بررسی اثر منابع کربن و نیتروژن بر تولید کاروتنوئیدها در سویه بومی آئورانتیوکیتریوم Ch25

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: میکروارگانیسم‌ها، کاروتنوئیدها را در پاسخ به استرس‌های محیطی تولید می‌کنند. کاروتنوئیدها کاربردهای زیادی در سلامتی انسان دارند که از جمله آن‌ها می‌توان به فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی، ضدسرطانی، محافظت نوری و به‌عنوان پیش‌ساز هورمون‌ها اشاره کرد‏. ‏‏

مواد و روش‏‏ ها: در این پژوهش اثر منابع مختلف کربن و نیتروژن بر تولید کاروتنوئیدها در سویه بومی آئورانتیوکیتریوم Ch25 بررسی شد. اثر منابع کربن و نیتروژن مختلف بر میزان رشد و تولید کاروتنوئیدها بررسی شد. سپس کاروتنوئیدها استخراج شدند و با روش TLC، اسپکتروفتومتری و HPLC آنالیز شدند. ‏‏

نتایج: نتایج نشان دادند که گلیسرول بهترین منبع کربن برای تولید محتوی زیاد کاروتنوئید است. محیط انتخاب‌شده شامل v/v %5/1گلیسرول، g/l 1 پپتون، g/l 1 عصاره مخمر و 50درصد آب دریا است. مقدار کل کاروتنوئید تولیدشده در این محیط برابر با (µg/g CDW) 8/134 محاسبه شد. آنالیز TLC نشان داد که عصاره کاروتنوئیدی حاوی بتاکاروتن، آستاگزانتین مونواستر، آستاگزانتین دی‌استر و آستاگزانیتن آزاد است. نتایج حاصل از HPLC، حضور کاروتنوئیدهای آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن در عصاره کاروتنوئیدی را نشان داد.‏

بحث و نتیجه ‏گیری: در این پژوهش، تولید کاروتنوئیدها در سویه بومی آئورانتیوکیتریوم بررسی شد و پروفایل کاروتنوئیدهای تولیدشده شامل آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن بودند‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of carbon and nitrogen sources on carotenoids production by native strain of Aurantiochytrium Ch25

نویسندگان [English]

  • Mahdiye Esmizade 1
  • Shahryar Shakeri 2
  • Mahmood Maleki 3
1 M.Sc. of Agricultural biotechnology, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
3 Assistant Professor of Agricultural biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: Microorganisms produce carotenoids as a part of their response to environmental stresses. Carotenoids have many applications in human health, such as antioxidant, anti-cancer, light protection activity and as a precursor for hormones.

Materials and methods: In this study, the effect of different carbon and nitrogen sources was evaluated on carotenoids production by native Aurantiochytrium strain. The effects of different carbon and nitrogen sources were studied on biomass and carotenoid production. Then, carotenoids were extracted and analyzed by TLC, spectrophotometry and HPLC methods.

Results: Results showed that glycerol is the best carbon source for production of high carotenoids content. Selected medium contained: glycerol (1.5% v/v), peptone (1g/l), yeast extract (1g/l) and 50% of sea water. Total carotenoids content was 134.8 µg/g CDW in this medium. TLC analysis showed that the extracted carotenoid is included: beta-carotene, astaxanthin monoester, astaxanthin diester and free astaxanthin. The results of HPLC analysis showed presence of astaxanthin, canthaxanthin, echinenone and β-carotene in the carotenoid extract.

Discussion and conclusion: In this research, production of carotenoids was investigated in native strain of Aurantiochytrium and carotenoids profile was included astaxanthin, canthaxanthin, β-carotene and echinenone.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Carotenoids
  • Aurantiochytrium
  • Carbon sources
  • Nitrogen sources

مقدمه.

