شناسایی مولکولی باکتری Streptomyces scabies عامل جرب معمولی سیب‌زمینی در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیماری‌شناسی گیاهی، دانشگاه تبریز، ایران

2 استادیار باکتری‌شناسی گیاهی، دانشگاه تبریز، ایران

چکیده

مقدمه: جنسStreptomycesاز بزرگ‌ترین و مهم‌ترین جنس‌های باکتریایی است که بعضی از اعضای آن بیمارگر گیاهان و محصولات کشاورزی محسوب می‌شوند. بیماری جرب معمولی از بیماری‌های مهم گیاهی است که به‌وسیلۀ باکتری Streptomyces scabies و برخی دیگر از گونه‌های مشابه عمدتاً روی سیب‌زمینی و ندرتاً روی برخی دیگر از محصولات غده‌ای نظیر چغندر، تربچه، شلغم و غیره ایجاد می‌شود. با توجه به جایگاه استراتژیک کشت سیب‌زمینی در منطقۀ شمال غرب کشور و علی‌رغم انتشار گستردۀ این بیماری در استان‌های آذربایجان و کردستان، هنوز گزارش دقیقی از عامل اصلی بیماری، میزان پراکنش و نژادهای مختلف این بیماری در دسترس نیست. هدف این پژوهش شناسایی مولکولی عامل اصلی اسکب سیب‌زمینی در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان و بررسی ارتباط بین بیماری‌زایی این باکتری و وجود ژن تاکستومین Aبود
مواد و روش‌ها: در فصل برداشت سال‌های 1391-1389 از غده‌های دارای علائم جرب در مزارع سیب‌زمینی نمونه‌برداری و به آزمایشگاه منتقل شدند. پس از جداسازی و خالص‌سازی باکتری، جدایه‌های باکتریایی براساس ویژگی‌های مورفولوژیکی، تست‌های بیوشیمیایی و نیز با استفاده از آزمون PCR توسط آغازگر عمومی جنسStreptomyces  و آغازگر اختصاصی گونۀ S. scabies ارزیابی شدند. همچنین قدرت بیماری‌زایی جدایه‌ها روی غدۀ سیب‌زمینی و تربچه و نیز حضور ژن تولیدکنندۀ توکسین تاکستومین A در نمونه‌ها بررسی شد.
نتایج: از بین جدایه‌ها، براساس صفات مورفولوژیک و تست‌های بیوشیمیایی و آزمون PCR ، 32 جدایه متعلق به جنس Streptomyces شناسایی شد. در تست بیماری‌زایی روی غدۀ سیب‌زمینی و تربچه 26 جدایه از 32 جدایه واکنش مثبت نشان دادند. نتیجۀ آزمون PCR با آغازگر اختصاصی گونۀ S. scabies به‌صورت مولکولی نیز اثبات کرد که این 26 جدایه به گونۀ S. scabies متعلق هستند. ضمناً نتایج آزمون PCR با آغازگر اختصاصی ژن بیماری‌زایی تاکستومین A (txt A) نشان داد این ژن در تمام 26 جدایه با قدرت بیماری‌زای وجود دارد که بیانگر همبستگی کامل قدرت بیماری‌زایی این باکتری در گیاهان و وجود این ژن در باکتری است. ‌
بحث و نتیجه‌گیری: این اولین گزارش علمی است که وجود این بیمارگر را به‌صورت مولکولی در منطقه اثبات می‌کند. نتایج به‌دست‌آمده و وجود جدایه‌های مثبت فراوان در داخل نمونه‌ها، حاکی از آلودگی گستردۀ مزارع سیب‌زمینی استان‌های آذربایجان و کردستان به بیماری جرب معمولی است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Molecular Identification of Streptomyces scabies Causal Agent of Potato Common Scab in East Azerbaijan and Kurdistan Provinces

نویسندگان [English]

  • Ali Ahmadi 1
  • Reza Khakvar 2
1 M.Sc student of Plant Pathology, University of Tabriz, Iran
2 Assistant Professor of Plant Bacteriology, University of Tabriz, Iran
چکیده [English]

