جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های اندوفیت نعناع فلفلی، بابونه، مارچوبه و بررسی تأثیر جدایه‌ها در بازدارندگی فعالیت قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری تخصصی میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، سمنان، ایران

2 استادیار پژوهشی بیولوژی خاک، مرکز تحقیقات کشاورزی و منابع طبیعی، گرگان، ایران

3 دانشجوی دکتری تخصصی میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد علوم و تحقیقات، تهران، ایران

4 استادیار ژنتیک، دانشگاه آزاد اسلامی، واحد دامغان، سمنان، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‌های اندوفیت از میکروارگانیسم‌های غیربیماری‌زای ساکن بافت‌های گیاهی‌اند که با تولید فاکتورهای رشد باعث افزایش متابولیسم، رشد و مقاومت گیاه در برابر عوامل بیماری‌زا و تنش‌های محیطی می‌شوند. این مطالعه به‌منظور جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های اندوفیت گیاهان دارویی نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه و بررسی فعالیت ضدمیکروبی جدایه‌ها علیه چندین پاتوژن گیاهی (آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا، فوزاریوم اکسی پوروم و موکور هایمالیس) و نیز بررسی تأثیر جدایه‌های اندوفیت بر عملکرد رشد گیاهان، انجام گرفت.
مواد و روش‌ها: باکتری‌های اندوفیت از بافت ریشۀ نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه جداسازی شد. فعالیت ضدقارچی جدایه‌های اندوفیت روی پاتوژن‌های قارچی آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا، فوزاریوم اکسی پوروم و موکور هایمالیس با استفادهاز روش ایجاد چاهک در محیط مولر هینتون آگار بررسی شد. هر بذر گیاه به سوسپانسیون جدایه‌های اندوفیت تلقیح و در گلدان‌های حاوی 300 گرم خاک کاشته شد. تأثیر جدایه‌های تلقیح‌شده روی پارامترهای رویشی گیاهان بررسی و با نرم‌افزار آماری SAS 9.2 تحلیل شد.
نتایج: در مجموع 6 جدایۀ اندوفیت متعلق به جنس باسیلوس از ریشۀ گیاهان موردمطالعه جدا شد. بررسی‌های آماری و نتایج حاصل از تجزیۀ واریانس داده‌ها نشان داد که جدایه‌ها تأثیر معنی‌داری را در فعالیت بازدارندگی پاتوژن‌های قارچی و نیز در رشد گیاهان آزمایش‌شده داشتند. رشد سه گیاه نعناع فلفلی، بابونه، و مارچوبه نشان داد که نمونه‌های گیاهی تیمارشده با باکتری‌های اندوفیت در مقایسه با نمونه‌های فاقد تیمار باکتری، طول بیشتر داشت. ‌
بحث و نتیجه‌گیری: در این مطالعه، باکتری‌های اندوفیت از سه گیاه نعناع فلفلی، بابونه، و مارچوبه جدا شد و تأثیر فعالیت بازدارندگی جدایه‌ها روی پاتوژن‌های قارچی رایج و نیز در بهبود رشد گیاهان تأیید شد. با توجه به پتانسیل بالقوۀ اندوفیت‌ها، این میکروارگانیسم‌ها به‌عنوان عوامل بیوکنترل در کشاورزی، جهت افزایش مقاومت گیاهان در برابر بیماری‌زاهای قارچی و تنش‌های محیطی و نیز در بهبود رشد و باروری گیاهان می‌توانند استفاده شوند. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and molecular characterization of endophytic bacteria from peppermint, chamomile, asparagus and antagonistic effect of isolates on fungal plant pathogens

نویسندگان [English]

  • Vahideh Faghanizadeh 1
  • Mohamad Hosein Arzanesh 2
  • Sajjad Yazdansetad 3
  • Reza Nezamzadeh 4
1 Ph.D. Student of Microbiology, Islamic Azad University, Damghan Branch, Semnan, Iran
2 Assistant Professor of Soil Biology, Agriculture and Natural Resources Research Center, Gorgan, Iran
3 Ph.D. Candidate of Microbiology, Islamic Azad University, Science and Research Branch, Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Genetics, Islamic Azad University, Damghan Branch, Semnan, Iran
چکیده [English]

Introduction:The endophytic bacteria are non-pathogenic organisms residing plant tissues which produced growth factors to increase metabolism, growth and resistance of plants to the pathogens and environmental tensions. The present study was aimed (i) to isolate and molecular characterization of endophytic bacteria from peppermint, chamomile, and asparagus (ii) to investigate antagonistic effect of isolates on fungal pathogens including Aspergillus niger, Alternaria alternata, Fusarium oxysporum and Mucor hiemalis (iii) to survey of isolates effect on plant growth characters.
Materials and methods: The endophytic bacteria were isolated from root tissue of peppermint, chamomile, and asparagus. The antagonistic effect of endophytic isolates were investigated on fungal pathogens including Alternaria alternata, Fusarium oxysporum and Mucor hiemalis using agar well diffusion assay testing on Mueller-Hinton agar. The seeds of plants inoculated to the bacterial suspension and then were cultured in vases containing 300 g soil. The isolates effect was studied on plant growth parameters and analyzed by statistical software SAS 9.2.
Results: A total of 6 endophytic bacteria (E1-E6) belonging Bacillus sp. were isolated from the plant root. The statistical and variance analysis indicated significance effect of isolates on fungal pathogens inhibition and plant growth improvement. The growth of peppermint, chamomile, and asparagus were showed high length of the plants which had been treated with the endophytic bacteria rather than the non-treatment of plants.
Discussion and conclusion: In this study, the endophytic bacteria were isolated from peppermint, chamomile, and asparagus, then verified antagonistic effect of isolates on current fungal pathogens, also on plant growth improvement. Regarding the potential of endophytic bacteria, the organisms can be used as biocontrols in agriculture, increasing resistance of plants against fungal pathogens, environmental stresses and improving growth of plants.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Endophytic bacteria
  • Peppermint
  • Chamomile
  • Asparagus
  • Fungal pathogens

مقدمه.

