جداسازی و شناسایی جدایه‌های اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز از مزارع سیب‌زمینی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار بیوشیمی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

2 استادیار بیوفیزیک، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

3 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: ال-آسپاراژیناز، به‌طور مؤثری در درمان لوسمی لنفوبلاستیک کاربرد دارد. سلول‌های سرطانی برای رشد سریع خود به ذخیرۀ ال-آسپاراژین احتیاج فراوانی دارند. ال-آسپاراژیناز، هیدرولیز ال-آسپاراژین به ال-آسپارتیک اسید و آمونیاک را کاتالیز می‌کند. هدف از این پژوهش، جداسازی و شناسایی جدایه‌های اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز از مزارع سیب‌زمینی جیرفت است.‏‏

مواد و روش‏‏ ها: گونه‌های اروینیای واجد فعالیت پکتولایتیکی در محیط کشت M9 از سیب‌زمینی‌های تیره و فاسدشده جداسازی شدند. باکتری‌های تولیدکنندۀ آنزیم مدنظر، براساس تغییر رنگ محیط متمایز شدند. تست‌های بیوشیمیایی-میکروبی و اثر بیماری‌زایی گونه‌های جداشده بر گیاه سیب‌زمینی و شمعدانی انجام شد. سپس میزان تولید آسپاراژیناز و شناسایی مولکولی اروینیای Er8 و Er11 بررسی شد. ‏‏

نتایج: در این پژوهش، جدایه‌های اروینیای پکتولایتیک مولد ال-آسپاراژیناز روی محیط‌های CVP و M9 جداسازی شد. آزمایش‌های مربوط به اثر بیماری‌زایی اروینیا بر گیاه سیب‌زمینی و شمعدانی نشان داد که گونه‌های Er8 و Er11 دارای توان بیماری‌زایی بر این دو گیاه هستند. بیشترین میزان بیماری‌زایی گونه‌های Er8 و Er11، در زمان‌های 48 و 15 ساعت پس از تلقیح به‌ترتیب در گیاه سیب‌زمینی و شمعدانی مشاهده شد. بررسی مولکولی ژن 16S rDNA نشان داد که جدایه‌های Er8 و Er11 به اروینیا کریزانتومی با 98درصد همولوژی نزدیک هستند. ‏

بحث و نتیجه‏ گیری: با توجه به کاربردهای گستردۀ ال-آسپاراژیناز در زمینه‌های مختلف، اروینیاهای جداشده و آنزیم‌هایی که تولید کرده‌اند، می‌توانند گزینه‌های مناسبی برای استفاده‌های کاربردی باشند‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and Identification of L-asparaginase producing Erwinia strains which isolated from Potato Farms

نویسندگان [English]

  • Arastoo Badoei-Dalfard 1
  • Zahra Karami 2
  • Narjes Ramezanipour 3
1 Associate Professors of Biochemistry, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Assistant Professors of Biophysics, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
3 M.Sc of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: L-Asparaginase can be effectively used for the treatment of lymphoblastic leukemia. The rapid growth of cancer cells are needed for L-asparagine abundant storage. L-asparaginase catalyzes the hydrolysis of L-asparagine into L-aspartic acid and ammonia. The purpose of this study was to isolate and identify the L-asparaginase producing Erwinia strains from the potato farms of Jiroft.

Materials and methods: Pectolytic Erwinia species isolated from crumbling potato in M9 medium. The desired L-asparaginase producing bacteria were isolated based on the color changes. Biochemical-microbial and the plant pathogenicity tests of these strains were also investigated with potato and geranium. The L-asparaginase production and molecular detection of these Erwinia strains were also investigated.

Results: In this study, L-asparaginase producing Erwinia was isolated on the CVP and M9 mediums. The inoculation of Erwinia strains on the potato and geranium plants showed that Er8 and Er11 species have the ability to cause plant pathogenicity. Results showed that the maximum pathogenicity of Er8 and Er11 was observed after 48 and 15 h of inoculation in potato and geranium plants, respectively. 16S rDNA sequencing and phylogenetic analyses exhibited that Er8 and Er11 strains were similar to Erwinia chrysanthemi with 98% homology.

Discussion and conclusion: Because of several applications of the Erwinia L-asparaginase in various fields, isolated Erwinia and their L-asparaginase can be suitable for applied utilization.

کلیدواژه‌ها [English]

  • L-asparaginase
  • leukemia
  • Screening
  • Erwinia
  • Cancer

مقدمه.

لوسمی لنفوبلاستی حاد[1] (ALL) یک سرطان[2] بدخیم مغز استخوان و خون است که آن را توده‌های کنترل‌نشده و سلول‌های خونی غیرطبیعی ایجاد می‌کند (1). این بیماری، سرطان گلبول‌های سفید خون است که با توقف فعالیت‌های طبیعی سلول‌های خونی و در خیلی از موارد مرگ آن‌ها، باعث مرگ‌ومیر افراد به‌ویژه در سنین نزدیک به 20 سال می‌شود (2).

