جداسازی و شناسایی مولکولی سویه‌ای از دیتزیا ماریس مقاوم به اشعه UV و بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: توانایی باکتری‌های مقاوم به اشعه برای بقا در برابر سطوح بالایی از اشعه فرابنفش وابسته به سیستم‌های ترمیم DNA و محصولات متابولیک اولیه و ثانویه است. بیوسنتز رنگدانه، فرصتی برای بقای باکتری در محیط‌های غنی از اشعه را فراهم می‌کند. رنگدانه‌های تولیدشده در برابر اشعه به‌عنوان رنگ‌های غذایی، داروهای ضدسرطان، همچنین به‌عنوان آنتی‌بیوتیک‌ها و برای اهداف آرایشی استفاده می‌شوند‏. ‏‏

مواد و روش‏‏ها: نمونه خاک شهر امیدیه در بهار سال 1393 جمع‌آوری شد و بعد از دو مرحله غربال‌گری اولیه و ثانویه سویه مقاوم به اشعه فرابنفش جداسازی و با روش مولکولی تعیین توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. فعالیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه با استفاده از DPPH و قدرت احیاکنندگی رنگدانه نیز با استفاده از کلرید فریک بررسی شد.‏‏

نتایج: در پژوهش حاضر، سویه جدید مقاوم به اشعه فرابنفش NM2 جداسازی شد. براساس مقایسه نتایج حاصل از تعیین توالی براساس الگوریتم بلاست در بانک ژنی، جنس و گونه این باکتری با دیتزیا ماریس به میزان 99درصد شباهت نشان داد. استخراج رنگدانه از سویه جداسازی‌شده با متانول و استون به‌عنوان حلال انجام شد. حداکثر جذب نوری برای رنگدانه سویه NM2 در 473 نانومتر بود. فعالیت آنتی‌اکسیدانی و توانایی احیاکنندگی رنگدانه با افزایش غلظت رنگدانه افزایش یافت. رنگدانه سویه MM2 غلظت EC50 معادل mg/ml 30/3 در مهار رادیکال آزاد از خود نشان داد و برای قدرت احیاکنندگی غلظت EC50 معادل µg/ml 46/28 به دست آمد. ‏

بحث و نتیجه‏ گیری: جداسازی منابع طبیعی تولیدکننده رنگدانه با قدرت آنتی‌اکسیدانی زیاد دارای اهمیت است. در مطالعه حاضر، رنگدانه باکتری مقاوم به اشعه فرابنفش در شرایط آزمایشگاهی، فعالیت آنتی‌اکسیدانی خوبی از خود نشان داد و رنگدانه این باکتری‌ها نقش مهمی در مقاومت به اشعه فرابنفش ایفا می‌کند. رنگدانه باکتری‌های مقاوم به اشعه ممکن است یک منبع مناسب برای غذاهایی با عملکرد مطلوب آنتی‌اکسیدانی و در صنایع داروسازی باشند‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and molecular identification of a UV-resistant strain of Dietzia maris and antioxidant activity of pigment

نویسندگان [English]

  • Narges Zamanian 1
  • Zahra Etemadifar 2
1 MSc. of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: The ability of radioresistant bacteria to survive high levels of UV radiation has been linked to their strong DNA repair systems and ability to produce primary and secondary metabolic products. The biosynthesis of pigments provides an opportunity for bacteria to live in radiation-rich environment. Recent radiation-responsive pigments are used commercially as food colorants, anticancer drugs, as well as antibiotics and for cosmetic purposes.

Materials and methods: Soil sample of Omidiyeh city was collected during the spring of 2014 and UV-resistant strain was isolated after primary and secondary screening. Then it was identified by molecular methods (16S rRNA gene sequencing). Antioxidant activity of pigment was evaluated by 2,2 -diphenyl-1-picryl hydrazyl (DPPH) and the reducing power of pigments were analyzed by ferric chloride.

Results: In this present study, new UV-resistant strain NM2 was isolated and by comparison of these 16S rRNA gene sequences to public database using the BLAST, the genus and species of the isolate was identified as Dietzia maris with 99% similarity. Extraction of pigment from isolated strain was carried out by methanol and acetone as solvents. The spectrum is characterized by maximum peak at 473 nm for pigment of NM2 strain. Antioxidant activity and the reducing ability of pigments increased by increasing their concentrations. NM2 strain pigment showed EC50 concentration of 3.30 mg/ml for DPPH free radical scavenging activity, and EC50 concentration of 28.46 µg/ml for reducing power.

Discussion and conclusion: Isolation of natural resources of pigment is very important with high anti-oxidant activity. In the current study, pigment of UV-resistant bacteria demonstrated a strong antioxidant activity in vitro and pigment of these bacteria could play an important role in UV tolerance. Pigment of UV-resistant bacteria may be an appropriate source for antioxidative-related functional foods and the pharmaceutical industry.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ultraviolet radiation
  • UV-resistant bacteria
  • Dietzia maris
  • pigment
  • Antioxidant
  • DPPH
  • Reducing power

مقدمه.