باکتری‌های اندوفیت از میکروارگانیسم‌های غیربیماری‌زای گیاهان هستند که حداقل بخشی از زندگی خود را در بافت‌های گیاهی به سر می‌برند. از نظر تکاملی به نظر می‌رسد که باکتری‌های اندوفیت حد واسط باکتری‌های ساپروفیت و بیماری‌زای گیاهی باشند و درواقع این باکتری‌ها ساپروفیت‌هایی هستند که بدون ایجاد آسیب در میزبان، توانسته‌اند خود را در پناهگاهی حفظ کنند. فسیل‌ها ارتباط بین گیاهان و اندوفیت‌ها را نشان می‌دهند و این حاکی از نقش مهم اندوفیت‌ها در تکامل گونه‌های گیاهی و حیات در کرۀ زمین است (1). ریزوسفر، خاستگاه اغلب باکتری‌های اندوفیت است. باکتری‌های ساکن ریزوسفر به‌طریق شیمیوتاکسی به میزبان نزدیک می‌شوند و ورود این باکتری‌ها به بافت‌های گیاهی از طریق روزنه، عدسک، زخم‌های حاصل از شکسته‌شدن تریکوم‌ها، منطقۀ خروج ریشه‌های جانبی و منطقۀ خروج رادیکال‌های ریشه صورت می‌گیرد. اغلب باکتری‌های اندوفیت در فضای بین سلولی ریشه تکثیر می‌یابند و یا ممکن است وارد سلول‌های دایرۀ محیطیه شوند و سپس وارد سلول‌های پارانشیم شوند (1و2). سپس، سیستم‌های ژنتیکی اختصاصی بین باکتری و گیاه فعال می‌شود (3). باکتری‌های اندوفیت ضمن استفاده از مواد مغذی که گیاه تولید کرده، با تثبیت نیتروژن، تولید مواد معدنی در دسترس، تولید 3و2 بوتان دی اُل، استوئین (4) و نیز با تولید هورمون‌هایی همچون اتیلن، اکسین، سیتوکینین و جیبرلین باعث افزایش متابولیسم و رشد گیاه و با تولید ترپونوئید، فلاوونوئید، و ایزوفلاوونوئید باعث افزایش مقاومت گیاه در برابر عوامل بیماری‌زا و مقابلۀ گیاه با استرس‌ها و تنش‌های محیطی می‌شوند. علاوه بر این، باکتری‌های اندوفیت با تولید ترکیبات ضدقارچی، تولید سیدروفور، رقابت برای مواد غذایی، محدودکردن نیچ اکولوژیکی و مقاومت القایی گیاه نقش مهمی را در کنترل بیولوژیکی آفات و ارگانیسم‌های مزاحم و بیماری‌زا ایفا می‌کنند (3). علاوه بر این، از باکتری‌های اندوفیت در مهندسی ژنتیک جهت انتقال ژن‌های خاص به میزبان استفاده می‌شود (5). این میکروارگانیسم‌ها پتانسیل بالقوه جهت بهرمندی در صنعت کشاورزی و ارتقای کیفیت محصولات زراعی را دارند (6).

قارچ‌های جنس فوزاریوم، آسپرژیلوس، آلترناریا و موکور از مهم‌ترین قارچ‌های بیماری‌زای گیاهان هستند که باعث پژمردگی، فساد و ازبین‌رفتن محصولات زراعی می‌شوند (7- 9). دلیل انتخاب گیاهان تیرۀ نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه در این مطالعه این است که این‌ها از مهم‌ترین گیاهان دارویی و تولیدکنندۀ مواد ضدمیکروبی متعدد هستند. این مطالعه به‌منظور جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‌های اندوفیت (درون همزیست) گیاهان دارویی نعناع فلفلی، بابونه و مارچوبه و بررسی فعالیت ضدمیکروبی جدایه‌ها علیه چندین پاتوژن گیاهی (آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا، فوزاریوم اکسی پوروم و موکور هایمالیس) و نیز بررسی تأثیر جدایه‌های اندوفیت روی عملکرد رشد گیاهان انجام گرفت.

 

مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری: نمونه‌های ریشۀ گیاهان دارویی نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه به همراه ریزوسفر یا خاک اطراف ریشۀ آن‌ها از مناطق مختلف استان گلستان (باغ مرکز تحقیقات کشاورزی گرگان واقع در 6 کیلومتری شمال گرگان به طول جغرافیایی '25 °54 و عرض جغرافیایی '54 °36، منطقۀ توسکستان واقع در 18 کیلومتری جنوب شرقی گرگان به طول جغرافیایی '34 54° و عرض جغرافیایی '46 °36 و منطقه کتول واقع در 40 کیلومتری شرق گرگان به طول جغرافیایی '52 °54 و عرض جغرافیایی '54 °36) جمع‌آوری شد. نمونه‌ها در ظروف سترون با ذکر تمامی مشخصات به آزمایشگاه مرکز تحقیقات میکروبیولوژی منتقل شد.