کاروتنوئیدها رنگدانه‌های چربی‌دوست با رنگ زرد یا قرمز هستند که به‌طور گسترده در طبیعت وجود دارند. این رنگدانه‌ها در همه موجودات زنده اعم از باکتری‌ها، مخمرها، جلبک‌ها، گیاهان و حیوانات عالی وجود دارند. این ترکیبات بیش از 700 رنگدانه طبیعی را شامل می‌شوند و مسؤول تنوع گسترده‌ای از رنگ‌ها در طبیعت هستند. در میان همه رنگ‌های طبیعی، کاروتنوئیدها گسترده‌ترین و متنوع‌ترین عوامل رنگی به‌لحاظ ساختاری هستند (1 و 2). این رنگدانه‌های طبیعی دارای فعالیت‌های آنتی‌اکسیدانی، ضدسرطانی، ضدچاقی هستند؛ اثر آنابولیکی بر اجزای استخوان و پیش‌ساز هورمون‌ها دارند و باعث افزایش فعالیت پروویتامین A و حفاظت نوری می‌شوند(1 و 2). در حال حاضر، کاروتنوئیدها به‌صورت تجاری به‌عنوان مواد افزودنی خوراکی، مکمل‌های غذای دام، رنگ‌های طبیعی غذایی ، مکمل مغذی و اخیراً برای اهداف آرایشی-بهداشتی و دارویی استفاده شده‌اند. (1 و 3). آستاگزانتین (3,3ˊ-dihidroxy-β,β-carotene-4,4ˊ-dione) یک رنگدانه کاروتنوئیدی حاوی اکسیژن است که مسئول رنگ نارنجی-قرمز در میگوها، خرچنگ‌ها، ماهی سالمون، قزل‌آلا و همچنین در پرندگانی مانند فلامینگو و بلدرچین، است(4 و 5). آستاگزانتین به‌عنوان جاذب رادیکال‌های آزاد اکسیژن که DNA را تخریب و پروتئین‌ها را اکسید می‌کنند، عمل می‌کند (4، 6 و 7). این ترکیب دارای فعالیت آنتی‌اکسیدانی بالاتری نسبت به ویتامین C و E است (6، 8 و 9). این رنگدانه در حال حاضر از طریق سنتز شیمیایی و همچنین بیولوژیکی تولید می‌شود (10). منبع تولیدکننده آن‌ها از نظر بیوتکنولوژی، ریزجلبک هماتوکوکوس است (3). این ریزجلبک اتوتروف است و برای تولید آستاگزانتین نیاز به نور و دی اکسید کربن دارد. اخیراً با توجه به مشکلات استفاده از اتوتروف‌ها در تولید آستاگزانتین، به ریزجلبک‌های هتروتروف توجه شده است؛ ترائوستوکیتریدها از آن نوع هستند. ترائوستوکیتریدها، میکروارگانیسم‌های هتروتروف دریازی هستند که در کلاس لابیرینتولا[1] و از سلسله کرومیستا[2] طبقه‌بندی شده‌اند (6 و 11). از نظر رده‌بندی با جلبک‌های هتروکنت[3] در یک راستا قرار دارند و معمولاً در محیط‌های دریایی و دهانه رودها یافت می‌شوند. در محیط زیست دریایی به‌عنوان گندزی از مواد آلی تغذیه می‌کنند. در جنگل‌های حرا، این میکروارگانیسم‌ها وابسته به برگ‌های پوسیده حرا هستند و به‌طور فعال نقش مهمی را در تجزیه مواد آلی بازی می‌کنند (11). توان جمع‌آوری و انباشتن مقدار زیادی از کاروتنوئیدها به ویژه آستاگزانتین و اکیننون، در ترائوستوکیتریدها به‌خوبی شناخته شده است و به‌عنوان افزودنی غذا در آبزی‌پروری نیز استفاده می‌شوند (4 و 6). این سویه‌ها برای اولین بار در سال 2003 به‌عنوان تولیدکننده‌های جدید کاروتنوئیدها با پتانسیل بالای تولید معرفی شدند (6). شیزوکیتریوم لیماسینوم[4] و ترائوستوکیتریوم اورئوم[5] حاوی رنگدانه‌های کاروتنوئیدی به‌ویژه آستاگزانتین هستند (4). همچنین سویه شیزوکیتریومKH105 سطوح قابل‌توجهی از بتاکاروتن و زانتوفیل‌ها شامل کانتاگزانتین و آستاگزانتین را جمع‌آوری می‌کند که این گونه خاص از ترائوستوکیتریدها به‌عنوان یک منبع امیدبخش برای زانتوفیل‌ها با کاربرد در صنایع غذایی، مطرح شده است(6). سویه شیزوکیتریومSB04 کلنی‌های به‌رنگ کرم کم‌رنگ تولید می‌کند که پس از چند روز انکوباسیون به نارنجی تبدیل می‌شود درحالی‌که سویة SB11 کلونی‌های کم‌رنگ، به‌رنگ نارنجی روشن تولید می‌کند که به‌دلیل حضور کاروتنوئیدها است. سویه شیزوکیتریوم SB04 حاوی مونواسترهای آستاگزانتین، دی‌استرهای آستاگزانتین، آستاگزانتین آزاد است درحالی‌که سویه SB11 دارای اکیننون، لوتئین، مونواسترهای آستاگزانتین و دی‌استرهای آستاگزانتین است (11). به نظر می‌رسد مسیر بیوسنتز آستاگزانتین در ترائوستوکیتریدها مشابه باکتری‌های دریایی مانند آگروباکتریوم[6] و آلکالیژنز[7] باشد (6). بیوسنتز آستاگزانتین از تبدیل پیش‌سازهای ایزوپرنوئید رایج فارنسیل پیروفسفات و ایزوپنتنیل پیروفسفات به جرانیل جرانیل پیروفسفات توسط GGPP سنتاز، شروع می‌شود. سپس دو مولکول GGPP به‌شکل فیتوئن متراکم می‌شوند که این کار با فیتوئن سنتاز کاتالیز می‌شود (12). برای تشکیل فرم لیکوپن، توسط فیتوئن دساچوراز و گاما کاروتن دساچوراز 4 پیوند دوگانه به فیتوئن عرضه می‌شود. لیکوپن به گاماکاروتن تبدیل می‌شود و سپس با فعالیت لیکوپن سیکلاز، بتاکاروتن از طریق تبدیل دو انتهای مارپیچی لیکوپن به حلقه‌های بتا، ساخته می‌شود (13). پس از آن، دو گروه کتو به‌صورت متوالی توسط کتولاز بتاکاروتن برای تبدیل بتاکاروتن به اکیننون و سپس کانتاگزانتین، عرضه می‌شوند که درنهایت به‌طور متوالی برای تشکیل فرم آدونیروبین و آستاگزانتین از طریق فعالیت کاروتنوئید هیدروکسیلاز، هیدروکسیله می‌شوند (6). هدف از این پژوهش، یافتن منابع کربن و نیتروژن مناسب جهت افزایش تولید کاروتنوئیدها در سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25 است. همچنین پروفایل کاروتنوئیدهای تولیدشده شامل آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن در این سویه بررسی شد.

‏‏مواد و روش‏ها.

فعال‌سازی و تلقیح سویه به محیط مایع: در این پژوهش از سویه بومی آئورانتیوکیتریوم (KP792759) استفاده شد. برای کشت مایع سویه جهت تولید کاروتنوئیدها، از سویه فعال استفاده شد. فعال‌سازی سویه آئورانتیوکیتریوم بر روی محیط GYP[8] انجام گرفت. این محیط کشت حاوی، 20 گرم بر لیتر گلوکز، 1 گرم بر لیتر پپتون، 1 گرم بر لیتر عصاره مخمر، 3/0 گرم بر لیتر پنی‌سیلین، 3/0 گرم بر لیتر استرپتومایسین، 20 گرم بر لیتر آگار و 50درصد آب دریا است. به‌دلیل اینکه سویه مدنظر دریازی است، در محیط کشت آن از آب دریا استفاده شد. سویه در این محیط تلقیح شد و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در تاریکی به‌مدت 48 ساعت انکوبه شد. سپس از این سلول‌های فعال برای تلقیح محیط کشت‌های جامد و مایع استفاده شد (14).

.بررسی رشد و تولید توده سلولی در منابع متفاوت کربن:به‌منظور بررسی اثر منابع کربن، به محیط‌های کشت آگاردار حاوی 1 گرم بر لیتر عصاره مخمر، 1 گرم بر لیتر پپتون، 20 گرم بر لیتر آگار و50درصد آب دریا، منابع مختلف کربن شامل: 10 گرم بر لیتر گلوکز، v/v %1 گلیسرول، 10 گرم بر لیتر ساکارز، 10 گرم بر لیتر اسکیم میلک (شیر چربی‌گرفته‌شده[9]) و توین 80[10] v/v %1 اضافه شد. در این مرحله 5 محیط کشت جامد و مایع با منابع متفاوت کربن ساخته شد که سویه در آن‌ها تلقیح داده شد و به‌مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در تاریکی انکوبه شد. در نهایت، نتایج رشد سویه روی محیط‌ها از نظر رشد کلنی‌ها و ازطریق اندازه‌گیری میزان رشد و تولید توده سلولی با یکدیگر مقایسه شد و بهترین منبع کربن جهت رشد سویه شناسایی شد.

