جداسازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه کننده گازوئیل از خاک‌های آلوده به مواد نفتی در استان خوزستان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسنده

دانشیار میکروبیولوژی، دانشکده علوم، دانشگاه شهید باهنرکرمان، کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: گازوئیل که یکی از محصولات عمدۀ نفت خام است، منبع عمدۀ آلودگی محیط زیست به شمار می‌رود و می‌تواند آثار خطرناک زیستی بر محیط اطراف بگذارد. یکی از روش‌های بازیابی این مناطق آلوده و واردکردن آن‌ها به چرخۀ تولید محصول سالم، حذف آلاینده‌ها با روش‌های زیستی است که از این میان روش تجزیۀ زیستی با توجه به استفاده از توان طبیعی و پتانسیل‌های نهفتۀ طبیعت و هزینۀ کمتر بیشتر موردِتوجه بوده است.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل ابتدا نمونه‌برداری از مناطق آلوده در استان خوزستان به عمل آمد. باکتری‌های جداسازی‌شده با روش‌های بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شدند. صفاتی در این باکتری‌ها همچون آب‌گریزی سطح سلولی و فعالیت امولسیونه‌کنندگی بررسی شد. میزان حذف گازوئیل با روش کروماتوگرافی گازی و به‌صورت کیفی برای هر سویه مشخص شد.
نتایج: در این پژوهش از بین 34 سویۀ تجزیه‌کنندۀ گازوئیل جداسازی شده، 10 سویه براساس حذف گازوئیل بیشتر انتخاب شدند. نتایج حاصل از شناسایی مولکولی نشان داد که این سویه‌ها به جنس‌های ‌Achromobacter، Enterobacter و Klebsiella تعلق داشتند. این باکتری‌ها در طی 10 روز بیش از نیمی از گازوئیل را حذف می‌کردند. بیشترین حذف گازوئیل مربوط به سویۀ Enterobacter cloacae strain L2 (72درصد) بود. بیشترین آب‌گریزی سطح سلولی مربوط به باکتری مربوط به سویۀstrain K2 Klebsiella oxytoca (76درصد) و بیشترین فعالیت امولسیون‌کنندگی مربوط به سویۀ  strain B2  Achromobacter denitrificans (58درصد) بود. ‌
بحث و نتیجه‌گیری: نتایج این پژوهش ثابت کرد که باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل در خاک‌های آلوده در ایران از تنوع مناسبی برخوردار هستند و پتانسیل استفاده در حذف آلودگی گازوئیلی از خاک را دارند. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and characterization of diesel-oil degrading bacteria from petroleum contaminated soil at Khozestan provenance

نویسنده [English]

  • Mehdi Hassanshahian
Associate Professor of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction:Diesel oil is the major product of crude oil. This product is the main pollutant of environment and has hazardous effects on the environment. Bioremediation is the best method for remediation of this pollutant, because this method use nature potential for remediation and also this method has a low cost.
Materials and methods: In this study, for isolation of diesel-oil degrading bacteria sampling  performed from contaminated regions. The prevalent diesel-oil degrading bacteria were identified by biochemical and molecular methods. Some properties in these bacteria were analyzed such as: hydrophobicity and emulsification activity. The percentage of diesel-oil degradation was assayed for each strain by Gas Chromatography (GC) and qualitative test.
Results: In this research 34 diesel-oil degrading bacteria were isolated. From these strains 10 strains were selected according to diesel-oil degradation. These strains belong to Achromobacter، Enterobacter and Klebsiella. The half percentages of diesel-oil were removed by these strains in 10 days of incubation. The best strain for degradation of diesel was Enterobacter cloacae strain L2 (72%). The highest hydrophobicity is related toKlebsiella oxytoca strain K2 (76%) and the best emulsification activity belongs to Achromobacter denitrificans strain B2 (58 %).
Discussion and conclusion: The results of this research confirmed that diesel degrading bacteria have sufficient diversity in soil contaminated in Iran. These bacteria have good potential for remediation of diesel pollution from soil.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biodegradation
  • Bacteria
  • Diesel-oil
  • Khozestan
  • Pollution

مقدمه.

