تأثیر یون‌های فلزی بر فعالیت و پایداری آنزیم‌های پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

2 استادیار بیوشیمی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

3 استادیار بیوفیزیک، دانشگاه تهران، تهران، ایران

4 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی، تهران، ایران

5 دانشیار فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه شهید مدنی آذربایجان، تبریز، ایران

چکیده

مقدمه: پیرازین‌آمیداز یک متالوآنزیم مونومری با فعالیت هیدرولازی است و مسئول تبدیل داروی ضدسل پیرازین‌آمید به شکل فعالش یعنی پیرازینوئیک اسید است. جایگاه اتصال به فلز در آنزیم پیرازین‌آمیداز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حاوی یک آسپارتیک اسید (آسپارتیک اسید49) و سه هیستیدین (هیستیدین 51، هیستیدین57 و هیستیدین71) است. بروز جهش در ژن پیرازین‌آمیداز (pncA) مسؤول اصلی مقاومت پیرازین‌آمیدی است و می‌تواند جایگاه اتصال به فلز را تغییر دهد. ازاین‌جهت، بررسی تأثیر یون‌های فلزی مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته می‌تواند مهم باشد.‏‏

مواد و روش‏‏ها: در این مطالعه ناقل بیانی حاوی ژن پیرازین‌آمیدازهای نوع وحشی و جهش‌یافته به اشرشیا کلی سویۀ BL21 منتقل شد سپس پروتئین‌های نوترکیب بیان و تخلیص شدند. میزان تخلیص با روش الکتروفورزSDS-PAGE ارزیابی شد؛ سپس فعالیت و پایداری آنزیم‌های خالص‌شده در حضور غلظت یک میلی‌مولار از یون‌های دوظرفیتی نیکل (Ni2+)، آهن (Fe2+) و منگنز (Mn2+) بررسی شد.‏‏

نتایج: بررسی ژل حاصل از الکتروفورز SDS-PAGE نشان داد که آنزیم‌های بیان‌شده، خالص شده‌اند. بررسی فعالیت و پایداری در حضور فلزات نشان داد که نیکل باعث افزایش فعالیت و پایداری آنزیم‌های نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها (جهش‌یافته ۱: L151S و جهش یافته 2 (سه‌گانه): A143T/T168A/E173K) شد. آهن باعث کاهش فعالیت و پایداری جهش‌یافتۀ 1 شد؛ اما بر سایر آنزیم‌ها تأثیر چشمگیری نداشت. منگنز باعث کاهش فعالیت و پایداری آنزیم‌ها شد.‏

بحث و نتیجه‏ گیری: یون نیکل نسبت به یون‌های آهن و منگنز میان‌کنش‌های مساعدتری با جایگاه اتصال به فلز در پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها برقرار کرد و بنابراین باعث افزایش فعالیت و پایداری آنزیم‌ها شد.‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of metal ions on the activity and stability of wild type and mutant pyrazinamidases

نویسندگان [English]

  • Mehrnoosh Safarzadeh 1
  • Mohammad Pazhang 2
  • Framarz Mehrnejad 3
  • Farahnoosh Dustdar 4
  • Nader Chaparzadeh 5
  • Davoud Rabiei Faradonbeh 1
1 M.Sc. of Cellular and Molecular biology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran
2 Assistant Professor of Biochemistry, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran
3 Assistant Professor of Biophysics, University of Tehran, Tehran, Iran
4 Assistant Professor of Microbiology, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran
5 Associate Professor of Plant physiology, Azarbaijan Shahid Madani University, Tabriz, Iran
چکیده [English]

Introduction: Pyrazinamidase is a metalloenzyme with hydrolyzing activity which is responsible for conversion of pyrazinamide (anti tuberculosis drug) to active molecule, pyrazinoic acid. The metal-binding site in the enzyme is composed of Asp49, His51, His56 and His71. Mutations in the pyrazinamidase gene are responsible for resistance to pyrazinamide in Mycobacterium tuberculosis and can alter the binding of metal ions to the metal binding site in the enzyme. Therefore, it is important to study the effect of metal ions on the enzymatic activity and stability of the wild type and mutant pyrazinamidases.

Materials and methods: In this study, E. coli BL21 was transformed by expression vectors carrying wild type and mutant pyrazinamidase genes. The recombinant proteins were expressed and then purified by Ni- agarose column. The purity of the purified proteins was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis. Finally, the activity and stability of the purified enzymes were studied in the presence of 1mM of Ni2+, Fe2+ and Mn2+.

Results: SDS-PAGE analysis showed that the expressed enzymes were purified. The activity and stability results depicted that Ni2+ increases the activity and stability of the wild type and mutant (mutant1: L151S, and mutant2 (triple): A143T/T168A/E173K) enzymes. Fe2+ decreased the activity and stability of mutant1, but has no significant effect on other enzymes. The activity and stability of the enzymes decreased in the presence of Mn2+.

Discussion and conclusion: Ni2+ interact favorably with metal binding site of the wild type enzyme and mutants compared with Fe2+ and Mn2+ and then increases the activity and stability of the enzymes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Activity and stability
  • Metal binding site
  • Mycobacterium Tuberculosis
  • Pyrazinamidase
  • Resistance to pyrazinamide

مقدمه.