 درمان لوسمی حاد شامل شیمی‌درمانی[3]، مصرف استروئیدها[4]، پرتودرمانی[5] و ترکیبی از درمان‌های متمرکز شامل کاشت مغز استخوان[6] و سلول‌های سخت است (3). در میان آن‌ها، شیمی‌درمانی به‌عنوان بهترین روش مورد توجه است که در آن از داروهایی مانند پردنیزولون[7]، دگزامتازون[8]، وینکریستین[9]، ال-آسپاراژیناز[10]، دانوروبسین[11]، سیتارابین[12]، اتوپوزاید[13] و... استفاده می‌شود (4). هرچند انواع این داروها امروزه در دسترس هستند، اما درجۀ اثر آن‌ها در درمان سرطان در سومین و چهارمین مرحله، مشکوک است. علاوه بر این، شیمی‌درمانی عوارض جانبی زیادی ایجاد می‌کند. از جملۀ این عوارض می‌توان به ناباروری، رشد دوبارۀ سلول‌های بدخیم، حالت تهوع و استفراغ و سرکوب سیستم ایمنی اشاره کرد (5). در میان داروهای ضدسرطان، آنزیم باکتریایی ال-آسپاراژیناز به‌عنوان مؤثرترین عامل دارویی شیمی‌درمانی، خصوصاً در درمان کودکان برای سرطان لنفوسیت حاد، به کار گرفته می‌شود (6).

ال-آسپاراژین[14]، یک اسیدآمینۀ ضروری برای سلول‌ها درجهت تولید پروتئین است (7). این ماده را یک آنزیم به نام آسپاراژین-سنتتاز[15] می‌تواند در داخل سلول تولید کند و یا از خارج جذب شود (از راه خوراکی جذب بدن شود و در دسترس سلول‌ها قرار گیرد). سلول‌های سرطانی، به‌ویژه سلول‌های سرطانی لنفوسیتی برای رشد سریع و بدخیم خود نیازمند مقادیر زیادی آسپاراژین هستند (8)؛ بنابراین، آسپاراژین دریافت‌شده ازطریق رژیم غذایی را در کنار آسپاراژینی که خودِ بدن تولید کرده (که محدود است) این سلول‌ها استفاده می‌کنند تا نیاز فوق‌العادۀ آن‌ها تأمین شود (8). درنتیجه، ال-آسپاراژین یک اسیدآمینۀ مهم برای رشد سلول‌های سرطانی است، درحالی‌که سلول‌های طبیعی برای رشد خود وابسته به آن نیستند؛ زیرا آنزیم سنتزکنندۀ ال-آسپاراژین به‌میزان کافی و برای برآورده‌کردن نیازهای متابولیک بدن، آن را سنتز می‌کند (9).

 وجود ال-آسپاراژیناز باعث می‌شود سلول‌های سرطانی از یک فاکتور رشد مهم محروم شوند و نتوانند به حیات خود ادامه دهند (10). ال-آسپاراژینازهای باکتریایی موضوع قابلِ‌توجهی در پزشکی هستند و در درمان لوسمی لنفوبلاستیک حاد استفاده می‌شوند. هرچند فعالیت ضدسرطانی و سمیت ال-آسپاراژیناز به‌دست‌آمده از اروینیا (پکتوباکتریوم[16]) کاراتوورا[17] و اشرشیا کلای[18] مشابه است ولی از نظر سرولوژی و بیوشیمی ال-آسپاراژیناز اروینیا کاراتوورا برجسته است (11). علاوه‌‌بر کاربردهای بالینی، ال-آسپاراژیناز در فرآوری مواد غذایی نیز استفاده می‌شود. در طی گرم‌کردن غذا، اسیدآمینۀ ال-آسپاراژینی که به‌طور طبیعی در غذاهای نشاسته‌ای وجود دارند، دچار واکنش‌های میلارد قهوه‌ای می‌شود. متأسفانه، در واکنش‌های میلارد عوامل پنهانی سرطان‌زایی در انسان مثل آکریل‌آمید شکل می‌گیرند. ال-آسپاراژیناز یک راه بالقوه برای کاهش میزان ال-آسپاراژین آزاد در مواد اولیۀ محصولات غذایی است (12). به‌این‌ترتیب، هدف از این پژوهش، جداسازی و شناسایی جدایه‌های اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز دارویی از مزارع سیب‌زمینی جیرفت است.

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‌برداری: با توجه به اینکه جدایه‌های اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز دارویی با داشتن خصوصیت بیماری‌زایی در سیب‌زمینی (عامل پوسیدگی نرم) نیز مطرح‌اند (13). ازاین‌رو، غربال‌گری برای یافتن جدایه‌های اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز با استفاده از سیب‌زمینی انجام شد. نمونه‌های سیب‌زمینی با علائم مشخص بخش‌های تیره‌رنگ و فاسدشده از مزارع کشاورزی شهرستان جیرفت استان کرمان جمع‌آوری و در آزمایشگاه استفاده شد.

