میکروبی

نمونۀ اصلی

OD620 نهایی کنسرسیوم‏های میکروبی بر روی محیط مایع بوشنل هس پس از یک هفته

(محیط کشت R2A)

(محیط کشت بوشنل هس همراه با گازوئیل)

(محیط کشت R2A)

(محیط کشت بوشنل هس همراه با گازوئیل)

خاک آلودۀ قم

CFU/mL 1015×9/1

CFU/mL 1015×9/1

103× 9/1

CFU/gram soil

1012×5/4

CFU/gram soil

1/3

خاک آلودۀ استخر هرزآب خانگیران

CFU/mL 1013×2

CFU/mL  1015×6/1

107×1/3

CFU/gram soil

107×1/3

CFU/gram soil

4/4

خاک آلودۀ خارک

CFU/mL 1012×9/2

CFU/mL 1014×8/1

104×8/6

CFU/gram soil

108×3/3

CFU/gram soil

8/3

خاک شور آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران

CFU/mL 107×5/1

CFU/mL 1015×9/1

105×9

CFU/gram soil

108×9/7

CFU/gram soil

5/3

خاک شور ارومیه

CFU/mL 1014×7/4

CFU/mL 1010×6/2

105×6

CFU/gram soil

106×4/4

CFU/gram soil

3/3

خاک شور میغان

CFU/mL 1010×4/9

CFU/mL 1013×3/2

106×3/2

CFU/gram soil

105×7/4

CFU/gram soil

8/3

خاک شور اشتهارد

CFU/mL 1014×8/1

CFU/mL 1012×1/1

108×3/4

CFU/gram soil

107×2/8

CFU/gram soil

1/4

آب شور ارومیه

CFU/mL 107×3/1

CFU/mL 108×6/1

103×5/3

CFU/mL

103×6

CFU/mL

3/3

آب شور میغان

CFU/mL 1010×4/1

CFU/mL 108×9/1

106×3/5

CFU/ mL

106×8/1

CFU/mL

7/2

آب شور اشتهارد

CFU/mL 109×2/1

CFU/mL 108×3/1

104×9/3

CFU/mL

109×8

CFU/mL

8/0

 

 

شکل3- مقایسۀ مقدار پروتئین و OD595 نمونه‏های مختلف با یکدیگر براساس پروتئین‌سنجی بردفورد


2-       شمارش باکتری‏های هتروتروف و تجزیه‌کنندۀ گازوئیل

جدول 2، نتایج حاصل از شمارش باکتری‏های هتروتروف و تجزیه‌کنندۀ گازوئیل در کنسرسیوم‏های میکروبی به‌دست‌آمده را نشان می‏دهد. همان‌گونه که مشخص است تعداد باکتری‏های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل در کنسرسیوم‏های میکروبی حاصل از نمونه‏های آلوده به نفت، در مقایسه با نمونه‏های غیرآلوده، به‌میزان قابلِ‌توجهی بیشتر است. ازآنجایی‌که تراکم باکتریایی نمونه‏های آلوده به نفت، از سایر نمونه‏های آب و خاک بیشتر است، این نمونه‏ها برای بررسی‏های بیشتر در مراحل بعد انتخاب شدند.

بررسی ویژگی‏های ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیک سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی:

ویژگی‏های ریخت‌شناسی و بیوشیمیایی سویه‏های بررسی‌شده و همچنین  نتایج حاصل از نمک‏دوستی و تحمل‏پذیری نمک نیز در جدول 3 آورده شده است.

 

 

تنوع کلنی‏های حاصل از رشد رقت‏های مشابه از نمونه‏های اصلی خاک و آب و کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده از آن‏ها بر روی محیط R2A نیز بایکدیگر مقایسه شد که تصاویر تعدادی از آن‏ها در شکل 4 آورده شده است. همان‌طور که در شکل مشاهده می‏شود، تنوع کلنی‏ها در نمونه‏های اصلی آب و خاک بیشتر از تنوع آن‏ها در کنسرسیوم‏های  میکروبی غنی‌شده است؛ درحالی‌که تراکم آن‏ها، در کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده بیشتر است.