یون‌های فلزی به‌میزان زیادی در ساختار پروتئین‌ها دیده می‌شوند (1). این یون‌ها می‌توانند در عملکرد و پایداری پروتئین‌ها نقش حیاتی داشته باشند (2- 4). آمینواسیدهای مختلفی در اتصال به یون‌های فلزی در پروتئین‌ها مشارکت دارند. از این آمینواسیدها می‌توان به آسپارتیک اسید، گلوتامیک اسید، سیستئین و هیستیدین اشاره کرد (1). همۀ فلزات غیر از مس تمایل دارند با زنجیره‌های جانبی حاوی گروه کربوکسیل میان‌کنش دهند (1). فلزاتی همچون منگنز، کبالت وآهن ترجیح می‌دهند با گروه ایمیدازول در زنجیرۀ جانبی آمینواسید هیستیدین میان‌کنش دهند، به این دلیل به این فلزات، فلزاتِ کلاس ایمیدازول گفته می‌شود (1). فلزات کلاس سولفور یعنی نیکل، روی و مس با گروه تیول در زنجیرۀ جانبی سیستئین میان‌کنش می‌دهند. فلزات این کلاس به گروه ایمیدازول نیز تمایل زیادی دارند (1). آنزیم پیرازین‌آمیداز (رمزشده توسط ژن pncA) یک متالوپروتئین مونومری 186 آمینو‌اسیدی با وزن مولکولی 89/20 کیلودالتون است و pH بهینۀ آن 7 و دمای بهینۀ آن 40 درجه سانتی‌گراد می‌باشد (5). این آنزیم داروی پیرازین‌آمید (دارویی ارزشمند در کنترل بیماری سل) را هیدرولیز می‌کند و به پیرازینوئیک اسید (شکل فعالش) تبدیل می‌کند (6). پیرازینوئیک اسید در عملکردهای طبیعی سلول باکتری عامل بیماری سل (مایکو باکتریوم توبرکلوزیس) اختلال ایجاد می‌کند (7 و 8). دو[1] و همکارانش ساختار سه‌بعدی پیرازین‌آمیداز مربوط به پیروکوکوس هوریلکوشی[2] را مشخص کردند. آن‌ها در مطالعۀ خود نشان دادند رزیدوهای آسپارتیک اسید52، هیستیدین54 و هیستیدین71 در ناحیۀ اتصال فلز مشارکت دارند (9). با تعیین ساختار سه‌بعدی آنزیم پیرازین‌آمیداز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس (عامل بیماری سل) مشخص شد که در ساختار آن دو نوع یون فلزی Fe+2 و Mn+2 وجود دارد (10). نتایج تعیین ساختار نشان داد این آنزیم از صفحه بتای موازی شش‌رشته‌ای با مارپیچ‌های واقع در هر دو طرف به‌شکل یک دمینβ/ α واحد ساخته شده است (شکل 1.الف) (10). جایگاه فعال حاوی سه رزیدوی کاتالیتیک متشکل از آسپارتیک اسید8، لیزین96 و سیستئین138 (شکل 1.ب) است و جایگاه اتصال به فلز نیز دارای یک آسپارتیک اسید (آسپارتیک اسید49) و سه هیستیدین (هیستیدین51، هیستیدین57 و هیستیدین71) است (شکل 1.ب) (10). همان‌طور که در شکل 1.الف و 1.ب مشخص است جایگاه اتصال به فلز در نزدیکی جایگاه فعال قرار دارد و بنابراین فلز قرارگرفته در جایگاه اتصال به فلز می‌تواند با مولکول‌های آب نزدیک جایگاه فعال میان‌کنش دهد (10- 13).

مشاهده شده است که جهش در ژن آنزیم‌هایی همچون DNA ژیراز و پیرازین‌آمیداز در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به‌ترتیب باعث بروز مقاومت به داروهای افلوکساسین و پیرازین آمید می‌شود (12 و 14). به‌علت جهش در ژن آنزیم پیرازین‌آمیداز، فعالیت پیرازین‌آمیدازی پروتئین حاصل از آن از دست می‌رود و باکتری از تبدیل پیرازین آمید به شکل فعال پیرازینوئیک اسید ناتوان می‌شود (12، 15- 20)؛ بنابراین نبود فعالیت پیرازین‌آمیدازی باعث مقاومت پیرازین آمیدی در سویه‌های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌شود. چندین مطالعه با پیرازین‌آمیداز مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نوترکیب نشان داد که جهش‌های مؤثر بر جایگاه فعال و جایگاه اتصال فلز، فعالیت آنزیم پیرازین‌آمیداز را مختل می‌کنند درحالی‌که جهش‌های دور از این جایگاه‌ها تأثیر کمتری بر فعالیت آنزیمی می‌گذارند (5، 12 و 21)؛ بنابراین بروز مقاومت به داروی پیرازین‌آمید در جهش‌یافته‌های مختلف مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌تواند به‌دلیل تأثیر جهش‌ها بر جایگاه اتصال فلزی باشد. جهش در جایگاه اتصال به فلز می‌تواند فعالیت و پایداری آنزیم پیرازین‌آمیداز را تحت تأثیر قرار دهد.