جداسازی باکتری‌های اندوفیت: برای جداسازی باکتری‌های اندوفیت از ریشۀ گیاهان دارویی، ابتدا نمونه‌های خاک ریشه به‌منظور زدودن گل و لای سطحی با آب شهری شستشو داده شد تا به همراه گل و لای، میکروب‌های سطحی نیز زدوده شود. سپس نمونه‌های ریشه توسط اسکالپل استریل برش داده شد و به قطعات 3-2 سانتی‌متری تبدیل شد. قطعات خردشده با احتیاط با آب مقطر استریل در پلیت شستشو داده شد و به‌وسیلۀ یک پنس استریل به پلیت دیگر منتقل شد و به‌مدت یک دقیقه در الکل اتیلیک (مرک، آلمان[1]) 70درصد و بعد به‌مدت 5 دقیقه در هایپوکلریت سدیم (مرک، آلمان) 2درصد غوطه‌ور شد. سپس، نمونه‌ها با استفاده از پنس استریل به پلیت استریل دیگر منتقل شد و 5 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد تا مواد ضدعفونی‌کننده به‌طور کامل از نمونه‌ها زدوده شود. در مرحلۀ بعد، نمونه‌ها به پلیت حاوی کلرید جیوه (مرک، آلمان) 1/0 درصد انتقال یافت و به‌مدت 2 دقیقه تیمار شد. درنهایت نمونه‌ها 3 بار با آب مقطر استریل شستشو داده شد. نمونه‌های ریشه در پلیت استریل در کنار شعله توسط میلۀ شیشه‌ای ته گرد کاملاً له شد. با استفاده از سواپ استریل از نمونه‌های له‌شده و از بافت درونی ریشه برداشته و روی محیط کشت نوترینت آگار و پپتون سویا آگار کشت و در دمای 35 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 24 ساعت گرماگذاری شد (10و11).

خالص‌سازی کشت‌های باکتری: جهت خالص‌سازی باکتری‌ها از روش کشت خطی استفاده شد. باکتری‌های خالص‌شده تحت بررسی‌های مورفولوژیکی، ماکروسکوپی و میکروسکوپی قرار گرفت (11).

شناسایی مقدماتی جدایه‌های باکتری: جدایه‌ها با استفاده از آزمون‌های بیوشیمیایی شامل کاتالاز، اکسیداز، احیای نیترات، MR-VP، SIM، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز ژلاتین، مصرف قندهای مختلف و فعالیت‌های آنزیمی اوره‌آز، آمیلاز، و پروتئاز بررسی شد. ضمن اینکه توانایی رشد جدایه‌ها در غلظت 7 درصد کلرید سدیم نیز بررسی شد (12).

استخراج DNA باکتری‌ها: استخراج DNA باکتری‌ها با استفاده از کیت استخراج DNA کیاژن (کیاژن، آلمان[2]) انجام گرفت.

تکثیر قطعۀ 16S rDNA باکتری‌ها با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR): واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با حجم نهایی 25 میکرولیتر شامل: 10 نانوگرم بر میکرولیتر DNA الگو، 4/0 میکرومولار از هر پرایمر فوروارد و ریورس، 2/0 میلی‌مولارdNTP ، 2 میلی‌مولار MgCl2، 5/2 میکرولیتر بافر PCR 10X و 1 واحد آنزیم Taq DNA Polymerase انجام شد. واکنش PCR با روش استاندارد (13) و با استفاده از پرایمرهای عمومی (F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3', R: 5'-GACGGGCGGTGTGTACAA-3') در دستگاه ترمال سایکلر (اپندورف، آلمان[3]) تحت شرایط دمایی 5 دقیقه واسرشت‌شدن اولیه در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد و در ادامه 35 چرخه شامل واسرشت‌شدن در دمای 94 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 1 دقیقه، اتصال در دمای 45 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه، طویل‌شدن در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 90 ثانیه و درنهایت طویل‌شدن نهایی در دمای 72 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه انجام گرفت. درنهایت، قطعۀ تکثیرشده جهت تعیین توالی به شرکت ماکروژن، کره جنوبی[4] فرستاده شد.