اکسیژن، یک اکسیدکننده قوی و یک پذیرنده خوب برای متابولیسم تنفسی است. احیای ناقص اکسیژن می‌تواند گونه‌های فعال اکسیژن شامل سوپراکسید، هیدروژن پراکسید و رادیکال‌های هیدروکسیل را تولید کند که این ترکیبات تأثیرات مخربی بر بیومولکول‌هایی مانند DNA، RNA، غشای لیپیدی و پروتئین‌ها می‌گذارند و باعث نقص‌های متابولیکی، پیری، جهش و درنهایت مرگ سلول می‌شوند (1 و 2). آنتی‌اکسیدان‌ها ترکیباتی هستند که از تشکیل رادیکال‌های آزاد در سلول‏ها جلوگیری می‌کنند. این ترکیبات نقش مهمی در پیشگیری از سرطان بر عهده دارند. کارتنوئیدها، ویتامین ث، ویتامین ای، سلنیوم و فیتو کمیکال‌ها از آنتی‌اکسیدان‌های مهم هستند. ارگانیسم‌ها این گونه‌های سمی را به‌وسیله آنتی‌اکسیدان‌های آنزیمی و غیرآنزیمی از بین می‌برند (3). آنتی‌اکسیدان‌ها با تحویل‌دادن یک الکترون به رادیکال‌های آزاد، از گرفتن الکترون به‌وسیله رادیکال‌ها از بیومولکول‌های دیگر و آسیب‌زدن به آن‌ها جلوگیری می‌کنند (4). باکتری‌های مقاوم به اشعه به‌وسیله ترکیبات آنتی‌اکسیدان خود، توانایی مقاومت در برابر تنش اکسیداتیو و اثرات مخرب گونه‌های فعال اکسیژن ایجادشده به‌علت تابش اشعه UV را پیدا می‌کنند. این ترکیبات آنتی‌اکسیدان می‌تواند شامل رنگدانه یا سایر متابولیت‌های اولیه و ثانویه تولیدشده در این گونه‌های باکتریایی باشد (5).

اولین بار جنس دیتزیا[1] را به‌جای گونه رودوکوکوس ماریس[2]، رینی[3] و همکاران پیشنهاد کردند. این جنس به‌طور گسترده در طبیعت پراکنده است و تاکنون سیزده گونه از آن شناخته شده است. گونه دیتزیا ماریس[4] را هریسون[5] از هالیبوت (نوعی ماهی بزرگ و پهن) جداسازی و تحت عنوان فلاووباکتریوم ماریس[6] نامگذاری کرد. این گونه از خاک، پوست و روده ماهی کپور، گلولای اعماق دریا و رسوب و داینوفلاژل پیرودینیوم باهامنس[7] نیز جداسازی شد. گزارش‌هایی مبنی بر بیماری‌زایی گونه دیتزیا ماریس وجود دارد. بمر ملچیور[8] و همکاران اولین مورد تشخیص حضور باکتری در خون (باکتریمی) را با استفاده از گونه دیتزیا ماریس گزارش کردند. این گونه از نمونه بیوپسی استخوان بیمار در بیمارستان جداسازی و به‌عنوان عامل عفونت پروتز استخوان ران تشخیص داده شد (6).

گونه دیتزیا ماریس، یک باکتری کوکسی گرم مثبت، هوازی، بدون حرکت، بدون اسپور، کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی و دارای کلنی‌های موکوئیدی است. مهم‌ترین فسفولیپدهای موجود در این گونه دیفسفاتیدیل گلیسرول، فسفاتیدیل گلیسرول، فسفاتیدیل اینوزیتول مانوزید، فسفاتدیل اینوزیتول و فسفاتیدیل اتانول آمین است. تمامی سویه‌های جنس دیتزیا رنگدانه‌های زرد تا نارنجی دارند؛ اما تنها در برخی از سویه‌های این جنس مانند دیتزیا ناترونولیمنه HS-1 و دیتزیا ماریس NIT-Dتواناییتولید رنگدانه کانتاگزانتین[9] گزارش شده است. رنگدانه کانتاگزانتین به‌علت ویژگی‌های آنتی‌اکسیدانی، ضدالتهاب، ضدتومور و ضدسرطان کاربردهای گسترده‌ای پیدا کرده است. سورفاکتانت‌های میکروبی ترکیبات فعال سطحی هستند که گروه گسترده‌ای از میکرو ارگانیسم‌ها آن‌ها را سنتز می‌کنند (7 و 8). گونه دیتزیا ماریس نیز از جمله گونه‌های تولیدکننده سورفاکتانت میکروبی است که این بیوسورفاکتانت‌ها در مقایسه با سورفاکتانت شیمیایی تریتون X-100 بهتر عمل می‌کنند (9). همچنین این گونه در پاکسازی خاک‌های آلوده به هیدروکربن‌های آلکالین‌دار، یک گونه مؤثر است (10).

یکی از علل مقاومت به اشعه و شرایط اکسیداتیو ایجادشده در باکتری‌های مقاوم به اشعه فرابنفش، وجود رنگدانه در این گونه‌های باکتریایی است (5). به‌همین‌منظور جداسازی این منابع طبیعی تولیدکننده رنگدانه‌هایی با قدرت آنتی‌اکسیدانی زیاد و شناسایی ساختمان آن‌ها برای استفاده در صنایع مختلف، مهم است و فرصت‌های مناسبی برای استفاده بشر از باکتری‌های مقاوم به اشعه را در زمینه‌های دارویی، درمانی، غذایی و بیوتکنولوژی فراهم می‌کند (8). در مطالعه حاضر، یک سویه جدید مقاوم به اشعه فرابنفش دارای رنگدانه، از خاک نفتی منطقه امیدیه در استان خوزستان جداسازی شد. مطالعات ژن 16S rRNA نشان داد این سویه جداسازی‌شده متعلق به گونه دیتزیا ماریس است. همچنین این پژوهش اولین گزارش از داشتن مقاومت به اشعه فرابنفش در این گونه است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

در انجام این پژوهش از سویه استاندارد باکتریایی داینوکوکوس رادیودورانس (ATCC:13939) R1 به‌عنوان یک سویه تأییدشده از نظر داشتن مقاومت زیاد به اشعه یونیزه‌کننده و غیرِیونیزه‌کننده و به‌عنوان شاهد برای تأیید آزمایش‌های انجام‌شده، استفاده شد.