شناسایی فیلوژنتیکی سویه‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از نمونه‏های آلوده به نفت: جهت بررسی‏های فیلوژنتیکی، تعیین توالی ژن 16SrRNA برای هر 4 سویه، با استفاده از پرایمر رفت (27F)، انجام شد. جدول 3 نتایج شناسایی مولکولی سویه‏های منتخب و میزان شباهت آن‏ها با نزدیک‏ترین گونه‏های شناخته‌شده را نشان می‏دهد. شکل ۵ درخت فیلوژنی ترسیم‌شده برای باکتری‏های ذکر‌شده در جدول 3 را نشان می‌دهد.

 

   

1

2

شکل 4-  شماره‏های 1 و 2، به‌ترتیب خاک آلوده و کنسرسیوم میکروبی غنی‏سازی‌شده از نمونۀ قم، در رقت3-10 بر روی محیط R2A

 

 

 

جدول 3- مقایسۀ توالی ژن S rRNA 16سویه ‏های غالب کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از نمونه‏های آلوده به نفت با بانک ژن با استفاده از ابزار BLAST

نام سویه

نزدیک‏ترین سویه

درصد شباهت

واکنش به رنگ‌آمیزی گرم

تست KOH  3%

تست کاتالاز

تست اکسیداز

نمک‏دوست یا تحمل‏پذیر نمک

Q (سویۀ غالب خاک آلودۀ قم)

Dietzia schimae

YIM 65001(T)

100

+ کوکوس

-

+

-

تحمل‏پذیر نمک

P3 (سویۀ غالب پوند3پالایشگاه تهران)

Salinicola salarius

M27(T)

100

-  باسیلوس

+

+

-

تحمل‏پذیر نمک

HKH (سویۀ غالب استخرهرزاب خانگیران)

Microbacterium lindanitolerans MNA2(T)

98.5

+ کوکوس

-

+

-

نمک‏دوست

KH (سویۀ غالب خاک آلودۀ خارک)

Microbacterium indicum BBH6(T)

98

+ کوکوس

-

+

+

تحمل‏پذیر نمک

 

شکل 5-  درخت فیلوژنی باکتری‏های تعیینِ‌توالی‌شده با استفاده از روش Neighbour-joining، Alcaliflexus imshenetskii DSM 15055T  به‌عنوان outgroup در نظر گرفته شده و اعداد ذکرشده در بخش انشعاب، نشان‌دهندۀ بوت استرپ از 1000 نمونه است. مقادیر بوت استرپ کمتر از 50 نشان داده نشده است.


 

 

بحث و نتیجه‏‏ گیری.

تخلیۀ کنده‏های حفاری به‌عنوان یکی از آلاینده‏های مهم در طی فعالیت حفاری چاه‏های نفت و گاز به محیط زیست و بدون هیچ تیماری، مشکلات مهمی برای خاک، آب‏های زیرزمینی و سلامت انسان ایجاد می‌کند. پاکسازی زیستی را بسیاری از پژوهشگران، به‌علت هزینۀ مقرون‌به‌صرفه و ایجادنکردن آلودگی ثانویه، تأیید کرده‌اند و مطالعات زیادی در زمینۀ پاکسازی پسماند‏های حفاری با استفاده از میکروارگانیسم‏ها انجام شده است (21).

در حال حاضر، به‌طور کلی جامعه علمی پذیرفته ‏است که هیچ تک‌گونه‏ای از میکروارگانیسم‏ها، نمی‏‏تواند به‌طور کامل بخشی از نفت را تجزیه کند. تجزیۀ نفت خام، نفت تصفیه‌شده و یا مشتقات آن‏ها، نیاز به کنسرسیومی از میکروارگانیسم‏ها دارد (22). از دیدگاه کاربردی، استفاده از یک کنسرسیوم میکروبی به‌جای کشت خالص با‏صرفه‏تر است؛ زیرا تنوع متابولیکی و توانمندی موردِنیاز برای کاربرد در محیط طبیعی را داراست (23).

