بهینه‏ سازی تولید نشاسته توسط جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی با روش سطح پاسخ

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد زیست‌شناسی گیاهی، جهاد دانشگاهی مازندران، ایران

2 کارشناس ارشد بیوشیمی، جهاد دانشگاهی مازندران، ایران

3 دکتری شیمی تجزیه، جهاد دانشگاهی مازندران، ایران

4 استاد زیست‌شناسی گیاهی، پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی، تهران، ایران

5 کارشناس میکروبیولوژی، جهاد دانشگاهی مازندران، ایران

چکیده

مقدمه: ریزجلبک سبز کلامیدوموناس رینهاردتی[i] به‌عنوان سیستم مدل جلبکی در پژوهش‌های فیزیولوژی، مورفولوژی، ژنتیک و سوخت‏های زیستی مورد توجه است‏‏‏. هدف از انجام این مطالعه بهینه‎سازی شرایط رشد و تولید نشاسته توسط این جلبک است. با این نگرش، تأثیر pH و شدت‎های نوری بر جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی بررسی شد‏. ‏‏
مواد و روش‏‏ها: بدین منظور تأثیر توأم عوامل pH و شدت نور بر رشد و تولید نشاسته توسط نرم‏افزار دیزاین اکسپرت[ii] و روش سطح پاسخ ارزیابی شد. میزان نرخ رشد با اندازه‌گیری وزن خشک و مقدار نشاسته با استفاده از روش اسپکتروفتومتری  ارزیابی شد‏‏‏. ‏‏
نتایج: با تجزیه و تحلیل نمودار سطح پاسخ و حل معادلۀ به‌دست‌آمده ، مقدار بهینه pH و شدت نور برای رسیدن به حداکثر نرخ رشد، به‌ترتیب 4/7 و 7400 لوکس و به‌منظور دستیابی به حداکثر میزان نشاسته 8 و 5300 لوکس تعیین شد. ‏
بحث و نتیجه‌گیری: نتایج نشان می‌دهد که شدت نور و pH نقش مهمی در تولید نشاسته و نرخ رشد در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی دارند. علاوه بر این، مشخص شد که روش سطح پاسخ به‌منظور افزایش تولید نشاسته در این ریزجلبک مفید است‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of starch production by Chlamydomonas reinhardtii using response surfaces methodology

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Gholizadeh 1
  • Tahereh Ghonbari 2
  • Vahid Sharifi 3
  • Neda Soltani 4
  • Seyed Mohammad Alavi 5
1 M.Sc. of Plant biology, Academic Center for Education, Culture & Research (ACECR), Mazandaran, Iran
2 M.Sc. of Biochemistry, Academic Center for Education, Culture & Research (ACECR), Mazandaran, Iran
3 PhD of Analytical chemistry, Academic Center for Education, Culture & Research (ACECR), Mazandaran, Iran
4 Professor of plant biology, Research Institute of Applied Science, ACECR, Tehran, Iran. Research Center of Environment and Sustainable Development, Tehran, Iran
5 B.Sc. of Microbiology, Academic Center for Education, Culture & Research (ACECR), Mazandaran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Green microalga Chlamydomonas reinhardetii is concerned as a model system to study algal physiology, morphology, genetics and biofuel production. The aim of this study was optimization of the growth and starch production conditions. With this respect, the effect of pH and light intensities was investigated in alga Chlamydomonas reinhardetii.
Materials and methods: The combination effect of these factors on growth and starch production was evaluated by design-Expert software and response surface method. The growth rate and starch content were evaluated using dry weight and spectrophotometric method respectively.
Results: Regarding to the response surface curve, maximum growth rates and starch content were achieved at pH 7.4 and 8; and light intensity 7400 and 5300 lux respectively.
Discussion and conclusion: Results showed that light intensity and pH play an important role in starch productivity of Chlamydomonas reinhardtii. Moreover, it was found that the response surface methodology was useful for enhancing the starch production in the algae.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Chlamydomonas reinhardetii
  • Growth rate
  • Optimization of culture conditions
  • Response surface method
  • starch

مقدمه.  

جلبک‏ها موجودات تک‌سلولی یا چندسلولی هستند که با انجام فتوسنتز قادر به تولید مواد غذایی هستند. عوامل محیطی مانند دما، نور، pH و مواد مغذی علاوه بر تأثیر بر فتوسنتز و نرخ رشد جلبک، بر فعالیت متابولیسم سلولی و ترکیبات آن نیز مؤثرند (1). در میان این عامل‏‏ها، تنظیم نور به‌دلیل اثر مستقیم بر مکانیسم‏های فتوسنتزی، عامل‏‏ مهمی در تعیین شرایط بهینه برای کشت محسوب می‏شود. در حضور مواد مغذی، راندمان کشت ریزجلبک‏ها به‌طور عمده توسط شدت نور و دما کنترل می‏شود (2).

هیدروژن، از جمله ترکیباتی است که جلبک تولید می‌کند و می‏تواند به‌عنوان منبع انرژی در نظر گرفته شود‏‏‏. جلبک‏ها برای تولید هیدروژن، از متابولیت‏هایی مانند نشاسته و گلوکز در فرایند کاتابولیسم استفاده می‏کنند (3). براساس گزارش‏های ارائه‌شده، گونه‏های کلامیدوموناس، کلرلا[1]، سندسموس[2] و چندین گونه سیانوباکتر قادر به تولید هیدروژن هستند (4).

جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی، جلبکی تک‌سلولی است که اغلب به‌عنوان یک سیستم مدل در مطالعات مختلف استفاده می‏شود (5). این جلبک، تحت شرایط بی‏هوازی، با استفاده از انرژی نور، هیدروژن را از آب تولید می‏کند. تشکیل هیدروژن در این جلبک سبز، به‌طور طبیعی تحت شرایط استرس غذایی و محیطی انجام می‏شود (6). در بسیاری از ریزجلبک‏ها مانند جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی، تحت شرایط استرس، تولید مواد ذخیره‏ای پرانرژی مانند نشاسته و چربی (تری آسیل گلیسرول) افزایش می‏یابد (7). استات به‌عنوان منبع اصلی کربن مصرف می‌شود و نشاسته در سلول‏ها ذخیره می‏شود. بین غلظت نشاسته و تولید هیدروژن، رابطه‏ای مستقیم وجود دارد. همچنین نشاسته در هنگام تولید هیدروژن استفاده می‌شود (8). پژوهش‌هایی درخصوص بررسی تأثیر شرایط محیطی بر میزان نرخ رشد و تولید نشاسته در ریزجلبک کلامیدموناس رینهاردتی در ایران صورت نگرفته است اما پژوهش‌هایی پیرامون بررسی تأثیر شرایط کشت بر میزان تولید بیومس و سایر ترکیبات شیمیایی مانند پروتئین و اسیدهای چرب در ریزجلبک‏ها انجام شده است (9 و 10).

به‌منظور کاهش هزینه‌های پژوهش‌ها و انجام حداقل آزمایش‏های موردِنیاز، از روش‏های آماری برای طراحی آزمایش‏ها استفاده می‏شود. یکی از روش‏های آماری استفاده‌شده در بهینه‏سازی شرایط کشت، روش سطح پاسخ[3] است‏‏‏. با استفاده از این روش تعداد کمتری آزمایش موردِنیاز است و برای سیستم‏های چندعاملی نیز مفید است. در این روش رابطه میان عامل‏‏های گوناگون نیز بررسی می‏شود (11).

 جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی در زمینۀ پژوهش‌های انرژی زیستی (هیدروژن زیستی و دیزل زیستی) اهمیت ویژه‌ای دارد و نیز عامل‏‏های محیطی بر نرخ رشد و تولید نشاسته در این جلبک تأثیرگذار است؛ با توجه به همین امر، هدف از این پژوهش‌ دستیابی به شدت نور و pH بهینه جهت افزایش نرخ رشد و تولید نشاسته در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی با استفاده از روش آماری سطح پاسخ و با استفاده از طرح مرکب مرکزی[4] بوده است. ‏

‏‏مواد و روش‏ها.  

گونۀ جلبکی و شرایط کشت: ریزجلبک کلامیدوموناس رینهاردتی از دانشگاه بیلفلد آلمان تهیه شد. به‌منظور تهیۀ استوک، جلبک‏ها بر روی محیط کشت استاندارد تریس- استات- فسفات (TAP)[5] حاوی NH4Cl (5/7 میلی‏مولار)، MgSO4 (41/0 میلی‏مولار)، CaCl2 (34/0 میلی‏مولار)، K2HPO4 (62/0 میلی‏مولار)، KH2PO4 (41/0 میلی‏مولار)، گلاسیال استیک اسید (1/0 %)، EDTA (171 میکرو‏‏مولار)، ZnSO4(31 میکرو‏مولار)، H3BO3(184 میکرو‏مولار)، MnCl2(2/7 میکرو‏مولار)، CoCl2 (2/2 میکرو‏مولار)، CuSO4 (3/6 میکرو‏مولار)، (NH4)MO7O24 (9/4 میکرو‏مولار) و Tris (20 میلی‏مولار) در  فلاسک 1000میلی‏لیتر رشد داده شدند. به‌منظور تنظیم pH از بافر Hepes[6] استفاده شد. هوادهی با پمپ آکواریوم HAILEA و با شدت خروجی ml/min 200 انجام شد. آزمایش‏ها تحت شرایط نور کنترل‌شده در اتاق کشت (فیتوترون) با قابلیت تنظیم دما (در دمای 1±22) با نوردهی پیوسته انجام شد و لامپ‏های فلورسنت به‌منظور تأمین نور استفاده شد. شدت نور با استفاده از دستگاه لوکس‏متر لوترون مدل [7]LX-105 در حدود 5000 لوکس (70 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه) تنظیم شد (8).

 

 

طراحی آزمایش: به‌منظور بهینه‏سازی شرایط رشد جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی با هدف دستیابی به بالاترین نرخ رشد و بیشترین میزان تولید نشاسته از نرم‏افزار آماری دیزاین اکسپرت استفاده شد. برای طراحی آزمون، دو عامل‏‏ شدت نور و pH در نظر گرفته شد که هر عامل‏‏ دارای سه سطح مختلف بود (جدول 1). عامل‏‏ها، در نرم‏افزار وارد و آزمون سطح پاسخ طراحی شد.