غربال‌گری اروینیا: غربال‌گری اروینیاهای مولد ال-آسپاراژیناز، با استفاده از بافت‌های تیره و نرم‌شدۀ سیب‌زمینی‌های جمع‌آوری‌شده صورت گرفت. نمونه‌ها ابتدا در 50 میلی‌لیتر محیط M9 و در دمای 30 درجه سانتی‌گراد و rpm160 غنی‌سازی شدند. این محیط شامل 2 گرم‌بر‌لیتر پتاسیم دی‌هیدروژن فسفات[19]، 3 گرم‌بر‌لیتر گلوکز[20]، 6 گرم‌بر‌لیتر ال-آسپاراژین، 1 گرم‌بر‌لیتر سولفات منیزیم[21] و 1 گرم‌بر‌لیتر کلسیم دی‌کلرید[22] بود (14). پس از گذشت 3 روز به‌میزان 5درصد به محیط تازه تلقیح شد؛ در این محیط باکتری‌های مولد ال-آسپاراژیناز قادر به رشد خواهند بود. پس از طی‌شدن 3 روز به‌میزان 1درصد به 100 میلی‌لیتر محیط CVP[23] تلقیح شد. این محیط، یک محیط اختصاصی و انتخابی برای رشد اروینیاهای گرم منفی است. حضور کریستال ویوله در ترکیب این محیط از رشد باکتری‌های گرم مثبت جلوگیری می‌کند. ترکیبات آن شامل 8/6 میلی‌لیتر کلسیم دی‌کلرید 10درصد، یک گرم سدیم نیترات[24]، 9 گرم پلی‌پکتات سدیم[25]، یک میلی‌لیتر کریستال ویوله[26] 075/0درصد، 5/0 میلی‌لیتر سدیم دو دسیل سولفات[27] 10درصد، 5/2 گرم سدیم سیترات[28]، 5/0 گرم تریپتون[29] و 2 گرم آگار[30] (حالت‌جامد) در 500 میلی‌لیتر آب مقطر است (15). پس از 3 روز، تعویض محیط صورت گرفت. سپس به‌میزان 100 میکرولیتر از محیط در پلیت‌های جامد CVP کشت داده شد و پلیت‌ها در انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. پس از طی‌شدن 5 روز، کلنی‌های دارای فعالیت پکتولایتیکی مشاهده شد. گفتنی است اروینیاهای بیماری‌زا دارای فعالیت پکتولایتیکی هستند و سدیم پلی‌پکتات موجود در محیط CVP را به‌عنوان منبع کربن استفاده می‌کنند (16).

تست‌های بیوشیمیایی-میکروبی: باکتری‌های جداسازی‌شده تخلیص و صفات ریخت‌شناسی و برخی از تست‌های بیوشیمیایی-میکروبی آن‌ها از جمله رنگ‌آمیزی گرم، اکسیداز، کاتالاز، هیدرولیز ژلاتین، رشد در نمک 5 درصد و... انجام شد (17).

اثر بیماری‌زایی بر گیاه سیب‌زمینی و شمعدانی: به‌منظور بررسی تست لهانیدن سیب‌زمینی[31]، تزریق باکتری‌های خالص به سیب‌زمینی انجام شد (17). در این تست، از سوسپانسیون باکتری‌های خالص جداشده در آب مقطر استریل استفاده شد. 10 میکرولیتر سوسپانسیون باکتری با سرنگ کاملاً استریل در شیار ایجادی در سطح ورقۀ یک سیب‌زمینی تزریق شد. پس از جذب و نفوذ سوسپانسیون باکتری، نمونه‌ها به‌مدت یک هفته درون انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شدند. پس از 7-2 روز میزان لهیدگی، نرم‌شدن و تیرگی بافت سیب‌زمینی در محل تزریق هر باکتری بررسی شد. این آزمایش یکی از تست‌های شاخص در زمینۀ جداسازی اروینیاها است.

همچنین، از جمله آزمایش‌های کاربردی دیگر در زمینۀ شناسایی اروینیاهای بیماری‌زای گیاهی از انواع غیربیماری‌زا، تست واکنشی فوق حساسیت[32] در گیاه حساس این گروه است (18). به‌این‌ترتیب، گیاه شمعدانی[33] به‌عنوان گیاه حساس، انتخاب شد و 10 میکرولیتر سوسپانسیون هریک از باکتری‌های جداشده در محل بافت برگ‌های جوان تزریق و نتایج پس از 24 ساعت مشاهده شد.

شناسایی مولکولی: جدایه‌هایی که در تمامی آزمایشات بهترین نتیجه را نشان دادند انتخاب شدند و تحت شناسایی مولکولی قرار گرفتند. به‌منظور استخراج DNA، از کیت استخراج DNA شرکت سیناژن استفاده شد. برنامۀ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز[34] با برنامه زمانی 95 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 2 دقیقه و 33 سیکل شامل، 94 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، 51 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه، 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت یک دقیقه و یک سیکل 72 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 5 دقیقه با استفاده از پرایمرهای 16S rDNA با نام F 5′‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ و R 5′-GACGGGCGGTGTGTACAA-3′ انجام شد (19). پس از آنالیز کیفی محصولات واکنش زنجیره‌ای پلیمراز توسط الکتروفورز ژل آگارز (1درصد) و اطمینان از تکثیر قطعه مدنظر در محدودۀ موردِانتظار، محصولات برای تعیین توالی به شرکت بیونیر (کره جنوبی) فرستاده شدند و پس از دریافت نتیجۀ تعیین توالی، در بانک ژنی[35] مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی[36]، شابه توالی‌ها با ابزار BLAST بررسی شد (20).