بررسی رشد و تولید تودة سلولی در منابع متفاوت نیتروژن:به‌منظور بررسی اثر منابع نیتروژن، به محیط کشت حاوی گلوکز، پپتون، آگار و آب دریا با غلظت‌های مشابه محیط کشت استفاده‌شده در بالا به‌ترتیب هرکدام از منابع نیتروژن که شامل عصاره مالت، اوره، کلرید آمونیوم، سدیم‌گلوتامات و عصاره مخمر هستند، به‌میزان 1 گرم بر لیتر اضافه شد. سویه روی محیط‌های کشت جامد تلقیح‌داده‌شده و با شرایط دمای 30 درجه سانتی‌گراد و در تاریکی به‌مدت 48 ساعت انکوبه شد. رشد سویه روی محیط‌ها از نظر رشد کلنی‌ها و مقدار توده سلولی تولیدشده با هم مقایسه شد و بهترین منبع نیتروژن مشخص شد.

بررسی تأثیر کلرید آمونیوم بر رشد سویه: دو محیط کشت شامل 10 گرم بر لیتر گلوکز، 2 گرم بر لیتر کلرید آمونیوم، 1 گرم بر لیتر عصاره مخمر، 20 گرم بر لیتر آگار و 50درصد آب دریا و دیگری شامل 10 گرم بر لیتر گلوکز، 2 گرم بر لیتر کلرید آمونیوم، 20 گرم بر لیتر آگار و 50درصد آب دریا تهیه شدند. این دو محیط کشت، به‌منظور بررسی تأثیر کلرید آمونیوم در حضور و یا نبودِ عصاره مخمر بر رشد سویه تهیه شدند. بعد از تلقیح، محیط کشت‌ها به‌مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‌گراد در تاریکی انکوبه می‌شود. درنهایت، نتایج رشد سویه روی محیط‌ها با یکدیگر مقایسه شد و تأثیر کلرید آمونیوم و عصاره مخمر بر روی رشد سویه و تولید توده سلولی بررسی شد.

بررسی تأثیر منابع کربن و نیتروژن بر رشد سلولی و تولید کاروتنوئیدها:از بین منابع مختلف کربن و نیتروژن بهترین منبع انتخاب شد. برای مشخص‌شدن تأثیر این منابع بر تولید توده سلولی و کاروتنوئیدها، محیط کشت‌های مایع طراحی شدند. 6 نوع محیط کشت ساخته شد که در جدول 1 میزان و نوع ترکیبات نشان داده شده است. بعد از تلقیح سویه‌ها، ارلن‌ها در شیکر انکوباتور با دمای 30 درجه سانتی‌گراد و دور rpm 150 و تحت تاریکی قرار داده شد و پس از 24 ساعت رشد در تاریکی، نور فلورسنت با شدت 2000 لوکس اعمال شد. تابش نور فلورسنت به‌مدت 6 روز (144 ساعت) ادامه یافت تا سویه رشد کند و کاروتنوئید تولید کند. سپس توده سلولی برای بررسی وزن خشک سلولی و استخراج کاروتنوئید استفاده شد. نتایج حاصل سه تکرار از آزمایشات هستند (14).

 

 

جدول 1- محیط کشت‌های ترکیبی (برحسب g/l و v/v%)

آب دریا (SW)

پپتون

عصاره مخمر

آمونیوم کلرید

سدیم گلوتامات

گلیسرول

گلوکز

شماره محیط کشت

50%

1

1

---

---

---

15

1

50%

1

1

1

---

---

15

2

50%

1

1

---

1

---

15

3

50%

1

1

---

---

5/1%

---

4

50%

1

1

1

---

5/1%

---

5

50%

1

1

---

1

5/1%

---

6

 

 


استخراج کاروتنوئیدها: محتویات ارلن به یک فالکن 50 میلی‌لیتری منتقل و با دور rpm 4500 سانتریفیوژ می‌شود. توده سلولی در ته فالکن تجمع می‌یابد و سوپرناتانت حذف می‌شود. توده سلولی به مدت 48 ساعت در آون با دمای 60 درجه سانتی‌گراد قرار داده می‌شود تا وزن خشک سلولی به دست آید. سپس 7 میلی‌لیتر آب مقطر به آن اضافه می‌شود و به‌مدت 20 ثانیه با دور rpm 60 ورتکس می‌شود. در این مرحله فالکن به‌مدت 10 دقیقه در بن‌ماری با دمای 50 درجه سانتی‌گراد قرار داده شده و سپس برای تخریب سلولی، به‌مدت 8 دقیقه با شدت KHz 24 التراسونیک انجام گرفت. سوسپانسیون حاصل، به‌مدت 30 دقیقه با دور rpm 4500 سانتریفیوژ شد و سوپرناتانت حذف شد. حلال کلروفرم (Chl) و متانول (Me) با نسبت 3(Chl):1(Me) به حجم 2 میلی‌لیتر اضافه شد و توده سلولی توسط مگنت و دستگاه همزن با دور rpm 750 و به‌مدت 3 ساعت هم زده شد. سپس سانتریفیوژ به‌مدت 5 دقیقه و با دور rpm 4500 انجام شد. حاصل کار، تشکیل سه فاز است که شامل مایع شفاف در بالا، توده سلولی تخریب‌شده در وسط و عصاره حاوی کاروتنوئید در ته فالکن است. عصاره به فالکن دیگری منتقل شد و سپس در دمای اتاق به‌مدت 2 روز قرار داده شد تا حلال‌ها تبخیر شوند. پس از تبخیر حلال‌ها، کاروتنوئیدها ته فالکن باقی ماندند و تا زمان آنالیز در فریزر 20- درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند (15).

آنالیز کاروتنوئیدها با روش TLC: مقداری از عصاره کاروتنوئید برداشته می‌شود و روی کاغذ TLC با فاصله یک سانتی‌متر از انتهای کاغذ، لکه‌گذاری می‌شود. در یک بشر 250 میلی‌لیتری، حدود 5 میلی‌لیتر از حلال‌های هگزان (He) و استون (A) به‌ترتیب با نسبت 7(He):3(A) ریخته می‌شود و کاغذ لکه‌گذاری‌شده به‌مدت 30 دقیقه درون حلال‌ها قرار می‌گیرد. سپس کاغذ برداشته می‌شود و روی آن باندهای زرد و قرمز و نارنجی با فواصل متفاوت از محل لکه‌گذاری دیده می‌شود. با استفاده از فرمول 1 و جدول 2، مقدار Rf هریک از باندهای ظاهرشده محاسبه شد. با مقایسه Rf محاسباتی و Rf استاندارد، نوع هریک از کاروتنوئیدها تعیین شد (16).

 

(1)        

 

در فرمول بالا Zs فاصله بین باند ظاهرشده با نقطه شروع نمونه بر حسب میلی‌متر، Zf فاصله‌ای که فاز مایع از سطح حلال پیموده برحسب میلی‌متر و Z0 فاصله بین سطح حلال و نقطه شروع برحسب میلی‌متر است.