بررسی فعالیت ضدقارچی جدایه‌ها: قارچ‌های آسپرژیلوس نایجر (PTCC No.5012)، آلترناریا آلترناتا (PTCC No.5224)، فوزاریوم اکسی پوروم (PTCC No.5115) و موکور هایمالیس (PTCC No.5292) ازمرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های صنعتی (بانک قارچ و مخمر) سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران[5] تهیه شد. جدایه‌های اندوفیت به محیط نوترینت براث تلقیح و در 30 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. از سوسپانسیون باکتری‌ها روی محیط مولر هینتون آگار به‌صورت یک خط موازی کشت داده شد. قارچ‌های آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا، فوزاریوم اکسی پوروم و موکور هایمالیس نیز در محیط سابوراد دکستروز براث کشت داده و گرماگذاری شد. مقدار مناسبی از کشت تازۀ قارچی به محیط کشت نوترینت براث استریل تلقیح شد تاآنجایی‌که چگالی نوری محیط، معادل استاندارد نیم مک فارلند شد. از سوسپانسیون موجود مقدار 20 میکرولیتر برداشته و روی محیط مولر هینتون آگار به فاصلۀ 5 میلی‌متر از خط کشت باکتری‌های اندوفیت به صورت نقطه‌ای کشت داده شد و در 30 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 48-24 ساعت گرماگذاری شد (14). علاوه بر این، از روش ایجاد چاهک در محیط مولر هینتون آگار استفاده شد. در این روش، سوسپانسیون قارچی با روش کشت متراکم روی محیط مولر هینتون آگار کشت داده شد. سپس چهار چاهک هم‌اندازه در محیط ایجاد شد. سوسپانسیون باکتری در 8000  دور در دقیقه به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و از مایع رویی به‌مقدار 50 میکرولیتر در چاهک‌ها بارگذاری شد و در 30 درجۀ سانتی‌گراد به‌مدت 24 ساعت گرماگذاری شد. بعد از این مدت، قطر بازدارندگی رشد قارچی بررسی شد (15).

اثر تلقیح باکتری‌های اندوفیت روی پارامترهای رویشی گیاهان دارویی: بذرهای گیاهان دارویی نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه از مؤسسه تحقیقات اصلاح و تهیه نهال و بذر[6] خریداری شد. یک گرم از هر بذر گیاه به 10 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری‌ها با جمعیت احتمالی معادل استاندارد نیم مک فارلند تلقیح و پس از تیمار به‌مدت 8 ساعت، بذرها در گلدان‌های حاوی 300 گرم خاک کاشته شد.

مرحلۀ کاشت: طرح آزمایشی در این مرحله از مطالعه، طرح کامل تصادفی با شش سطح باکتری و سه شاهد با سه تکرار بود. برای این منظور، مقدار یک گرم از هر بذر گیاه در عمق 5/0 سانتی‌متری خاک نهاده شد و با 2 میلی‌لیتر آب شهری آبیاری شد. ضمن اینکه در تیمارهای آزمایشی حاوی باکتری، هر گرم بذر به همراه 2 میلی‌لیتر از سوسپانسیون باکتری بود. نمونۀ شاهد (کنترل) نیز هر گرم بذر گیاه آبیاری‌شده با 2 میلی‌لیتر آب شهری بود.

مرحلۀ داشت و تنک‌کردن: تمامی گلدان‌ها در روزهای اولیه با 2 میلی‌لیتر و در روزهای بعدی با 5 میلی‌لیتر آب شهری آبیاری شد. پس از جوانه‌زنی گیاهان، هر گیاه در گلدان مجزایی کاشته شد و هر گلدان روزانه با 3 میلی‌لیتر آب شهری آبیاری شد.

اندازه‌گیری رشد طولی گیاه: بعد از 14 روز از کاشت، رشد طولی گیاهان در همۀ تیمارهای موردآزمایش با استفاده از خط‌کش اندازه‌گیری و با نمونۀ شاهد مقایسه شد.

 

نتایج.

همۀ جدایه‌های اندوفیت سه گیاه دارویی نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه از نظر واکنش گرم‌مثبت بودند. نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی جدایه‌ها در جدول 1آورده شده است.

تکثیر قطعۀ 16S rDNA جدایه‌های باکتری با استفاده از واکنش PCR: تکثیر قطعۀ ژنی16S rDNA باکتری‌های اندوفیت باند مناسب در اندازۀ حدوداً 1494 جفت باز را نشان داد (شکل 1). توالی تعیین‌شدۀ قطعۀ ژنی با نرم‌افزار بلاست موجود در وب سایت NCBI[7] بررسی شد و درصد شباهت جدایه‌ها مقایسه شد (جدول 2).

 

شکل 1- تکثیر قطعۀ 16S rDNA باکتری‌های اندوفیت (E1-E6)، NC: کنترل منفی، M: نشانگر 1kb plus (Fermentas)

 

جدول 1- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی جدایه‌های اندوفیت

E6*

E5*

E4*

E3*

E2*

E1*

Biochemical tests

-

-

+

-

+

+

Citrate utilization

+

+

+

+

-

+

VP (Voges-Proskauer)

+

+

+

+

-

+

Nitrate reduction

-

-

-

-

-

-

Indole

+

+

+

+

+

+

Growth in salt 7%

+

+

+

+

+

+

Starch hydrolysis

-

-

-

-

+

-

Urease

+

+

+

+

+

+

Glucose utilization

-

-

-

-

+

-

Mannitol utilization

+

+

+

+

+

+

Motility

-

-

-

-

-

-

H2S production

+

+

+

+

+

+

Catalase test

+

+

+

+

-

+

Hemolysis blood Agar

-

-

-

-

-

-

Acid and gas production from glucose

+

+

+

+

+

+

Casein hydrolysis

+

+

+

+

+

+

Gelatin hydrolysis

-

-

-

-

-

-

Growth in 65°C

E1, E2 * باکتری‌های اندوفیت جداشده از گیاه مارچوبه، E3, E4 باکتری‌های اندوفیت جداشده از گیاه نعناع و E5, E6 باکتری‌های اندوفیت جداشده از گیاه بابونه هستند.