مقایسۀ میزان فعالیت ال-آسپاراژینازی جدایه‌های برتر: مقایسۀ میزان فعالیت ال-آسپاراژیناز جدایه‌های برتر روی محیط جامد M9 حاوی 5/2درصد فنل‌رد[37] با اندازه‌گیری قطر هالۀ حاصل از فعالیت ال-آسپاراژینازی در بازۀ زمانی 30 ساعت صورت گرفت. فعالیت آنزیم تجزیه‌کنندۀ ال- آسپاراژین با تهیۀ لوله‌های نمونه، شاهد و استاندارد انجام شد. لوله‌های استاندارد حاوی غلظت‌های متفاوتی از سوبسترای استاندارد و نیز شاهد استاندارد است و برای رسم منحنی استاندارد استفاده می‌شود. لولۀ نمونه، حاوی اسیدآمینۀ آسپاراژین است و درصورت تولید ال-آسپاراژیناز از باکتری‌های بررسی‌شده، طبق روش فاست و اسکات[38] (1960) و براساس واکنش فنل-هیپوکلریت[39] با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر[40] اندازه‌گیری می‌شود (21). این روش براساس مقدار آمونیاک آزادشده از ال-آسپاراژین در هنگام فعالیت آنزیم است. به‌این‌منظور، ابتدا 100 میکرولیتر از فاز مایع باکتری به 300 میکرولیتر بافر با سوبسترا اضافه می‌شود و به‌مدت 30 دقیقه در دمای اتاق انکوبه می‌شود. سپس 400 میکرولیتر محلول A (فنل[41] 59/0 مولار و سدیم نیتروپروساید[42] یک میلی‌مولار) و 400 میکرولیتر محلول B (سدیم هیپوکلریت[43] 11/0 مولار و سدیم هیدروکسید[44] 2 مولار) اضافه می‌شود. با پدیدارشدن رنگ آبی، جذب مخلوط ویال در طول موج 600 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در برابر شاهد آب مقطر خوانده شد. هر واحد فعالیت آنزیم ال-آسپاراژیناز به‌عنوان مقدار آنزیمی در نظر گرفته شد که یک میکرومول آمونیاک را در مدت یک دقیقه در شرایط استاندارد آزاد کند (21).

 

نتایج.

غربال‌گری جدایه‌های اروینیا: گونه‌های مختلف این باکتری پاتوژن گیاهی هستند و باعث نکروز، گال، پلاسیده‌شدن یا پوسیدگی نرم در گیاهان می‌شوند و ازاین‌رو به گیاهان، سبزیجات و میوه‌ها صدمه وارد می‌کنند. اروینیا کاروتوورا عامل بیماری پوسیدگی نرم باکتریایی است. این باکتری در سیب‌زمینی پوسیدگی سیاه ایجاد می‌کند (شکل 1). در این پژوهش، از محیط جامدM9  حاوی آسپاراژین، برای غربال‌گری باکتری‌های مولد آنزیم ال-آسپاراژیناز استفاده شد. این محیط حاوی فنل‌رد است که در اثر فعالیت آنزیمی، آمونیاک آزادشده و اسیدیتۀ محیط افزایش می‌یابد و منجر به تغییر رنگ محیط واکنش از زرد به صورتی می‌شود. کشت خالص اروینیاEr8  روی محیط CVP در شکل 2 نشان داده شده است. ظاهرشدن کلنی در محیط CVP، فعالیت پکتولایتیک باکتری در اثر تجزیه سدیم پلی‌پکتات را نشان می‌دهد. در این پژوهش، 11 جدایه با توانایی ال-آسپاراژینازی و رشد در محیط CVP جداسازی شدند که از میان آن‌ها 2 جدایه برتر Er8 و Er11 در مطالعات شناسایی و بیماری‌زایی به‌عنوان اروینیای مولد ال-آسپاراژیناز انتخاب شدند.

تست‌های بیوشیمیایی-میکروبی: آزمایش رنگ‌آمیزی گرم و دیگر آزمون‌های بیوشیمیایی-میکروبی برای Er8 و Er11 انجام شد. هر دوی آن‌ها به‌صورت کوکوباسیل‌های گرم منفی منفرد یا جفت به‌صورت کوتاه زنجیره و متحرک مشاهده شدند. آن‌ها کاتالاز مثبت، ژلاتیناز مثبت، پکتیناز مثبت، اکسیداز منفی و قادر به رشد در نمک 5درصد بودند.