اثر این دو عامل‏‏ بر دو پاسخ نرخ رشد و میزان تولید نشاسته  ارزیابی شد‏‏‏. 13 آزمون توسط نرم‏افزار طراحی شد. آزمون‏ها در آزمایشگاه انجام شد و اطلاعات حاصل وارد نرم‏افزار شد. مدلی به‌منظور دستیابی به بالاترین نرخ رشد و مدلی جهت حصول بیشترین میزان تولید نشاسته ارائه شد. مقادیر پیش‌بینی‌شدۀ نرخ رشد و میزان نشاسته توسط مدل‏های به‌دست‌آمده در آزمایشگاه انجام شد.

 

جدول 1- عامل‏‏های انتخاب‌شده در نرم‏افزار دیزاین اکسپرت و سطوح آن‏ها

عامل‏‏

سطح 1 (1-)

سطح 2 (0)

سطح 3 (1)

شدت نور (لوکس)[8]

2000

5000

8000

pH

6

7

8

 

تعیین نرخ رشد: به‌منظور دستیابی به میزان نرخ رشد جلبک‏های کشت‌داده‌شده در شرایط نوری و pHهای مختلف، اندازه‏گیری دانسیته نوری (12)، غلظت کلروفیل (13) و وزن خشک (14) با فاصلۀ زمانی یک روز در میان انجام شد.

نرخ رشد طبق معادلۀ زیر محاسبه شد:

µ نرخ رشد وN1 و N2 به‌ترتیب میزان بیومس (وزن خشک) در زمان‏های t1 و t2است (15).

 

اندازه‏گیری میزان نشاسته: اندازه‌گیری میزان نشاسته با استفاده از روش اصلاح‌شدۀ اسیدسولفوریک- UV انجام شد. برای این کار عصاره جلبکی با استفاده از اتانول 80درصد و بن ماری جوش استخراج شد. به یک میلی‏لیتر از محلول حاصل، اسیدسولفوریک غلیظ اضافه شد و سپس با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر، جذب در طول موج 315 نانومتر خوانده شد. براساس مقایسه میزان جذب خوانده‌شده با منحنی استاندارد گلوکز، مقدار نشاسته در نمونۀ جلبکی محاسبه شد (16).

تجزیه و تحلیل آماری: جهت تحلیل‏‏‏ داده‏ها از نرم‏افزار دیزاین اکسپرت ورژن 9 و برای ترسیم نمودارها از نرم‏افزار اکسل[9] استفاده شد.

 

نتایج.

مدل‌سازی: طرح آزمایشی سطح پاسخ برای بهینه‏سازی شرایط کشت در افزایش نرخ رشد و میزان تولید نشاسته با استفاده از روش طرح مرکب مرکزی انجام شد. در این روش، مجموعه‏ای از 13 آزمایش طراحی شد که دارای 5 تکرار در نقطه مرکزی است (جدول 2).

نتایج اثر شدت نور و pH بر نرخ رشد: بررسی اثر متقابل pH و شدت نور بر نرخ رشد نشان داد که بیشترین مقدار نرخ رشد در هر سه شدت نور مختلف (2000، 5000 و 8000 لوکس)، در 7=pH مشاهده شد و کمترین مقدار نرخ رشد در 6= pH مشاهده شد (شکل 1).

 

 

جدول 2- طراحی دیزاین اکسپرت همراه با پاسخ‏های اندازه‏گیری‌شده. در این طراحی، نرخ رشد و میزان نشاسته به‌عنوان پاسخ در نظر گرفته شده است.

شماره آزمایش

عامل‏‏ 1 (pH)

عامل‏‏ 2 (شدت نور)

پاسخ 1: نرخ رشد       (روز 1- )

پاسخ 2: نشاسته (میلی‌گرم/میلی‏لیتر)

1

0

1-

243/1

018/0

2

0

0

23/1

019/0

3

1

1-

023/1

029/0

4

1

1

182/1

032/0

5

1

0

176/1

038/0

6

0

0

284/1

017/0

7

1-

1

385/0

009/0

8

1-

1-

076/0

005/0

9

0

0

262/1

021/0

10

0

0

266/1

02/0

11

1-

0

201/1

006/0

12

0

1

318/1

014/0

13

0

0

271/1

019/0

 


 

شکل 1- اثر pH بر نرخ رشد (روز 1-) در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی در شدت‏های نور مختلف.

 

تحلیل‏‏‏ نتایج سطح پاسخ: مدل حاصل از روش سطح پاسخ با معادله 1 نشان داده شده است که در نرخ رشد (Y) به عنوان تابعی از مقدار متغیرهای مستقل است.

معادله 1:

Y= + 27/1 + 49/0 × A + 037/0 × B – 038/0 × AB + 59/0 × A2 + 080/0 × A2B –051/0× AB2

در این فرمول Y مقدار نرخ رشد جلبک، A مقدار pH محیط کشت و B میزان شدت نور است‏‏‏.