امروزه آلودگی نفتی به‌عنوان یکی از خطرناک‌ترین آلودگی‌های محیطی شناخته شده است. گازوئیل که یکی از محصولات عمدۀ نفت خام است، منبع عمده آلودگی محیط زیست به شمار می‌رود که می‌تواند آثار خطرناک زیستی بر محیط اطراف اعمال کند. گازوئیل می‌تواند در نتیجۀ فعالیت‌های انسانی در انتقال از منابع به محل‌های مصرف، پالایش، ذخیره‌سازی و همچنین استفادۀ نادرست آن توسط مصرف‌کننده‌ها و فعالیت‌های کشتیرانی وارد محیط شود. از تقطیر نفت مازوت مایعی حاصل می‌شود که عمدتاً جهت روشن‌کردن موتورهای دیزلی به کار می‌رود؛ به این سوخت گازوئیل گویند. محدودۀ هیدروکربن‌های گازوئیل بین C11-C25 و دامنۀ تقطیر آن 1۸0 تا380 درجه سانتی‌گراد است. گازوئیل از 3 گروه ساختاری اصلی هیدروکربنی تشکیل شده است که شامل آلکان‌ها، سیکلوآلکان‌ها و ترکیبات اروماتیک است. نسبت این ترکیبات در گازوئیل‌های مختلف، متفاوت است (1 و 2).

بیشتر ترکیبات موجود در گازوئیل برای سیستم‌های زیستی مضر هستند. نشت گازوئیل بر روی زمین‌های کشاورزی، رشد گیاهان را کاهش می‌دهد که به‌دلیل اثر سمیت مستقیم بر گیاهان و کاهش جوانه‌زنی که در نتیجۀ عدم تهویۀ مناسب خاک است صورت می‌گیرد (3). پیامد آن حذف پوشش گیاهی، ازبین‌رفتن پدیدۀ فتوسنتز، فرسایش خاک، خالی‌شدن ساختار اجتماعات گیاهی، افزایش نفوذپذیری خاک نسبت به آلاینده‌ها و در آخر، آلودگی منابع آب‌های سطحی و زیرزمینی است. آلاینده‌های موجود در خاک می‌توانند وارد زنجیرۀ غذایی شوند و سلامت حیوان و انسان را با خطر جدی مواجه سازند. گازوئیل نسبتاً در آب محلول است و می‌تواند در بافت‌ها تجمع پیدا کند (3).

تعداد زیادی از باکتری‌ها، قارچ‌های رشته‌ای و مخمرها می‌توانند سوبستراهای هیدروکربنی گازوئیل را تجزیه کنند. ترکیبات هیدروکربنی باید قبل از تجزیه‌شدن وارد سلول شوند. با این حال، تماس مستقیم بین هیدروکربن‌ها که ماهیت آب‌گریز دارند و غشای سلول که بخش‌های آب‌گریز دارد بدلیل نیروی دافعه دو ترکیب آب گریز ممانعت می شود. تجزیۀ هیدروکربن‌ها توسط میکروب‌ها تا حد زیادی توسط فراهمی‌زیستی هیدروکربن‌ها، تحتِ‌تأثیر قرار می‌گیرد. خصوصیات شیمیایی هیدروکربن‌ها، فراهمی‌زیستی آن‌ها را تعیین می‌کند. برای تجزیه، هیدروکربن‌ها ابتدا باید توسط میکروب‌های تجزیه‌کننده جذب شوند که به معنای فرایند انتقال غشاگذر است. جذب دارای دو مرحله است: ارائۀ هیدروکربن‌ها به میکروب‌ها و انتقال غشاگذر. ترکیبات آلی به‌طور طبیعی برای جذب سوبسترا به‌شکل محلول هستند؛ درحالی‌که جذب بر روی ذرات خاک یک مانع برای تجزیه ایجاد می‌کند (4). مکانیسم‌های متفاوتی توسط گونه‌های تجزیه‌کننده برای افزایش جذب هیدروکربن‌ها وجود دارد؛ برای مثال ترشح بیوسورفاکتانت‌ها یا امولسیون‌کننده‌ها. بیوسورفاکتانت‌ها مولکول‌های فعال سطحی هستند که می‌توانند به‌عنوان پراکنده‌سازها و عوامل اصلاح‌کنندۀ سازگار با محیط زیست در فرایندهای بازسازی مثل تصفیۀ زیستی، شستشوی خاک و غیره به کار روند (5).

تاکنون تعداد زیادی از باکتری‌هایی که قادرند گازوئیل را تجزیه کنند، از خاک‌های آلوده جداسازی شده‌اند. به‌طور مثال دو جنس باکتریایی Micrococcus و Pseudomonas از گاراژ ماهاراشترا[1] در هند جداسازی شده است. در این بررسی سرعت تجزیۀ زیستی هریک از جنس‌ها به دست آمد و نشان داده شد که سرعت تجزیۀ زیستی حالت مخلوط این دو جنس باکتری از حالت منفرد آن‌ها بیشتر است (6). در یک پژوهش با استفاده از یک جمعیت میکروبی مخلوط که از انستیتو مکزیک به دست آمده بود نشان داده شد که با افزودن تلقیح میکروبی به خاک و افزودن تدریجی مواد غذایی، فعالیت میکروبی در خاک آلوده به هیدروکربن‌ها را می‌توان افزایش داد (7).