Introduction:Common scab which caused by Streptomyces scabies and other closely related species is a serious disease of potato and other tuber crops such as beet, radish, and turnip and etc. Although, potato is one of the most important food crops in Northwest of Iran and common scab disease is prevalent in these areas, there is no accurate information about the exact causal agent of potato common scab and also their strains distribution in the area.
Materials and methods: During 2010-2012 harvesting seasons, potato tubers with common scab symptoms were collected from different fields in East Azerbaijan and Kurdistan provinces. Collected isolates were characterized based on morphological and physiological and biochemical assays. Also PCR assay was performed using universal primer for Streptomyces genus and specific primer for S. scabies species. Pathogenicity assay was performed on potato slices and radish seedlings too.
Results: Based on morphological and physiological characteristics and biochemical test, 32 bacterial strains were identified as Streptomyces. Pathogenicity assay were positive in 26 isolates. All selected 32 isolates were amplified a 1027-bp fragment with using universal primer for Streptomyces genus and 26 isolates were amplified a 475-bp fragment using a pair of primers which is specific for S. scabies and its closely related plant pathogenic species. The PCR assay for detection of taxtomine (txtA) showed that all selected 26 pathogenic isolates could produce expected 522-bp band which indicated a significant correlation between pathogenicity capability of isolates on potato slices and radish seedlings and existing of txtA gene.
Discussion and conclusion: This is the first report of molecular identification of S. scabies in Northwest of Iran. The results demonstrated that there is significant distribution of this pathogen in the potato farms of Azerbaijan and Kurdistan provinces.

کلیدواژه‌ها [English]

  • txtA gene
  • PCR
  • Common Scab
  • Streptomyces

مقدمه.

سیب‌زمینی یکی از محصولات مهم کشاورزی در ایران است که از نظر تولید سالیانه بعد از گندم، برنج، ذرت و جو در مقام پنجم قرار دارد. بیماری جرب [1] معمولی سیب‌زمینی یکی از بیماری‌های مهم گیاهی است که به‏وسیله باکتری Streptomyces scabies و سایر گونه‌های مشابه دیگر روی سیب‌زمینی و سایر سبزیجات غده‌ای (تربچه، شلغم و غیره) ایجاد می‌شود (1). ایجاد علائمی نظیر زخم‌های نکروتیک برجسته، سطحی یا فرورفته از علائم مشخص جرب معمولی بر روی غده‌های سیب‌زمینی است که ارزش بازارپسندی و کیفیت غده‌های سیب‌زمینی را کاهش می‌دهد و باعث خسارت اقتصادی به محصول می‌شود (2). گونه‌های مهم عامل جرب سیب‌زمینی، Streptomyces scabies، S. acidiscabies و S. turgidiscabies هستند (3). acidiscabie S. به‌عنوان عامل جرب معمولی سیب‌زمینی در خاک‌های اسیدی نام‌گذاری شده است. S. acidiscabies و  S. turgidiscabies دارای پراکنش کمتری در جهان هستند. سایر گونه‌های بیماری‌زای Streptomycesشامل S. setonii ، S. griseus ،S. tendae، aureofaciensS.وS. caviscabies است کهشدت بیماری‌زایی کمتری دارند (4 و 5).

گونۀ S. scabies به‌عنوان مهم‌ترین عامل ایجاد جرب معمولی سیب‌زمینی در جهان، دارای پراکنش وسیعی در جهان است و در اکثر نقاط جهان به‌عنوان مهم‌ترین عامل ایجاد جرب شناخته شده است (6). در ایران برخی از گونه‌های بیماری‌زای گیاهی Streptomyces نظیر S. scabies، S. acidiscabies، S. turgidiscabies، aureofaciensS.،
 S. reticuliscabies و ... از برخی مناطق ایران گزارش شده‌اند اما از میزان دقیق خسارت و پراکنش واقعی آن‌ها اطلاع دقیقی در دست نیست (7).

در بیماری‌زایی گونه‌های جنسStreptomycesبه‌خصوص گونه‌های بیماری‌زای گیاهی، توکسین‌ها نقش بسیار مهمی دارند.در بین توکسین‌های S. scabies غالب‌ترین توکسین تولیدشده، تاکستومین [2]A و بعد از آن تاکستومین B است که مقدار آن ۵درصد مقدار تاکستومین A گزارش شده است (8). ردیابی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین A (txtA) اهمیت زیادی در شناخت مکانیسم بیماری‌زایی این باکتری ایفا می‌کند. ژن تاکستومینA تاکنون فقط در سه گونۀ S. scabies، S. acidiscabiesوS. turgidiscabies شناسایی شده و در سایر گونه‌های بیماری‌زای گیاهی یا این ژن وجود نداشته و یا اندازۀ این ژن در آن‌ها متفاوت با طول ژن در این دو گونه است (3) بنابراین با توجه به مشکلات و پیچیدگی‌های موجود در تفکیک اعضای جنس Streptomycesدر سطح گونه و نیز مشکلات تشخیص نژادهای بیماری‌زا از نژادهای غیربیماری‌زا، شناسایی وجود ژن تاکستومین راهی آسان برای اثبات گونه و قدرت بیماری‌زایی عامل اسکب سیب‌زمینی خواهد بود.