همان‌طور که در معادله 1 مشاهده می‏شود، ضریب هر دو عامل‏‏ شدت نور و pH، مثبت است‏‏‏ که بیانگر تأثیر هر دو عامل‏‏ بر نرخ رشد است. از میان این دو عامل‏‏، با توجه به ضریب خطی pH (49/0) می‏توان گفت که اثر آن بر نرخ رشد، نسبت به شدت نور با ضریب خطی (037/0) بیشتر است‏‏‏. براساس ارزیابی آماری معادله 1، مدل مناسب، یک مدل چند جمله‏ای درجه دوم بود. داده‏های تحلیل‏‏‏ واریانس، دقت این مدل درجه دوم را تأیید می‌کند. شاخص‏‏‏‏ F معیاری از انحراف داده‏ها از مقدار میانگین است و به‌طور کلی برای مدلی که نتایج آزمایش را با موفقیت پیشگویی می‌کند، مقدار F معمولاً بسیار بالا است. مقدار prob>F کمتر از 05/0 است که به معنی معنی‏داربودن مدل است‏‏‏. نتایج نشان می‏دهد که هر دو عامل‏‏ مستقل بر میزان نرخ رشد تأثیر به‌سزایی دارند. محاسبۀ عدم تطابق[x]، نشان‏دهنده صحت داده‏های مدل است. درواقع معنی‏دارنبودن این شاخص‏‏‏‏ مطلوب است. مقدار این شاخص‏‏‏‏ برای رگرسیون معادله 1، معنی‌دار نیست و 3509/0= p است‏‏‏.

تأثیر متغیرهای مستقل بر نرخ رشد در شکل‏ 2 نشان داده شده است. در این شکل تأثیر pH و شدت نور بر تغییرات نرخ رشد ملاحظه می‏شود. با توجه به ضریب متغیرهای مستقل در رابطۀ شماره 1 مشاهده می‏شود که pH تأثیر عمده‏ای بر تغییرات نرخ رشد داشته است (p<0.0001). به‌طوری که در محدوده 7=pH، میزان نرخ رشد به‌طور چشمگیری افزایش یافته است.

با حل معادلۀ شماره 1 و تجزیۀ نمودار سطح پاسخ (شکل 2)، شدت نور و pH بهینه به‌منظور رسیدن به حداکثر رشد، به‌ترتیب 7400 لوکس و 4/7 است‏‏‏.

 

 

شکل 2- منحنی سطح پاسخ. تأثیر شدت نور و pH بر نرخ رشد در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی

تأیید تجربی مدل: برای تأیید نتایج فوق، ریزجلبک کلامیدوموناس رینهاردتی در شرایط بهینه پیشنهاد شده توسط مدل (شدت نور ،7400 لوکس و 4/7 = pH) کشت داده شد و نرخ رشد حاصل از آن اندازه‏گیری شد. پاسخ مشاهده‌شده نرخ رشد برابر با 36/1 بود. نتایج نشان داد که همبستگی بالایی بین پاسخ پیش‌بینی‌شده (38/1) و پاسخ عملی به‌دست‌آمده در آزمایشگاه وجود دارد که تأییدی بر معتبربودن مدل است‏‏‏ (جدول 3).

 

جدول3- ارزیابی تجربی مدل. هر دو عامل‏‏ در شرایط بهینه در نظر گرفته شده‌اند.

شاخص‏‏‏‏های مستقل

مقدار بهینه

نرخ رشد پیش‌بینی‌شده

نرخ رشد اندازه‌گیری‌شده

pH

4/7

38/1

36/1

شدت نور

7400

 

 

شکل 3- نمودار میزان نشاسته تولیدی در شدت‏های نوری و pHهای مختلف

 

بررسی اثر شدت نور و pH بر میزان تولید نشاسته: میزان نشاستۀ تولیدی برای هریک از آزمایش‏ها طراحی شد در نمونه‏های برداشت‌شده از انتهای مرحلۀ رشد تصاعدی محاسبه شد و نتایج به‌صورت نمودار نشان داده شد. میزان تولید نشاسته در 8=pH از سایر pH ها (6 و 7) بیشتر بود. در نور 5000 لوکس و 8=pH بیشترین میزان تولید نشاسته به دست آمد. کمترین میزان تولید نشاسته در شدت نور 2000 و 6=pH حاصل شد (شکل 3).

 

محاسبات طرح آماری: مدل حاصل از روش سطح پاسخ با معادله 2 نشان داده شده است که در مقدار تولید نشاسته (Y) به‌عنوان تابعی از مقدار متغیرهای مستقل است.

معادله 2:

Y= + 019/0 + 016/0 × A – 2 × 3-10 × B + 776/2 × A2 – 224/3 ×3-10 ×B2 + 75/3× 3-10 ×A2B – 250/4 ×3-10 × AB2

در این فرمول Y مقدار تولید نشاسته در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی، A مقدار pH محیط کشت و B میزان شدت نور است‏‏‏.