استفاده از روش غنی‏سازی انتخابی و جداسازی کنسرسیوم میکروبی نسبت به کشت‏های خالص باکتریایی، به‌منظور کاربرد آن در پاکسازی زیستی، در بسیاری از مطالعات مشابه انجام شده و موفقیت‌آمیز بوده است. به‌عنوان مثال، دستغیب[xiii] و همکارانش، کنسرسیوم میکروبی نمک‌دوست تجزیه‌کنندۀ‏ هیدروکربن‏های نفتی در غلظت‏های بالای نمک را جداسازی کردند که یک سویۀ قابلِ‌کشت از جنس Halomonas  و یک سویۀ غیرقابلِ‌کشت از جنس Marinobacter به‌عنوان اعضای آن، شناسایی شدند و قادر به تجزیۀ فنانترن در غلظت 15درصد نمک NaCl بودند (24).

ریس[xiv] و همکارانش، کنسرسیوم‏های میکروبی نمک‏دوست از نمونه‏های خاک شور جداسازی کردند که قادر به تجزیۀ گازوئیل در غلظت‏های  NaCl۰تا۱۵درصد و متشکل از جنس‏های Cellulomonas، Bacillus، Dietzia و  Halomonas بود (25).

شارما[xv] و همکارانش نشان دادند که کنسرسیوم باکتریایی (متشکل از جنس‏های Moraxella، Alteromonas، Klebsiella و Pseudomonas) گازوئیل بیشتری را نسبت به کشت‏های خالص از باکتری‏ها (مانند Klebsiella) تجزیه می‌کنند (25).

بنتو[xvi] و همکارانش، پاکسازی زیستی از طریق سه روش تلقیح و تحریک زیستی و تضعیف طبیعی را بررسی کردند و نشان دادند که تحریک زیستی به‌ویژه با استفاده از کنسرسیومی از باکتری‏ها (در این پژوهش غالباً متشکل از Bacillus، Pseudomonas و Acinetobacter) بیشترین مقدار تجزیه برای گازوئیل را نشان می‌دهد (26).

در این پژوهش، پس از سپری‌شدن مرحلۀ غنی‌سازی، همان‌طور که منحنی‏های رشد و همچنین نتایج حاصل از رنگ‌آمیزی گرم نشان می‌دهند، از هر 10 نمونۀ آلوده و غیرآلودۀ شور، کنسرسیوم‏های میکروبی دارای قابلیت تجزیۀ گازوئیل در غلظت 7درصد NaCl جداسازی شدند. ازآنجایی‌که هیدروکربن‏ها را پیش از ورود آلاینده‏های نفتی، فیتوپلانکتون‏ها وگیاهان و فرآیند‏های مختلف آبی و خاکی در طبیعت تولید می‌کردند، باکتری‏ها در طول تکامل برای تجزیۀ هیدروکربن‏ها سازگار می‌شدند‏ و درنتیجه جداسازی کنسرسیوم‏های باکتریایی تجزیه‌کنندۀ گازوئیل از محیط‏های بدون سابقۀ آلودگی، تعجب‌آور نخواهد بود (27).

بررسی منحنی‏های رشد مقایسه‏ای نشان می‏دهد که کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده از نواحی آلوده به نفت، سرعت رشد بیشتری نسبت به نمونه‏های غیرآلوده دارند، سریع‌تر به فاز لگاریتمی می‏رسند و می‏توانند تنها منبع کربن موجود در محیط را استفاده کنند. درنهایت کدورت و تراکم سلولی بیشتری نیز در آن‏ها ایجاد می‌شود و همان‏طور که در مطالعات گذشته نیز بررسی شده است، علت این پدیده آن است که جوامع باکتریایی در محیط‏های دارای سابقۀ آلودگی‏های نفتی، به تجزیۀ این ترکیبات در طولانی‌مدت سازگار می‌شوند و گروهی از باکتری‏ها که قادر به استفاده از هیدروکربن‏های نفتی هستند، جوامع غالب در این مکان‏ها خواهند شد (28 و 29).