در این مطالعه، فعالیت و پایدرای آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی (مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویۀ H37Rv) و دو جهش‌یافتۀ L151S (جهش‌یافتۀ 1، شکل 2) و A143T/T168A/E173K (جهش‌یافتۀ 2 (سه‌گانه)، شکل ۲) بررسی شد. گفتنی است که توالی آمینواسیدی ژن آنزیم پیرازین‌آمیداز در مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویۀ H37Rv به‌عنوان مبنا قرار می‌گیرد (سویۀ رفرنس) (10 و 22) و توالی آنزیم‌های جهش‌یافته از سویه‌های مقاوم نسبت به آن مقایسه می‌شوند. همان‌طور که نتایج تطبیق توالی در شکل 2 و همچنین بررسی ساختار جهش‌یافته‌ها در شکل 3 (الف و ب) نشان می‌دهد، در جهش‌یافته‌های 1 و 2، جهش‌ها در نزدیکی جایگاه اتصال به فلز و جایگاه فعال قرار ندارند. گفتنی است در این مطالعه ژن آنزیم نوع وحشی مربوط به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویۀ H37Rv است و ژن آنزیم‌های جهش‌یافته را دوستدار [3]و همکاران از سویه‌های مقاوم مایکوباکتریوم توبرکلوزیس از ایران، گزارش کرده‌اند (23). هدف از این مطالعه، بررسی خصوصیات آنزیمی پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته و ارزیابی فعالیت آنزیمی و پایداری حرارتی آن‌ها در حضور فلزات است.

 

 

 

 

شکل 1- الف) ساختار سوم آنزیم پیرازین‌آمیداز، ب) رزیدوهای دخیل در جایگاه فعال و جایگاه اتصال به فلز.

شکل‌ها با استفاده از فایل با کد پی‌دی‌بی[4]: 3pl1 با نرم‌افزار اس‌پی‌دی‌بی‌وی[5] رسم شده‌اند. گفتنی است فایل پی‌دی‌بی مربوط به باکتری مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویۀ H37Rv بوده (10) و از سایت اینترنتی www.pdb.org تهیه شده است.

 

شکل 2- تطبیق توالی آمینواسیدی آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها. توالی آمینواسیدی آنزیم نوع وحشی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس سویة H37Rv است. توالی مریوط به جهش‌یافتۀ 1 (L151S) و جهش‌یافتة ۲ (سه‌گانه) از منبع 23 تهیه شده است. اطراف آمینواسیدهای تغییریافته در جهش‌یافته‌ها، خط کشیده شده است. آمینواسیدهای نشان‌داده‌شده با علامت ستاره و پیکان به‌ترتیب مربوط به آمینواسیدهای دخیل در جایگاه فعال و جایگاه اتصال به فلز هستند.

 

 

 

شکل 3- ساختار مدل‌سازی‌شدۀ جهش‌یافتۀ 1 (الف) و جهش‌یافتۀ 2 (سه‌گانه) (ب). مدل‌ها با استفاده از الگو با کد پی‌دی‌بی: 3pl1 از طریق SWISS-MODEL Workspace (http: //swissmodel.expasy.org) ساخته شده‌اند.

 

 

‏‏

 

مواد و روش‏ها.

مواد: ایزوپروپیل بتا-د- تیوگالاکتوپیرانوزید[6] از شرکت فرمنتاز[7] تهیه شد. پیرازین آمید و سایر مواد به‌کاررفته در این پژوهش از شرکت مرک خریداری شد.

.بیان، تخلیص و الکتروفورز پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌های آن: ناقل بیانی pET28a(+) حاوی ژن آنزیم نوع وحشی و آنزیم‌های جهش‌یافته از دوستدار و همکاران (24) تهیه شد و با شوک حرارتی به سلول‌های اشریشیا کلی سویۀ BL21 منتقل شد و سپس با استفاده از محیط کشتLB حاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین، بیان پروتئین در دمای 22 درجۀ سانتی‌گراد توسط غلظت نهایی یک میلی‌مولار از ایزوپروپیل بتا-د- تیوگالاکتوپیرانوزید به‌مدت 14 ساعت القا شد. برای تخلیص، از ستون نیکل –NTA (شرکت کیاژن[8]) (22) استفاده شد و الکتروفورز SDS-PAGE با استفاده از ژل پلی‌آکریل‌آمید 12درصد (وزنی/حجمی) توسط روش لاملی[9] انجام شد (25).

تعیین فعالیت آنزیم‌ها (12): تعیین فعالیت آنزیمی براساس تست واین[10] انجام شد (12). 50 میکرولیتر از محلول حاوی سوبسترا (پیرازین آمید 40 میلی‌مولار، تریس 100 میلی‌مولار 7pH،2- مرکاپتواتانول 2 میلی‏مولار) به 50 میکرولیتر از محلول‌های حاوی آنزیم اضافه شد. به محیط واکنش آنزیمی بعد از انکوباسیون در 37 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 3 دقیقه، 10 میکرولیتر از آمونیوم فروس سولفات[11]و 890 میکرولیتر از گلیسین هیدروکلراید[12] (4/3 pH) اضافه شد. سپس ناخالصی‌ها توسط سانتریفیوژ در دور g20000 به‌مدت 5 دقیقه حذف شد و جذب محلول رویی در طول موج 480 نانومتر تعیین شد. این نوع تعیین فعالیت براساس پیرازینوئیک اسید تولیدی است و یک واحد عمل آنزیمی معادل مقدار آنزیمی است که در زمان یک دقیقه، یک میکرومول پیرازینوئیک اسید تولید کند.