همان‌طور که در معادله 2 مشاهده می‏شود، ضریب  عامل‏‏ pH، مثبت و ضریب عامل‏‏ شدت نور، منفی است‏‏‏ که نشان می‏دهد که افزایش pH اثر مثبت بر روی تولید نشاسته دارد و افزایش شدت نور دارای اثر منفی بر تولید نشاسته است. براساس ارزیابی آماری معادله 2، مدل مناسب، یک مدل چند جمله‏ای درجه دوم بود. داده‏های تحلیل‏‏‏ واریانس، دقت این مدل درجه دوم را تأیید می‏کند. در این مدل مقدار prob>F کمتر از 05/0 است که به‌معنی معنی‏دار‌بودن مدل است‏‏‏. نتایج نشان می‏دهد که عامل‏‏ pH بر میزان تولید نشاسته مؤثر است. اما تأثیر شدت نور بر میزان تولید نشاسته معنی‏دار نیست. مقدار شاخص‏‏‏‏ عدم تطابق، برای رگرسیون معادله 2، معنی‌دار نیست و 3509/0= p است‏‏‏ که نشان‏دهندۀ صحت داده‏های مدل است‏‏‏.

تحلیل‏‏‏ نتایج سطح پاسخ: تأثیر متغیرهای مستقل بر میزان تولید نشاسته در شکل‏ 4 نشان داده شده است. در این شکل تأثیر pH و شدت نور بر تغییرات تولید نشاسته ملاحظه می‏شود. با توجه به ضریب متغیرهای مستقل در رابطۀ شماره 2 مشاهده می‏شود که pH تأثیر عمده‏ای بر تغییرات میزان تولید نشاسته داشته است (p<0.0001). به‌طوری که در محدودۀ 8=pH، میزان تولید نشاسته به‌طور چشمگیری افزایش یافته است.

با حل معادله شماره 2 و تجزیه نمودار سطح پاسخ (شکل 4)، شدت نور و pH بهینه به‌منظور رسیدن به حداکثر نشاسته، به‌ترتیب 5300 لوکس و 8 است‏‏‏.

 

 

شکل 4- منحنی سطح پاسخ. تأثیر شدت نور و pH بر نشاسته در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی

تأیید تجربی مدل: به‌منظور تأیید نتایج فوق، ریزجلبک کلامیدوموناس رینهاردتی در شرایط بهینۀ پیشنهادشده توسط مدل (شدت نور ،5300 لوکس و 8 = pH) کشت داده شد و میزان نشاستۀ حاصل از آن اندازه‏گیری شد. میزان نشاسته تولید شده در آزمایشگاه برابر با 034/0 بود. نتایج نشان داد که همبستگی بالایی بین پاسخ پیش‌بینی‌شده (038/0) و پاسخ عملی به‌دست‌آمده در آزمایشگاه وجود دارد که تأییدی بر معتبربودن مدل است‏‏‏ (جدول 4).

 

جدول4- ارزیابی تجربی مدل. هر دو عامل‏‏ در شرایط بهینه در نظر گرفته شده‌اند.

شاخص‏‏‏‏های مستقل

مقدار بهینه

نشاسته پیش‌بینی‌شده

نشاسته اندازه‏گیری‌شده

pH

8

038/0

034/0

شدت نور

5300

 

بحث و نتیجه‏‏ گیری.

بهینه‏سازی شرایط رشد، عامل اصلی در تکنولوژی کشت انبوه ریزجلبک‏ها است‏‏‏. بنابراین جهت درک رفتار گونه‏های جلبکی تحت عوامل مختلف محیطی، تعیین شاخص‏‏‏‏های مختلف رشد ضروری به نظر می‏رسد. بررسی اثر متقابل بین این عوامل و مدل‌سازی شاخص‏‏‏‏های رشد، منجر به دستیابی شرایط بهینه رشد در کشت گونه‏های مدنظر در مقیاس صنعتی می‌شود (2). بررسی میان‏کنش متقابل بین چندین عامل‏‏، به‌منظور جایگزینی تکنولوژی استفاده از جلبک در تولید تجاری سوخت زیستی ضروری است‏‏‏ (1).

نتایج حاصل از این پژوهش‌ نشان می‏دهد که دو عامل‏‏ pH و شدت نور بر نرخ رشد و میزان تولید نشاسته مؤثرند. نرخ رشد جلبک در 6=pH بسیار کمتر از سایر pHها بود و در 4/7=pH، جلبک رشد بهتری را نشان داد. پژوهش‌های انجام‌شده بر سراتیوم لیناتوم[xi]، هتروکاپسا تریکوترا[xii]، پروروسنتروم مینیموم[xiii] و کلامیدوموناس اپلانتا[xiv]نشان داد که بسیاری از گونه‏های جلبکی در محدودۀ pH (6/7- 0/7) رشد می‌کنند (1). ویسویکی[xv] و سانتیکول[xvi] رشد کلامیدوموناس اپلانتا را در محدودۀ pH (4/8- 4/1)، مطالعه کردند. هیچ رشدی در محدوده 4/1 تا 4/3 مشاهده نشد. رشد در pHهای بالاتر در کلامیدوموناس اپلانتا (با رشد بهینه در 4/7) مشاهده شده است. رشد تصاعدی برای بیش از 5 روز در 4/5 تا 4/8 مشاهده شده است. اما حداکثر رشد در 4/7=pH به دست آمده است که با نتایج حاصل از پژوهش‌ ما انطباق دارد (17). نتایجی که کیم[xvii] و همکاران به دست آوردند نیز نشان داد که pH بهینۀ رشد در گونه‏های کلرلا معادل 7 بود که مشابه نتایج حاصل از این پژوهش‌ است (18). سلطانی و همکارانش، اثر pHهای مختلف (5، 7 و 9) را بر پاسخ‏های فیزیولوژیکی جلبک فیشرلا آمبیگوآ[xviii] بررسی کردند که نشان داد نرخ رشد در 9=pH و 7=pH مشابه بود، اما رشدی در 5=pH مشاهده نشد (14). یافته‏های حاصل از این مطالعات، نتایج پژوهش‌ حاضر را تأیید می‏کند. از آنجایی‌که pH، حلالیت و دسترسی دی‏اکسید‏کربن و دیگر مواد غذایی ضروری را تعیین می‌کند، می‏تواند تأثیر مهمی بر متابولیسم جلبکی داشته باشد. به‌علت جذب کربن غیرآلی توسط جلبک، pH به‌طور معنی‌داری در محیط کشت جلبکی افزایش می‏یابد. حداکثر رشد جلبکی در محدودۀ pH خنثی رخ می‏دهد. pH بالاتر دسترسی به کربن دی‏اکسیدکربن را محدود می‌کند که موجب مهار رشد جلبکی می‌شود (1).