در بین کنسرسیوم‏های میکروبی جداسازی‌شده از نمونه‏های غیرآلوده، مقدار تراکم نهایی و سرعت رشد کنسرسیوم میکروبی جداشده از خاک شور اشتهارد، قابلِ‌رقابت با نمونه‏های آلوده بود که با توجه به تراکم میکروبی بالای آن در ابتدا (جدول 2)، تا حدودی قابلِ‌توجیه است. از طرفی، با اینکه در این منطقه، آلودگی نفتی وجود ندارد ممکن است به‌علت گستردگی زمین‏های کشاورزی در آن و تردد وسایل نقلیه، آلودگی‌های خفیفی ایجاد شده باشند و این آلودگی‌ها در طولانی‌مدت منجر به سازگاری جوامع باکتریایی محل نمونه‌برداری و درنتیجه حذف ترکیبات هیدروکربنی شود که می‏توانند سریع‏تر از سایر نمونه‏های غیرآلوده، منبع کربن محیط را استفاده کنند.

از طرفی، ویژگی‏های ریخت‌شناسی کلنی‌های رشدیافته در رقت‏های اولیۀ کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده در مقایسه با نمونه‏های اصلی (شکل 4)، نشان‌دهندۀ آن است که تنوع کلنی‏ها در نمونه‏های اصلی خاک و آب، نسبت به تنوع آن در کنسرسیوم‏های میکروبی غنی‌شده، بیشتر است اما تعداد کلی کلنی‏ها (تراکم سلولی) به‌دلیل چندین مرحلۀ غنی‌سازی، در کنسرسیوم‏های میکروبی جداشده بالاتر بود. با اختصاصی‌کردن منبع کربن و درصد نمک، تنوع باکتری‌های قادر به رشد در این شرایط کاهش خواهند یافت (30).

همان‌طور که در جدول 3 نشان داده شده است، کنسرسیوم میکروبی جداسازی‌شده از خاک آلودۀ قم، دارای بیشترین تراکم سلولی نسبت به سایر کنسرسیوم‏های میکروبی است. تراکم بالای سلولی این کنسرسیوم در محیط بوشنل هس که تنها منبع کربن آن گازوئیل است، می‏تواند نشان‌دهندۀ توانمندی بیشتر میکروفلور آن در تجزیۀ گازوئیل نیز باشد. از طرفی، خود نمونۀ خاک آلودۀ قم، بر روی محیط R2A، دارای کمترین تراکم سلولی است. می‌توان چنین نتیجه گرفت که ازآنجایی‌که منشأ آلودگی این محیط، نشت قدیمی نفت در این مکان بوده است، جوامع باکتریایی غالب این نمونۀ خاک آلوده، همان‌طور که در مطالعۀ (31) نشان داده شده است، از انواع تجزیه‌کننده‌های اجباری هیدروکربن‏ها هستند که تنها در حضور هیدروکربن‏ها قادر به رشد هستند.

به علاوه، در روش پروتئین‌سنجی که می‏توان به‌طور غیرمستقیم تراکم سلولی باکتری‏ها را سنجید، کنسرسیوم میکروبی حاصل از خاک آلودۀ قم، دارای غلظت پروتئین قابلِ‌توجهی بود؛ بنابراین، سابقۀ شوری و آلودگی مکان نمونه‌برداری، در نتایجی که در پاکسازی مشاهده می‌شود، بسیار تأثیرگذار است.

با نتایج به‌دست‌آمده از این مطالعه، کنسرسیوم میکروبی جداسازی‌شده از خاک شور آلودۀ قم دارای پتانسیل بالایی برای کاربرد در پاکسازی زیستی گل‏های حفاری آلوده به گازوئیل است.