با توجه به آلودگی‌های نفتی گسترده در استان خوزستان و آثار زیان‌بار این آلودگی‌ها بر روی خاک و پوشش گیاهی این منطقه، این پژوهش در جهت پیداکردن باکتری‌هایی که می‌توانند این نوع آلودگی را حذف کنند طراحی شده است. درخصوص باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ نفت خام تاکنون کارهای بسیاری انجام شده است. اما گزارشات بسیار کمی دربارۀ جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل وجود دارد. هدف از این پژوهش جداسازی باکتری‌های مؤثر در تجزیۀ گازوئیل از خاک‌هایی است که در زمان‌های متمادی تحتِ‌تأثیر آلودگی نفتی بوده‌اند.

 

.مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری: نمونه‌های خاک از پنج ایستگاه نشت گازوئیل از مناطق نفتی مسجد سلیمان، میدان نفت و گاز مارون، میدان نفتی آزادگان، پالایشگاه نفت آبادان، صنایع پتروشیمی اهواز در استان خوزستان جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری تحت شرایط استریل انجام شد. ابتدا 10 سانتی‌متر از سطح خاک برداشته شد و حدوداً 400 گرم از خاک داخل ظروف استریل ریخته شد. نمونه‌های خاک تا انتقال به آزمایشگاه روی یخ نگهداری شدند و سپس در دمای 4 درجه سانتیگراد تا انجام آزمایشات بعدی قرار داده شدند.

جدا سازی و شناسایی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: جهت جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل از محیط بوشنل هاس حاوی 1درصد گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن استفاده شد. از نمونه‌های خاک به‌میزان 5 گرم داخل این محیط جهت غنی‌سازی اولیه تلقیح شد و بر روی شیکر با دورrpm  160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 هفته قرار گرفت. پس از گذشت یک هفته میزان 5 میلی‌لیتر از این محیط برداشته شد و به محیط BH جدید حاوی 1درصد گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن انتقال یافت. عمل شیک‌کردن برای پاساژ دوم به‌مدت یک هفته ادامه یافت تا کدورت به‌دست‌آمدۀ ناشی از رشد باکتری‌های تجزیه‌کننده باشد و آلودگی ترکیبات دیگر در نمونه کاهش یابد. از پاساژ پایانی (پاساژ سوم)، میزان 100میکرولیتر بر روی محیط  NAپخش شد و پس از رشد در دمای 30 درجه سانتی‌گراد ، باکتری‌های متفاوت از نظر کلنی جداسازی شدند و هر کلنی منحصربه‌فرد، به محیط NA جدید منتقل شدند (8). برای شناسایی بیوشیمیایی باکتری‌های جداشده از منابع فوق از آزمایش‌های اولیه شامل رنگ‌آمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، شکل کلنی، حرکت، اکسیداز، کاتالاز، اکسایش/ تخمیر (O/F)، احیای نیترات، تولید H2S، تولید اندول و آزمون ‌ TSI استفاده شد (۹).

.شناسایی مولکولی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: شناسایی مولکولی با تکثیر قسمتی از ژن16S rDNA توسط پرایمرهای رفتی 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 و پرایمر برگشتی 5-TACGYTACCTTGTTACGACTT -3  انجام شد. برنامۀ PCR برای تکثیر ژن بدین صورت بود: دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 55 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه و دمای تکثیر 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه و تعداد سیکل‌ها 35 است محصول حاصل از PCR در ژل آگاروز 1درصد بارگذاری شد و سپس باند bp 1400 از ژل آگاروز طبق دستورالعمل کیت فرمنتاژ (K0513) استخراج و جهت تعیین توالی فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک‌های ژنی بلاست‌شده و همولوژی آن‌ها بررسی شد و قرابت بالاتر از 98درصد به‌عنوان جنس و گونۀ باکتری مجهول لحاظ شد (10).

.سنجش حذف گازوئیل توسط باکتری‌های جداشده:

روش اسپکتروفتومتری: برای این منظور یک کشت 24ساعته از باکتری در محیط  NAتهیه شد و با استفاده از محیط BH، کدورت همۀ آن‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD600=2). سپس باکتری‌ها در دور 5000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب باکتری‌ها به محیط بوشنل هاس براث حاوی 1درصد گازوئیل تلقیح شدند. ارلن‌ها بر روی شیکر با دورrpm 160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 10روز همراه با نمونه شاهد قرار گرفتند. پس از دورۀ انکوباسیون ، نمونه‌ها با شاهد مقایسه و نتایج به‌صورت کیفی گزارش شد (6).  