از میان سه شدت نوری مختلف (2000، 5000 و 8000 لوکس ) که در پژوهش حاضر بررسی شد، براساس نتایج حاصل، شدت نور 7400 لوکس به‌عنوان شدت نور بهینه برای دستیابی به بهترین نرخ رشد به دست آمد که معادل 97 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه بود. با توجه به مطالعه‌ای که سیف آبادی و همکارانش انجام دادند، در بررسی اثر شدت‏های نوری مختلف 5/37، 5/62 و 100 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه بر نرخ رشد  کلرلا ولگاریس[xix]، بالاترین نرخ رشد 13/1 در روز در شدت نور 100 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه به دست آمد (19). هو[xx] و همکارانش، اثر شدت نور، تحت شرایط نوردهی پیوسته، بر نرخ رشد ویژه را در انتهای مرحلۀ رشد تصاعدی در جلبک سندسموس ابلیکوم[xxi] بررسی کردند. نرخ رشد ویژه با افزایش شدت نور افزایش می‏یابد. همچنین تولید بیومس و نرخ تثبیت دی‌اکسیدکربن با افزایش شدت نور به‌طور معنی‏داری افزایش می‏یابد (20). در مطالعاتی که جهت تولید هیدروژن از جلبک کلامیدوموناس انجام گرفته و در آن، مرحلۀ رشد هوازی در محیط کشت TAP، دمای 25 درجه سانتی‌گراد و شرایط نوری 100 میکرومول فوتون بر مترمربع در ثانیه اعمال شده (21-23)، نتایجی مشابه نتایج پژوهش‌ حاضر به دست آمده است.

شدت نور موجب افزایش رشد سلولی، تولید کربوهیدرات و لیپید و بهبود بازده تثبیت دی‌اکسیدکربن شده است (20). بررسی‏ها نشان می‏دهد که شدت نور، با اثر بر فتوسنتز، رشد جلبک را تحت تأثیر قرار می‏دهد. سازگاری به نور از طریق چندین مکانیسم مانند تغییر در نوع و مقدار رنگیزه‏ها، نرخ رشد، نرخ تنفس تاریکی یا دسترسی به اسیدهای چرب ضروری رخ می‏دهد. جلبک‏ها توسط غشاهای کلروپلاستی بر محدودیت نور غلبه می‌کنند (1).

افزایش شدت نور بیش از حد اشباع، موجب بازدارندگی نوری می‏شود. این فرایند به‌دلیل اختلال در تیغه‏های کلروپلاستی در اثر شدت نور بالا و غیرفعال‌شدن آنزیم‏های دخیل در تثبیت دی‏اکسید‏کربن است‏‏‏ (1).

نشاسته به‌عنوان یکی از منابع اصلی انرژی شیمیایی نقش مهمی در چرخۀ سلولی ایفا می‌کند. این پلی‏ساکارید در پلاستیدهای جلبک‏های سبز و گیاهان عالی ذخیره می‏شود و در هر دوی این موجودات زنده، هریک از مراحل مسیر متابولیکی توسط ایزوفرم‏های آنزیمی متنوعی انجام می‏شود (24). نتایج حاصل از پژوهش‌ حاضر نشان می‏دهد که میزان نشاسته در شدت نور 2000 لوکس از دو شدت نور (5000 و 8000 لوکس) بسیار کمتر است‏‏‏. همچنین در شدت نور  5400 لوکس، بیشترین میزان نشاسته تولید شد. در بررسی اثر pH بر میزان تولید نشاسته مشاهده شد که با افزایش pH از 6 به 8 میزان تولید نشاسته بیشتر می‏شود. در پژوهشی که‌ زنگ[xxii] و همکاران انجام دادند، به‌منظور انباشت نشاسته در جلبک تتراسلمیس سابکوردیفورمیس[xxiii]، pH محیط کشت بر روی 8 تنظیم شد (25). در پژوهش‌ حاضر نیز بیشترین میزان نشاسته در 8=pH به دست آمد. این در حالی است که در برخی دیگر از پژوهش‌ها، به‌منظور افزایش تولید نشاسته در جلبک‏ها، pH محیط کشت در حدود 7 تنظیم شده است (26، 27). بررسی‏های به‌عمل‌آمده نشان داده است که مقدار کربن تثبیت‌شده در لیپیدها و کربوهیدرات‏ها (نشاسته)، به‌شدت تحت تأثیر عامل‏‏های محیطی است‏‏‏ (1).