اثر بیماری‌زایی روی گیاه سیب‌زمینی و شمعدانی: شکل 3 نتایج حاصل از تست لهانیدن با تلقیح جدایه‌های جداسازی‌شده در سیب‌زمینی را نشان می‌دهد. همان‌طور که در شکل مشاهده می‌شود جدایه‌های Er8 وEr11 بیشترین میزان نرم‌شدگی و فساد را در بافت سیب‌زمینی نشان می‌دهند. جدایۀ 8 در زمان 48 ساعت و جدایۀ 11 در 96 ساعت در مقایسه با 9 جدایۀ دیگر، آثار لهانیده‌شدن بافت‌های سیب‌زمینی را نشان دادند. پکتوباکتریومها یا اروینیاهای عامل پوسیدگی نرم، متعلق به خانواده انتروباکتریاسه[45] هستند. از ویژگی‌های اصلی این باکتری‌ها، تولید و ترشح آنزیم‌های منهدم‌کنندۀ دیوارۀ سلولی، به‌ویژه آنزیم‌های پکتیناز یا پکتولایتیک است که موجب لهانیده‌شدن بافت‌های گیاهی می‌شوند. پوسیدگی‌های نرم باکتریایی بیشتر در گیاهانی که بافت‌های ذخیره‌ای یا برگ و ساقه‌های نرم و آبدار دارند رخ می‌دهد و علائم بیماری در تمامی میزبان‌ها بسیار مشابه است؛ بافت‌های آلوده، نرم و آبکی و پوسیده‌اند (16).

 

 

 

 

شکل 3- تست لهانیدن سیب‌زمینی. نتایج نشان می‌دهد که بهترین جدایه‌های جداسازی‌شده، Er8 و Er11 هستند.

 

 

برای بررسی میزان بیماری‌زایی جدایه‌ها، تست واکنشی فوق حساسیت انجام شد و سوسپانسیون هریک از جدایه‌ها به گیاه شمعدانی تلقیح و نتایج پس از 24 ساعت بررسی شد. نتایج در شکل 4 نشان می‌دهد که جدایه‌های Er8 و Er11 بیشترین میزان بیماری‌زایی را به‌ترتیب در 15 و 20 ساعت پس از تلقیح در گیاه شمعدانی ایجاد کرده‌اند.

شناسایی مولکولی: درخت فیلوژنتیکی جدایه‌های Er8 و Er11 با استفاده از سایر توالی‌های ژن
16S rDNA سویه‌های اروینیا موجود در NCBI با استفاده از نرم‌افزار MEGA5 رسم شد (شکل 5). نتایج حاصل از تطبیق توالی نشان داد که این توالی ژن
16S rDNA دو سویه به اروینیا کریزانتومی به‌میزان 98درصد شباهت دارند.

 

 

شکل 4- تست واکنشی فوق حساسیت در گیاه شمعدانی. بیشترین میزان بیماری‌زایی در جدایه‌های Er8 و Er11 دیده می‌شود.

 

 

 

 

 

شکل 5- درخت فیلوژنی سویه‌های اروینیا Er8 و Er11 رسم‌شده با استفاده از نرم‌افزار MEGA 5 به‌روش neighbour joining و با استفاده از معیار Boot strap.

 


.مقایسۀ میزان فعالیت ال-آسپاراژینازی جدایه‌های برتر: در ادامه روش جداسازی، از بین جدایه‌های جداسازی‌شده، دو جدایۀ Er8 و Er11 با اثر بیماری‌زایی قابلِ‌توجه که توانایی هیدرولیز ال-آسپاراژین در محیط حاوی فنل‌رد با بیشترین قطر هالۀ صورتی را داشتند، به‌عنوان جدایه‌های برتر مولد آنزیم در نظر گرفته شدند. در شکل 6 و جدول 1 قطر هالۀ تشکیل‌شده و مقادیر به‌دست‌آمده توسط 2 جدایه در بازۀ زمانی 30 ساعت روی محیط M9 حاوی فنل‌رد نشان داده شده است. با توجه به شکل، جدایه‌های Er8 و Er11 فعالیت آنزیمی خود را در زمان 6 ساعت پس از انکوباسیون آغاز کرده‌اند که با گذشت زمان به‌تدریج بر میزان فعالیت، تجزیۀ ال-آسپاراژین و اسیدیتۀ محیط افزوده شده است. در زمان 18 ساعت به‌طور تقریبی50درصد محیط در نتیجۀ فعالیت آنزیمی دو جدایه صورتی‌رنگ شده است. زمان 30 ساعت نیز به‌عنوان زمانی که جدایه‌ها به حدود 100درصد میزان فعالیت خود رسیده‌اند به دست آمده است. با مشاهدۀ میزان فعالیت ال-آسپاراژینازی دو جدایه در 30 ساعت پس از انکوباسیون و مقایسۀ آن مشخص شد که جدایۀ 8 این مراحل را با فعالیت آنزیمی بیشتری گذرانده است.

 

 

شکل 6- تغییر رنگ محیط کشت بر اثر تولید آنزیم توسط باکتری Er8 وEr11 پس از 30 ساعت انکوباسیون

 

جدول 1- قطر هالۀ ال-آسپاراژینازی تشکیل‌شده توسط سویه‌ها روی محیط M9 برحسب میلی‌متر

زمان (ساعت)/ سویه

Er8

Er11

0

0

0

6

5/0

2

12

5

5/7

18

10

14

24

5/16

19

30

26

30

 

بحث و نتیجه‏‏ گیری.