با توجه به بررسی‏هایی که محققان انجام‌ داده اند، شاخص‏ترین باکتری‏های تجزیه‌کنندۀ هیدروکربن‏های نفتی که تاکنون گزارش شده‏اند در اغلب موارد ازحوزه‏های نفتی، آب تولیدشده و سایر محیط‏های شور آلوده به نفت جدا‏سازی شده‏اند و متعلق به شاخه‏های Actinobacteria و Gamaproteobacteria هستند (7، 32-35). در این پژوهش در بین سویه‏های غالب جداشده از نمونه‏های آلوده به نفت، 3 سویه متعلق به شاخۀ Actinobacteria بودند که با بررسی‏های پیشین هم‌خوانی دارد. بررسی‏های فیلوژنتیکی هر یک از سویه‏ها و سابقۀ گزارش آن‏ها در زمینۀ تجزیۀ زیستی هیدروکربن‏های نفتی و یا گازوئیل، در زیر آمده است.

تعیین توالی ژن 16sr RNAو شناسایی سویۀ غالب کنسرسیوم میکروبی قم، نشان داد که این سویه با 100درصد شباهت، متعلق به گونۀ Dietzia schimae است. از این گونه، تا کنون چندین گزارش مبنی بر تجزیۀ نفت مشاهده شده است (36). تاکنون گزارش‌های فراوانی در زمینۀ جداسازی گونه‏های مختلف این جنس، از محیط‏های خاکی آلوده به هیدروکربن‏های نفتی داده شده است و ازآنجایی‌که گازوئیل نیز ترکیبی متشکل از هیدروکربن‏های بلندزنجیره (C18-C25) است، جداسازی گونه‏ای از جنس Dietzia، از خاک آلوده به نفت قم، با نتایج پژوهش‏های پیشین هم‌خوانی دارد.  به‌عنوان مثال، گونۀ D. cinnamea strain P4 (قادر به تجزیۀ آلکان‏های C11-C36) و نیز Dietzia sp. E1 (تجزیه‌کنندۀ اجزای آلکان نفت خام (C12-C38) D.maris  (36 و 37) از محیط‏های خاکی آلوده به نفت، جداسازی شده‏اند.

سویۀ غالب کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ پوند 3 پالایشگاه تهران پس از بررسی‏های فیلوژنتیکی، شباهت 100درصد با گونۀ Salinicola salarius نشان داد. این گونه را کیم[xvii] و همکارانش، در سال ۲۰۰۷ با عنوان Halomonas salaria از آب شور جداسازی کردند و نام آن را رفائل[xviii] و همکارانش در سال ۲۰۱۰ به Salinicola salariusتغییر دادند (38, 39). الیورا[xix] و همکارانش، جداسازی سویه‏ای با 6/98درصد به H. salaria از رسوبات اعماق دریا با سابقۀ مواجهه با ترکیبات هیدروکربنی گزارش داده‏اند که قادر به تولید امولسیفایر است (40).

سویه‌های غالب جداشده از کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ خارک، با 98درصد شباهت، به گونۀ Microbacterium indicum نزدیک است. به‌علاوه، سویۀ غالب جداشده از کنسرسیوم میکروبی خاک آلودۀ استخر هرزاب خانگیران نیز با 5/98درصد شباهت به گونۀ Microbacterium lindanitoleransنسبت داده شد. M. lindanitoleransبرای اولین بار، از خاک آلوده به هگزاکلروسیکلوهگزان در سال 2010 (41) و M. indicum در سال 2007 از رسوبات اعماق دریا جداسازی شده‏اند (42). تا کنون گزارشی در زمینۀ توانمندی تجزیۀ نفت یا مشتقات آن توسط M. indicum مشاهده نشده است. گونه‏های مختلف جنس Microbacteriumبه‌عنوان اعضایی از کنسرسیوم‏های باکتریایی از خاک‏های آلوده به مواد بیگانه با محیط زیست[xx] مانند رنگ‌ها، فلزات مانند روی و کادمیم و نیز آفت‌کش‌ها (M. oxydans) جداسازی شده‌اند (41 و 43). به‌علاوه گونه هایی از جنس Microbacterium مانند M. hydrocarbonoxydans  (44
 M. aoyamense و M. oxydans (45) و M. foliorum (36)، از مناطق مختلفی جدا شده‏اند که قادر به تجزیۀ PAHها، هیدروکربن‏های نفتی و نفت خام به‌عنوان منبع کربن هستند.