جرب معمولی سیب‌زمینی در سال‌های اخیر در بعضی مناطق کشت سیب‌زمینی در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان به وفور مشاهده شده است. ازآنجایی‌که در بعضی مزارع شدت بیماری بالا است و به‌صورت یکی از مسائل عمده در کشت سیب‌زمینی در آمده است و نیز به‌علت عدم وجود گزارش رسمی از عامل اصلی این بیماری در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان، شناسایی عامل اسکب معمولی سیب‌زمینی با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز و آزمون‌های بیوشیمیایی و مورفولوژیکی و همچنین شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین در جدایه‌ها می‌تواند سودمند باشد. نتایج این پژوهش همچنین می‌تواند جهت اتخاذ استراتژی مناسب برای کاهش خسارت بیماری در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان کاربردهای فراوانی داشته باشد.

 

مواد و روش‌ها.

نمونه‌برداری و تهیه جدایه‌ها:       طی فصول زراعی سال 1389-1391 در زمان برداشت از مناطق مختلف سیب‌زمینی‌کاری استان‌های آذربایجان شرقی (شهرستان‌های سراب و بستان‌آباد) و کردستان (شهرستان‌های قروه و ده‌گلان) بازدید و غده‌های دارای علائم بیماری از نقاط مختلف مزارع جمع‌آوری و به آزمایشگاه منتقل شد. قسمت‌های آلوده از غده‌های دارای علائم اسکب به‌روش شاد[3] و همکاران (9) جداسازی شد. برای جداسازی از محیط کشت YME [4] (عصارۀ مخمر 4 گرم ؛ عصارۀ مالت 10 گرم ؛ دکستروز 4 گرم؛ آگار 20 گرم، در یک لیتر آب مقطر با pH=7.2) حاوی آنتی‌بیوتیک‌های50 میلی‌گرم نیستاتین، 5 میلی‌گرم پلی‌میکسین‌سولفات، 10میلی‌گرم سدیم پنی‌سیلینG و 50 میلی‌گرم سیکلوهیگزامیددر لیتر استفاده شد. تشتک‌ها به‌صورت وارونه در دمای 25 تا 30 درجه سانتی‌گراد نگهداری و پس از 5 تا 7 روز از پرگنه‌های رشدکرده که ظاهری شاخه و پودری داشتند، انتخاب شد و مجدداً تا خالص‌سازی کامل روی محیط YME به‌صورت مخطط کشت شدند. جهت نگهداری باکتری از کشت‌های 10 تا 14روزه هر جدایه سوسپانسیونی از اسپور در آب مقطر سترون تهیه و در شیشه‌های کوچک در‌دار داخل یخچال در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

اثبات بیماری‌زایی: اثبات بیماری‌زایی استرین‌ها روی غدۀ سیب‌زمینی به‌روش لوریا و همکاران[5] (10) انجام شد. ابتدا غدۀ سیب‌زمینی رقم آگریا[6] با آب شستشو و در شرایط استریل پوست غده‌ها جدا شد و از قسمت وسط غده قطعاتی به اندازۀ دو سانتی‌متر مربعتهیه شد و در تشتک‌های پتری استریل حاوی کاغذ صافی و مقداری آب مقطر استریل قرار داده شدند. از هر جدایه که قبلاً روی محیط غذایی OMA[7] کشت و تولید اسپور شده بود (کشت‌های 14روزه) قطعه‌ای از محیط کشت برداشته شد و به‌طور وارونه روی قطعات سیب‌زمینی قرار گرفت. از محیط OMA تلقیح‌نشده به‌عنوان شاهد منفی استفاده شد. پتری‌ها در انکوباتور در دمای 25 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 3 تا 5 روز نگهداری شدند، این آزمایش برای هر جدایه سه بار تکرار شد. ایجاد نکروز و یا نکروز همراه با فرورفتگی به‌عنوان بیماری‌زایی جدایه‌ها در نظر گرفته شد. اثبات بیماری‌زایی روی گیاهچه تربچه به‌روش شاد و همکاران (9) انجام شد. بذر تربچه به‌طور سطحی با هیپوکلریت‌سدیم 5 تا۱۰درصد به‌مدت یک دقیقه ضدعفونی شد و به‌منظور جوانه‌زنی روی محیط آب آگار ۱درصد به‌مدت 24 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند. بذرهای جوانه‌زده با سوسپانسیونی از اسپور باکتری مایه‌زنی و در لوله‌های حاوی محیط کشت آب آگار (۱درصد) سترون قرار داده شدند. علائم بیماری روی گیاهچه تربچه یک تا دو هفته بعد بررسی شد.