 

جدول 2- مقدار Rf استاندارد ارائه‌شده برای کاروتنوئیدها (16)

Rf Value

Carotenoids

99/0

β-Carotene

87/0

Echinenone

75/0

Astaxanthin Diesters

50/0

Astaxanthin Monoesters

40/0

Canthaxanthin

33/0

Astaxanthin Free

25/0

Lutein

 

تعیین کل کاروتنوئیدها و بررسی طیف جذبی با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر: برای بررسی طیف جذبی کاروتنوئیدها از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. در این مرحله به اندازه حجم عصاره استخراج‌شده، به کاروتنوئیدها استون اضافه می‌شود. علاوه بر بررسی طیف جذبی کاروتنوئیدهای موجود در عصاره، مقدار کل کاروتنوئیدهای تولیدی نیز با استفاده از فرمول 2 محاسبه شد.

 

(2)              

 

در فرمول بالا، A470nm مقدار جذب کاروتنوئید استخراج‌شده از نمونه در 470 نانومتر است، Vextract حجم عصاره کاروتنوئید هنگام استخراج است، DF فاکتور رقت است، 2/0 ارزش جذب 1 میکروگرم در میلی لیتر آستاگزانتین استاندارد در 470 نانومتر و Wsample وزن خشک نمونه‌ای که کاروتنوئیدها از آن استخراج شده‌اند، است (15).

.آنالیز کاروتنوئیدها با استفاده از دستگاه HPLC[11]: عصاره کاروتنوئیدی استخراج‌شده از سویة آئورانتیوکیتریوم شامل چندین کاروتنوئید مختلف است که با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC)، نوع و میزان هرکدام از کاروتنوئیدها در مقایسه با استانداردها مشخص می‌شود. جهت آماده‌سازی نمونه برای انجام HPLC، ابتدا 100 میکرولیتر از نمونه که حاوی حلال استون است، در یک میکروتیوب ریخته می‌شود و در زیر هود قرار داده می‌شود تا استون کاملاً تبخیر شود. سپس 800 میکرولیتر اتیل استات به کاروتنوئیدهای خشک‌شده اضافه می‌شود و برای حل‌کردن کاروتنوئیدها در حلال، پیپتاژ صورت می‌گیرد. نمونه‌ها از فیلتر 2/0 گذرانده شدند و سپس به دستگاه HPLC با ستون فاز معکوس 18C با اندازه 25 سانتی‌متر × 6/4 میلی‌متر ساخت شرکت Agilent، تزریق شدند. فازهای متحرک HPLC نیز شامل آب، اتیل استات و متانول است. نتایج به‌دست‌آمده از دستگاه شامل چندین پیک هستند که هرکدام در زمان مشخصی نمایان شده‌اند و بیانگر وجود کاروتنوئید خاصی هستند. تشخیص نوع کاروتنوئیدها با استفاده از استانداردها (آستاگزانتین، سیگما، A9335، بتاکاروتن، سیگما، 22040) انجام گرفت و مقدار هرکدام از آن‌ها با توجه به کل کاروتنوئیدهای تولیدشده در هر محیط کشت، تعیین شد (14).

آنالیز آماری: تمام داده‌ها حاصل سه تکرار از آزمایشات هستند. آنالیزهای آماری نتایج نیز با نرم‌افزار SPSS (version 16) انجام شد (P<0.05).

 

نتایج.

.بررسی رشد کلنی‌ها و مقدار توده سلولی تولیدشده با منابع مختلف کربن: رشد سویه آئورانتیوکیتریوم روی پلیت‌ها با منابع مختلف کربن و همچنین در محیط‌های مایع بررسی شد. ملاک مقایسه، رشد کلنی‌ها و میزان تولید توده سلولی بعد از 24 ساعت است. سویه آئورانتیوکیتریوم روی محیط کشت شامل گلوکز بهترین رشد را نشان داد. همچنین کلنی‌ها بسیار بزرگ و لعابی بودند. رنگ کلنی‌ها بر روی این محیط نارنجی پررنگ بود. همچنین مقدار توده سلولی تولیدشده 1/2 گرم در لیتر محاسبه شد. سپس توین 80 و بعد از آن گلیسرول بهترین رشد سویه را نشان دادند. سویه‌های رشدداده‌شده بر روی محیط حاوی گلیسرول نیز کلنی‌های نارنجی‌رنگ داشتند. محیط کشت‌های حاوی ساکارز و اسکیم میلک (شیر چربی‌گرفته‌شده) کمترین میزان رشد را داشتند و کلنی‌های کوچک مشاهده شدند، بااین‌حال، رشد در ساکارز کمی بیشتر از شیر بدون چربی بود. مقدار توده سلولی تولیدی در هر محیط نیز در جدول 3 نشان داده شده است.

 

جدول 3- مقایسه رشد سویه در منابع مختلف کربن

اسکیم میلک (شیر چربی‌گرفته‌شده)

توین 80

گلیسرول

ساکارز

گلوکز

منبع کربن

زمان

06/0±52/0

32/0±7/1

10/0±95/0

11/0±58/0

2/0±1/2

وزن خشک سلولی (گرم بر لیتر)

 

جدول 4- رشد سویه در منابع مختلف نیتروژن

عصاره مالت

اوره

NH4Cl

عصاره مخمر

سدیم‌گلوتامات

منبع نیتروژن

زمان

10/0±3/1

27/0±39/1

06/0±45/0

15/0±9/1

11/0±63/1

وزن خشک سلولی (گرم بر لیتر)

 


.بررسی رشد کلنی‌ها و مقدار توده سلولی تولیدشده با منابع مختلف نیتروژن: با بررسی رشد کلنی‌ها بعد از 24 ساعت، مشخص شد که سویة آئورانتیوکیتریوم در تمام محیط‌ها به‌طور یکسان رشد کرده است. رشد سویه روی محیط‌های مختلف بعد از 48 ساعت افزایش یافت. سویه مدنظر بر روی محیط حاوی سدیم گلوتامات بهترین رشد را داشت و کلنی آن به رنگ نارنجی مشاهده شد. مقدار توده سلولی تولیدشده در این محیط 63/1 گرم بر لیترگرم‌بر‌لیتر گزارش شد. پس از آن، سویه در محیط حاوی عصاره مخمر بیشترین رشد را داشت. مقدار توده سلولی تولیدی در این محیط 9/1 گرم در لیتر محاسبه شد. دو محیط اوره و عصاره مالت به‌طور یکسان باعث رشد سویه شدند (جدول 4). همچنین کمترین رشد مربوط به محیط حاوی کلرید آمونیوم به‌عنوان منبع نیتروژن بود.