 

جدول 2- شناسایی مولکولی باکتری‌های اندوفیت

شمارۀ دسترسی در بانک ژنی

درصد شباهت

NCBI  باکتری مرجع

جدایۀ اندوفیت

DQ448749.1

97%

Bacillus sp. CNJ732 PL04

E4

HQ238661.1

95%

Bacillus thuringiensis srain z8b-52 16

E3

FJ946999.1

96%

Bacillus sp. CNJ732 PL04

E5

FJ217159.1

97%

Bacillus thuringiensis strain ucsc27

E6

JF895480.1

96%

Bacillus cereus strain KU4

E1

FN667913.1

96%

Bacillus thuringiensis strain ucsc27

E2


بررسی فعالیت ضدقارچی جدایه‌های اندوفیت: همۀ جدایه‌های اندوفیت علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی انتخاب‌شده فعالیت بازدارندگی داشتند. میانگین اثر ضدقارچی جدایه‌های اندوفیت علیه گونه‌های قارچی با استفاده از نرم‌افزار  9.2[8]SAS بررسی و نتایج آن در جدول 3 آورده شده است.

اثر تلقیح باکتری‌های اندوفیت روی پارامترهای رویشی گیاهان دارویی: نتایج حاصل از تجزیۀ واریانس داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار آماری9.2 SAS نشان داد که به غیر از اثر متقابل زمان در تیمارهای باکتری، بقیۀ پارامترها روی رشد طولی گیاه معنی‌دار است. نتایج آماری تجزیۀ واریانس حاصل از اندازه‌گیری رشد طولی گیاه در جدول 4 آورده شده است. رشد سه گیاه نعناع فلفلی، بابونه، و مارچوبه نشان داد که نمونه‌های گیاهی تیمار شده با باکتری‌های اندوفیت در مقایسه با نمونه‌های فاقد تیمار باکتری (نمونه‌های شاهد)، طول بیشتر داشت (شکل 2 تا 4).

 

 

جدول 3- میانگین فعالیت ضدقارچی جدایه‌های باکتری (E1-E6) علیه قارچ‌های بیماری‌زای گیاهی (واحد به سانتی‌متر)

جدایۀ باکتری

آسپرژیلوس نایجر

فوزاریوم اکسی پوروم

آلترناریا آلترناتا

موکور هایمالیس

E1

1/0

46/1

0

0

E2

63/0

8/2

03/1

1/0

E3

26/0

36/1

0

0

E4

1/0

33/1

0

0

E5

16/0

43/1

1/0

0

E6

16/0

45/1

13/0

0

 

   

شکل 2- عدم تلقیح (سمت راست) و تلقیح (سمت چپ) باکتری‌های اندوفیت در گیاه نعناع فلفلی

شکل 3- عدم تلقیح (سمت راست) و تلقیح (سمت چپ) باکتری‌های اندوفیت در گیاه بابونه

 

شکل 4- عدم تلقیح (سمت راست) و تلقیح (سمت چپ) باکتری‌های اندوفیت در گیاه مارچوبه

جدول 4- تجزیۀ واریانس حاصل از اندازه‌گیری رشد طولی گیاه

منبع تغییرات

درجۀ آزادی

مجموع مربعات

میانگین مربعات

فاکتور F

زمان

6

454/966

*076/161

58/147

گیاه

2

04/1739

*519/869

66/799

باکتری

2

2798/70

*1399/35

20/32

زمان در گیاه

12

799/783

*3166/65

84/59

زمان در باکتری

12

4061/23

ns19051/1

79/1

باکتری در گیاه

4

4491/50

*6123/12

56/11

خطای آزمایشی

150

718/163

 

 

مجموع

188

14/3797

 

 

* معنی‌دار در سطح 05/0  ns غیر معنی‌دار

 


بحث و نتیجه‌گیری.

یکی از چالش‌های عمده در قرن بیست و یکم، کشاورزی سازگار با محیط زیست و تولید محصول سالم است. استفاده از روش‌ها و فناوری‌های نوین زیستی در کشاورزی همچون تیمار میکروبی بذر (خیساندن بذر در سوسپانسیون میکروب‌های مفید یا تزریق سوسپانسیون میکروبی به داخل بذر) خیساندن خاک با سوسپانسیون میکروبی، تزریق به درون ساقه و اسپری سوسپانسیون میکروبی روی سطح اندام‌های گیاه در راستای نیل به هدف مذکور است. از جملۀ این میکروارگانیسم‌ها، باکتری‌های اندوفیت هستند که در ریشه، برگ و دانۀ گیاهان زندگی می‌کنند. اندوفیتیک‌بودن میکروارگانیسم‌ها در گیاهان، یک مزیت اکولوژیکی محسوب می‌شود که باعث افزایش رشد و باروری گیاه و بالابردن تحمل گیاه در برابر تنش‌های محیطی و پاتوژن‌ها می‌شود (16). عواملی نظیر ژنوتایپ گیاه، مرحلۀ رشد، وضعیت فیزیولوژیکی، نوع بافت گیاهی، شرایط محیطی و شیوه‌های کشاورزی تعیین‌کنندۀ کلونیزاسیون میکروارگانیسم‌های اندوفیت است. علاوه براین، صفات ذاتی میکروارگانیسم‌ها نیز از عوامل مهم در کلونیزاسیون و تنوع اندوفیت‌ها است (17). آنچه مسلم است، عواملی از قبیل درجۀ حرارت، شرایط خاک و اشعۀ ماورای بنفش به‌صورت مستقیم روی گیاه میزبان و به‌صورت غیرمستقیم روی باکتری‌های اندوفیت اثر می‌گذارد. فاکتورهای فیزیکی و شیمیایی خاک نیز همچون اسیدیته، شوری و بافت خاک نیز جمعیت باکتری‌های اندوفیتیک را با تغییر در جمعیت باکتری‌های ریزوسفری به‌صورت غیرمستقیم تحت تأثیر قرار می‌دهند (18). میکروارگانیسم‌های اندوفیتیک با تولید متابولیت‌های ثانویه، آنزیم‌های خارج سلولی، هورمون‌های گیاهی مشابه و مواد دیگر باعث فعال‌سازی اجزا و مسیرهای بیوشیمیایی سلول‌های گیاهی می‌شوند. این میکروارگانیسم‌ها منبع جدیدی از ترکیبات فعال زیستی-شیمیایی با پتانسیل بالقوه جهت بهره‌مندی در عرصه‌های پزشکی، کشاورزی و صنعتی هستند (19). با این حال، مطالعات کمی روی آن‌ها انجام شده است. گیاهان تیره نعناع، مارچوبه و بابونه به‌صورت وحشی در اکثر نقاط دنیا می‌رویند. اهمیت طبی-دارویی این گیاهان بر کسی پوشیده نیست؛ بنابراین، این گیاهان در این مطالعه انتخاب و به‌منظور بهبود رشد و باروری با کمک باکتری‌های اندوفیتیک مطالعه شدند.