آنزیم آسپاراژیناز از دیرباز به‌عنوان آنزیم دارویی در درمان لوسمی استفاده شده است. این آنزیم در رده‌های مختلف حیات موجود است، ولی آنزیم باکتریایی به‌علت تولید ارزان‌تر، خالص‌سازی آسان‌تر و اثرات جانبی کمتر مورد توجه ویژۀ پژوهشگران است (22). از جمله مهم‌ترین باکتری‌های مولد این آنزیم می‌توان به اشرشیا کلای، اروینیاکاروتوورا (23) و جدایه‌های باسیلوس (24) اشاره کرد. مهم‌ترین آسپاراژیناز استفاده شده در درمان آنزیمی از جدایۀ اروینیا کاروتوورابه دست آمده است که اولین بار، کید در 1950 قابلیت دارویی آن را بررسی کرد (25). از آن زمان تا­کنون پژوهشگران مختلفی سویه‌های مختلف اروینیا مولد ال-آسپاراژیناز را غربال‌گری کرده‌اند (26). به‌منظور غربال‌گری باکتری‌های مولد ال-آسپاراژیناز، از روش رنگ‌سنجی در پلیت با استفاده از محیط M9 حاوی فنل‌رد به‌عنوان شناساگر pH استفاده شد. در این روش که از سریع‌ترین روش‌های غربال‌گری باکتری‌های مولد ال-آسپاراژیناز در بازۀ زمانی 24-18 ساعت است، در صورت وجود فعالیت ال-آسپاراژینازی و تولید آمونیاک، فنل‌رد از زرد به صورتی تغییر رنگ می‌دهد. باشا[xlvi] و همکاران (27)، دارماراج[xlvii] (28) و کوشواها[xlviii] و همکاران (29) نیز از محیط M9 حاوی فنل‌رد جهت غربال‌گری اولیۀ میکروارگانیسم‌ها استفاده کردند.

در این مطالعه با استفاده از روش ذکرشده، دو جدایۀ بومی از جنس اروینیا با قطر هالۀ 10 تا 20 میلی‌متر حاصل از فعالیت آنزیمی در بازۀ زمانی 18-24 ساعت به دست آمد. گولاتی و همکاران در بررسی هالۀ حاصل از فعالیت ال-آسپاراژینازی باکتری‌های مختلف در بازۀ زمانی 18 ساعت، ایجاد قطر هالۀ 6 میلی‌متری Bacillus licheniformis و  ایجادنشدن هاله توسط باکتری Erwinia herbicola گزارش دادند (30). همچنین، در مطالعه‌ای که در سال 2007 انجام شد، پژوهشگران با استفاده از روش سنجش یاد شده به جداسازی باکتری Erwinia aroideae با قطر هالۀ 10 میلی‌متر در کنار سایر باکتری‌های برتر مولد ال-آسپاراژیناز مانند Bacillus subtilis، Psendomonas florescens، Escherichia coli و vulgarisProteus دست یافتند (31 و 32). در مطالعات قبلی ما، سویه های سودوموناس و باسیلوس با پتانسیل تولید مقدار قابل توجهی از آنزیم آسپارازیناز گزارش شده است (33- 35). در این پژوهش دو جدایۀ اروینیا با قابلیت تولید ال-آسپاراژیناز جداسازی‌شده و بررسی بیماری‌زابودن آن‌ها با دو تست لهانیدن سیب‌زمینی و واکنش فوق حساسیت در دو گیاه حساس این گروه، سیب‌زمینی و شمعدانی تأیید شد. جدایه‌های وابسته به باکتری جنس اروینیا از مهم‌ترین عوامل بیماری‌زای گیاهی به‌ویژه سیب‌زمینی هستند (13). علاوه‌بر‌این، توانایی هیدرولیز سدیم پلی‌پکتات به‏عنوان منبع کربن روی محیط CVP از این جدایه‌ها نیز تأییدکنندۀ فعالیت پکتولایتیکی آن‌ها است (16).

ناوازا و همکاران، تیواری و دوآ، مالادکار و همکاران و مولا و همکاران از جمله پژوهشگرانی بودند که به مطالعه دربارۀ جداسازی آنزیم ال-آسپاراژیناز از گونه‌های مختلف اروینیا پرداخته‌اند (36). در 2006 کامبل[xlix] و همکاران، یک گونۀ اروینیای تولیدکنندۀ ال-آسپاراژیناز را جداسازی کردند و ویژگی‌های آنزیمی آن را مطالعه کردند (37). همچنین در 2009 وارانکار[l] و همکاران، غربال‌گری باکتری اروینیا مولد ال- آسپاراژیناز و بهینه‌سازی شرایط تولید آنزیم را از این سویه انجام دادند (38). نتایج حاصل از این پژوهش، فعالیت بالای این سویه‌ها نسبت به سویه‌های مشابه را نشان می‌دهد.

در حال حاضر، آنزیم ال-آسپاراژیناز با نام تجاری Elspar از دو منبع باکتریایی اشرشیای کلای و اروینیا را شرکت معتبر آلمانی مرک[li] و شرکت پخش مواد دارویی فرانسیسکو آمریکا[lii] به بازار فروش عرضه می‌کنند (39). با توجه به مصرف قابلِ‌توجه این آنزیم در کشور متأسفانه این آنزیم در داخل کشور تولید نمی‌شود. پژوهش در این زمینه می‌تواند مقدمۀ تولید این آنزیم مهم را در کشور فراهم آورد.

تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه شهید باهنر کرمان، کمال تشکر را دارند.

 

 



[1]- Acute Lymphoblastic Leukaemia

[2]- Cancer

[3]- Chemotherapy

[4]- Steroids

[5]- Radiation therapy

[6]- Bone marrow transplants

[7]- Prednisolone

[8]- Dexamethasone

[9]- Vincristine

[10]- L-asparaginase

[11]- Daunorubicin

[12]- Cytarabine

[13]- Etoposide

[14]- L-asparagine

[15]- Asparagine-synthetase

[16]- Pectobacterium

[17]- Erwinia carotovora

[18]- E. coli

[19]- KH2PO4

[20]- Glucose

[21]- MgSO4

[22]- CaCl2

[23]- Crystal Violet Pectate

[24]- NaNO3

[25]- Sodium polypectate

[26]- Crystal violet

[27]- Sodium Lauryl Sulfate (=SDS)

[28]- Trisodium citrate dehydrate (=Sodium citrate)

[29]- Tryptone

[30]- Agar

[31]- Potato soft rot test

[32]- Hypersensitive reaction

[33]- Geranium

[34]- The Polymerase Chain Reaction

[35]- Gene Bank

[36]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI)

[37]- Phenol red

[38]- Fawcett & Scott

[39]- Phenol/hypochlorite

[40]- Spectrophotometer

[41]- Phenol

[42]- Sodium nitroprosside

[43]- Sodium hypochlorite

[44]- NaOH

[45]- Enterobacteriaceae

[xlvi]- Basha

[xlvii]- Dharmaraj

[xlviii]- Kushwaha

[xlix]- Kamble

[l]- Warangkar

[li]- Merck

[lii]- BioServices Pharmacy Repository, USA.

(1)               Pieters R., Hunger SP., Boos J., Rizzari C., Silverman L., Baruchel A., et al. L‐asparaginase treatment in acute lymphoblastic leukemia. Cancer 2011; 117 (2): 238- 49.

(2)               Pui CH., Relling MV., Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine 2004; 350 (15): 1535- 48.

(3)               Inaba H., Greaves M., Mullighan CG. Acute lymphoblastic leukaemia. The Lancet 2013; 381 (9881): 1943- 55.

(4)               Jabbour E., Thomas D., Cortes J., Kantarjian HM., O'Brien S. Central nervous system prophylaxis in adults with acute lymphoblastic leukemia. Cancer 2010; 116 (10): 2290- 300.

(5)               Can G., Demir M., Erol O., Aydiner A. A comparison of men and women's experiences of chemotherapy-induced alopecia. European Journal of Oncology Nursing 2013; 17 (3): 255- 60.

(6)               Ahmad N., Pandit NP., Maheshwari SK. L-asparaginase gene–a therapeutic approach towards drugs for cancer cell. International Journal of Bioscience 2012; 2 (4): 1- 11.

(7)               Yadav S., Verma SK., Singh J., Kumar A. Industrial production and clinical application of L-asparaginase: A chemotherapeutic agent. Stroke 2014; 76 (1): 41.

(8)               Kamble VP., Rao RS., Borkar PS., Khobragade CN., Dawane BS. Purification of L-asparaginase from a bacteria Erwinia carotovora and effect of a dihydropyrimidine derivative on some of its kinetic parameters. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 2006; 43 (6): 391.

(9)               Elshafei AM., Hassan MM., Abouzeid MAE., Mahmoud DA., Elghonemy DH. Purification, characterization and antitumor activity of L-asparaginase from Penicilliumbrevicompactum NRC 829. British Microbiology Research Journal 2012; 2 (3): 158- 74.

(10)           Amena S., Vishalakshi N., Prabhakar., M., Dayanand A., Lingappa K. Production., purification and characterization of L-asparaginase from Streptomyces gulbargensis. Brazilian Journal of Microbiology 2010; 41 (1): 173- 8.

(11)           Dey SK., Raha SK., Roy SK., Chakrabarty SL. Comparison of Lasparaginasea ctivity in different species of Vibrio. Indian Journal of Medical Research 1988; 88 (1): 398- 403.

(12)           Kornbrust BA., Stringer MA., Lange NK., Hendriksen HV. Asparaginase- an enzyme for acrylamide reduction in food products. Enzymes in Food Technology 2010; 2 (1): 59- 87.

(13)           Rashid M., Chowdhury MSM., Sultana N. In-vitro Screening of some Chemicals and Biocontrol Agents against Erwinia carotovora subsp. carotovora, the Causal Agent of Soft Rotof Potato (Solanum tuberosum). The Agriculturists 2013; 11 (2): 1- 9.

(14)           Sarquis MIDM., Oliveira EMM., Santos AS., Costa GLD. Production of L-asparaginase by filamentous fungi. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 2004; 99 (5): 489- 92.

(15)           Bdliya BS., Langerfeld E., Rudolph K. A modified crystal violet pectate (CVP) medium for detection and isolation of soft rot Erwinia spp. from plant materials. Journal of Plant Diseases and Protection. 2004; 111 (5): 506- 15.