جداسازی باکتری‏های مقاوم به اشعه فرابنفش: نمونه‌های خاک (سطح خاک به ارتفاع 1-5 سانتی‌متر) از مناطق مختلف استان خوزستان که در معرض تابش مستقیم نور خورشید قرار داشتند، در بهار 1393 جمع‌آوری شد. از نمونه‌های خاک جمع‌آوری‌شده به‌میزان 1 گرم به 50 میلی‌لیتر محیطTryptone glucose yeast extract (TGY) براث تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 3 روز در انکوباتور با دور rpm 160 گرماگذاری شد. پس از غنی‌سازی اولیه، 100 میکرولیتر از نمونه به پلیت‌های TGY آگار منتقل و با میله شیشه‌ای سرکج، در محیط به‌طور کامل پخش شد و به‌مدت 2 تا 4 ساعت در 30 درجه سانتی‌گراد به‌منظور جوانه‌زنی اسپورها گرماگذاری شد. سپس پلیت‌ها در فاصله 14سانتی‌متری از لامپ (CROSSLINKER CL-E508.G) با تابش اشعه UVC با طول موج  nm254 قرار داده شدند و در معرض 10 ژول اشعه فرابنفش (زمان تابش 30 دقیقه) قرار گرفتند. بعد از اشعه پلیت‌ها، به‌منظور اجتناب از ترمیم وابسته به نور، در داخل فویل آلومینیومی پیچیده شدند و به‌مدت 3 تا 10 روز در 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. پس از غربال‌گری اولیه، به‌منظور غربال‌گری سویه‌های مقاوم به اشعه فرابنفش کشت شبانه‌ای از سویه‌ها تهیه شد. از باکتری‌های میانه فاز لگاریتمی با کدورت ۵/۰ مک‌فارلند به‌میزان 100 میکرولیتر به پلیت TGY آگار انتقال داده شد و در معرض دوز نهایی 15 ژول اشعه فرابنفش (زمان تابش 45 دقیقه) قرار داده شد. شمارش تعداد کلنی سویه‌ها بر روی محیط TGY آگار انجام شد. سویه‌های با بیشترین میزان شمارش کلنی در مقایسه با شاهد بدون تابش اشعه، به‌عنوان سویه‌های مقاوم به اشعه در نظر گرفته شدند. برای شناسایی سویه جداسازی‌شده از خصوصیات ماکروسکوپی، میکروسکوپی، آزمون‌های بیوشیمیایی و روش مولکولی استفاده شد (11 و 12).

منحنی رشد باکتری: به‌منظور رسم منحنی رشد، سویه جداسازی‌شده در محیط TGYبراث کشت شبانه‌ای تهیه شد و به‌میزان 1 میلی‌لیتر از آن با کدورت 5/0 مک‌فارلند در 100 میلی‌لیتر محیط TGY براث تلقیح شد. پس از آن به‌مدت 96 ساعت در 160 دور در دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد، سپس جذب نوری در ابتدا هر 2 ساعت و بعد از ساعت دوازدهم هر 4 ساعت در طول موج 600 نانومتر خوانده شد.

.شناسایی مولکولی سویه جداسازیشده با تعیین توالی ژن 16S rRNA: استخراج DNA به‌روش جوشاندن انجام گرفت. به‌منظور تکثیر ژن 16S rRNA نیز از دو آغازگر عمومی:

 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') و

 1492R (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')

 

استفاده شد (13). برای آماده‌سازی محصول PCR از master mix 2X آماده شرکت سینا ژن در حجم 25میکرولیتری استفاده شد. سپس جهت انجام واکنش PCR در طی 30 چرخه واکنش، دماهای 30 ثانیه در دمای C94 برای مرحله دناتوراسیون، 45 ثانیه در دمای C54 برای مرحله اتصال و 90 ثانیه در دمای C72 برای مرحله تکثیر انجام شد. پس از انجام واکنش PCR به‌منظور اطمینان از تکثیر قطعه 1500 جفت بازی، 4 میکرولیتر از محصول PCR به‌همراه اندازه نمای DNA 1kb بر روی ژل آگاروز 5/1درصد الکتروفورز شد. درنهایت محصول PCR برای تعیین توالی به شرکت Macrogen کره ارسال شد. پس از توالی‌یابی قطعه DNA مدِنظر، به‌وسیله پایگاه داده اطلاعات ژنومی NCBI تشابه جنس و گونه سویه جداسازی‌شده بررسی شد. به‌منظور تأیید نتایج به‌دست‌آمده از بلاست ژنی برای سویه جداسازی‌شده، درخت فیلوژنی با استفاده از نرم‌افزارCLC Sequence Viewer (6.1) برپایه روش Neighbor- Joining و با بوت‌استریپ 100تکرار رسم شد.

استخراج رنگدانه: برای استخراج رنگدانه تولیدی توسط سویه جداسازی‌شده، ابتدا سویه جداسازی‌شده بر روی محیط Tryptic soy agar (TSA) کشت داده شد؛ پس از رشد مناسب چندین کلنی درون آب مقطر استریل غوطه‌ور شد. پس از ورتکس نمونه محلول استون سرد 99درصد و متانول 95درصد به نسبت 3 به 7 به لوله‌ها اضافه شد و نمونه به شدت ورتکس و به‌مدت 1 ساعت در دمای آزمایشگاه با دور rpm 160 شیکرگذاری شد. سپس نمونه به‌مدت 10 دقیقه با دور rpm 4000 سانتریفیوژ شد. در 2 فاز تشکیل‌شده، فاز زیری حاوی جسم سلولی و فاز رویی حاوی رنگدانه باکتری است. فاز رویی جداسازی و جذب در محدوده 300 تا 600 نانومتر با طیف سنج نور مرئی- فرابنفش (Biowave II V1.2) بررسی شد. پس از آن فاز رویی نمونه در پتری‌دیش استریل تخلیه و در خشک‌کن 40 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد تا محلول استون و متانول آن تبخیر شود. درنهایت نمونه‌ها از ته پتری‌دیش تراشیده و در یخچال برای آنالیز نگهداری شدند (14 و 15).