روی[ix] و بانرجی[x] باکتری‌های اندوفیتیک باسیلوس کواگولانس و سایر گونه‌های باسیلوس را از گیاه Vinca rosea جداسازی کردند (20). آراویند[xi] و همکاران نیز گزارش کردند که از بین باکتری‌های اندوفیت جداشده از گیاهان مختلف، باکتری‌های اندوفیت متعلق به گونه‌های باسیلوس بعد از گونه‌های آرتروباکتر و میکروکوکوس جمعیت غالب هستند (10). در مطالعۀ ماهافی[xii] و کلوپر[xiii] نیز اغلب جدایه‌های اندوفیت مربوط به گونه‌های باسیلوس، آرتروباکتر و سودوموناس بود (21).

این مطالعات نشان داد که با وجود تنوع در جدایه‌های اندوفیتیک گیاهان مختلف، اغلب جدایه‌ها متعلق به جنس باسیلوس هستند که با مطالعۀ ما نیز مطابقت داشت. گونه‌های مختلف جنس باسیلوس به‌دلیل ویژگی‌هایی همچون حضور گسترده در محیط، هوازی تا بی‌هوازی اختیاری، تحمل دمای بالا و فرم مقاوم به‌صورت اسپور داخلی از باکتری‌های مهم و مطرح در کنترل بیولوژیکی‌اند (22). از سوی دیگر، یافته‌های اخیر مبنی بر وجود باسیلوس‌ها به‌صورت اندوفیتیک در داخل آوندهای گیاهانی نظیر افرا، نارون، سرو و سایر گونه‌های گیاهی، افق جدیدی را در راستای استفاده از این باکتری‌ها به‌عنوان عوامل بیوکنترل بیماری‌های آوندی گشوده است (16).

حسنین[xiv] و همکاران باکتری‌های اندوفیتیک سودوموناس آئروژینوزا و باسیلوس فیرموس را از ریزوسفر گندم جداسازی و تأثیر بازدارندگی این جدایه‌ها را روی پاتوژن قارچی آسپرژیلوس[xv]، فوزاریوم[xvi]،آلترناریا[xvii]، کلادوسپوریوم[xviii]، هلمیندوسپوریوم[xix] و ریزوکتونیا[xx] بررسی کردند. این دو جدایه و به‌ویژه باسیلوس فیرموس اثر قابلِ‌توجهی را در مهار رشد پاتوژن‌های قارچی داشت (15).

دالال[xxi] و همکاران اثر آنتاگونیستی گونه‌های مختلف باسیلوس (Bacillus sp.) را روی آسپرژیلوس نایجر، فوزاریوم اکسی پاروم، کاندیدا آلبیکنس و موکور بررسی و مشاهده کردند که بین قارچ‌های مختلف ازلحاظ مهار رشد تفاوت معنی‌داری وجود دارد به‌طوری‌که بیشترین بازدارندگی روی آسپرژیلوس نایجر مشاهده شد (23). این مطالعه به‌لحاظ جدایه‌های اندوفیتیک و آزمون بازدارندگی این جدایه‌ها روی پاتوژن‌های مهم قارچی (آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا، فوزاریوم اکسی پوروم و موکور هایمالیس) با مطالعۀ ما مطابق بود. به‌طوری‌که اثر بازدارندگی به‌ترتیب روی فوزاریوم اکسی پوروم، آسپرژیلوس نایجر، آلترناریا آلترناتا و موکور مشاهده شد.