.بررسی رشد و تولید کل کاروتنوئیدها در محیط‌های ترکیبی: عصاره‌های کاروتنوئیدی استخراج‌شده، با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه‌گیری و مقدار کل کاروتنوئیدها با استفاده از رابطه (1) محاسبه شد (جدول 5). شکل 2 نمونه‌ای از طیف جذبی کاروتنوئیدهای استخراج‌شده از محیط شماره 1 توسط دستگاه اسپکتروفتومتری را نشان می‌دهد که حداکثر جذب آن در طول موج بین 470 تا 480 نانومتر است. از بین 6 محیط کشت با ترکیبات نیتروژن و کربن متفاوت، محیط کشت‌های شماره 1 به‌ترتیب حاوی گلوکز، عصاره مخمر، پپتون و محیط شماره 4 حاوی گلیسرول، عصاره مخمر، پپتون، بهترین رشد سویه و تولید کاروتنوئید را داشتند. مقدار توده سلولی تولیدی در این محیط‌ها به‌ترتیب 3/2 و 71/0 گرم در لیتر محاسبه شد (جدول 5). تفاوت این دو محیط، در نوع رشد سویه و رنگ توده سلولی تولیدی در محیط کشت است. به این ترتیب که سویه در محیط کشت حاوی گلوکز به‌صورت توده‌ای رشد می‌کند، به‌راحتی ته‌نشین می‌شود و رنگ توده سلولی نارنجی و پررنگ‌تر از محیط شماره 4 است. مقدار کل کاروتنوئید تولیدشده در این دو محیط نیز به‌ترتیب برابر با 8/134 و 8/332 میکروگرم‌درگرم وزن خشک است. سویة آئورانتیوکیتریوم در محیط کشت حاوی گلیسرول، به‌صورت سوسپانس رشد می‌کند و برای جداسازی توده سلولی از محیط کشت باید حتماً سانتریفیوژ انجام گیرد. چون توده سلولی در محیط کشت پخش شده است، کم‌رنگ‌تر به نظر می‌رسد و کل محیط کشت به‌رنگ نارنجی کم‌رنگ یا قرمز کم‌رنگ دیده می‌شود (شکل 1). اندازه سلول‌ها در این محیط بین 20 تا 30 میکرومتر هستند و گرانول‌های داخل سلولی کاروتنوئیدها در سلول‌ها به‌خوبی قابل مشاهده هستند. سویه آئورانتیوکیتریوم در محیط کشت‌های شماره 3 و 6 که تنها تفاوتشان در نوع منبع کربن (گلوکز و گلیسرول) است و حاوی سدیم‌گلوتامات هستند، تقریباً یکسان رشد کرده‌اند و به یک اندازه تولید کاروتنوئید کرده‌اند. محیط‌ها تغییر رنگ بسیار کمی داشته‌اند و سویه هم به‌صورت توده‌ای و هم به‌صورت سوسپانس در هر دو محیط رشد کرده‌اند. محیط کشت شماره 2، حاوی گلوکز، کلرید آمونیوم، عصاره مخمر و پپتون، تغییر رنگ بسیار بسیار کمی داشته اما رشد سویه و تولید توده سلولی تقریباً به‌اندازه محیط‌های شماره 3 و 6 است. سویه در این محیط هم به‌صورت سوسپانس و هم به‌صورت توده‌ای رشد کرده است. کمترین مقدار کل کاروتنوئید (9/39 میکروگرم در گرم وزن خشک) در این محیط تولید شده بود. درنهایت محیط کشت شماره 5، حاوی گلیسرول، کلرید آمونیوم، عصاره مخمر و پپتون، بدون هیچ تغییر رنگی دیده می‌شود. سویه در محیط به‌صورت توده‌ای رشد کرده اما تولید توده سلولی آن از سایر محیط‌ها کمتر بوده است و به‌راحتی ته‌نشین می‌شود. محیط کشت کاملاً شفاف و توده سلولی سفیدرنگ است.

 

 

 

شکل 1- تغییر رنگ نارنجی کلنی‌های آئورانتیوکیتریوم Ch25 بر روی محیط ترکیبی شماره 4 به‌دلیل تولید کاروتنوئیدها تحت استرس نوری (A مورفولوژی سلول‌های حاوی گلبول‌های داخل سلولی کاروتنوئیدها (B

 

 

شکل 2- طیف جذبی کاروتنوئیدهای سویة آئورانتیوکیتریوم Ch25 در محیط شماره 1. این پیک و جذب در طول موج 470 تا 480 نانومتر در کاروتنوئیدهای استخراج‌شده از بقیة محیط‌ها نیز مشاهده شد.

 

در جدول 5 میزان وزن خشک سلولی و مقدار کل کاروتنوئیدهای تولیدشده در هر محیط کشت ترکیبی نشان داده شده است. بیشترین مقدار کل کاروتنوئید برابر با 8/332 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی است که مربوط به محیط شماره 4 است. سویة آئورانتیوکیتریوم در این محیط گلیسرول را به‌عنوان منبع کربن و برای منبع نیتروژن از عصاره مخمر و پپتون استفاده می‌کند. پس از محیط شماره 4، محیط‌های 6 و 1 به‌ترتیب با تولید 7/197 و 8/134 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی، دارای بیشترین مقدار کل کاروتنوئید هستند. با توجه به وزن خشک سلولی و تولید کاروتنوئید، می‌توان گفت محیط شماره 4 با کمترین وزن خشک سلولی (71/0 گرم در لیتر) دارای بیشترین مقدار تولید کاروتنوئید است. در شکل 3 مقدار وزن خشک سلولی و کل کاروتنوئیدها در محیط‌ها با یکدیگر مقایسه شده است.

 

 

جدول 5- مقدار وزن خشک سلولی و کل کاروتنوئیدهای به‌دست‌آمده از محیط‌های 1 تا 6

کل کاروتنوئیدها (µg/gCDW)

وزن خشک سلولی (g/l)

شماره محیط کشت

8/134

2/0±3/2

1

9/39

17/0±4/1

2

9/62

13/0±7/1

3

8/332

08/0±71/0

4

7/41

4/0±3/5

5

7/197

32/0±5/1

6

 

 

شکل 3- مقادیر تولیدی وزن خشک سلولی و کاروتنوئیدها در محیط‌های ترکیبی

 


 

 

 

 

 

 

آنالیز TLC: با توجه به نتایج به‌دست‌آمده و مقایسه کل کاروتنوئیدهای 6 محیط کشت، محیط کشت شماره 4 به‌عنوان بهترین فرمولاسیون محیط کشت برای رشد سلول‌ها و تولید کاروتنوئیدها شناخته شد. ازاین‌رو، برای شناسایی ترکیبات کاروتنوئیدی این محیط، آنالیز TLC انجام گرفت. با استفاده از رابطه (2) مقدار Rf هر یک از باندها محاسبه شد و برای شناسایی ترکیبات، Rf محاسباتی با Rf استاندارد مقایسه شد (جدول 6).