روش گاز کروماتوگرافی[2] (GC): در این روش یک کشت 24ساعته از باکتری در محیط  NAتهیه شد و با استفاده از محیط BH، کدورت همۀ آن‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD600=2). سپس باکتری‌ها در دور 5000 به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند، مایع رویی دور ریخته شد و رسوب باکتری‌ها به محیط بوشنل هاس براث حاوی 1درصد گازوئیل تلقیح شدند و بر روی شیکر با دورrpm 160 و دمای 30 درجه سانتی‌گراد همراه با شاهد قرار داده شدند. در انتهای دورۀ انکوباسیون (10 روز) میزان 50 میلی‌لیتر دی‌کلرومتان (DCM) به ارلن حاوی کشت باکتری و گازوئیل اضافه شد. DCM به‌خوبی با محیط گازوئیل بوشنل براث مخلوط شد و درون قیف جداکننده ریخته شد تا فاز آلی و آبی از هم جدا شوند. سپس فاز آلی که حاوی گازوئیل حل‌شده در [3]DCM بود درون ارلن ریخته شد و 3 گرم سدیم سولفات جهت جذب آب باقیمانده به ارلن اضافه شد و به‌مدت یک شب در دمای اتاق انکوبه شد. سپس محتویات ارلن از کاغذ واتمن شماره 1 عبور داده شد و در دمای محیط جهت تبخیر DCM قرار گرفت. پس از تبخیر DCM مجدداً 100میکرولیتر DCM به 100 میکرولیتر گازوئیل باقیمانده اضافه شد و توسط دستگاه GC آنالیز شد. برنامۀ GC بدین صورت بود: ستون ) 0.32 mm × 0.1 μm (30 m × varian capillary column cp-sil5cB دتکتور FID، گاز حامل هلیم، دمای اولیه 100 درجه سانتی‌گراد برای 1 دقیقه، دمای انتقال 300 درجه سانتی‌گراد ، دمای تزریق 200 درجه سانتی‌گراد ، دمای نگهداری ستون 100 درجه سانتی‌گراد برای 1 دقیقه، دمای نهایی 300 درجه سانتی‌گراد و جریان عبوری 25 میلی‌لیتر بر دقیقه بود. پیک‌های حاصل از GC با شاهد مقایسه شد و درصد تجزیه برای هر سویه محاسبه شد (11).

 

 

سنجش هیدروفوبیسیته سطح سلولی[4] (BATH): ابتدا سوسپانسیون باکتریایی در بافر تهیه شد . ترکیبات بافر به شرح زیر است (گرم بر لیتر) 22 گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات، 22 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات،26/7 گرم اوره و 2/0 گرم منیزیم سولفات.سپس 200 میکرولیتر هیدروکربن هگزا دکان به آن اضافه شد و پس از 2 دقیقه همزنی، 45 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد تا فاز هیدروکربنی جدا شود و کدورت فاز آبی قبل و بعد از تیمار اندازه‌گیری شد. نتایج به‌صورت جذب فاز آبی بعد از تیمار نسبت به جذب اولیۀ سوسپانسیون باکتریایی محاسبه شد (۱۲).

فعالیت امولسیونه‌کنندگی[5] (E24): باکتری‌های تجزیه‌کننده ابتدا در محیط نوترینت براث به‌همراه 4درصد نمک کشت داده شدند و پس از آنکه باکتری‌ها به رشد لگاریتمی رسیدند، میزان 4 میلی‌لیتر از محیط کشت درون لولۀ آزمایش حاوی 6 میلی‌لیتر از نفت سفید استریل ریخته شد و با سرعت بالا همزنی شد. سپس به‌مدت 24 ساعت به‌صورت ساکن در دمای محیط قرار داده شد. پس از 24 ساعت فعالیت امولسیونه‌کنندگی با فرمول زیر به دست آمد (۱۳).

 

 

 

منحنی رشد سویه در محیط حاوی گازوئیل: برای این منظور یک کشت 24ساعته از هر باکتری در محیط  NBتهیه شد و با استفاده از بافر فسفات، کدورت آن با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر در یک مقدار مشخص تنظیم شد (OD600=1). سپس باکتری به محیط بوشنل هاس براث حاوی غلظت یک درصد گازوئیل تلقیح شد. ارلن‌ها بر روی شیکر با دور rpm 160 در دمای30 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند و رشد باکتری‌ها با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر روزانهسنجش شد (13).

 

نتایج.

جداسازی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل: در طی این پژوهش 34 سویه باکتری از نمونه‌های خاک جداسازی شد. کلیۀ 34 سویۀ جداسازی‌شده در محیط حاوی گازوئیل به‌عنوان تنها منبع کربن کشت داده شدند. تنها ۱۰ سویه قادر به رشد بالاتر و تجزیۀ بیشتری از گازوئیل بودندکه به‌عنوان سویه‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل انتخاب و مطالعات بعدی روی آن‌ها انجام گرفت. در جدول 1 پاره‌ای از ویژگی‏های این باکتری‌ها آمده است.