درمجموع، پاکسازی زیستی کنده‏های حفاری به‌عنوان یکی از پسماند‏های آلاینده‏ در صنعت نفت، اهمیت زیادی دارد و دست‌یابی به کنسرسیوم‌های میکروبی و سویه‌های توانمند در تجزیۀ سریع‏تر و بیشتر هیدروکربن‏ها، به پاکسازی مؤثرتر این پسماند کمک خواهد کرد. همان‏طور که در این پژوهش نیز نشان داده شد، محیط‏های با سابقۀ آلودگی نفتی، به‌علت سازگاری طولانی‌مدت میکروارگانیسم‏ها به حضور آلاینده‏ها، در مقایسه با نمونه‏های غیرآلوده ظرفیت بالقوه بیشتری برای جداسازی کنسرسیوم‏های تجزیه‌کننده دارند و در بین کنسرسیوم‏های غنی‌شده، کنسرسیوم میکروبی جدشده از خاک آلودۀ قم، می‌تواند در پژوهش‏های بعدیِ پاکسازی زیستی کنده‏های حفاری در مقیاس بالاتر در محیط خاک در استفاده شود.

 



[1]- Bioremediation

[2]- Biostimulation

[3] Bioaugmentation

[4]- Synergistic

[5]- Bushnell Haas (BH)  

[6]- Bradford

[7]- Coomassie Brilliant Blue G-250

[8]- Bovine serum albumin )BSA)

[9]- Hucker

[10]- Baron

[11]- Marmur

[12]- Polymerase Chain Reaction (PCR)

[xiii]- Dastgheib

[xiv]- Riis

[xv]- Sharma

[xvi]- Bento

[xvii]- Kim

[xviii]- Rafael

[xix]- Olivera

[xx]- Xenobiotic

 

(1)              Kebria DY, Khodadadi A, Ganjidoust H, Badkoubi A, Amoozegar M. Isolation and characterization of a novel native Bacillus strain capable of degrading diesel fuel. International Journal of Environmental Science & Technology. 2009; 6(3): 435-42.

(2)              Agwu OA, Ilori MO, Nwachukwu SU. Utilization of Drilling Fluid Base Oil Hydrocarbons by Microorganisms Isolated from Diesel-Polluted Soil. Soil and Sediment Contamination: An International Journal. 2013; 22(7): 817-28.

(3)              Souza F, Salgueiro A, Albuquerque C. Production of bioemulsifiers by Yarrowia lipolytica in sea water using diesel oil as the carbon source. Brazilian Journal of Chemical Engineering. 2012; 29(1): 61-7.

(4)              Chandra S, Sharma R, Singh K, Sharma A. Application of bioremediation technology in the environment contaminated with petroleum hydrocarbon. Annals of Microbiology. 2013; 63(2): 417-31.

(5)              van der Heul R. Environmental degradation of petroleum hydrocarbons. Utrecht University journal. 2009; 53p.

(6)              Gallego JL, Loredo J, Llamas JF, Vázquez F, Sánchez J. Bioremediation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation. Biodegradation. 2001; 12(5): 325-35.

(7)              Dastgheib SMM, Amoozegar MA, Khajeh K, Ventosa A. A halotolerant Alcanivorax sp. strain with potential application in saline soil remediation. Applied microbiology and biotechnology. 2011; 90(1): 305-12.

(8)              McGenity T. Halophilic hydrocarbon degraders. In: Timmis, Kenneth N.
McGenity, Terry J., Meer, Jan Roelof, de Lorenzo, Victor editors.Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. Verlag Berlin Heidelberg: Springer; 2010: 1939-51.

(9)              García MT, Ventosa A, Mellado E. Catabolic versatility of aromatic compound‐degrading halophilic bacteria. FEMS microbiology ecology. 2005; 54(1): 97-109.

(10)          El-Gendy NS, Farah JY. Kinetic modeling and error analysis for decontamination of different petroleum hydrocarbon components in biostimulation of oily soil microcosm. Soil and Sediment Contamination. 2011; 20(4): 432-46.