.بررسی خصوصیات مورفولوژیکی، فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی جدایه‌ها: رنگ‌آمیزی گرم، آزمون رشد هوازی و بی‌هوازی (OF[8])، تست کاتالاز، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز ژلاتین و هیدرولیز کازئین به‌روششاد و همکاران (8) انجام شد. ویژگی‌های مورفولوژیکی جدایه‌ها شامل تعیین نوع و طول زنجیرۀ اسپور، شکل پرگنه و نیز رنگ پرگنه به‌روش شیرلینگ وگوتلیب[9] (11) بررسی شد. به‌منظور بررسی تولید ملانین، جدایه‌ها به‌ترتیب برروی محیط کشت PYIA[10] و YME کشت شد و نتایج 7 تا 10 روز بعد یادداشت شد. تولید رنگدانۀ ملانین قهوه‌ای‌رنگ به‌عنوان نتیجۀ مثبت تست ارزیابی شد (4). محیط کشت فوق، اختصاصی باکتری است که فقط بعضی از جدایه‌ها تولید ملانین[11] می‌کنند.

واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (PCR): استخراج DNA ژنومی از جدایه‌ها به‌روش تعدیل‌یافتۀ لی و دبور[12] (12) انجام شد. برای استخراج DNA ژنومی، جدایه‌ها ابتدا در محیط [13]NA کشت شدند و به‌مدت چند روز در شیکر قرار داده شدند. سپس محیط کشت در لولۀ فالکن ریخته و در دور 3000 دور در دقیقه به‌مدت سه دقیقه سانتریفیوژ شد تا باکتری در ته لوله رسوب کند. چند لوپ از باکتری به داخل تیوب جدید منتقل و به آن 400 میکرولیتر آب مقطر سترون اضافه شد. به سوسپانسیون حاصل 400 میکرولیتر بافر استخراج X2 (50 میلی‌مولار Tris-HCl، 25 میلی‌مولار EDTA[14]، ۱درصد SDS [15]و 10 میکروگرم بر لیتر پروتئیناز [16]K) اضافه شد و نمونه‌ها به‌مدت سه ساعت در دمای 55 سانتی‌گراد قرار گرفتند. سپس400 میکرولیتر از آمونیوم استات 5/7 مولار به هر لوله اضافه و به‌مدت 2 تا 3 دقیقه تکان داده شد. بعد از این مرحله، لوله‌ها به‌مدت 10 دقیقه در 12500 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس750 میکرولیتر از رونشین به لولۀ جدید منتقل شد و 750 میکرولیتر ایزوپروپانول سرد به آن اضافه و به‌وسیلۀ دست تکان داده شد. نمونه‌ها به‌مدت یک شب در دمای 20- تا 30- درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از این مدت نمونه‌ها به‌مدت 30 دقیقه در 12500 دور در دقیقه در دمایچهار درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند و رسوب حاصل با 750 میکرولیتر اتانول 70 درصد سرد دو بار شسته شد و در دمای 56 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 دقیقه خشک شد. رسوب حاصل در 100 میکرولیتر آب مقطر سترون حل و در چهار درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. DNA خارج‌شده در واکنش PCR با آغازگرهای مختلف استفاده شد. کیفیت و کمیت DNA خارج‌شده با اسپکروفتومتر و الکتروفورز در ژل آگارز بررسی شد.

 از آغازگرهایStrepB و StrepF برای شناسایی جنس Streptomyces استفاده شد. این جفت آغازگر برای ناحیۀ 16srRNA طراحی شده است و قادر به شناسایی تقریباً همه گونه‌های جنس Streptomyces است (جدول 1)(9). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی[17] اولیه به‌مدت پنج دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه، اتصال [18]آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط [19]در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

از آغازگرهایASE3 و scab2m نیز که اختصاصی برای شناسایی گونۀ S. scabiesو چند گونه نزدیک آن که بیماری‌زای گیاهی هستند استفاده شد (جدول1)(9). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت ۵ دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 40 چرخه واسرشت‌سازی در 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت ۵ دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

از آغازگرهایtxtA F2 و txtA R2 برای شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومین A در گونه‌های بیماری‌زای گیاهی S. scabies استفاده شد (جدول 1) (13). چرخه‌های حرارتی شامل یک چرخه واسرشت‌سازی اولیه به‌مدت ۵ دقیقه در 95 درجه سانتی‌گراد، 30 چرخه واسرشت‌سازی در 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 20 ثانیه، اتصال آغازگر در دمای 52 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و بسط در 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 30 ثانیه و درنهایت یک چرخه بسط نهایی به‌مدت 5 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد بود.