.میزان به‌دام‌اندازی رادیکال آزاد[10]DPPH توسط رنگدانه: توانایی ترکیب با هیدروژن یا الکترون‌دهندگی رنگدانه‌های آزمایش‌شده به‌وسیله توانایی بی‌رنگ‌کردن محلول متانولی DPPH که به‌رنگ بنفش بود، انجام شد. در این اندازه‌گیری که براساس اسپکتروفتومتری انجام شده است، جهت بررسی خاصیت آنتی‌اکسیدانی، از رادیکال 2، 2 ـ دی فنیل 1 ـ پیکریل هیدرازیل (DPPH) به‌عنوان معرف استفاده شد. رنگدانه استخراج‌شده به‌میزان 05/0 تا 10 میلی‌گرم در 1 میلی‌لیتر آب دوبارتقطیر استریل اضافه شد، سپس با 1 میلی‌لیتر محلول متانولی DPPH ترکیب شد، به‌طوری‌که غلظت نهایی DPPH در محلول 2میلی‌لیتری برابر 1/0 میلی‌مولار به دست آمد. محلول حاصل وورتکس و به‌مدت 30 دقیقه در تاریکی قرار داده شد. پس از این مدت جذب اختصاصی در 517 نانومتر خوانده شد و درصد مهار رادیکال‌های آزاد در نمونه‌های استخراج‌شده بررسی شد. قدرت خنثی‌سازی رادیکال آزاد DPPH طبق رابطه 1 محاسبه شد. گفتنی است در نمونه بلانک، رنگدانه با 1 میلی‌لیتر آب دوبارتقطیر جایگزین شد (15).

رابطه 1

×100 = [(A0-A1)/A0] درصد به‌دام‌اندازی رادیکال

 

در فرمول ذکرشده، A0 جذب نوری در طول موج 517 مربوط به نمونه بلانک و A1 جذب نوری مربوط به غلظت ترکیب آنتی‌‌اکسیدان است. پس از آن غلظتی از نمونه رنگدانه که دارای درصد مهار رادیکالی 50درصد بود با نمودار محاسبه شد و به‌عنوان[11]EC50 گزارش شد. همچنین ترکیب سنتزی آسکوربیک اسید به‌عنوان نمونه کنترل، استفاده شد.

بررسی قدرت احیاکنندگی: بررسی قدرت احیاکنندگی رنگدانه استخراج‌شده با استفاده از کلرید فریک (FeCl3) یا متد اویاایزو[12] (1986) مشخص شد. رنگدانه به‌میزان 5/0 تا 10 میکروگرم در 1 میلی‌لیتر آب دوبارتقطیر استریل به‌همراه 5/2 میلی‌لیتر بافر سدیم فسفات 200 میلی‌مولار (pH=6.6) و 5/2 میلی‌لیتر پتاسیم فری سیانید 1درصد ترکیب و به‌مدت 20 دقیقه در 50 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. بعد از گذشت زمان گرمخانه‌گذاری 5/2 میلی‌لیتر تری‌کلرو استیک اسید 10درصد به محلول اضافه شد و محلول حاصل به‌مدت 10 دقیقه در 2000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس به 5 میلی‌لیتر از محلول رویی 5 میلی‌لیتر آب دوبارتقطیر استریل و 1 میلی‌لیتر کلرید فریک 1/0درصد اضافه شد و بلافاصله جذب آن در 700 نانومتر قرائت شد. افزایش جذب نسبت به محلول بلانک نشان‌دهنده قدرت احیاکنندگی است. هرچه میزان جذب خوانده‌شده بیشتر باشد قدرت احیاکنندگی نیز بیشتر خواهد بود. آسکوربیک اسید به‌عنوان نمونه کنترل استفاده شد (16).

مطالعات آماری: ترسیم نمودارها از داده‌های آزمایش‌های فوق با استفاده از نرم‌افزار EXCEL 2010 و تجزیه و تحلیل آماری‌ها درصورت لزوم، با استفاده از نرم‌افزار SPSS 20 انجام گرفت. مقایسه میانگین نمونه‌های مختلف با استفاده از آزمون دانکن در سطح معنی‌داری 05/0 و اختلافات میان تکرارها در یک نمونه با رسم Error bars براساس Standard Deviation ± 1 مشخص شد.

 

نتایج.

از میان 10 سویه جداسازی‌شده در مرحله غربال‌گری اولیه، یک سویه برتر از نظر دارابودن مقاومت به اشعه فرابنفش و بالاتربودن شمارش کلنی (CFU/ml103× 223/1) پس از تیمار با 15 ژول اشعه فرابنفش از خاک منطقه امیدیه جداسازی، انتخاب و با نام سویه NM2 نامگذاری شد. سویه جداسازی‌شده یک باکتری گرم مثبت، کوکسی، هوازی، بدون اسپور کاتالاز مثبت، اکسیداز منفی و دارای کلنی‌های نارنجی بود. منحنی رشد سویه جداسازی‌شده NM2 در محیط براث رسم شد. سویه  بعد از حدود 84 ساعت و رسیدن به  به انتهای فاز لگاریتمی خود رسیدند (شکل 1).