 

 

جدول 1- باکتری‌های جداسازی‌شده و ویژگی‏‏های آن‌ها

نام سویه

شکل باکتری و واکنش گرم

ویژگی‏‏های کلنی

نتیجۀ آزمون کیفی

OD600

A1

باسیل گرم‌منفی

درشت سفید

+++

853/0

A2

باسیل بلند تیپیک گرم‌منفی

نقطه قطره ریز سفید

+++

925/1

A3

باسیل متوسط گرم‌منفی

ریز حاشیه‌ای سفید

+++

870/1

B1

باسیل ریز گرم‌منفی

متوسط نخودی

-

238/0

B2

کوکو باسیل گرم‌منفی

ریز سرسوزنی شیری

++

670/1

B3

کوکو باسیل گرم‌منفی

درشت شیری

-

762/0

C1

باسیل ریز گرم‌منفی

ریز سفید

++++

106/2

D3

کوکو باسیل گرم‌منفی کورینه فرمی

درشت سفید

+++

798/1

K2

کوکو باسیل گرم‌منفی

متوسط مات لزج

++++

309/2

L2

باسیل بلند گرم‌منفی

درشت مات

++++

715/1


 

 

انتخاب سویه‌های برتر تجزیه‌کننده گازوئیل با غربالگری باکتری‌های جداسازی‌شده: در این مرحله فعالیت امولسیون‌کنندگی (E24) و هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی (BATH) ۱۰ سویۀ تجزیه‌کننده بررسی شد. سویه‌های برتر با درنظرگرفتن این دو ویژگی انتخاب شدند. نتایج حاصل در جدول 2 آمده است با توجه به این جدول بیشترین هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی مربوط به سویۀ K2و بیشترین فعالیت امولسیون‌کنندگی مربوط به سویه‌هایA3وB2است.

شناسایی بیوشیمیایی: پس از غربالگری اولیه، آزمون‌های بیوشیمیایی جهت شناسایی سویه‌های برتر انجام شد. در جدول 3 نتایج حاصل از این آزمون‌ها برای هر سویه آمده است. این نتایج نشان می‌دهد که سویه‌ها در برخی صفات بیوشیمیایی با یکدیگر تفاوت دارند. با توجه به جدول سویه‌های ‌A2, A3, B3, K2 غیر متحرک و سویه‌های A1, K2, L2قابلیت تولید گاز در محیط TSI  را دارند.

 

جدول 2- فعالیت امولسیون‌کنندگی و هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی سویه‌ها

نام سویه

فعالیت امولسیون‌کنندگی E24 %))

هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی BATH %))

A1

15

2

A2

46

7

A3

50

8

B1

33

2

B2

58

9

B3

16

3

C1

41

61

D3

33

4

K2

46

76

L2

30

18

 

 

 

جدول 3- نتیجه آزمون‌های بیوشیمیایی باکتری‌های تجزیه‌کننده

نام سویه

TSI

تولید گاز

تولید اندول

حرکت

O/F

کاتالاز

اکسیداز

A1

قلیا/ اسید

+

-

+

+/-

+

-

A2

قلیا/ قلیا

-

-

-

-/-

+

-

A3

قلیا/ قلیا

-

-

-

-/-

+

+

B1

قلیا/ قلیا

-

-

+

-/-

+

+

B2

قلیا/ قلیا

-

-

+

-/-

+

+

B3

قلیا/ قلیا

-

-

-

-/-

+

-

C1

قلیا/ قلیا

-

-

+

-/+

+

+

D3

قلیا/ قلیا

-

-

+

+/+

+

+

K2

اسید/ اسید

+

+

-

+/+

+

-

L2

اسید/ اسید

+

-

+

+/+

+

-

 

 

 

 

 

شناسایی مولکولی: شناسایی مولکولی باکتری‌های قوی در تجزیۀ گازوئیل با تکثیر قسمتی از ناحیه ژنی S rRNA16 با پرایمرهای ویژۀ این ژن انجام شد. سپس محصول bp1400 حاصل از PCR از ژل استخراج، خالص‌سازی و جهت تعیین توالی فرستاده شد. توالی‌های حاصل‌شده در بانک‌های ژنی بلاست شد و بالاترین همولوژی (بالاتر از 98درصد) به‌عنوان جنس و گونۀ باکتری تعیین شد. توالی حاصل‌شده و بالاترین همسانی پس از بلاست‌کردن توالی به‌دست‌آمده در بانک‌های ژنی به‌همراه شمارۀ دستیابی توالی این سویه‌ها در پایگاه EMBL برای هر سویه در جدول 4 آمده است. فیلوژنی این باکتری‌ها در شکل 1 آمده است.