 

نتایج.

درمجموع بیش از 120 غده با علائم مشکوک به بیماری اسکب عمومی سیب‌زمینی شناسایی و جمع‌آوری شد. بیشتر غده‌های جمع‌آوری‌شده از ارقام مارفونا، اسپریت و اگریا بودند. علائم موجود در روی غده‌های جمع‌آوری‌شده متفاوت و عمدتاً شامل جرب برجسته، فرورفته و سطحی و یا زخم‌های سطحی یا عمیق بودند (شکل 1).

پس از جداسازی باکتری، مجموعاً 32 جدایه با خصوصیات مورفولوژیک جنسStreptomyces (با پیکره‌های هیفی‌شکل) بر روی محیط کشت YME جداسازی و خالص‌سازی شد. پرگنه جدایه‌ها به‌رنگ خاکستری روشن یا تیره بر روی محیط کشت عصارۀ مخمر مالت آگار مشاهده شد. آزمون گرم، تست کاتالاز، تست OF (هوازی و بی‌هوازی‌بودن) و تست تجزیۀ نشاسته برای این جدایه‌ها مثبت و تست تجزیه ژلاتین منفی بود (جدول 2).

 

 

جدول 1- آغازگرهای استفاده‌شده در واکنش‌های زنجیره‌ای پلی‌مراز و توالی آن‌ها و اندازۀ جفت محصول این آغازگرها

نام آغازگر

توالی آغازگر

اندازه محصول

(جفت باز)

StrepF

5´- ACG TGT GCA GCC CAA GAC A -3´

1027

StrepB

5´- ACA AGC CCT GGA AAC GGG GT -3´

ASE3

5´- AAC GGC CAG AGA TGG TCG C -3´

475

scab2m

5´- TTC GAC AGC TCC CTC CCT TAC -3´

txtA F2

5´- TGC GGT TCC GGT CTG CTG CTC TC -3´

522

txtA R2

5´- GGC GTC GTA CCC GCC GTT GA -3´

 

 

شکل1- علائم مختلف باکتری اسکب بر روی غده‌های سیب‌زمینی

 

 

جدول 2- نتایج آزمون‌های بیوشیمیایی و فنوتیپی

آزمون

واکنش

رنگ پرگنه روی محیط کشت YME

خاکستری

نوع زنجیره اسپور

مارپیچی

گرم

+

OF (هوازی)

+

کاتالاز

+

تجزیه ژلاتین

+

تجزیه نشاسته

-

تولید رنگدانه ملانین در محیط کشت (PYIA)

فقط سه جدایه تولید ملانین کردند

 

اسپور جدایه‌ها با میکروسکوپ نوری عموماً به‌صورت زنجیره‌ای صاف و بعضاً مارپیچ مشاهده شدند که دلالت بر تعلق آن‌ها به جنسStreptomyces داشت (شکل2)(9).

آزمون بیماری‌زایی روی جدایه‌های جمع‌آوری‌شده نشان داد 26 جدایه از 32 جدایه خالص‌شده، قادر به ایجاد علائم نکروز روی تکه‌های سیب‌زمینی و گیاهچه تربچه هستند و 6 جدایه باقیمانده دارای قدرت بیماری‌زای خفیف و یا فاقد توانایی ایجاد نکروز روی سیب‌زمینی و یا گیاهچه تربچه هستند. نتایج بررسی تولید رنگدانه ملانین برروی محیط کشت PYIA و YME نشان داد که فقط سه جدایه روی محیط کشت PYIA تولید ملانین کردند و باقی جدایه‌ها قادر به تولید ملانین نیستند (شکل 3).

 برای شناسایی جنس Streptomyces از جفت پرایمر Strep B و Strep Fاستفاده شد که باندهایی به‌اندازۀ 1027 باز برای هر 32 جدایه منتخب پس از الکتروفورز مشاهده شد (شکل 4).