 

 

به‌منظور شناسایی مولکولی سویه جداسازی‌شده قطعه 1500 جفت بازی ژن 16S rRNA تکثیر و تعیین توالی شد. نتایج بلاست ژنی نشان‌دهنده شباهت مولکولی 99درصدی و تعلق این سویه جداسازی‌شده به گونه دیتزیا ماریس بود. ترسیم درخت فیلوژنی برای این سویه نتایج به‌دست‌آمده از بلاست را تأیید کرد (شکل 2). درنهایت، این سویه با شماره دسترسی KP222293 در بانک ژنی NCBI تحت عنوان D.maris NM2ثبت شد.

بررسی رنگدانه باکتری با استفاده از طیفسنج نور مرئی- فرابنفش: استخراج رنگدانه دو سویه مقاوم به اشعه فرابنفش NM2 و داینوکوکوس رادیودورانس R1 با استفاده از دو حلال متانول و استون انجام شد. استفاده هم‌زمان متانول و استون سبب استخراج طیف گسترده‌تری از رنگدانه‌ها می‌شود. جذب نوری در محدوده 300 تا 600 نانومتر رنگدانه دو سویه NM2 و داینوکوکوس رادیودورانس R1 با استفاده از طیف‌سنج نور مرئی-فرابنفش بررسی شد. رنگدانه سویه NM2 بیشترین میزان جذب نوری را در ناحیه 473 نانومتر و رنگدانه سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 بیشترین میزان جذب نوری را در ناحیه 479 نانومتر از خود نشان دادند.

 

 

 

شکل ۱- منحنی رشد سویه NM2 در محیط TGY‌براث در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و 160 دور در دقیقه در مدت‌زمان 96 ساعت

 

 

شکل 2- درخت فیلوژنی سویه جداسازی‌شده NM2 ترسیم‌شده با نرم‌افزار CLC 6.1 برپایه روش Neighbor-joining با بوت‌استریپ 100 تکرار


میزان به دام‏اندازی رادیکال آزاد DPPH: اثر آنتی‌اکسیدانی رنگدانه سویه جداسازی‌شده با استفاده از کاهش ظرفیت رادیکالی به کمک رادیکال دی‌فنیل پیکریل هیدرازیل (ترکیب ارغوانی) و تبدیل آن به ترکیب دی‌فنیل پیکریل هیدرازین (ترکیب زرد) ارزیابی شد. نتایج به‌دست‌آمده در این بخش نشان داد که رنگدانه سویه NM2 دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالایی است و با افزایش غلظت رنگدانه، مهار رادیکال آزاد DPPH با قدرت بیشتری صورت می‌گیرد (شکل 3-الف). توانایی مهار 50درصد رادیکال آزاد (EC50) توسط رنگدانه سویه NM2 در غلظت 30/3 میلی‌گرم در میلی‌لیتر و برای رنگدانه سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 در غلظت 28/3 میلی‌گرم در میلی‌لیتر، به‌ترتیب برای سویه NM2 و داینوکوکوس رادیودورانس R1 برحسب معادله‌های خط y = 7.1633x + 26.29 و y = 7.2657x + 26.149 به‌دست‌آمده حاصل شد. توانایی مهار رادیکال آزاد توسط رنگدانه استخراج‌شده در غلظت‌های بررسی‌شده نسبت به ترکیب سنتزی آسکوربیک اسید ضعیف‌تر بود؛ اما در غلظت 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه برابر قدرت آنتی‌اکسیدانی ترکیب آسکوربیک اسید بود. مطالعات آماری نشان داد افزایش غلظت رنگدانه سویه‌های باکتریایی تأثیر معناداری بر مهار رادیکال آزاد دارد (P value < 0.05).

بررسی قدرت احیاکنندگی: احیای آهن سه‌ظرفیتی می‌تواند شاخصی از قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه استخراج‌شده باشد. آنتی‌اکسیدان‌ها (عوامل احیاکننده) منجر به احیاء کمپلکسی فری‌سیانید می‌شوند. نتایج به‌دست‌آمده در این بخش نشان داد با افزایش غلظت رنگدانه، قدرت احیاکنندگی نیز افزایش می‌یابد (شکل 4). همچنین نتایج حاصل از آنالیز واریانس نشان داد که افزایش غلظت، تأثیر معناداری بر قدرت احیاکنندگی دارد (P value < 0.05). معادلات خط برای محاسبه میزان EC50 حاصل شد و میزان EC50 برای رنگدانه سویه NM2 و داینوکوکوس رادیودورانس R1 به‌ترتیب در غلظت‌های 46/28 و 19/20 میکروگرم در میلی‌لیتر براساس معادله‌های خط y = 0.0162x + 0.0388 و y = 0.0204x + 0.088 به دست آمد. این نتایج نشان می‌دهد که با توجه به کمتربودن غلظت EC50در سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1، قدرت احیاکنندگی این رنگدانه بیشتر از رنگدانه سویه NM2 است.

 

 

 

شکل 3- بررسی درصد فعالیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه سویه NM2 (الف) و رنگدانه سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 (ب) در غلظت‌های 05/0 تا 10 میلی‌گرم در میلی‌لیتر. مقایسه میانگین داده‌ها تحت ANOVA و با آزمون دانکن در سطح 5درصد؛ حروف غیرمشابه در یک سویه نشان‌دهنده وجود اختلاف معنی‌دار در یک متغیر.

 

شکل 4- بررسی قدرت احیای رنگدانه سویه NM2 (الف) و رنگدانه سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 (ب) در غلظت‌های 5/0 تا 10 میکروگرم در میلی‌لیتر، مقایسه میانگین داده‌ها تحت ANOVA و با آزمون دانکن در سطح 5درصد؛ حروف غیرمشابه در یک سویه نشان‌دهنده وجود اختلاف معنی‌دار در یک متغیر

 


بحث و نتیجه ‏‏گیری.