تأثیر یون‌های فلزی بر فعالیت آنزیم‌ها: فعالیت آنزیمی (نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها) در حضور غلظت 1 میلی‌مولار از نمک‌های سولفاته فلزات نیکل، آهن و منگنز براساس روش مذکور در فوق انجام شد. گفتنی است که هرکدام از واکنش‌ها سه بار تکرار شدند.

.بررسی پایداری حرارتی هرکدام از پروتئین‌ها در حضور و نبود یون‌های فلزی: ابتدا محلول‌های آنزیمی هرکدام از پیرازین‌آمیدازهای نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها در دمای 40 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و در بازه‌های زمانی صفر، 5، 10، 20، 30،40، 50، 60 دقیقه برداشته شدند و به داخل یخ منتقل شدند. پس از 30 دقیقه فعالیت باقی‌مانده آنزیم براساس روش مذکور در فوق ارزیابی شد. بررسی پایداری برای هریک از آنزیم‌ها سه بار تکرار شد. زمان صفر انکوباسیون دمایی به‌عنوان کنترل (100درصد فعالیت) در نظر گرفته شد.

جهت بررسی تأثیر یون‌های فلزی بر پایدرای آنزیم‌ها، محلول‌های آنزیمی نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها در غلظت 1 میلی‌مولار از فلزات نیکل، آهن و منگنز، در دمای 40 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند و در بازه‌های زمانی صفر، 5، 10، 20، 30،40، 50 و 60 دقیقه برداشته شدند و به داخل یخ منتقل شدند. پس از 30 دقیقه سرعت‌های آنزیمی ارزیابی شدند. زمان صفر انکوباسیون دمایی به‌عنوان کنترل (100درصد فعالیت) در نظر گرفته شد. بررسی پایداری برای هریک از آنزیم‌ها در حضور فلزات مختلف، سه بار تکرار شد.

 

.محاسبۀ ثابت سرعت غیرفعال‌شدن (kin) و نیمه عمر آنزیم در حضور و نبودِ فلزات: با توجه به اینکه غیرفعال‌شدن آنزیم‌ها (کاهش پایداری) مطابق با واکنش‌های درجه یک بود، بنابراین برای محاسبۀ ثابت سرعت غیرفعال‌شدن(kin) و همچنین نیمه عمر[13] آنزیم‌ها از معادلات زیر استفاده شد (26):

 (1)ln(Activity)=ln(Activity)0- kint و         

(2)   

 تجزیه و تحلیل آماری: در این پژوهش جهت تجزیه و تحلیل آماری اطلاعات حاصل از فعالیت و پایداری آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها در حضور و نبودِ فلزات از نرم‌افزار SPSS استفاده شد.

 

نتایج.

.بیان و تخلیص پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌های آن: بعد از بیان و تخلیص آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها، جهت ارزیابی میزان خلوص پروتئین‌ها، آنزیم‌های خالص‌شده توسط الکتروفورز SDS- PAGE بررسی شد. نتیجه نشان داد که پروتئین‌های حاصل از بیان تقریباً 21 کیلو دالتون وزن مولکولی داشته و به‌طور کامل خالص شده‌اند (شکل 4).

 

جدول 1- تجزیة واریانس تأثیر فلز آهن بر فعالیت آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها

منابع تغییر

درجه آزادی

مجمع مربعات

میانگین مربعات

F

نوع وحشی

3

4/1794

2/598

*2/668

جهش‌یافتة 1

3

2/5622

2/1874

*6/484

جهش‌یافتة 2

3

6/3553

5/1184

*6/182

* معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد

 

 

شکل 4- نتیجۀ الکتروفورز ژل SDS-PAGE. 1. اندازه نمای پروتئین، 2. آنزیم نوع وحشی، 3. جهش‌یافتۀ ۱ و 4. جهش‌یافتۀ ۲

 

تأثیر یون‌های فلزی بر فعالیت آنزیم‌ها: جهت بررسی فعالیت آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها فعالیت آنزیم‌های مذکور در غلظت یک میلی‌مولار از فلزات آهن، نیکل و منگنز ارزیابی شد. همان‌طور که در شکل 5 و جدول ۱ (به عنوان مثال فلز آهن) مشاهده می‌شود، فلزات بر فعالیت آنزیم‌های نوع وحشی و جهش‌یافته به‌طور معنی‌داری تأثیر گذاشته‌اند. نتایج نشان داد که نیکل باعث افزایش فعالیت آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها شد. این افزایش در مورد آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافتۀ 1 بیشتر است (شکل 5 الف). آهن در جهش‌یافتۀ 1 باعث کاهش فعالیت شد اما در آنزیم‌های دیگر (نوع وحشی و جهش‌یافتۀ ۲) مقداری فعالیت آنزیم‌ها را افزایش داد (شکل 5 ب). بررسی فعالیت آنزیم‌ها در حضور منگنز نشان داد که منگنز فعالیت آنزیم‌های نوع وحشی و جهش‌یافته را کاهش می‌دهد (شکل 5 ج).