 

شکل 2-.زنجیره اسپورهای Streptomyces scabies

 

 

شکل 3- تولید رنگدانه قهوه‌ای‌رنگ ملانین برروی محیط کشت PYIA

 

از 32 جدایۀ منتخب، 26جدایه با استفاده از آغازگر اختصاصیscab2m و ASE3 باندهای به وزن 475 باز را تکثیر کردند (شکل 5) ولی 6 جدایه علی‌رغم تولید قطعۀ 1027 بازی با جفت پرایمر اول، قادر به تولید باند 475 نوکلئوتیدی نبودند و باندی برای آن‌ها مشاهده نشد. برای شناسایی ژن سنتزکنندۀ تاکستومینA از جفت آغازگر txtA F2 وtxtA R2 استفاده شد که قطعۀ 522 نوکلئوتیدی در هر 26 جدایه با قدرت بیماری‌زایی روی سیب‌زمینی و تربچه تکثیر شد (شکل 6).

 

 

شکل 4-.الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد، PCR با آغازگرهای Strep Fو Strep R. چاهک‌های 1 تا 6 ( از چپ به راست) جدایه‌های منتخب جمع‌آوری‌شده از آذربایجان شرقی، چاهک‌های 7-9 جدایه‌های منتخب جمع‌آوری‌شده از کردستان، چاهک 9 شاهد مثبت، M DNA Ladder

 

 

شکل 5-الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد قطعات DNA تولیدشده در PCR با آغازگرهای اختصاصی scab2m و ASE3. چاهک شماره 1: جدایه جمع‌آوری شده از کردستان، چاهک‌های 2 تا 8 ( از چپ به راست) جدایه‌های منتخب از آذربایجان شرقی، 8:شاهد مثبت، M : DNA Ladder

 

شکل 6- الکتروفورز در ژل آگارز 2/1درصد قطعات DNA در PCR با آغازگرهای txtA F2 و txtAR2 ، چاهک‌های 1 تا 4 ( از چپ به راست ) جدایه‌های منتخب از کردستان، چاهک‌های 5-8 جدایه‌های منتخب از آذربایجان شرقی، چاهک شماره 9 شاهد مثبت

 


بحث و نتیجه‌گیری.

از 120 نمونه با علائم اسکب، فقط 32 جدایه جنس Streptomyces جداسازی و شناسایی شد. با توجه به اینکه سایر بیمارگرهای گیاهی نظیر قارچ Rhizotonia و برخی آفت حشره‌ای نظیر لارو پروانه بید سیب‌زمینی (Phthorimaea operculella) علائم مشابه با اسکب در غدۀ سیب‌زمینی ایجاد می‌کنند (2)، احتمالاً تعدادی از نمونه‌های جمع‌آوری‌شده متعلق به آن‌ها بود و آلوده به اسکب نبودند. براساس نتایج بررسی تولید ملانین نیز فقط سه جدایه از 32 جدایه قادر به تولید ملانین در محیط کشت بودند. هرچند براساس گزارش بووسیژیور و بیولیو (14) جدایه‌های با قدرت تولید ملانین دارای توان بیماری‌زایی بالاتری هستند، براساس گزارش حاضر فقط برخی از جدایه‌های بیماری‌زا قادر به تولید ملانین روی این محیط کشت هستند (14). در این پژوهش نیز ارتباط معنی‌داری بین توان تولید ملانین و قدرت بیماری‌زایی روی غدۀ سیب‌زمینی و یا تربچه مشاهده نشد.

برای شناسایی اولیه جدایه‌ها از جفت آغازگر عمومی Strep B و Strep Fاستفاده شد. قبلاً اختصاصیت این جفت آغازگر برای جنس Streptomycesاثبات شده بود (9) بنابراین وجود باند موردِنظر در محصول PCR دلالت بر تعلق هر 32 جدایه به جنس ذکرشده دارد. تست‌های بیوشیمیایی انجام‌شده نیز نتایج کار مولکولی را تعیین می‌کند.

برای شناسایی اختصاصی‌تر در سطح گونه از آغازگر اختصاصیscab2m و ASE3 استفاده شد که فقط 26 جدایه توان تولید باند موردِنظر را داشتند. این جفت پرایمر برای شناسایی گونه های بیماری‌زایی گیاهی جنس Streptomycesطراحی شده‌اند و تنها قادر به شناسایی معدودی از گونه‌های جنسStreptomycesاست که عمدتاً در روی گیاهان بیماری‌زا هستند. احتمالاً 6 جدایه‌ای که با این آغازگر شناسایی نشدند، گونه‌های دیگری غیر از باکتری اصلی عامل اسکب یعنی S. scabies هستند. چون این 6 جدایه با رنگی متفاوت و به‌رنگ خاکستری روی محیط کشت مشاهده شدند و با توجه به اینکه اسپورهای آن‌ها به‌شدت مارپیچی بودند، بیشترین شباهت را به گونه S. turgidiscabies دارند (11،5و15) که در صورت توالی‌یابی و کارهای مولکولی بیشتر، این اولین گزارش از وجود این باکتری بیماری‌زای گیاهی در شمال غرب ایران خواهد بود.