در طبیعت آنتی‌اکسیدان‌ها و مواد غذایی غنی از آنتی‌اکسیدان‌ها، از سلول‌ها و بدن انسان در برابر تنش‌های اکسیداتیو و گونه‌های فعال اکسیژن محافظت می‌کنند. غذاهای غنی از کارتنوئید از بسیاری از بیماری‌ها مانند بیماری‌های چشمی و انواع سرطان‌ها جلوگیری می‌کنند. گونه‌های باکتریایی توانایی تولید طیف گسترده‌ای از کارتنوئیدها را دارند. اکسیداسیون لیپیدها مقدار زیادی از ترکیباتی مانند مالون‌دی‌آلدهید[xiii] را تولید می‌کند که سبب تخریب غشای سلول و آسیب به DNA می‌شود. آنتی‌اکسیدان‌ها با جلوگیری از واکنش‌های زنجیره‌ای اکسیداسیون لیپیدها از ایجاد این آسیب‌ها در سلول‌ها جلوگیری می‌کنند. همچنین گزارشاتی از ترکیبات بتا-کاروتن[xiv]، آستاگزانتین[xv]، کپزانتین[xvi] و بیکسین[xvii] مبنی بر جلوگیری از تکثیر سلول‌های لوکمی K562 با القای آپپتوز وجود دارد. استفاده از میکروب‌های غنی از کارتنوئید، مزایای بالاتری در استخراج، کاهش هزینه‌های تولید و نداشتن نگرانی برای تغییرات فاکتورهایی مانند آب‌وهوا و یا منشأ تأمین منابع را فراهم می‌کند. داینوکوکوس رادیودورانس R1 یک کارتنوئید مشخص با نام داینوگزانتین تولید می‌کند. این کارتنوئید نسبت به لیکوپن و بتا-کاروتن فعالیت آنتی‌اکسیدانی قوی‌تری دارد. چنگ[xviii] و همکاران در سال 2014 تأثیر داینوگزانتین استخراج‌شده از سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 را بر آسیب‌هایی که ترکیب تتراکلریدکربن به سلول‌های کبدی موش می‌رساند، بررسی کردند. نتایجِ آن نشان داد داینوگزانتین یک اثر محافظتی بر سلول‌های کبدی موش دارد؛ این عملکرد حفاظتی به‌علت خاصیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه فوق است (17).

یکی از معیارها در مشخص‌کردن ویژگی‌های کارتنوئیدها طیف‌سنجی نور مرئی-فرابنفش است. این طیف‌سنجی اطلاعاتی در زمینه گروه‌های عاملی رنگی فراهم می‌کند (18). لمه[xix] و همکاران در سال 1997 نشان دادند بیشترین طول موج‌های به‌دست‌آمده از رنگدانه داینوگزانتین استخراج‌شده از سویه داینوکوکوس رادیودورانس R1 با استفاده از حلال متانول در نواحی 479، 506 و 451 نانومتر بود (19). نتایج به‌دست‌آمده در این پژوهش نشان می‌دهد که تنها یک ناحیه با بیشترین میزان جذب نوری برای رنگدانه داینوگزانتین در ناحیه 479 نانومتر به دست آمد. ونوگوپالان[xx] و همکاران در سال 2013 با مطالعه بر کروماتوگرام‌های HPLC رنگدانه کانتاگزانتین استخراج‌شده از سویه دیتزیا K44 مشاهده کردند این رنگدانه دو پیک در ناحیه 3/465 و 475 نانومتر دارد که ایزومرهای ترانس آن پیکی در ناحیه 475 نانومتر و ایزومرهای سیس پیکی در ناحیه 3/465 نانومتر دارند (14). بیشترین جذب نوری به‌دست‌آمده از رنگدانه سویه دیتزیا ماریس NM2در ناحیه 473 نانومتر قرار دارد. کارتنوئید آلفا کاروتن نیز در نواحی 444 و 473 نانومتر بیشترین جذب نوری را دارد (20). با توجه به این نتایج نمی‌توان نظر قطعی مبنی بر تولید رنگدانه کانتاگزانتین در سویه NM2 ارائه کرد و برای تعیین دقیق ساختار آن احتیاج به آنالیزهای بیشتر بر این رنگدانه و مطابقت آن با رنگدانه کانتاگزانتین استاندارد است.