 

 

شکل 5- تأثیر غلظت یک میلی‌مولار یون‌های فلزی بر فعالیت آنزیم نوع وحشی (الف)، جهش‌یافتۀ 1 (ب) و جهش‌یافتۀ ۲ (سه‌گانه) (ج).

 

 

.بررسی پایداری حرارتی آنزیم‌ها در حضور یون‌های فلزی: محلول‌های آنزیمی از آنزیم وحشی و جهش‌یافته‌ها در حضور فلزات نیکل، آهن و منگنز (با غلظت یک میلی‌مولار) و بدون حضور آن‌ها در دمای 40 درجه سانتی‌گراد در زمان‌های مختلف انکوبه شد و سپس نمودار فعالیت باقی‌مانده علیه زمان رسم شد (شکل 6). سپس براساس نمودارهای حاصل (شکل 6) و با استفاده از معادله (1) ثابت سرعت غیرفعال‌شدن (kin) آنزیم‌ها ( در حضور و نبودِ فلزات به دست آمد (شکل 7) گفتنی است که با کاهش ثابت سرعت غیرفعال‌شدن، پایداری (نیمه عمر) افزایش می‌یابد. بنابراین هر عاملی که باعث کاهش و یا افزایش ثابت سرعت غیرفعال‌شدن آنزیم‌ها شود، به‌ترتیب باعث افزایش و کاهش پایداری آنزیم‌ها می‌شود. همان‌طور که در شکل 7 و جدول 2 قابل مشاهده است، تأثیر فلزات بر ثابت سرعت غیرفعال‌شدن آنزیم‌ها و درنتیجه بر پایداری آنزیم‌ها، در کل (غیر از آهن در نوع وحشی و جهش‌یافتۀ سه‌گانه) معنی‌دار بوده است. نتایج نشان داد نیکل باعث کاهش ثابت سرعت غیرفعال‌شدن و درنتیجه افزایش نیمه عمر (پایداری) آنزیم نسبت به حالت کنترل (بدون حضور فلز) به‌خصوص در جهش‌یافتۀ 1 (تا پنج برابر) شده (شکل 7 الف و جدول 3) و این تأثیر معنی‌دار بوده است. فلز آهن تأثیری بر ثابت سرعت غیرفعال‌شدن (پایداری) آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافتۀ سه‌گانه نگذاشته (شکل 7ب و جدول 3) اما باعث افزایش سه‌برابری ثابت سرعت غیرفعال‌شدن (کاهش سه‌برابری نیمه عمر) جهش‌یافتۀ 1 (نسبت به حالت کنترل) شده است (شکل 7 ب و جدول 3). یون منگنز باعث کاهش نیمه عمر در همۀ آنزیم‌های مورد مطالعه‌ شده است (شکل 7 ج و جدول 3).

 

 

 

شکل 6- پایداری حرارتی آنزیم نوع وحشی (الف)، جهش‌یافتۀ 1 (ب) و جهش‌یافتۀ ۲ (سه‌گانه) (ج) در عدم حضور (کنترل) (♦) و حضور غلظت یک میلی‌مولار منگنز(▲)، نیکل (× ) و آهن (■)، انحراف معیار نمودارها تا 4درصد است. گفتنی است که error bar نشان‌داده‌شده در نمودارها در اغلب نقاط در داخل علائم قرار گرفته است.

 

جدول 2- تجزیۀ واریانس تأثیر فلزات بر ثابت غیرفعال‌شدن آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها

منابع تغییر

درجه آزادی

مجمع مربعات

میانگین مربعات

F

نوع وحشی

3

8/107

9/35

*6/176

جهش‌یافتۀ ۱

3

1329

443

*3/347

جهش‌یافتۀ ۲

3

3/1500

1/500

*4/972

* معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد

 

شکل 7- ثابت سرعت غیرفعال‌شدن آنزیم نوع وحشی (الف)، جهش‌یافتۀ ۱ (ب) و جهش‌یافتۀ ۲ یا سه‌گانه (ج) در حضور فلزات مختلف. همان‌طور که در نمودارها مشخص است تأثیر فلزات بر ثابت غیرفعال‌شدن آنزیم ها معنی‌دار است (به جز آهن در آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافتۀ ۲).

 

جدول 3- ثابت سرعت غیرفعال‌شدن (kin) و نیمه عمر برای هریک از آنزیم‌ها در حضور و نبود فلزات. اطلاعات مربوط به کنترل از منبع 24 آورده شده است.