در26 جدایه از 32 جدایۀ مثبت، وجود ژن تاکستومین با استفاده از آغازگر اختصاصی اثبات شد. این ژن فقط در گونه‌های بیماری‌زای S. scabiesو دو گونۀ نزدیک به آن یعنی (S. acidiscabiesو S. turgidiscabies) وجود دارد و در سایر گونه‌ها یا وجود ندارد و یا اندازۀ باند PCR با پرایمرهای txtA برای آن‌ها متفاوت است (3). با توجه به نتایج PCR با پرایمرهای scab2m و ASE3 و نیز مورفولوژی زنجیره‌های صاف اسپوری این 26 جدایه، احتمال تعلق آن‌ها به گونۀ S. turgidiscabies منتفی است. چرا که اسپورهای S. turgidiscabies به‌شدت به‌صورت مارپیچ دیده می‌شوند و با پرایمرscab2m و ASE3 قابلِ‌شناسایی نیستند. از طرفی با توجه به قلیایی‌بودن خاک هر دو استان و اینکه گونۀ S. acidiscabiesفقط در خاک‌های به‌شدت اسیدی (> 5 pH=) یافت می‌شود، بنابراین هر 26 جدایه با اطمینان بالا و به‌صورت مولکولی متعلق به گونۀ S. scabiesشناسایی شدند. این اولین گزارش علمی از وجود این بیمارگر در استان‌های آذربایجان شرقی و کردستان است. با توجه به درصد جدایه‌های مثبت به نمونه‌های جمع‌آوری‌شده، نتایج حاکی از گسترش شدید این بیماری در منطقه است. ضمناً در پژوهش مشابه، حسنی و تقوی (7) از آغازگرهای اختصاصی مشابه (scab2m و ASE3) برای شناسایی گونۀ S. scabies استفاده کردند و توانستند جدایه‌های مختلف این بیمارگر را در استان فارس و شهرستان بهار همدان حتی بدون نیاز به جداسازی از بافت شناسایی کنند.

از طرفی با توجه به اینکه صددرصد جدایه‌هایی که این باند را تولید کردند در آزمایش بیماری‌زایی روی غدۀ سیب‌زمینی و گیاهچه تربچه نیز بیماری‌زا تشخیص داده شدند، همبستگی کاملاً معنی‌داری بین حضور این ژن و قدرت بیماری‌زایی گونه‌های Streptomyces دیده شد.کینگ [xx] و همکاران (8) اظهار داشتند که شدت علائم ایجادشده بر روی سیب‌زمینی با میزان تولید تاکستومین در ارتباط است، آن‌ها با جداسازی و خالص‌سازی این توکسین از محیط کشت و اندازه‌گیری میزان آن نشان دادند که میزان تولید توکسین با شدت تولید علائم مختلف اسکب (سطحی، فرورفته و یا برجسته) ارتباط معنی‌داری دارد.

هلی[xxi] و همکاران (13) نیز در تأیید نتایج پژوهش حاضر نشان دادند در برخی نژادهای باکتری S. turgidiscabies و acidiscabie S. ژن txtA کاملاً ازبین‌رفته و یا به‌شدت تحلیل‌رفته هستند و قادر به سنتز تاکستومین نیستند، بنابراین روی غده‌های سیب‌زمینی، بیماری‌زایی خفیف نشان می‌دهند. در این پژوهش نیز 6 جدایه علی‌رغم اینکه از بافت‌های آلوده جداسازی شده بودند، فاقد قدرت بیماری‌زایی و فاقد ژن تاکستومین تشخیص داده شدند بنابراین احتمال وجود این گونه در منطقه بسیار بالاست.