کیم و همکاران، اثر عامل‏‏های مختلف مانند شدت نور، دما، pH و فسفات بر تولید بیومس را در سه جلبک سبز، با استفاده از روش سطح پاسخ بررسی کردند. آن‏ها اظهار داشتند که استفاده از روش‏ سطح پاسخ، به‌منظور بهینه‏سازی شرایط رشد مفید است‏‏‏ (18). کابوسی و همکاران نیز اظهار داشتند که روش سطح پاسخ برای بهینه‏سازی شرایط به‌منظور تولید آنزیم آلفا آمیلاز از باکتری باسیلوس آمیلولیکویی فسینز، کارایی مطلوبی دارد (28). در پژوهش‌ حاضر نیز از روش سطح پاسخ استفاده شد که به‌منظور بهینه‏سازی شرایط رشد و تولید نشاسته سودمند واقع شد.

تکنولوژی تولید سوخت‏های زیستی از منابع تجدیدپذیر در حال گسترش است‏‏‏. جلبک‏ها منابع ارزشمندی به‌منظور تولید متابولیت‏های مؤثر و سوخت‏های زیستی هستند. براین‌اساس دستیابی به روش‏های نوین در زمینۀ بهبود بازده این محصولات نیازمند پژوهش‌های بیشتری است‏‏‏. با توجه به نتایج حاصل از این پژوهش‌ در بهینه‏سازی تولید نشاسته و با درنظرگرفتن نقش نشاسته در تولید هیدروژن، می‏توان پژوهش‌های بیشتری با هدف افزایش بیشتر تولید نشاسته انجام داد. علاوه بر این، به‌منظور بهینه‏سازی شرایط رشد استفاده از نرم‏افزارهای طراحی آزمایش همانند دیزاین اکسپرت پیشنهاد می‏شود. این پژوهش‌ نشان می‏دهد که تغییر شدت نور و pH بر نرخ رشد مؤثر است‏‏‏. همچنین تغییر pH، عامل‏‏ مؤثری در میزان تولید نشاسته در جلبک کلامیدوموناس رینهاردتی است‏‏‏.

 



[1]- Chlorella

[2]- Scenedesmus

[3]- Response Surface Methodology (RSM)

[4]- Central composite (CCD)

[5]- Tris-Acetate Phosphate

[6]- 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid

[7]- LUTRON

[8]- Lux

[9]- Excel

[x]- Lake of fit

[xi]- Ceratium lineatum

[xii]- Heterocapsa triquetra

[xiii]- Prorocentrum minimum

[xiv]- Chlamydomonas applanata

[xv]- Visviki

[xvi]- Santikul

[xvii]- Kim

[xviii]- Fischerella ambigua

[xix]- Chlorella vulgaris

[xx]- Ho

[xxi]- Scenedesmus obliqum

[xxii]- Zheng

[xxiii]- Tetraselmis subcordiformis

 

(1) Juneja A, Ceballos RM, Murthy GS. Effects of Environmental Factors and Nutrient Availability on the Biochemical Composition of Algae for Biofuels Production: A Review. Energies. 2013; 6(9): 4607-38.

(2) Bouterfas R, Belkoura M, Dauta A. The effects of irradiance and photoperiod on the growth rate of three freshwater green algae isolated from a eutrophic lake. Limnetica. 2006; 25(3): 647-56. 

(3) Chochois V, Constans L, Dauvillée D, Beyly A, Solivérès M, Ball S, et al. Relationships between PSII-independent hydrogen bioproduction and starch metabolism as evidenced from isolation of starch catabolism mutants in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. International Journal of Hydrogen Energy. 2010; 35(19): 10731-40.

(4) Milledge J, Heaven S. Methods of energy extraction from microalgal biomass: a review. Rev Environ Sci Biotechnol. 2014; 13: 301-20.

(5) Bonente G, Pippa S, Castellano S, Bassi R, Ballottari M. Acclimation of Chlamydomonas reinhardtii to different growth irradiances. Journal of Biological Chemistry. 2012; 287(8): 5833-47.

(6) Saleem M, Chakrabarti MH, Abdul Raman AA, Hasan DuB, Ashri Wan Daud WM, Mustafa A. Hydrogen production by Chlamydomonas reinhardtii in a two-stage process with and without illumination at alkaline pH. International journal of hydrogen energy. 2012; 37(6): 4930-4.

(7) Siaut M, Cuiné S, Cagnon C, Fessler B, Nguyen M, Carrier P, et al. Oil accumulation in the model green alga Chlamydomonas reinhardtii: characterization, variability between common laboratory strains and relationship with starch reserves. BMC biotechnology. 2011; 11(1): 1-15.