 

جدول 6- مقدار Rf و نوع کاروتنوئیدهای تولیدشده در محیط کشت شماره 4

Rf نمونه

Rf استاندارد

Carotenoids

شماره باند

36/0

33/0

Astaxanthin Free

1

49/0

5/0

Astaxanthin Monoesters

2

76/0

75/0

Astaxanthin Diesters

3

98/0

99/0

β-Carotene

4


.بررسی تولید آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن توسط HPLC: برای تأیید نوع ترکیبات مشخص‌شده و همچنین تعیین مقدار هریک از آن‌ها، آنالیز HPLC انجام گرفت که شکل 4 نتایج حاصل را نشان می‌دهد.

با استفاده از آنالیز HPLC چهار کاروتنوئید آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن شناسایی شدند (جدول 7). اولین پیک مشاهده‌شده مربوط به کاروتنوئید آستاگزانتین است که 77/6درصد از کل کاروتنوئیدها یعنی 68/17 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی را به خود اختصاص داده است. پیک دوم، نشان از حضور کانتاگزانتین با مقدار 48/37 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی (34/14درصد) است. مقدار کاروتنوئیدهای اکیننون و بتاکاروتن نیز در عصاره کاروتنوئیدی به‌ترتیب 88/164 و 86/18 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی است. نتایج حاصل‌شده نشان می‌دهد که کاروتنوئید اکیننون دارای بیشترین درصد در عصاره کاروتنوئیدی است و آستاگزانتین نزدیک به 7درصد از کل کاروتنوئیدها را تشکیل داده است.

 

 

 

شکل 4- کروماتوگرام مربوط به کاروتنوئیدهای استخراج‌شده از توده سلولی. پیک شماره 1 مربوط به کاروتنوئید آستاگزانتین، شماره 2: کانتاگزانتین، شماره 4: اکیننون و شماره 6 مربوط به بتاکاروتن است.

 

جدول 7- نوع و مقدار کاروتنوئیدهای تولیدشده توسط سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25

مقدار کاروتنوئید (µg/g biomass)

مقدار کاروتنوئید mg/L

مقدار کاروتنوئید (%)

شماره پیک

نوع کاروتنوئید

68/17

013/0

77/6

1

آستاگزانتین

48/37

027/0

34/14

2

کانتاگزانتین

88/164

117/0

11/63

4

اکیننون

86/18

013/0

22/7

6

بتاکاروتن

 

 

مقدار تولید اکیننون در این سویه در محیط شماره 4 بیشتر از سایر کاروتنوئیدهای شناسایی شده است (شکل 5). بعد از اکیننون، بیشترین مقدار کاروتنوئید تولیدشده در سویه آئورانتیوکیتریوم، کانتاگزانتین است و مقدار کاروتنوئیدهای آستاگزانتین و بتاکاروتن نیز تقریباً برابر است.

 

 

شکل 5- نمودار هریک از کاروتنوئیدهای تولیدشده توسط سویه آئورانتیوکیتریوم بر حسب میلی‌گرم در لیتر

 

بحث و نتیجه ‏‏گیری.