آنزیم

یون‌های فلزی

kin (دقیقه/1) 103 ×

نیمه عمر (دقیقه)

نوع وحشی

کنترل

08/0 ±4

8±173

Fe2+

07/0±4

6±170

Ni2+

05/0±2

16±346

Mn2+

02/0±10

4±69

جهش‌یافتة ۱

کنترل

3/0±10

4±69

Fe2+

1±30

1±23

Ni2+

04/0±2

14±346

Mn2+

06/0±20

1±34

جهش‌یافتة 2 (سه‌گانه)

کنترل

5/0±20

2±34

Fe2+

04/0±20

2±34

Ni2+

02/0±9

3±77

Mn2+

2/1±40

5/0±17


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

نقش مهم آنزیم پیرازین‌آمیداز در تعیین مقاومت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به داروی پیرازین‌آمید باعث شده است درک تأثیر فلزات یونی بر فعالیت و پایداری این آنزیم و جهش‌یافته‌های آن از اهمیت بسزایی برخوردار باشد (22). در این پژوهش جهت بررسی تأثیر فلزات مختلف بر فعالیت و پایداری آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها سه فلز آهن، منگنز و نیکل انتخاب شد. گفتنی است آهن و منگنز با توجه حضور در ساختار آنزیم (10) و نیکل نیز به دلیل نبود اطلاعات کافی دربارۀ اثر آن بر فعالیت و پایداری آنزیم پیرازین‌آمیداز انتخاب شد (دربارۀ تأثیر فلزات دیگر همچون منیزیوم و کبالت که در ساختار آنزیم دیده نشده‌اند، قبلاً اطلاعاتی ارائه شده است (22). آهن، منگنز و نیکل توانایی میان‌کنش با رزیدوهای هیستیدین موجود در جایگاه اتصال به فلز در آنزیم‌ها را دارند (1، 10). نتایج نشان داد که فلز نیکل باعث افزایش فعالیت و پایداری آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها می‌شود. فلزات می‌توانند ازطریق میان‌کنش با زنجیره‌های جانبی رزیدوهای موجود در پروتئین‌ها، به آن‌ها متصل شوند و بدین ترتیب عملکرد و پایداری پروتئین‌ها را تحت تأثیر قرار دهند (27). ژنگ[xiv] و همکاران نشان دادند یون‌های فلزی نقش مهمی در تعدیل فعالیت و پایداری آنزیم پیرولیزین دارند (27). اسپاراتا[xv] و همکاران مشاهده کردند جانشینی یون‌های فلزی به جای یکدیگر در آنزیم کاتکول-او- متیل ترانسفراز[xvi] می‌تواند فعالیت آنزیم را در مرحلۀ انتقال گروه متیل به روی سوبسترای کاتکولی تحت تأثیر قرار دهد (28). شین[xvii] و همکاران نشان دادند که فعالیت آنزیم پیرازین‌آمیداز با نوع یون فلزی و همچنین نوع جهش‌ها در ارتباط است (22). از طرف دیگر سالازار- سالیناس[xviii] و همکاران مشاهده کردند که فلزات می‌توانند از طریق میان‌کنش با مواد و تغییر مقدار قطبیت آن‌ها، واکنش‌ها را تحت تأثیر قرار دهند (11). آن‌ها نشان دادند فلزاتی همچون روی از طریق جهت‌گیری مناسب در جایگاه اتصال به فلز می‌توانند با افزایش میزان قطبیت گروه هیدروکسیل در مولکول آب، حملۀ نوکلئوفیلی آن را در واکنش هیدرولیزی کاتالیز‌شده توسط آنزیم پیرازین‌آمیداز افزایش دهد و بدین ترتیب باعث افزایش فعالیت هیدرولازی آنزیم شود (11). بنابراین دربارۀ نیکل می‌توان گفت، این فلز می‌تواند در جایگاه اتصال به فلز در آنزیم پیرازین‌آمیداز به جای فلز آهن که به‌طور طبیعی در آن جایگاه حضور دارد (10)، قرار گیرد و احتمالاً با جهت‌گیری مناسب نسبت به آهن توانسته است میان‌کنش‌های مساعدتری را با زنجیره‌های جانبی رزیدوهای موجود در جایگاه اتصال به فلز برقرار کند. درنتیجه نیکل توانسته ازطریق جهت‌گیری مناسب با جایگاه اتصال به فلز میان‌کنش دهد و بدین ترتیب باعث افزایش پایداری آنزیم‌ها (نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها) شود. این جهت‌گیری به‌گونه‌ای بوده است که توانسته همچون روی باعث قطبی‌ترشدن گروه هیدروکسیل در مولکول آب (دخیل در هیدرولیز) شود و درنتیجه باعث افزایش فعالیت آنزیم‌ها نیز شود.