(8) Tamburic B, Zemichael FW, Maitland GC, Hellgardt K. Parameters affecting the growth and hydrogen production of the green alga Chlamydomonas reinhardtii. International Journal of Hydrogen Energy. 2011; 36(13): 7872-6.

(9) Naderi Farsani M, Meshkiniy S, Manaffar R, Asal Pishe Z. Response of growth, protein and fatty acid content of Desmodesmus cuneatus to the repletion and depletion of nitrogen. Biological Journal of Microorganism. 2015; 3(12): 59-68.

(10)           Blair MF, Kokabian B, Gude VG. Light and growth medium effect on Chlorella vulgaris biomass production. Journal of Environmental Chemical Engineering. 2014; 2(1): 665-74.

(11)           Chang C-Y, Lee C-L, Pan T-M. Statistical optimization of medium components for the production of Antrodia cinnamomea AC0623 in submerged cultures. Applied microbiology and biotechnology. 2006; 72(4): 654-61.

(12)           Moheimani NR, Borowitzka MA, Isdepsky A, Sing SF. Standard methods for measuring growth of algae and their composition.  Algae for Biofuels and Energy. 1st  ed. Netherlands: Springer; 2013: 265-84.

(13)           Hemschemeier A, Melis A, Happe T. Analytical approaches to photobiological hydrogen production in unicellular green algae. Photosynthesis research. 2009; 102(2-3): 523-40.

(14)           Soltani N, Khavari-Nejad RA, Yazdi MT, Shokravi S, Fernández-Valiente E. Variation of nitrogenase activity, photosynthesis and pigmentation of the cyanobacterium Fischerella ambigua strain FS18 under different irradiance and pH values. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2006; 22(6): 571-6.

(15)           Levasseur M, Thompson PA, Harrison PJ. Physiological acclimation of marine phytoplankton to different nitrogen sources1. Journal of Phycology. 1993; 29(5): 587-95.

(16)           Albalasmeh AA, Berhe AA, Ghezzehei TA. A new method for rapid determination of carbohydrate and total carbon concentrations using UV spectrophotometry. Carbohydrate polymers. 2013; 97(2): 253-61.

(17)           Visviki I, Santikul D. The pH tolerance of Chlamydomonas applanata (Volvocales, Chlorophyta). Archives of environmental contamination and toxicology. 2000; 38(2): 147-51.

(18)           Kim W, Park JM, Gim GH, Jeong S-H, Kang CM, Kim D-J, et al. Optimization of culture conditions and comparison of biomass productivity of three green algae. Bioprocess and biosystems engineering. 2012; 35(1-2): 19-27.

(19)           Seyfabadi J, Ramezanpour Z, Khoeyi ZA. Protein, fatty acid, and pigment content of Chlorella vulgaris under different light regimes. Journal of Applied Phycology. 2011; 23(4): 721-6.

(20)           Ho S-H, Chen C-Y, Chang J-S. Effect of light intensity and nitrogen starvation on CO2 fixation and lipid/carbohydrate production of an indigenous microalga Scenedesmus obliquus CNW-N. Bioresource technology. 2012; 113: 244-52.

(21)           Wu S, Li X, Yu J, Wang Q. Increased hydrogen production in co-culture of Chlamydomonas reinhardtii and Bradyrhizobium japonicum. Bioresource technology. 2012; 123: 184-8.

(22)           Scoma A, Bertin L, Pintucci C, Raddi S, Fava F. Inhibition of photosystem 2 in starch-enriched Chlamydomonas reinhardtii cells prevents the efficient induction of H 2 production in sulfur-depleted cultures. International journal of hydrogen energy. 2012; 37(14): 10604-10.

(23)           Godman JE, Molnár A, Baulcombe DC, Balk J. RNA silencing of hydrogenase (-like) genes and investigation of their physiological roles in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Biochemical Journal. 2010; 431(3): 345-51.

(24)           Busi MV, Barchiesi J, Martín M, Gomez‐Casati DF. Starch metabolism in green algae. StarchStärke. 2014; 66(1-2): 28-4.

(25)           Zheng Y, Chen Z, Lu H, Zhang W. Optimization of carbon dioxide fixation and starch accumulation by Tetraselmis subcordiformis in a rectangular airlift photobioreactor. African Journal of Biotechnology. 2013; 10(10): 1888-901.

(26)           Fernandes B, Dragone G, Abreu AP, Geada P, Teixeira J, Vicente A. Starch determination in Chlorella vulgaris a comparison between acid and enzymatic methods. Journal of Applied Phycology. 2012; 24(5): 1203-8.

(27)           de-Bashan LE, Bashan Y, Moreno M, Lebsky VK, Bustillos JJ. Increased pigment and lipid content, lipid variety, and cell and population size of the microalgae Chlorella spp. when co-immobilized in alginate beads with the microalgae-growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense. Canadian journal of microbiology. 2002; 48(6): 514-21.

(28)           Kaboosi H, Tabari N, Samadlouie HR. Optimization of α-amylase production by Bacillus amyloliquefaciens using response surfaces methodology. Biological Journal of Microorganism 2014; 11: 79-90.