در مطالعۀ حاضر، تیمار گونه‌های گیاهی نعناع فلفلی، مارچوبه و بابونه با جدایه‌های اندوفیت، نشان‌دهندۀ افزایش رشد طولی این گیاهان در مقایسه با نمونه‌های فاقد تیمار (شاهد) بود. نتایج آماری نشان داد که با افزایش زمان تیمار، ارتفاع گیاه افزایش یافت و بیشترین ارتفاع گیاه در روزهای پایانی آزمایش مشاهده شد. با افزایش زمان تیمار، غلظت فاکتورهای مؤثر در رشد گیاه توسط اندوفیت‌ها افزایش پیدا می‌کند. این امر علت احتمالی رشد فزایندۀ گیاه با افزایش زمان تیمار است که با مطالعۀ رودریگز[xxii] و همکاران و استورز[xxiii] و همکاران نیز مطابقت داشت. مطالعۀ رودریگز و همکاران در بررسی هم‌زیستی اندوفیت‌ها با گیاهان نشان داد که از این ارتباط هم‌زیستی متابولیت‌های ثانویه تولید می‌شود و با افزایش زمان تیمار و تعامل اندوفیت و گیاه به حداکثر مقدار خود می‌رسد (24). استورز و همکاران نیز تأثیر اندوفیت‌های باکتریایی کورتوباکتریوم سیتروم[xxiv] و ریزوبیوم لگومینوساروم[xxv] را در افزایش رشد طولی شبدر و سیب‌زمینی بررسی کردند. این جدایه‌ها به میزان 63درصد باعث افزایش ارتفاع اندام‌های هوایی گیاه و به‌میزان 66درصد باعث افزایش وزن اندام‌های هوایی و به‌میزان 55درصد باعث افزایش وزن ریشه شدند (4). عوامل متعددی در افزایش رشد و مقاومت گیاهان توسط باکتری‌های اندوفیت وجود دارد. این عوامل شامل افزایش مواد معدنی و بهبود روابط آبی در گیاه با کلونیزه‌شدن اندوفیت‌ها در ریشۀ گیاه، تولید هورمون‌های رشد مانند اتیلن، اکسین، سیتوکینین و جیبرلین توسط اندوفیت‌ها، تنظیم عملکردهای آنزیمی مهم در مسیرهای بیوشیمیایی دخیل در تنش‌ها و استرس‌های محیطی است (17). لی[xxvi] و همکاران تولید ایندول استیک اسید (25) و خان و دوتی[xxvii] تثبیت نیتروژن ملکولی توسط باکتری‌های اندوفیت در ریشه را در افزایش رشد و باروری گیاهان ذکر کردند (26). در مطالعۀ ما تأثیر هرکدام از مکانیسم‌های اشاره‌شده در بالا نیز می‌تواند علت احتمالی افزایش رشد و ارتفاع گیاه باشد.

در جمع‌بندی نتایج حاصل از این پژوهش و با مقایسۀ فعالیت ضدقارچی و اثر تلقیح اندوفیت‌ها روی رشد گیاهان انتخاب‌شده می‌توان گفت که از بین اندوفیت‌های جداشده از گیاه مارچوبه، جدایۀ E2 تأثیر معنی‌داری در رشد گیاه و جدایۀ E1 تأثیر معنی‌داری در فعالیت ضدقارچی داشت. از بین اندوفیت‌های جداشده از گیاه نعناع فلفلی جدایۀ E4 تأثیر معنی‌داری را هم در فعالیت ضدقارچی و هم در رشد گیاه و جدایۀ E3 تأثیر معنی‌داری را تنها در فعالیت ضدقارچی داشت. از بین اندوفیت‌های جداشده از گیاه بابونه جدایه‌های E5 و E6 به یک میزان در فعالیت ضدقارچی و رشد گیاه بابونه تأثیر داشتند.

در راستای این پژوهش، جداسازی بیشتر میکروارگانیسم‌های اندوفیت از گیاهان مختلف و مطالعۀ مولکولی و عملکردی آن‌ها جهت به‌کارگیری این میکروارگانیسم‌ها به‌عنوان عوامل بیوکنترل در برابر پاتوژن‌های گیاهی و بهبود رشد و باروری گیاهان و نیز افزایش مقاومت گیاهان در برابر تنش‌های مختلف محیطی توصیه و پیشنهاد می‌شود.



[1]- Merck, Germany

[2]- QIAamp DNA mini kit; Qiagen, Germany

[3]- Mastercycler® nexus; Eppendorf, Germany

[4]- MacroGen, Korea-http://www.macrogen.com

[5]- http://portal.irost.org/persian/PTCC

[6]- http://www.spii.ir

[7]- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/

[8]- Statistical Analysis System

[ix]- Roy

[x]- Banerjee

[xi]- Aravind

[xii]- Mahafee

[xiii]- Kloepper

[xiv]- Hassanein

[xv]- Aspergillus

[xvi]- Fusarium

[xvii]- Alternaria

[xviii]- Cladosporium

[xix]- Helminthosporium

[xx]- Rhizoctonia

[xxi]- Dalal

[xxii]- Rodriguez

[xxiii]- Sturz

[xxiv]- Curtobacterium citreum

[xxv]- Rhizobium leguminosarum

[xxvi]- Lee

[xxvii]- Khan & Doty

 

(1)              Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Mahaffee WF, Kloepper JW. Bacterial endophytes in agricultural crops. Canadian Journal of Microbiology. 1997; 43(10): 895-914.

(2)              Hallmann J, Quadt-Hallmann A, Rodriguez-Kbana R, Kloepper JW. Interactions between Meloidogyne incognita and endophytic bacteria in cotton and cucumber. Soil Biology and Biochemistry. 1998; 30(1): 925-37.