(11)          Liu W, Luo Y, Teng Y, Li Z, Ma LQ. Bioremediation of oily sludge-contaminated soil by stimulating indigenous microbes. Environmental geochemistry and health. 2010; 32(1): 23-9.

(12)          Sarkar D, Ferguson M, Datta R, Birnbaum S. Bioremediation of petroleum hydrocarbons in contaminated soils: comparison of biosolids addition, carbon supplementation, and monitored natural attenuation. Environmental pollution. 2005; 136(1): 187-95.

(13)          Tsai T, Kao C, Surampalli RY, Chien H. Enhanced bioremediation of fuel-oil contaminated soils: laboratory feasibility study. Journal of Environmental Engineering. 2009; 135(9): 845-53.

(14)          Wongsa P, Tanaka M, Ueno A, Hasanuzzaman M, Yumoto I, Okuyama H. Isolation and characterization of novel strains of Pseudomonas aeruginosa and Serratiamarcescens possessing high efficiency to degrade gasoline, kerosene, diesel oil, and lubricating oil. Current microbiology. 2004; 49(6): 415-22.

(15)          Mukherjee AK, Bordoloi NK. Bioremediation and reclamation of soil contaminated with petroleum oil hydrocarbons by exogenously seeded bacterial consortium: a pilot-scale study. Environmental Science and Pollution Research. 2011; 18(3): 471-8.

(16)          Burgess RR, Deutscher MP. Guide to protein purification: Academic Press; 2009.

(17)          Kleinsteuber S, Riis V, Fetzer I, Harms H, Müller S. Population dynamics within a microbial consortium during growth on diesel fuel in saline environments. Applied and environmental microbiology. 2006; 72(5): 3531-42.

(18)          Gerhardt P, Wood WA, Krieg NR. Methods for general and molecular bacteriology. Washington : American Society for Microbiology; 1994.

(19)          Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. Journal of Molecular Biology. 1-208: (2)3; 961IN1.

(20)          Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, et al. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA. Applied and environmental microbiology. 1998; 64(2): 795-9.

(21)          Chang Y, Wang X, Han Y, Wang M, Zheng C, Wang Y, et al., editors. The Removal of Crude Oil in Waste Drilling Muds by a Constructed Microbial Consortium, Proceedings of the 2012 International Conference on Applied Biotechnology (ICAB 2012). Berlin Heidelberg: Springer; 2014.

(22)          Balba M, Al-Awadhi N, Al-Daher R. Bioremediation of oil-contaminated soil: microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation. Journal of microbiological methods. 1998; 32(2): 155-64.

(23)          Tyagi M, da Fonseca MMR, de Carvalho CC. Bioaugmentation and biostimulation strategies to improve the effectiveness of bioremediation processes. Biodegradation. 2011; 22(2): 231-41.

(24)          Dastgheib SMM, Amoozegar MA, Khajeh K, Shavandi M, Ventosa A. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a halophilic microbial consortium. Applied microbiology and biotechnology. 2012; 95(3): 789-98.

(25)          Riis V, Kleinsteuber S, Babel W. Influence of high salinities on the degradation of diesel fuel by bacterial consortia. Canadian journal of microbiology. 2003; 49(11): 713-21.

(26)          Bento FM, Camargo FA, Okeke BC, Frankenberger WT. Comparative bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation. Bioresource technology. 2005; 96(9): 1049-55.

(27)          Marchal R, Penet S, Solano-Serena F, Vandecasteele J. Gasoline and diesel oil biodegradation. Oil & gas science and technology. 2003; 58(4): 441-8.

(28)          Okoh AI. Biodegradation alternative in the cleanup of petroleum hydrocarbon pollutants. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2006; 1(2): 38-50.

(29)          Evans FF, Rosado AS, Sebastián GV, Casella R, Machado PL, Holmström C. et al. Impact of oil contamination and biostimulation on the diversity of indigenous bacterial communities in soil microcosms. FEMS microbiology ecology. 2004; 49(2): 295-305.