رادیکال DPPH یک رادیکال آزاد پایدار با اتم مرکزی نیتروژن است. ترکیباتی که با دادن هیدروژن یا الکترون به DPPH باعث احیای این ترکیب ارغوانی‌رنگ به ترکیب زردرنگ می‌شوند، به‌عنوان ترکیبات آنتی‌اکسیدان مطرح می‌شوند. میزان کاهش رنگ با قدرت آنتی‌اکسیدانی ترکیب بررسی‌شده رابطه مستقیم دارد (21). اندازه‌گیری میزان مهار رادیکال‌های آزاد با DPPH یک روش معتبر و مقرون‌به‌صرفه با قابلیت تکرارپذیری بالا است که در بررسی فعالیت آنتی‌اکسیدانی در این پژوهش استفاده شد. رنگدانه استخراج‌شده از سویه دیتزیا ماریس NM2 دارای قدرت آنتی‌اکسیدانی زیادی است. هرچه غلظت EC50 کمتر باشد نشان‌دهنده قدرت آنتی‌اکسیدانی بیشتر در رنگدانه استخراج‌شده است. قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه سویه دیتزیا ماریس NM2 با قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه داینوگزانتین با توجه به غلظت EC50 برابری می‌کند. در پژوهشی در سال 2013 که ساسیدهاران[xxi] و همکاران بر فعالیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه آستاگزانتین در غلظت‌های 25 تا 500 میلی‌گرم در میلی‌لیتر استخراج‌شده از برخی سویه‌های جنس اگزیگوباکتریوم انجام دادند، میانگین درصد رادیکال آزاد DPPH که این رنگدانه‌ها مهار کردند، 72درصد سنجیده شد (15). با توجه به بیشتربودن فعالیت آنتی‌اکسیدانی دو رنگدانه داینوگزانتین و رنگدانه سویه دیتزیا ماریس NM2 نسبت به رنگدانه آستاگزانتین، نتایج نشان می‌دهد که رنگدانه‌های باکتری‌های مقاوم به اشعه فرابنفش نسبت به رنگدانه سایر باکتری‌ها قدرت بیشتری دارند. تیان[xxii] و همکاران نیز در سال 2009 قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه داینوگزانتین را به‌وسیله احیای رادیکال DPPH سنجیدند و نشان دادند داینوگزانتین یک محافظت‌کننده قوی در برابر اکسیداسیون پروتئین‌ها است. در مطالعه حاضر میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه داینوگزانتین در غلظت‌های 1/0 و 5/0 میلی‌گرم در میلی‌لیتر به‌ترتیب برابر با 20درصد و 39درصد بود که میزان فعالیت آنتی‌اکسیدانی این رنگدانه با نتایجی که تیان و همکاران به دست آوردند هم‌خوانی داشت (22). ونگوپالان و همکاران نیز در سال 2013 با مطالعه قدرت آنتی‌اکسیدانی بر ایزومرهای سیس و ترانس، رنگدانه کانتاگزانتین مشتق‌‌شده از سویه K44 در جنس دیتزیا مشاهده کردند ایزومرهای سیس فعالیت مهارکنندگی بسیار بالاتری نسبت به ایزومرهای ترانس در مهار رادیکال‌های آزاد، رادیکال‌های سوپراکسید و گونه‌های فعال اکسیژن دارند (14).

احیای آهن فریک به‌عنوان یک ایندکس برای پتانسیل الکترون‌دهی به کار می‌رود. این روش براساس مکانیسم افزایش در جذب‌نوری مخلوط واکنش است. در این روش آنتی‌اکسیدان‌ها با پتاسیم‌فری‌سیانید، تری‌کلرواستیک اسید و کلریدفریک ترکیب می‌شوند و کمپلکس آبی‌رنگی ایجاد می‌کنند که در طول موج 700 نانومتر اندازه‌گیری می‌شود. افزایش در جذب نوری نمونه‌ها نشان‌دهنده قدرت احیاکنندگی نمونه است (17). رنگدانه با اهدای تعداد بیشتری الکترون یا اتم هیدروژن واکنش‌های زنجیره‌ای تشکیل رادیکال آزاد را می‌شکند و اکسیداسیون را به تأخیر می‌اندازد (23). با توجه به نتایج به‌دست‌آمده در ارتباط با میزان قدرت احیاکنندگی، هر دو رنگدانه باکتری‌های مقاوم به اشعه فرابنفش داینوکوکوس رادیودورانس R1 و رنگدانه سویه دیتزیا ماریس NM2، قدرت آنتی‌اکسیدانی بالایی را از خود نشان دادند؛ اما رنگدانه داینوگزانتین در مقایسه با رنگدانه استخراج‌شده از سویه دیتزیا ماریس NM2 قدرت آنتی‌اکسیدانی بالاتری داشت و غلظت EC50 به‌دست‌آمده برای آن پایین و برابر 19/20 میکروگرم در میلی‌لیتر بود. چنگ و همکاران در سال 2014 قدرت احیاکنندگی رنگدانه داینوگزانتین را بررسی کردند و توانایی بالای رنگدانه در احیای یون فریک را نشان دادند (17). میزان قدرت احیاکنندگی رنگدانه داینوگزانتین به‌دست‌آمده در این پژوهش در غلظت‌های بررسی‌شده با میزان قدرت احیاکنندگی که چنگ و همکاران در همین غلظت‌ها به دست آوردند، هم‌خوانی داشت.

جداسازی منابع طبیعی تولیدکننده رنگدانه‌هایی با قدرت آنتی‌اکسیدانی بالا و سپس شناسایی ساختمان آن‌ها و تعیین قدرت آنتی‌اکسیدانی به‌منظور استفاده از آن‌ها در صنایع مختلف دارویی، درمانی و غذایی مهم است. رنگدانه باکتری‌های مقاوم به اشعه یکی از علل اصلی مقاومت آن‌ها به اشعه و تنش‌های اکسیداتیو است. رنگدانه سویه جداسازی‌شده دیتزیا ماریس با دارابودن مقاومت به اشعه فرابنفش، فعالیت آنتی‌اکسیدانی زیادی از خود نشان دادند. جنس دیتزیا و متابولیت‌های آن‌ها می‌تواند اهمیت اقتصادی برای اهداف صنعتی در زمینه کاربردهایی در صنایع دارویی و غذایی داشته باشد. انتظار می‌رود در سال‌های آینده، محصولات زیستی و رنگدانه به‌دست‌آمده از این ارگانسیم‌ها جایگزین مواد و ترکیبات شیمیایی سنتزی استفاده‌شده در صنعت شود. با وجود توانایی بالای باکتری‌های مقاوم به اشعه فرابنفش در زمینه تجزیه و تغییر شکل ترکیبات آلی و بالابودن قدرت آنتی‌اکسیدانی رنگدانه این گونه‌ها، مطالعات درباره این ارگانیسم‌ها بسیار کم است. نتایج این پژوهش، اطلاعاتی اولیه برای پژوهش‌های بعدی در زمینه فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی متابولیت‌های باکتری‌های مقاوم به اشعه فرابنفش فراهم می‌کند.