با بررسی تأثیر فلز آهن بر آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها نتایج نشان داد که آهن فعالیت جهش‌یافتۀ 1 (L151S) را کاهش داده است درحالی‌که بر فعالیت دو آنزیم دیگر تأثیر چشمگیری نگذاشته است. همچنین فلز آهن پایداری (نیمه عمر) جهش‌یافتۀ 1 را به‌طور چشمگیری کاهش داده است. پژوهش‌ها نشان داده است که تغییر در جایگاه اتصال به فلز می‌تواند بر اتصال فلز و درنهایت عملکرد آن در پروتئین‌ها تأثیرگذار باشد (27 و 28). بنابراین می‌توان گفت جایگزینی آمینواسید سرین به جای لوسین در جهش‌یافتۀ ۱ احتمالاً باعث تغییر ساختار جایگاه اتصال به فلز در این جهش‌یافته شده است. این تغییر ساختار جایگاه اتصال به‌نحوی است که آهن به‌طور مناسب نمی‌تواند در آن قرار گیرد و میان‌کنش مساعد با رزیدوهای آن برقرار کند (28). این امر باعث کاهش چشمگیر پایداری و به تبع آن کاهش فعالیت در این جهش‌یافته در حضور آهن شده است.

فلز منگنز نیز همانند آهن در جایگاه اتصال به فلز در آنزیم پیرازین‌آمیداز دیده شده است (10). نتایج این پژوهش نشان داد که آنزیم‌ها در حضور این فلز پایداری و فعالیت کمی نسبت به حالت کنترل (بدون فلز) در مقایسه با فلز آهن و نیکل دارند. سالازار- سالیناس و همکاران نشان دادند که منگنز بیشتر از آهن باعث افزایش قطبیت گروه هیدروکسیل در مولکول آب درگیر در هیدرولیز پیرازین‌آمید می‌شود اما میان‌کنش آن با آنزیم ضعیف‌تر از آهن است (نیروی کئوردینه‌شدن منگنز با آنزیم کمتر از آهن است) (11). بنابراین می‌توان گفت گرچه منگنز در جایگاه اتصال به فلز در آنزیم مشاهده شده است و می‌تواند در کاتالیز آنزیم نقش داشته باشد (10)؛ اما به نظر می‌رسد میان‌کنش نیکل و آهن با جایگاه اتصال به فلز در آنزیم پیرازین‌آمیداز نسبت به منگنز مساعدتر است و جهت‌گیری آن‌ها برای تأثیرگذاری بر کاتالیز آنزیمی بهتر از منگنز است.

درنهایت می‌توان گفت فلز نیکل احتمالاً با ایجاد میان‌کنش‌های مساعدتر با جایگاه اتصال به فلز و احتمالاً افزایش قطیبت گروه هیدروکسیل در مولکول آب به‌ترتیب باعث افزایش پایداری و فعالیت آنزیم پیرازین‌آمیداز نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها شده است. با وجود این، جهت درک بهتر و کامل از نحوۀ تأثیر فلزات ذکرشده در این پژوهش بر آنزیم نوع وحشی و جهش‌یافته‌ها نیاز به مطالعات بیشتر از جمله مطالعات شبیه‌سازی دینامیک مولکولی است.

تشکر و قدردانی

نویسنگان مقاله از مساعدت سرکار خانم دکتر لیلا زرندی میاندوآب در تجزیه و تحلیل آماری نتایج و از حمایت‌های مالی معاونت پژوهش و فناوری دانشگاه شهید مدنی آذربایجان کمال تشکر و قدردانی را دارند.

 



[1]- Du

[2]- Pyrococcus horilcoshii

[3]- Doustdar

[4]- Protein Data Bank Code

[5]- SPDBV

[6]- Isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)

[7]- Fermentas

[8]- Qiagen

[9]- Laemmli

[10]- Wayne

[11]- FeSO4(NH4)2

[12]- Glycine HCl

[13]- Half Life

[xiv]- Zheng

[xv]- Sparta

[xvi]- Catechol-O-methyltransferase

[xvii]- Sheen

[xviii]- Salazar-Salinas

 

 

(1)               Zheng H., Chruszcz M., Lasota P., Lebioda L., Minor W. Data mining of metal ion environments present in protein structures.Journal of Inorganic Biochemistry 2008; 102 (9): 1765- 76.

(2)               Dahms SO., Konnig I., Roeser D., Guhrs KH., Mayer MC., Kaden D., et al. Metal binding dictates conformation and function of the amyloid precursor protein (APP) E2 domain. Journal of  Molecular Biology 2012; 416 (3): 438- 52.

(3)               Carrell AB., Shimoni L., Carrell CJ., Bock CW, Murray-Rust P, Glusker JP. The stereochemistry of the recognition of nitrogen-containing heterocycles by hydrogen bonding and by metal ions. Receptor 1993; 3 (1): 57- 76.

(4)               Guengerich FP. Thematic minireview series: metals in biology 2014. Journal of Biological Chemistry 2014; 289 (41): 28094.

(5)               Zhang H., Deng JY., Bi LJ., Zhou YF., Zhang ZP., Zhang CG., et al. Characterization of Mycobacterium tuberculosis nicotinamidase/ pyrazinamidase. FEBS Journal 2008; 275 (4): 753- 62.

(6)               Zhang Y., Scorpio A., Nikaido H., Sun Z. Role of acid pH and deficient efflux of pyrazinoic acid in unique susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to pyrazinamide. Journal of  Bacteriology 1999; 181 (7): 2044- 9.

(7)               Zhang Y., Wade MM., Scorpio A., Zhang H., Sun Z. Mode of action of pyrazinamide: disruption of Mycobacterium tuberculosis membrane transport and energetics by pyrazinoic acid. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2003; 52 (5): 790- 5.