 

جدول 4- توالی به‌دست‌آمده برای سویه‌های تجزیه‌کنندۀ برتر

نام سویه

شناسایی سویه

شمارۀ دستیابی

B2

Achromobacter denitrificans

LK391628

D3

Achromobacter xylosoxidans

LK391627

K2

Klebsiella oxytoca

LK39163

L2

Enterobacter cloacae

LK391629

 

 

 

 

 

 

شکل 1- درخت فیلوژنی جنس‌های ‌Achromobacter ، Enterobacter و Klebsiella


رشد و تجزیۀ گازوئیل توسط سویه‌های برتر: کلیۀ سویه‌ها در محیط  BHحاوی ۱درصد گازوئیل در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و دورrpm  160 به‌مدت 10 روز کشت داده شدند. سپس میزان رشد سویه‌ها به‌صورت کیفی و کمی با مقایسه با نمونه شاهد به دست آمد. درصد تجزیۀ گازوئیل نیز با محاسبه سطح زیر منحنی برای هر نمونه به دست آمد. نتایج حاصل‌شده در جدول 5 آمده است. پیک‌های حاصله از گاز کروماتوگرافی در شکل 2 نشان داده شده است. همان‌طور که در این جدول دیده می‌شود هر چهار سویۀ برتر قادر به حذف بیش از ۵۰درصد نفت پس از ده روز هستند اما سویۀ L2 بالاترین میزان حذف گازوئیل را دارد.

منحنی رشد سویه‌های برتر تجزیه‌کننده: برای این منظور، رشد باکتری‌های درون ارلن‌های حاوی محیط بوشنل براث که بر روی شیکر با دور rpm160 در دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شده بودند، با خواندن جذب نوری در 600 نانومتر با فاصله زمانی 1 روزه سنجش شد. نتایج حاصل‌شده در شکل 3 آمده است. همان‌طور که در این شکل دیده می‌شود، بیشترین میزان رشد پس از 10 روز مربوط به سویۀ K2 با 95/1=OD600 بود که قدرت تجزیه‌کنندگی بالایی در مقایسه با سایر سویه‌ها دارد و کمترین میزان رشد مربوط به سویۀ L2 با 23/1OD600= بود که قدرت تجزیه‌کنندگی پایینی نیز دارد.

 

جدول 5- میزان رشد ودرصد حذف گازوئیل سویه‌ها پس از 10 روز

نام سویه

OD600

رشد کیفی

 (محیط عمومی)

رشد کیفی

 (محیط اختصاصی)

درصد تجزیۀ محاسبه‌شده با GC

Achromobacter denitrificans strain B2

670/1

++

++

55

Achromobacter xylosoxidans strain D3

798/1

++

++

61

Klebsiella oxytoca strain K2

309/1

+

+

53

Enterobacter cloacae strain L2

715/1

+

++

72

 

 

شکل 3- منحنی رشد چهار سویۀ برتر در محیط حاوی گازوئیل

 

شکل 2- طیف‌های گاز کروماتوگرافی حاصل‌شده از تجزیۀ گازوئیل توسط باکتری‌های برتر

 


بحث و نتیجه‌گیری.

توانایی میکروبی برای تجزیۀ هیدروکربن‌های گازوئیل در خاک و آب مشاهده شده است. پژوهشگران متعددی باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیل را از محیط‌های گوناگون جداسازی کرده‌اند. از جمله اکوسیستم‌های دریایی می‌توان به پژوهش لو[vi] و همکاران اشاره کرد. آن‌ها در پژوهش خود از آب‌های آلودۀ چین یک سویۀ باکتریایی متعلق به جنس Acinetobacter جداسازی کردند (۱۱).

شوکور[vii] و همکاران از خاک‌های آلوده به گازوئیل در اندونزی یک باکتری متعلق به جنس Staphylococcus aureus جدا کردند (14). همچنین این پژوهشگران موفق به جداسازی یک جنس Pseudomonas از منطقۀ جنوبگان شدند (15).

رحمان[viii] و همکاران 11 جنس باکتریایی از خاک‌های آلوده بمبی در هند جداسازی کردندکه شامل: Micrococcus، Corynebacterium، Flavobacterium، Bacillus، Pseudomonas، Moraxella، Alcaligenes، Enterobacter، Aeromonas، Vibrio و Acinetobacter بودند (16).

 نیشا[ix] و همکاران از یک منطقۀ آلودۀ گازوئیلی در هند 2 سویه از جنس Staphylococcus، یک سویه از جنس Pseudomonas و دو سویه از جنس Bacillusشناسایی شدند(17). سیریک[x] و همکاران از یک منطقۀ آلوده در بریتانیا 12 باکتری تجزیه‌کننده جداسازی کردند که مربوط به جنس‌های ‌Rhodococcus، Pseudomonas، Achromobacter، Psychrobacter و Acinetobacter بود(18). هونگ[xi] و همکاران از یک منطقۀ آلوده در کره یه سویۀ باکتریایی Pseudomonas aeruginosa IU5 جداسازی کردند (8).