[1]- Dietzia genus

[2]- Rhodococcus maris

[3]- Rainey

[4]- Dietzia maris

[5]- Harrison

[6]- Flavobacterium maris

[7]- Pyrodinium bahamense

[8]- Bemer-Melchior

[9]- Cantaxanthin

[10]- 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicals (DPPH)

[11]- Effective Concentration

[12]- Oyaizu (1986)

[xiii]- Malondialdehyde

[xiv]- ß- carotene

[xv]- Astaxanthin

[xvi]- capsanthin

[xvii]- bixin

[xviii]- Cheng

[xix]- Lemee

[xx]- Venugopalan

[xxi]- Sasidharan

[xxii]- Tian

(1)               Singh OV., Gabani P. Extremophiles: Radiation resistance microbial reserves and therapeutic implications. Journal of Applied Microbiology 2011; 110: 851- 61.

(2)               Liochev SI. Reactive oxygen species and the free radical theory of aging. Free Radical Biology and Medicine 2013; 60: 1- 4.

(3)               Huang D., Ou B., Prior RL. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry 2005; 53 (6): 1841- 56.

(4)               Sarma AD., Mallick AR., Ghosh AK. Free radicals and their role in different clinical conditions: an overview. International Journal of Pharma Sciences and Research 2010; 1 (3): 185- 92.

(5)               Gabani P., Singh OV. Radiation-resistant extremophiles and their potential in biotechnology and therapeutics. Applied Microbiology and Biotechnology 2011; 97: 993- 1004.

(6)               Yassin AF., Hupfer H., Schaal KP. Dietzia cinnamea sp. nov., a novel species isolated from a perianal swab of a patient with a bone marrow transplant. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2006; 56: 641- 45.

(7)               Nasri Nasrabadi MR., Razavi SH. Enhancement of canthaxanthin production from Dietzia natronolimnaea HS-1 in a fed-batch process using trace elements and statistical methods. Brazilian Journal of Chemical Engineering 2010; 27: 517- 29.

(8)               Gharibzahedi SMT., Razavi SH., Mousavi M. Potential applications and emerging trends of species of the genus Dietzia: a review. Annals of Microbiology 2014; 64: 421- 9.

(9)               Mohee R., Mudhoo A. Bioremediation and Sustainability: Research and Applications. Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons; 2012.

(10)           Procopio L., Alvarez VM., Jurelevicius DA., Hansen L., Srensen SrJ., Cardoso JS., et al. Insight from the draft genome of Dietzia cinnamea P4 reveals mechanisms of survival in complex tropical soil habitats and biotechnology potential. Antonie van Leeuwenhoek 2012; 101: 289- 302.

(11)           Gholami M., Etemadifar Z., Bouzari M. Isolation a new strain of Kocuria rosea capable of tolerating extreme conditions. Journal of Environmental Radioactivity 2015; 144: 113- 19.

(12)           Gholami M., Etemadifar Z. Isolation and molecular identification of a new strain of Microbacterium resistens, capable of tolerating the extreme condition. Biological Journal of Microorganisms 2013; 2 (5): 27- 42.

(13)           Frank JA, Reich CI, Sharma S, Weisbaum JS, Wilson BA., Olsen GJ. Critical evaluation of two primers commonly used for amplification of bacterial 16S rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology 2008; 74: 2461- 70.

(14)           Venugopalan V., Tripathi SK., Nahar P., Saradhi PP., Das RH., Gautam HK. Characterization of Canthaxanthin Isomers Isolated from a New Soil Dietzia sp. and Their Antioxidant Activities. Journal of Microbiology and Biotechnology 2013; 23: 237- 45.

(15)           Sasidharan P., Raja R., Karthik C., Ranand kumar Sharma IAP. Isolation and characterization of yellow pigment producing Exiguobacterium sps. Journal of Biochemical Technology 2008; 4 (4): 632- 5.

(16)           Tsai S-Y., Huang S-J., Mau J-L. Antioxidant properties of hot water extracts from Agrocybe cylindracea. Food Chemistry 2006; 98: 670- 7.

(17)           Cheng J., Zhang Z., Zheng Z., Wang L., Tian B., Hua Y. Antioxidative and hepatoprotective activities of deinoxanthin-rich extract from Deinococcus radiodurans R1 against carbon tetrachloride-induced liver injury in Mice. Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2014; 13: 581- 6.

(18)           Britton G, Liaaen-Jensen S and Pfander H. Carotenoids: handbook. Basel AG, Boston: Springer 2004.

(19)           Lemee L., Peuchant E., Clerc M., Brunner M., Pfander H. Deinoxanthin: A new carotenoid isolated from Deinococcus radiodurans Tetrahedron 1997; 53: 919- 26.

(20)           Britton G. Structure and properties of carotenoids in relation to function. The FASEB Journal 1995; 9: 1551- 8.

(21)           Brand-Williams W., Cuvelier., Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity. LWT-Food Science and Technology 1995; 28: 25- 30.

(22)           Tian B., Sun Z., Shen S., Wang H., Jiao J., Wang L., et al. Effects of carotenoids from Deinococcus radiodurans on protein oxidation. Letters in Applied Microbiology 2009; 49: 689- 94.

(23)           Kumaran A., Joel Karunakaran R. In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India. LWT-Food Science and Technology 2007; 40: 344- 52.