معصومی و تقوی (16) نشان دادند که ژنTxtA می‌تواند نشانگر مناسبی جهت تشخیص بیماری‌زایی در نژادهای استرپتومایسس باشد و نشان دادند که ژن بیماری‌زای TxtA در همه جدایه‌های بیماری‌زا موجود و در جدایه‌های غیربیماری‌زا وجود ندارد که بیانگر نقش مستقیم این ژن در بیماری‌زایی این پاتوژن است. البته خداکرمیان و همکاران (17) در مغایرت با نتایج این پژوهش و پژوهش‌های مشابه، نشان دادند که فقط جدایه‌هایی که تولید اسکب برجسته می‌کنند توان تولید تاکستومین را دارند و سایر نژادهایی که تولید اسکب حفره‌ای یا زخم فرورفته می‌کنند قادر به تولید این توکسین نیستند.



[1]- Common Scab

[2]- Thaxtomin

[3]- Schaad

[4]- Yeast malt extract agar

[5]- Loria

[6]- Agria

[7]- Oat Meal Agar

[8]- Oxidative fermentative test

[9]- Shirling & Gottlieb

[10]- Pepton-yeast extract iron agar

[11]- Melanin

[12]- Li & DeBoer

[13]- Nutrient Broth

[14]- Ethylene Diamine Tetra Acetic acid

[15]- Sodium dodecyl sulfate

[16]- Proteinase K

[17]- Denaturation

[18]- Annealing

[19]- Extension

[xx]- King

[xxi]- Healy

 

(1)              Goyer C, Beaulieu C. Host range of Streptomyces strains causing common scab. Plant Disease. 1997; 81(8): 901–904.

(2)              Agrios GN. Plant Pathology. 5th edition. USA: Elsevier Academic Press; 2005.

(3)              Loria R, Kers J, Joshi M. Evolution of plant pathogenicity in Streptomyces. Annual Review Phytopathology. 2006; 44(1): 469–487.

(4)              Lambert DH, Loria R. Streptomyces acidiscabies sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology. 1989; 39(4): 387-392.

(5)              Miyajima K, Tanaka F, Takeuchi T, Kuninaga S. Streptomyces turgidiscabies sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 1998; 48(1): 495–502.

(6)              Hill J, Lazarovits G. A mail survey of growers to estimate potato common scab prevalence and economic loss in Canada. Canadian Journal Plant Pathology. 2005; 27(1): 46–52.

(7)              Hasani S, Taghavi SM. Phenotypic and genotypic diversity of Iranian Streptomyces isolates that cause potato common scab. Journal of Plant Pathology. 2014; 96 (3): 459-464

(8)              King RR, Lawrence CH, Clark MC, Calhoun LA. Correlation of phytotoxin production with pathogenicity of Streptomyces scabies isolates from scab infected tubers. Journal of American Potato Association. 1991; 68(10): 675–680.

(9)              Schaad NW, Jones JB, Chun W. Laboratory Guide for identification of Plant Pathogenic Bacteria. New York: American Phytopathological society Press. 2001; 373p.

(10)          Loria R, Bukhliad RA, Creath RH, Leiner M, Steffens JC. Differential production of thaxtomins by pathogenic Streptomyces species in vitro. Phytopathology. 1995; 85(5): 537-541.

(11)          Shirling EB, Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology. 1966; 16(3): 313–340.

(12)          Li X, De Boer SH. Selection of polymerase chain reaction primers from an RNA intergenic spacer region for specific detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus. Phytopathology. 1995; 85(8): 837-842.

 

(13)          Healy FG, Wach M, Krasnoff SB, Gibson DM, Loria R. The txt AB genes of the plant pathogen Streptomyces acidiscabies encode a peptide synthetase required for phytotoxin thaxtomin A production and pathogenicity. Molecular Microbiology 200; 38(4): 794–804.  

 

(14)          Beausejour J, Beaulieu C. Characterization of Streptomycesscabies mutants deficient in melanin biosynthesis. Canadian Journal of Microbiology, 2004; 50(9): 705-709.

(15)          Khayat maher R, Amoozegar M, Seyyedmahdi S, Hamedi J, Naghavi M, Foroozan far F et al .Isolation and screening of phytotoxin producing actinomycetes and determination of phytotoxin effect spectrum of selected strains. Biological Journal of Microorganism. 2012; 1 (2): 1-22.

(16)          Masoomi F, Taghavi SM. Identification of Pathogenicity genes and their roles in pathogenicity of Streptomyces isolates causal agent of potato common scab. Proceeding of the 20th Iranian Plant Protection Congress. Shiraz; Page 607.

(17)          Khodakaramian G, Zafari D, Soleimani Pari MJ. Diversity of Streptomyces strains of causal agent of potato common scab in hamadan province and their capability in production of Taxtomin. Journal of Plant Pests and Diseases. 2011; 79(1): 53-70.