در سال‌های اخیر ترائوستوکیتریدها جزء سویه‌های تولیدکننده کاروتنوئیدها معرفی شده‌اند. با توجه به جدیدبودن این سویه‌ها بررسی نقش منابع کربن و نیتروژن در تولید کاروتنوئیدها مهم است. گلوکز به‌طور گسترده‌ای برای تخمیرهای صنعتی استفاده می‌شود و نسبت به سایر منابع کربن دارای عملکرد بالا در تولید توده سلولی و بهره‌وری لیپید است (17). همچنین استفاده از گلیسرول به‌عنوان یک منبع کربن جایگزین به جای گلوکز، به‌علت فراوانی و هزینه‌های نسبتاً کم آن در مقایسه با گلوکز از اهمیت زیادی برخوردار است (18). در این بررسی نیز گلیسرول به‌عنوان بهترین منبع کربن برای رشد و تولید کاروتنوئیدها در این سویه معرفی شد. در محیط غنی‌شده با گلیسرول مقدار کل کاروتنوئید تولیدشده برابر با 8/332 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی است درحالی‌که میزان کاروتنوئید تولیدی در محیط مشابه اما غنی‌شده با گلوکز 781/134 میکروگرم در گرم وزن خشک سلولی است. هنگامی که در کشت سویه‌های شیزوکیتریوم S31، ترائوستوکیتریوم AMCQS5-3، ترائوستوکیتریوم AMCQS5-5 و شیزوکیتریوم AMCQS1-9 به جای گلوکز از گلیسرول به‌عنوان منبع کربن در محیط کشت استفاده شد، تولید توده سلولی، کاروتنوئید و محتوای لیپید در آن‌ها به‌مقدار قابل ‌توجهی بالاتر از محیط‌های تغذیه‌شده با گلوکز بود (17). همچنین اسکات[xii] و همکاران مشاهده کردند زمانی که محیط کشت با گلیسرول به جای گلوکز تغذیه شود، افزایش در تولید توده سلولی و محتوای لیپید ترائوستوکیتریدها قابلِ‌ملاحظه خواهد بود (19). در پژوهش دیگری استفاده از گلیسرول به‌عنوان منبع کربن، منجر به افزایش محتوای کاروتنوئیدها در شیزوکیتریوم S31 از 8/16 به 28/20 میکروگرم در گرم شد. افزایش محتوای کاروتنوئید در دو سویه ترائوستوکیتریوم AMCQS5-3 و ترائوستوکیتریوم AMCQS5-5 به‌ترتیب از 16 و 17 به 50 و 60 میکروگرم در گرم، یعنی حدود 3 برابر مشاهده شد (17) درحالی‌که آرمنتا[xiii] و همکاران محتوای کاروتنوئید را تا 50 میکروگرم در گرم با استفاده از منبع کربن گلوکز در تخمیر ترائوستوکیتریوم سویه ONC-T18، گزارش داده‌اند (15). شرایط نور در محیط نیز برای تأثیر بر بیوسنتز آستاگزانتین و رشد ترائوستوکیتریدها اثبات شده است. سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25 نیز برای تولید کاروتنوئیدها باید در محیط دارای استرس قرار بگیرد. ازاین‌رو در این بررسی برای ایجاد استرس در محیط رشد سلول‌ها، از نور فلورسنت با شدت 2000 لوکس استفاده شد. این سویه در تاریکی نیز رشد می‌کند و مقدار کاروتنوئید ناچیزی تولید می‌کند اما با اعمال استرس نوری تولید کاروتنوئیدها در سلول‌ها بسیار افزایش می‌یابد و باعث تغییر رنگ محیط می‌شود. اثر نور شدید فلورسنت (1500 لوکس)، نور قرمز، آبی، مادون قرمز نزدیک و تاریکی بر سنتز رنگدانه و رشد ترائوستوکیتریوم CHN-1 مطالعه و مشخص شد که نور فلورسنت بهترین اثر تحریک بر رشد را دارد درحالی‌که نور آبی برای ارتقاء بیوسنتز آستاگزانتین طی روشنایی طولانی 15 روز، بهتر است (20). همچنین در این مطالعه مشاهده شد که سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25در محیط کشت فاقد عصاره مخمر و دارای کلرید آمونیوم رشد کمی دارد. در حقیقت وجود عصاره مخمر در محیط‌های کشت یکی از فاکتورهای مهم و ضروری برای رشد این سویه است و کلرید آمونیوم نمی‌تواند جایگزین عصاره مخمر باشد و جوابگوی نیازهای سویه برای رشد نیست. با بررسی‌های انجا‌م‌شده مشخص شد که سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25 توانایی تولید کاروتنوئیدهای آستاگزانتین، کانتاگزانتین، اکیننون و بتا کاروتن را دارد. در نتایج حاصل‌شده از آنالیز عصاره کاروتنوئیدی با استفاده از HPLC، پیک شماره 4 مربوط به اکیننون است که نسبت به سایر کاروتنوئیدهای موجود، دارای بیشترین مقدار است. در سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25، اکیننون به‌عنوان کاروتنوئید غالب شناخته شد که در محیط حاوی گلیسرول، 11/63درصد از کل کاروتنوئیدهای تولیدشده را به خود اختصاص داده است. اکیننون مانند بتاکاروتن و آستاگزانتین به‌عنوان یک رنگدانه خوراکی، آنتی‌اکسیدان و پروویتامین A، استفاده می‌شود. معمولاً اکیننون به‌عنوان یک محصول واسطه تولید آستاگزانتین با استفاده از میکروارگانیسم‌ها تولید می‌شود و ممکن است از بتاکاروتن ازطریق اکسیداسیون و تجزیه شیمیایی، مشتق شود (21). تولید کاروتنوئیدهای آستاگزانتین، اکیننون، کانتاگزانتین، فوئنیکوزانتین و بتاکاروتن در سویه ترائوستوکیتریوم CHN-1 بررسی شده است. محتوای کاروتنوئیدی در این سویه با میزان رشد سلولی یا توده سلولی ارتباط مستقیم دارد. تولید توده سلولی و کاروتنوئیدها برای این سویه پس از 8 روز انکوباسیون به حداکثر خود رسید. انکوباسیون 14روزه سویه ترائوستوکیتریوم CHN-1 نه تنها سبب افزایش در توده سلولی و عصاره کاروتنوئیدی نشد بلکه کاهش در مقدار این دو فاکتور را نیز نشان داد. در روز هشتم محتوای کل بتاکاروتن در ترائوستوکیتریوم CHN-1 کاهش یافته بود، درحالی‌که مقدار آستاگزانتین افزایش نشان داد. به‌طورکلی، مقدار کل کاروتنوئیدها (کاروتنوئیدهای هیدروکربنی) در طی فازهای تأخیری و ثابت کاهش می‌یابد درحالی‌که محتوای زانتوفیل‌ها (کاروتنوئیدهای اکسیژن‌دار) افزایش می‌یابد. مشاهده تغییرات پی‌در‌پی در محتوای بتاکاروتن و همچنین کتوکاروتنوئیدها، اکیننون، فوئنیکوزانتین و کانتاگزانتین، امکان تبدیل بین این کاروتنوئیدها را در سویه ترائوستوکیتریوم CHN-1 نشان می‌دهد (14). در مطالعه‌ای که Gupta و همکاران بر سویه‌های ترائوستوکیترید انجام دادند، مشخص شد که همه ترائوستوکیتریدهای جداشده که نارنجی‌رنگ هستند، آستاگزانتین یا کانتاگزانتین را به‌عنوان کاروتنوئید غالب و مقداری اکیننون تولید می‌کنند. کاروتنوئیدهای دیگر مانند لوتئین، زآزانتین یا بتاکریپتوزانتین در این ترائوستوکیتریدها مشاهده نشدند. سویه شیزوکیتریوم S31 دارای مقدار آستاگزانتین و اکیننون قابلِ‌توجه به‌ترتیب 7/29 و 21/33 میکروگرم در گرم همراه با مقداری کانتاگزانتین (63/14 µg/g) است. در این محیط کشت تبدیل مؤثر بتاکاروتن به زانتوفیل‌ها در فاز تأخیری باعث می‌شود که در مجموعه کاروتنوئیدی، بتاکاروتن مشاهده نشود. بااین‌حال غیبت بتاکاروتن و حضور معنی‌دار آستاگزانتین و اکیننون، سرعت اکسیداسیون بتاکاروتن به اکیننون و به دنبال آن با استفاده از اکسیداسیون/هیدروکسیداسیون به آستاگزانتین، از طریق مسیر کانتاگزانتین را نشان می‌دهد (17). همچنین آرمنتا و همکاران مجموعه‌ی کاروتنوئیدی مشابهی را در ترائوستوکیتریوم ONC-T18 گزارش کردند که حضور کانتاگزانتین، اکیننون و بتاکاروتن و مقدار کمی آستاگزانتین را نشان می‌دهد (15). با توجه به یافته‌های گوپتا[xiv] و همکاران، می‌توان وجود کانتاگزانتین را به‌عنوان کاروتنوئید عمده در ترائوستوکیتریوم و آستاگزانتین را در شیزوکیتریوم، بیان کرد. سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25 همچنین توانایی تولید بتا کاروتن را دارد. در مسیر سنتز کاروتنوئیدها، ابتدا کانتاگزانتین از بتا کاروتن مشتق می‌شود و سپس آستاگزانتین تولید می‌شود. ازاین‌رو، می‌توان این موضوع را به‌عنوان یکی از دلایل احتمالی اینکه میزان کانتاگزانتین تولیدی در سویه بیشتر از میزان آستاگزانتین تولیدی آن است، در نظر گرفت. همچنین غیرفعال‌شدن آنزیم بتاکاروتن هیدروکسیلاز که مسئول اضافه‌کردن گروه‌های هیدروکسیل به اسکلت کانتاگزانتین است، می‌تواند منجر به معیوب‌شدن سنتز آستاگزانتین و تجمع کانتاگزانتین شود (17). البته بررسی آنزیم‌های دخیل و ژن‌های آن‌ها در مسیر بیوسنتز کاروتنوئیدها در این سویه در دست بررسی است. سویه آئورانتیوکیتریوم Ch25 استفاده‌شده در این پژوهش قبلاً طی یک فرآیند جداسازی و غربالگری وسیع برای یافتن ترائوستوکیتریدهای بومی ایران با قابلیت تولید کاروتنوئیدها، جداسازی و شناسایی شد (22). به‌طورکلی با توجه به تجمع کاروتنوئیدهای با ارزش مثل بتاکاروتن، اکیننون، کانتاگزانتین و آستاگزانتین در این سویه بومی، بهینه‌سازی محیط کشت از روش‌های تاگوچی و غیره، ضروری به نظر می‌رسد تا بتوان به تولید بیشتر کاروتنوئیدها دست یافت.