(30)          Margesin R, Schinner F. Biodegradation and bioremediation of hydrocarbons in extreme environments. Applied microbiology and biotechnology. 2001; 56(5-6): 650-63.

(31)          Yakimov MM, Timmis KN, Golyshin PN. Obligate oil-degrading marine bacteria. Current opinion in biotechnology. 2007; 18(3): 257-66.

(32)          Wang Y-N, Cai H, Chi C-Q, Lu A-H, Lin X-G, Jiang Z-F, et al. Halomonas shengliensis sp. nov., a moderately halophilic, denitrifying, crude-oil-utilizing bacterium. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2007; 57(6): 1222-6.

(33)          Mnif S, Chamkha M, Sayadi S. Isolation and characterization of Halomonas sp. strain C2SS100, a hydrocarbon‐degrading bacterium under hypersaline conditions. Journal of applied microbiology. 2009; 107(3): 785-94.

(34)          Zvyagintseva I, Poglazova M, Gotoeva M, Belyaev S. Effect on the medium salinity on oil degradation by nocardioform bacteria. Microbiology. 2001; 70(6): 652-6.

(35)          Kuznetsov V, Zaitseva T, Vakulenko L, Filippova S. Streptomyces-albiaxialis sp-nov-a new petroleum hydrocarbon-degrading species of thermotolerant and halotolerant streptomyces. Microbiology. 1992; 61(1): 62-7.

(36)          Amirasheva B. Evaluating the destructive activity and phytotoxicity of oil oxidizing strains of microorganisms isolated from oil-contaminated soils in Kyzylorda region. Микробиология және вирусология.16.

(37)          Pleshakova E, Dubrovskaya E, Turkovskaya O. Efficiencies of introduction of an oil-oxidizing Dietzia maris strain and stimulation of natural microbial communities in remediation of polluted soil. Applied Biochemistry and Microbiology. 2008; 44(4):389-95.

(38)          Kim KK, Jin L, Yang HC, Lee S-T. Halomonas gomseomensis sp. nov., Halomonas janggokensis sp. nov., Halomonas salaria sp. nov. and Halomonas denitrificans sp. nov., moderately halophilic bacteria isolated from saline water. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2007; 57(4): 675-81.

(39)          Rafael R, Sánchez-Porro C, Márquez MC, Ventosa A. Taxonomic study of the genus Salinicola: transfer of Halomonas salaria and Chromohalobacter salarius to the genus Salinicola as Salinicolasalarius comb. nov. and Salinicola halophilus nom. nov., respectively. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2010; 60(4): 963-71.

(40)          Olivera NL, Nievas ML, Lozada M, del Prado G, Dionisi HM, Siñeriz F. Isolation and characterization of biosurfactant-producing Alcanivorax strains: hydrocarbon accession strategies and alkane hydroxylase gene analysis. Research in microbiology. 2009; 160(1): 19-26.

(41)          Lal D, Gupta SK, Schumann P, Lal R. Microbacterium lindanitolerans sp. nov., isolated from hexachlorocyclohexane-contaminated soil. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2010; 60(11): 2634-8.

(42)          Shivaji S, Bhadra B, Rao RS, Chaturvedi P, Pindi PK, Raghukumar C. Microbacterium indicum sp. nov., isolated from a deep-sea sediment sample from the Chagos Trench, Indian Ocean. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2007; 57(8): 1819-22.

(43)          Dutra ES, Pascon RC, Vallim MA. So Paulo Zoo composting as a source of bacteria with bioremediation potential. African Journal of Microbiology Research. 2013; 7(45): 5200-6.

(44)          Schippers A, Bosecker K, Spröer C, Schumann P. Microbacterium oleivorans sp. nov. and Microbacterium hydrocarbonoxydans sp. nov., novel crude-oil-degrading Gram-positive bacteria. International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2005; 55(2): 655-60.

(45)          Wang W, Wang L, Shao Z. Diversity and abundance of oil-degrading bacteria and alkane hydroxylase (alkB) genes in the subtropical seawater of Xiamen Island. Microbial ecology. 2010; 60(2): 429-39.