(3)              Hardoim PR, van Overbeek LS, van Elsas JD. Properties of bacterial endophytes and their proposed role in plant growth. Trendsin Microbiology. 2008; 16(10): 463-71.

(4)              Sturz AV, Christie BR, Nowak J. Bacterial endophytes: Potential role in developing sustainable systems of crop production. Critical Reviews in Plant Sciences. 2000; 19(1): 1-30.

(5)              Tomasino SF, Leister RT, Dimock MB, Beach RM, Kelly JL. Field performance of Clavibacterxylisubsp. cynodontisexpressing the insecticidal protein gene cryIA (c) of Bacillus thuringiensis against European corn borer in field corn. Biological Control. 1995; 5 (3): 442- 48.

(6)              Rosenblueth M, & Martinez-Romero E. Bacterial endophytes and their interactions with hosts. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2006; 19(8): 827-37.

(7)              Joseph B, Ahmad Dar M, Kumar V. Bioefficacy of Plant Extracts to Control Fusarium solani F. Sp. Melongenae Incitant of Brinjal Wilt. Global Journal of Biotechnology and Biochemistry Research (GJBBR). 2008; 3(2): 56-9.

(8)              Ramamoorthy V, Raguchander T, Samiyappan R. Induction of defense-related proteins in tomato roots treated with Pseudomonas fluorescens and Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. Plant and Soil. 2002; 239(1): 55-68.

(9)              Narisawa K, Kawamata H, Currah RS, Hashiba T. Suppression of Verticillium wilt in eggplant by some fungal root endophytes. European Journal of Plant Pathology. 2002; 108(1):103-9.

(10)          Aravind R, Antony D, Eapen SJ, Kumar A, Ramana KV. Isolation and evaluation of endophytic bacteria against plant parasitic nematodes infesting black pepper (Piper nigrum L.). Indian Journal of Nematology. 2009; 39(2): 211-17.

(11)          Hung PQ and Annapurna K. Isolation and characterization of endophytic bacteria in soybean (Glycine sp.). OmonRice. 2004; 12(4): 92-101.

(12)          John GH, Noel RK, Peter HS, James TS, Stanley TW. Bergey´s Manual of Determinative Bacteriology (In Russian). 9th Ed. Moscow: Mir Publishers 2; 1997.

(13)          Sambrook J, Russell D. Irwa N et al. Eds. Molecular Cloning, a LaboratoryManual. 3rd Ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

(14)          Kimiran Erden A, Sanli Yurudu NO. The evaluation of antibacterial activity of fabrics impregnated with dimethyltetradecyl (3- (Trimethoxysilyl) Propyl) ammonium chloride. IUFS Journal of Biologiy. 2008; 67 (2): 115-22.

(15)          Hassanein WA, Awny NM, El-Mougith AA, Salah El-Dien S. H. Characterization and antagonistic activities of metabolite produced by Pseudomonasaeruginosa. Journal of Applied Sciences Research. 2009; 5(4): 392-403.

(16)          Haggag WM. Role of entophytic microorganisms in biocontrol of plant diseases. Life Science Journal. 2010; 7(2): 57-62.

(17)          Brader G, Compant S, Mitter B, Trognitz F, Sessitsch A. Metabolic potential of endophytic bacteria. Current Opinion in Biotechnology. 2014; 27(1): 30-7.

(18)          Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiology Letters. 2008; 278(1): 1-9.

(19)          Berg G, Hallmann J. Control of plant pathogenic fungi with bacterial endophytes. In: Schulz BJE, Boule CJC, Sieber TN editors. Microbial Root Endophytes. Berlin: Springer-Verlag; 2006. p. 53-69.

(20)          Roy S, Banerjee D. Isolation of antimicrobial compound by endophytic bacteria from Vincarosea. International Journal of Current Research. 2010; 5(1): 47-51.

(21)          Mahafee WF, Kloepper JW. Bacterial communities of the rhizosphere and endorhiza associated with field-grown cucumber plants inoculated with a plant growth promoting rhizobacterium or its genetically modified deriative. Canadian Journal of Microbiology. 1997; 43(4): 344-53.

(22)          Peterson CA, Emanuel ME, Humphreys GB. Pathway of movement of apoplastic fluorescent dye tracers through the endodermis at the site of secondary root formation in corn (Zeamays) and broad bean (Viciafaba). Cannadian Journal of Botany. 1981; 59(5): 618-25.

(23)          Dalal J, Kulkarni N. Antagonistic and plant growth promoting potentials of indigenous endophytic bacteria of soybean (Glycine max (L) Merril). Current Research in Microbiology and Biotechnology. 2013; 1(2): 62-9.

(24)          Rodriguez RJ, White JR, Arnold AE, Redman RS. Fungal endophytes: diversity and functional roles. New Phytologist. 2009; 182(2): 314-30.

(25)          Lee S, Flores-Encarnacion M, Contreras-Zentella M, Garcia Flores L, Escamilla JE, Kennedy C. Indole-3-acetic acid biosynthesis is deficient in Gluconacetobacter diazotrophicus strains with mutations in cytochrome C biogenesis genes. Journal of Bacteriology. 2004; 186(16): 5384-91.

(26)          Khan Z, Doty SL. Characterization of bacterial endophytes of sweet potato plants. Plant and Soil. 2009; 332(1-2): 197-207.