تشکر و قدردانی

هزینه‌های این پژوهش از محل گرنت پژوهشی دانشگاه، تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته (کد طرح: 419401 و شماره 900/7) تأمین شد که قابل تقدیر است.

 



[1]- Labyrinthula

[2]- Chromista

[3]- Heterokont

[4]- Schizochytrium limacinum

[5]- Thraustochytrium aureum

[6]- Agrobacterium

[7]- Alcaligenes sp.

[8]- Glucose, Yeast extract, Pepton

[9]- Skim milk

[10]- Tween 80

[11]- High-performance liquid chromatography

[xii]- Scott

[xiii]- Armenta

[xiv]- Gupta

  

(1)               Noviendri D., Hasrini RF., Octavianti F. Carotenoids: Sources, medicinal properties and their application in food and nutraceutical industry. Journal of Medicinal Plants Research 2011; 5 (33): 7119- 31.

(2)               Lorenz RT., Cysewski GR. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends in biotechnology 2000; 18 (4): 160- 7.

(3)               Bhosale P. Environmental and cultural stimulants in the production of carotenoids from microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology 2004; 63 (4): 351- 61.

(4)               Chatdumrong W., Yongmanitchai W., Limtong S., Worawattanamateekul W. Optimization of docosahexaenoic acid (DHA) production and improvement of astaxanthin content in a mutant Schizochytrium limacinum isolated from mangrove forest in Thailand. Kasetsart Journal (Natural Science) 2007; 41: 324- 34.

(5)               Chattopadhyay P., Chatterjee S., Sen SK. Biotechnological potential of natural food grade biocolorants. African Journal of Biotechnology 2008; 7 (17): 2972- 85.

(6)               Aki T., Hachida K., Yoshinaga M., Katai Y., Yamasaki T., Kawamoto S., et al. Thraustochytrid as a potential source of carotenoids. Journal of the American Oil Chemists' Society 2003; 80 (8): 789- 94.

(7)               Guerin M., Huntley ME., Olaizola M. Haematococcus astaxanthin: applications for human health and nutrition. TRENDS in Biotechnology 2003; 21 (5): 210- 6.

(8)               Yamasaki T., Aki T., Mori Y., Yamamoto T., Shinozaki M., Kawamoto S., et al. Nutritional enrichment of larval fish feed with thraustochytrid producing polyunsaturated fatty acids and xanthophylls. Journal of bioscience and bioengineering 2007; 104 (3): 200- 6.

(9)               Cifuentes AS., Gonzalez MA., Vargas S., Hoeneisen M., Gonzalez N. Optimization of biomass., total carotenoids and astaxanthin production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Nevada, USA) under laboratory conditions. Biological Research 2003; 36 (3/4): 343- 58.

(10)           Guedes AC., Amaro HM., Malcata FX. Microalgae as sources of carotenoids. Marine drugs 2011; 9 (4): 625- 44.

(11)           Atienza G., Arafiles K., Carmona M., Garcia J., Macabago A., Peñacerrada B., et al. Carotenoid analysis of locally isolated Thraustochytrids and their potential as an alternative fish feed for Oreochromis niloticus (Nile tilapia). Mycosphere 2012; 3(4): 420- 428.

(12)           Steinbrenner J., Linden H. Regulation of two carotenoid biosynthesis genes coding for phytoene synthase and carotenoid hydroxylase during stress-induced astaxanthin formation in the green alga Haematococcus pluvialis. Plant Physiology 2001; 125 (2): 810- 7.

(13)           Martín JF., Gudiña E., Barredo JL. Conversion of β-carotene into astaxanthin: Two separate enzymes or a bifunctional hydroxylase-ketolase protein? Microbial Cell Factories 2008; 7 (1): 3.

(14)           Carmona ML., Naganuma T., Yamaoka Y. Identification by HPLC-MS of carotenoids of the Thraustochytrium CHN-1 strain isolated from the Seto Inland Sea. Biosci Biotechnol Biochem 2003; 67 (4): 884- 8.

(15)           Armenta RE., Burja A., Radianingtyas H., Barrow CJ. Critical assessment of various techniques for the extraction of carotenoids and co-enzyme Q10 from the thraustochytrid strain ONC-T18. Journal of agricultural and food chemistry 2006; 54 (26): 9752- 8.

(16)           Lorenz Todd R. Thin-Layer Chromatography (TLC) system for Natu Rose Carotenoids. Natu Rose Technical Bulletin 1998; 3: 1- 3.

(17)           Gupta A., Singh D., Barrow CJ., Puri M. Exploring potential use of Australian thraustochytrids for the bioconversion of glycerol to omega-3 and carotenoids production. Biochemical Engineering Journal 2013; 78: 11- 7.

(18)           Abad S., Turon X. Valorization of biodiesel derived glycerol as a carbon source to obtain added-value metabolites: Focus on polyunsaturated fatty acids. Biotechnology advances 2012; 30 (3): 733- 41.

(19)           Scott SD., Armenta RE., Berryman KT., Norman AW. Use of raw glycerol to produce oil rich in polyunsaturated fatty acids by a thraustochytrid. Enzyme and microbial technology 2011; 48 (3): 267- 72.

(20)           Yamaoka Y., Carmona ML., Oota S. Growth and carotenoid production of Thraustochytrium sp. CHN-1 cultured under superbright red and blue light-emitting diodes. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 2004; 68 (7): 1594- 7.

(21)           Matsuura H., Watanabe MM., Kaya K. Echinenone production of a dark red-coloured strain of Botryococcus braunii. Journal of Applied Phycology 2012; 24 (4): 973- 7.

(22)           Gerami M. Study of carotenoids production in unicellular marine protist strain [Dissertation]. Kerman: Graduat University of Advanced Technology. 2013.