در پژوهش حاضر تعداد 34 سویۀ باکتریایی از خاک‌های آلوده به مواد نفتی در استان خوزستان جداسازی شد. سویه‌های باکتریایی جداشده در این پژوهش به جنس‌های ‌Achromobacter، Enterobacter و Klebsiella تعلق داشتند. این جنس‌های میکروبی تجزیه‌کننده با جنس‌هایی که پژوهشگران دیگر شرح داده‌اند، هم‌خوانی دارد. اما سویۀ متعلق به جنس Klebsiella را تنها چمخا[xii] و همکاران از یک منطقه در جزایر قرقنه[xiii] گزارش داده‌اند که توانایی تجزیه‌کنندگی هیدروکربن‌های آلیفاتیک نفت را دارد، و تاکنون توانایی تجزیه‌کنندگی گازوئیل این جنس باکتری گزارش نشده است (19).

از روش‌های گوناگونی جهت بررسی میزان حذف گازوئیل توسط باکتری‌های تجزیه‌کننده استفاده شده است. نیخی[xiv] و همکاران از روش گراوی متری جهت سنجش تجزیۀ گازوئیل استفاده کردند. این پژوهشگران حذف گازوئیل را در دوره‌های ‌5، 10، 15، 20 و 25 روزه با این روش اندازه‌گیری کردند. اغلب پژوهشگران بر استفاده از روش کروماتوگرافی و اندازه‌گیری طیف‌های حاصل‌شده به‌عنوان بهترین و مطمئن‌ترین روش بررسی حذف گازوئیل تأکید دارند و در اکثر مقالات از این روش استفاده شده است (6، 19 و 20).

در پژوهش حاضر از دو روش کیفی و کروماتوگرافی گازی جهت سنجش تجزیۀ گازوئیل استفاده شد و مقایسۀ نتایج حاصل از این دو روش هم‌خوانی آن‌ها را نشان داد. در این پژوهش بالاترین حذف گازوئیل پس از 10 روز مربوط به سویۀ Enterobacter cloacae strain L2 (72درصد) است که از حذف گازوئیل به‌دست‌آمده توسط پژوهشگرانی همچون هونگ و همکاران که از سویۀ منفرد جهت تجزیۀ گازوئیل استفاده کردند بالاتر است (11).

حلالیت گازوئیل در آب، پایین است. بنابراین بایستی که باکتری‌ها باید برای جذب و استفاده از این ماده آب‌گریز مکانیسم‌هایی داشته باشند. هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی وتولید امولسیون‌کننده‌ها ممکن است دو مکانیسم برای جذب و تجزیۀ بهتر گازوئیل در محیط‌های آبی باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که رابطه‌ای مستقیم بین هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی(E24) و فعالیت امولسیون‌کنندگی (BATH) در تجزیۀ زیستی گازوئیل وجود دارد. ازآنجایی‌که سویۀ L2 هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی و فعالیت امولسیون‌کنندگی بالایی دارد، می‌تواند گازوئیل را به‌مقدار زیاد و در غلظت‌های بالاتر در مقایسه با سایر سویه‌ها تجزیه کند؛ بنابراین نتایج اثبات کرد که وقتی یک سویۀ باکتری، هیدروفوبیسیتۀ سطح سلولی بالایی دارد، می‌تواند امولسیون‌کننده‌های بیشتری تولید کند و تجزیۀ زیستی گازوئیل را افزایش دهد. حسن شاهیان[xv] و همکاران یک رابطۀ آشکار بین فعالیت امولسیون‌کنندگی، چسبندگی سلولی به هیدروکربن و سرعت رشد باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ نفت خام در محیط نفت خام گزارش کردند (10).

در این پژوهش باکتری‌های تجزیه‌کنندۀ گازوئیلی از مناطق آلوده جداسازی شدند. این باکتری‌ها پس از شناسایی در جنس‌های متفاوتی از جمله: Achromobacter، Enterobacter و Klebsiella قرار گرفتند. این باکتری‌ها قابلیت بالای تجزیۀ گازوئیل را نشان دادند. آن‌ها دارای خصوصیاتی همچون تولید بیوسورفکتانت و چسبندگی سطح سلولی بودند. نتایج نشان داد که این باکتری‌ها قابلیت تجزیۀ زیستی در خاک‌های ایران را دارند و با به‌کاربردن این باکتری‌ها برای تصفیۀ زیستی، می‌توان آلودگی‌های گازوئیلی را کاهش داد.