(8)               Zhang Y., Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. International Journal of Tuberculosis and Lung Disease 2003; 7 (1): 6-21.

(9)               Du X., Wang W., Kim R., Yakota H., Nguyen H., Kim SH. Crystal structure and mechanism of catalysis of a pyrazinamidase from Pyrococcus horikoshii. Biochemistry 2001; 40 (47): 14166- 72.

(10)           Petrella S., Gelus-Ziental N., Maudry A., Laurans C., Boudjelloul R., Sougakoff W. Crystal structure of the pyrazinamidase of Mycobacterium tuberculosis: insights into natural and acquired resistance to pyrazinamide. PLoS One 2011; 6 (1): e15785.

(11)           Salazar-Salinas K., Baldera-Aguayo PA., Encomendero-Risco JJ., Orihuela M., Sheen P., Seminario JM., et al. Metal-ion effects on the polarization of metal-bound water and infrared vibrational modes of the coordinated metal center of Mycobacterium tuberculosis pyrazinamidase via quantum mechanical calculations. Journal of Physical Chemistry B 2014; 118 (34): 10065- 75.

(12)           Sheen P., Ferrer P., Gilman RH., Lopez-Llano J., Fuentes P., Valencia E., et al. Effect of pyrazinamidase activity on pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinb) 2009; 89 (2): 109- 13.

(13)           Quiliano M., Gutierrez AH., Gilman RH., Lopez C., Evangelista W., Sotelo J., et al. Structure-Activity relationship in mutated pyrazinamidases from Mycobacterium tuberculosis. Bioinformation 2011; 6 (9): 335- 9.

(14)           Vahidi V., Zolfaghari M R., Ahmadi A., Shojapour M., Moadab S R., Arjomandzadegan M. Allele Specific-PCR method for rapid detection of gyrA gene mutaions in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Biological Journal of Microorganism 2014; 3 (9): 21- 34.

(15)           Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L., Gilman R., Siddiqi S., Cynamon M., et al. Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1997; 41 (3): 540- 3.

(16)           Hirano K., Takahashi M., Kazumi Y., Fukasawa Y., Abe C. Mutation in pncA is a major mechanism of pyrazinamide resistance in Mycobacterium tuberculosis. Tubercle and Lung Disease 1997; 78 (2): 117- 22.

(17)           Hou L., Osei-Hyiaman D., Zhang Z., Wang B., Yang A., Kano K. Molecular characterization of pncA gene mutations in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates from China. Epidemiology and Infection 2000; 124 (2): 227- 32.

(18)           Mestdagh M., Fonteyne PA., Realini L., Rossau R., Jannes G., Mijs W., et al. Relationship between pyrazinamide resistance, loss of pyrazinamidase activity, and mutations in the pncA locus in multidrug-resistant clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother 1999; 43 (9): 2317- 9.

(19)           Park SK., Lee JY., Chang CL., Lee MK., Son HC., Kim CM., et al. pncA mutations in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates from Korea. BMC Infectious Diseases 2001; 1: 4.

(20)           Sreevatsan S., Pan X., Zhang Y., Kreiswirth BN., Musser JM. Mutations associated with pyrazinamide resistance in pncA of Mycobacterium tuberculosis complex organisms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1997; 41 (3): 636- 40.

(21)           Lemaitre N., Sougakoff W., Truffot-Pernot C., Jarlier V. Characterization of new mutations in pyrazinamide-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and identification of conserved regions important for the catalytic activity of the pyrazinamidase PncA. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1999; 43 (7): 1761- 3.

(22)           Sheen P., Ferrer P., Gilman RH., Christiansen G., Moreno- Roman P., Gutierrez AH., et al. Role of metal ions on the activity of Mycobacterium tuberculosis pyrazinamidase. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 2012; 87 (1): 153- 61.

(23)           Doustdar F., Khosravi AD., Farnia P. Mycobacterium tuberculosis genotypic diversity in pyrazinamide-resistant isolates of Iran. Microbial Drug Resistance 2009; 15 (4): 251- 6.

(24)           Doustdar F., Pazhang M., Mehrnejad F., Safarzadeh M., Rabiei D., Chaparzadeh N., et al. Biochemical Characterization and Computational Identification of Mycobacterium tuberculosis Pyrazinamidase in Some Pyrazinamide-Resistant Isolates of Iran. Protein Journal 2015.

(25)           Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227 (5259): 680- 5.

(26)           Asghari SM., Pazhang M., Ehtesham S., Karbalaei-Heidari HR., Taghdir M., Sadeghizadeh M., et al. Remarkable improvements of a neutral protease activity and stability share the same structural origins. Protein Engineering Design and Selection 2010; 23 (8): 599- 606.

(27)           Zeng J., Gao X., Dai Z., Tang B., Tang XF. Effects of metal ions on stability and activity of hyperthermophilic pyrolysin and further stabilization of this enzyme by modification of a Ca2+-binding site. Applied Environmental Microbiology 2014; 80 (9): 2763- 72.

(28)           Sparta M., Alexandrova AN. How metal substitution affects the enzymatic activity of catechol-O-methyltransferase. PLoS One 2012; 7 (10): e47172.