(16)           Diallo S., Latour X., Groboillot A., Smadja B., Copin P., Orange N., et al. Simultaneous and selective detection of two major soft rot pathogens of potato: Pectobacterium atrosepticum (Erwinia carotovora subsp. atrosepticum) and Dickeya spp.(Erwinia chrysanthemi). European journal of plant pathology 2009; 125 (2): 349- 54.

(17)           Leavesley HB., Li L., Prabhakaran K., Borowitz JL., Isom GE. Interaction of cyanide and nitric oxide withcytochrome oxidase: implications for acute cyanide toxicity. Toxicological Sciences 2008; 101 (1): 101- 11.

(18)           Schaad NW., Jones JB., ChunW. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3rd ed. Saint Paul Minnesota United States: American Phytopathological Society; 2001.

(19)           Badoei-Dalfard A., Amiri-Bahrami M., Riahi-Madvar A., Karami Z., Ebrahimi M A. Isolation, identification and characterization of organic solvent tolerant protease from Bacillus sp. DAF-01. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (2): 37- 48.

(20)           Kim OS., Cho YJ., Lee K., Yoon SH., Kim M., Na H., et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent unculturedspecies. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2012; 62 (3): 716- 21.

(21)           Fawcett JK., Scott JE. A rapid and precise method for the determination of urea. Journal of Clinical Pathology. 1960; 13 (2): 156-159.

(22)           Savitri N., Asthana N. Azmi., W. Microbial l-asparaginase a potent antitumour enzyme. Indian Journal of Biotechnology 2002; 2 (2): 184- 94.

(23)           Deokar VD., Vetal MD., Rodrigues L. Production of intracellular l-asparaginase from erwinia carotovora and its statistical optimization using response surface methodology (RSM). International Journal of Applied Chemical Sciences Research 2010; 1 (1): 25- 36.

(24)           Moorthy V., Ramalingam A., Sumantha A., Shankaranaya RT. Production., purification and characterization of extracellular l-asparaginase from a soil isolate of bacillus sp. African Journal of Microbiology Research 2010; 4 (18): 1862- 7.

(25)           Kidd JG. Regression of transplanted lymphomas induced in vivoby means of normal guinea pig serum. The Journal of Experimental Medicine 1953; 98 (6): 565- 81.

(26)           Warangkar SC., Khobragade CN. Purification, characterization, and effect of thiol compounds on activity of the Erwinia carotovora L-asparaginase. Enzyme research 2010; 10 (1): 1- 11.

(27)           Basha NS., Rekha R., Komala M., Ruby S. Production of extracellular anti-leukaemic enzyme l-asparaginase from marin actinomycetes by solid-state and submerged fermentation: purification and characterization. Tropical Journal of Pharmaceutical Research2009; 8 (4): 353- 60.

(28)           Dharmaraj S. Study of l-asparaginase production by stereptomyces noursei MTCC10469, Isolated from marine sponge callyspongia diffusa. Iranian Journal of Biotechnology 2011; 9 (2): 102- 08.

(29)           Kushwaha A., Ahmed F., Singh P. Production and purification of l-asparaginase from bacterial source. International Journal of Pharmacy and Life Sciences2012; 2 (2): 39- 62.

(30)           Gulati R., Saxena RK., Gupta R. A rapid plate assay for screening l-asparaginase producing micro-organisms. Letters in Applied Microbiology 1997; 24 (1): 23- 6.

(31)           Peterson R. E., Ciegler A. L-asparaginase activity by various bacteria. Journal of Missan Researches 1969; 17 (6): 929–930.

(32)           Graham., DC. Taxonomy of the soft rot coliform bacteria. Annual Review of Phytopathology 1964; 2 (1): 13- 42.

(33)           Badoei-Dalfard A., Karami Z., Ramezani-pour N. Gene sequencing, cloning, and expression of the recombinant L-Asparaginase of Pseudomonas aeruginosa SN4 strain in Escherichia coli. Biological Journal of Microorganism 2016; 4 (16):11- 20.

(34)           Badoei-Dalfard A. Purification and characterization of l-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa strain SN004: Production optimization by statistical methods. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 2015:4 (3): 388- 97.

(35)           Badoei-Dalfard A. L-asparaginase production in the pseudomonas pseudoalcaligenes strain JHS-71 isolated from Jooshan Hot-spring. Molecular Biology Research Communications 2016; 5 (1): 1- 10.

(36)           Sinha R., Singh HR., Jha SK. Microbial l-asparaginase: present and future prospective. International Journal of Innovative Research in Science, Engineering and Technology 2013; 2 (11): 2319- 25.

(37)           Kamble V P., Rao RS., Borkar PS., Khobragade CN., Dawane BS. Purification of L-asparaginase from a bacteria Erwinia carotovora and effect of a dihydropyrimidine derivative on some of its kinetic parameters. Indian Journal of Biochemistry and Biophysics 2006;43 (6): 391- 4.

(38)           Warangkar S., Khobragade C. Screening, enrichment and media optimization for L-asparaginase production. Journal of Cell and Tissue Research 2009; 9 (3): 1963-.68.

(39)           Saxena S. Microbial enzymes and their industrial applications. In Applied Microbiology. India:Springer; 2015.