[1]- Maharashtra

[2]- Gas Chromatography

[3]- Dichloromethane

[4]- Bacterial Adhesion To Hydrocarbon

[5]- Emulsification Activity

[vi]- Luo

[vii]- Shukor

[viii]- Rahman

[ix]- Nisha

[x]- Ciric

[xi]- Hong

[xii]- Chamkha

[xiii]- Kerkennah island

[xiv]- Nikhi

[xv]- Hassanshahian

(1)              Hassanshahian M, Zeynalipour MS, Hosseinzadeh Musa F. Isolation and characterization of crude oil degrading bacteria from the Persian Gulf (Khorramshahr provenance). Marine Pollution Bulletin 2014; 82: 39-44.

(2)              Durand JP, Béboulène JJ, Ducrozet A. Detailed characterization of petroleum products with capillary analyzers. Analusis 1995; 23: 481-483.

(3)              Baker JM. Mangroove swamps and the oil Industry. Oil and Petrochemical Pollution 1982; 1(1): 5-22.

(4)              Li XW, Liu ZP. Microbial biodegradation of petroleum hydrocarbon. Acta Microbiology Sinica 2002; 42: 764-767.

(5)              Niazy Z, Hassanshahian M, Ataei A. Isolation and characterization of diesel-degrading Pseudomonasstrains from diesel-contaminated soils in Iran (Fars province). Pollution 2016; 2(1): 68-75.

(6)              Nikhi T, Deepa V, Rohan G, Satish B. Isolation, Characterization and Identification of Diesel Engine Oil Degrading Bacteria from Garage Soil and Comparison of their Bioremediation Potential. International Research Journal of Environment Sciences 2013; 2(2): 48-52.

(7)              Marquez-Rocha FJ, Hernandez-Rodriguez,V, Teresalamela MA. Biodegradation of diesel oil in soil by a microbial consortium. Water, Air and Soil Pollution 2001; 128: 313–320.

(8)              Hong JH, Kim J, Choi OK, Cho KS, Ryu HW. Characterization of a diesel degrading bacterium, Pseudomonas aeruginosa IU5, isolated from oil-contaminated soil in Korea. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2005; 21: 381–384.

(9)              Holt SG, Kriey NR, Sneath PHA, Staley JT Williams ST. Bergys Manual of Determinative for Bacteriology. 4rd ed. New York: Williams and Wilkins: 1996.

(10)          Hassanshahian M, Emtiazi G, Kermanshahi R, Cappello S. Comparison of oil degrading microbial communities in sediments from the Persian Gulf and Caspian Sea. Soil and Sediment Contamination 2010; 19 (3): 277–291.

(11)          Luo Q, Zhang JG, Shen XR, Fan ZQ, He Y, Hou DY. Isolation and characterization of marine diesel oil-degrading Acinetobactersp. strain Y2. Annals of Microbiology 2013; 63: 633–640.

(12)          Pruthi V, Cameotra SS. Rapid identification of biosurfactant-producing bacterial strains using a cell surface hydrophobicity technique. Biotechnology Techonology 1997; 11: 671-674.

(13)          Batista SB, Mounteer A, Amorim FR, Totola MR. Isolation and characterization of biosurfactant bioemulsifier- producing bacteria frompetroleum contaminated sites. Bioresource Technology 2006; 97: 868-875.

(14)          Shukor MY, Dahalan FA, Salvamani S, Jusoh A Z, Shamaan NA, Syed MA. Characterization of a diesel-degrading enzymes from Acinetobacter sp.strine DYR12. Bioremediation Science and Technology Research 2013; 76(2): 34-45.

(15)          Shukor MY, Hassan AZ, Jusoh AZ, Perumal N, Shamaan NA, MacCormack WP, Syed MA. Isolation and characterization of a Pseudomonas diesel-degrading strain from Antarctica. Journal Environmental Biology 2009; 30(1): 1-6.

(16)          Rahman PK, Lakshmanaperumalsamy P, Banat IM. Occurrence of crude oil degrading bacteria in gasoline and diesel station soils. Journal of Basic Microbiology 2002; 42(4): 284-291.

(17)          Nisha P, Nayana M, Varghese M. Degradation Studies on Diesel Oil Using Bacterial Consortium Isolated From Oil Polluted Soil. Advanced Biotechnology 2013; 13(2): 06-14.

(18)          Ciric L, Philp JC, Whiteley AS. Hydrocarbon utilization within a diesel-degrading bacterial consortium. FEMS microbiology letters 2010; 303:116–122.

(19)          Chamkha M, Trabelsi Y, Mnif S, Sayadi S. Isolation and characterization of Klebsiella oxytoca strain degrading crude oil from a Tunisian off‐shore oil field. Journal of Basic Microbiology 2011; 51(6): 580-589.

(20)          Hassanshahian M, Emtiazi G. Isolation, and molecular detection ofAlcanivoraxdieselolei in the Persian Gulf and the study of biodegradation ability for remediation of oil pollution. Biological Journal of Microorganism 2012; 1(1): 1-4.