تولید آنزیم L-آسپاراژیناز خارج‌سلولی توسط سویه نمک‌دوست، Vibrio sp.

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکربی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استاد بیوشیمی، دانشگاه تربیت مدرس، ایران

چکیده

مقدمه: L-آسپاراژیناز داروی ضدسرطان است که در شیمی‌درمانی لوسمی لنفوسیتی استفاده می‌شود. امروزه این آنزیم از منابع باکتریایی مشتق شده و اکثراً L-آسپاراژیناز II Escherichia coli و به‌میزان کمتر L-آسپاراژیناز Erwinia sp. استفاده پزشکی دارد. به‌دلیل ایجاد واکنش‌های افزایش حساسیت، پیداکردن و استفاده از آنزیم‌های جدید L- آسپاراژیناز امروزه درخور توجه است. با توجه به شناخت کمتر باکتری‌های نمک‌دوست غربال‌گری این آنزیم در این گروه از باکتری‌ها می‌تواند نتایج مفیدی را به‌همراه داشته باشد‏. ‏‏

مواد و روش‏‏ها: در این مطالعه، آنزیم L-آسپاراژیناز در 130 باکتری نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک دریافت‌شده از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران با استفاده از معرف فنل‌رد غربال شدند. سپس برای سویه منتخب منحنی رشد، سنجش آنزیمی انجام شد و نهایتاً اثر فاکتورهای مختلف بر تولید و فعالیت آنزیم‌ها بررسی شد. ‏‏

نتایج: براساس نتایج به‌دست‌آمده 40 سویه مولد این آنزیم به دست آمد. بیشترین فراوانی جنس باکتریایی تولیدکننده L-آسپاراژیناز، متعلق به جنس Halomonas و Marinobacter بودند که هریک 4/21درصد از کل را به خود اختصاص دادند. در میان سویه‌های تولیدکننده، بیشترین میزان تولید متعلق به سویه GBP­x­3 بود که براساس آنالیز S rRNA16 متعلق به جنس Vibrio بود. شرایط محیط کشت بهینه برای تولید آنزیم در دمای 35 درجه سانتی‌گراد (65/0 IU/ml)، pH 8 (926/0IU/ml) و 5/2درصد NaCl (903/0 IU/ml) به دست آمد و بیشترین میزان فعالیت آنزیم در دمای 35 درجه سانتی‌گراد (781/0 IU/ml)، pH 8 (82/0 IU/ml) و نبودِ NaCl (806/0 IU/ml) تعیین شد. ‏

بحث و نتیجه‏ گیری: این پروژه با هدف غربال‌گری باکتری‌های نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک جداشده از مناطق شور ایران که تولیدکننده آنزیم L-آسپاراژیناز هستند، انجام شده است. از میان سویه‌های مثبت به‌دست‌آمده، سویه منتخب GBP­x­3 از جنس Vibrio به‌عنوان سویه منتخب در تولید آنزیم انتخاب شد که ممکن است دارای L-آسپاراژیناز با اثرات جانبی کمتر برای بیماران باشد.‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Production of extracellular L- asparaginase by halophilic bacterium vibrio sp.

نویسندگان [English]

  • Mahdis Zolfaghar 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Khosro Khajeh 3
1 M.Sc. of Microbial biotechnology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Professor of biochemistry, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: L-Asparaginase is an anti-neoplastic drug used in lymphoblastic leukemia chemotherapy. Nowadays, this enzyme derived from bacterial sources, mostly L-asparaginase II from Escherichia coli and in lesser amount L-asparaginase of Erwinia sp. has medical utilization. The long-term usage of these agents leads to allergic reactions; therefore new
L- asparaginase with new immunological characteristics is required. Halophilic bacteria might contain L-asparaginase with novel immunological properties that can be used in hypersensitive patients.

Materials and methods: In this study, the production of L-asparaginase by 130 halophilic and halotolerant bacteria isolated from saline environments in Iran was screened. Modified M-9 agar medium was used for qualitative analysis. In the selected strain, growth curve plotting, asparaginase activity assay and analysis for the effect of some factors on the production and enzyme activity were done.

Results: 40 strains produced L-asparaginase. Most of L-asparaginase producers were member of genus Halomonas and Marinobacter (21.4%). GBP­x3 is potent bacteria in L-asparaginase production which belonged to Vibrio sp. based on 16S rRNA analysis. Optimized factors for
L-asparaginase production were 350C (0.65 IU/ml), pH 8 (0.926 IU/ml) and 2.5% NaCl (0.903 IU/ml). The highest activity of L-asparaginase was in 350C (0.781 IU/ml), pH 8 (0.82 IU/ml) and without NaCl (0.806 IU/ml).

Discussion and conclusion: The aim of this study was to screen the production of
L-asparaginase through 130 halophilic and halotolerant bacteria which were isolated from saline environments in Iran. The results of this work indicate that the bacterium, Vibrio sp. GBP­x3 displays to be potent for asparaginase production.

کلیدواژه‌ها [English]

  • L-asparaginase
  • halophilic bacteria
  • Vibrio sp
  • Screening

مقدمه.

رشد هجومی و غیرقابل‌کنترل سلول‌ها را سرطان می‌گویند. این سلول‌ها ممکن است به سایر بخش‌های بدن انتشار یابند که به این حالت، متاستاز می‌گویند (1). اگرچه درمان‌های سنتی سرطان شامل عمل جراحی، رادیوتراپی و شیمی‌درمانی در مدیریت بیماری بسیاری از بیماران سرطانی مؤثر است، برای نیمی از سرطان‌ها غیراختصاصی و غیرمؤثر است و اثرات جانبی برای بیماران ایجاد می‌کند؛ بنابراین بهبود، تکمیل و یا جایگزین‌کردن روش‌های سنتی در حال توسعه است (2).

آنزیم‌درمانی، یک روش مؤثر در درمان اختصاصی سرطان است. آنزیم‌ها دارای دو ویژگی مهم هستند که باعث تمایز آن‌ها از سایر انواع داروها می‌شود؛ اول، آنزیم‌ها اغلب با تمایل و اختصاصیت بالا به هدف خود متصل می‌شوند و دوم، مولکول‌هایی واکنش‌گر هستند که مولکول(های) هدف را به محصول مدنظر تبدیل می‌کنند. این دو ویژگی باعث شده است که آنزیم‌ها تبدیل به مولکول‌هایی قوی و اختصاصی شوند به گونه‌ای که مسیرهای درمانی بیوشیمیایی را در بدن انجام دهند که مولکول‌های کوچک‌تر قادر به انجام آن‌ها نیستند. این خصوصیات سبب توسعه بسیاری از داروهای آنزیمی جهت درمان طیف وسیعی از اختلالات از جمله سرطان شده است (3). به‌طور بالقوه، فقر آمینواسیدی به‌عنوان یک روش کارآمد جهت درمان سرطان شناخته شده است. کاهش یک آمینواسید خاص در جریان خون از طریق رژیمی با محتوای آمینواسیدی کم و یا به کارگیری آنزیم‌های کاتابولیکی خاص جهت هیدرولیز آمینواسید موردِنظر، امکان‌پذیر است (4 و 5).

 آنزیم L-آسپاراژیناز یکی از آنزیم‌های مؤثر در درمان لوسمی لنفوسیتی حاد است که برای مدت‌زمان طولانی استفاده شده است. برای اولین بار در سال 1922، مشاهده شد که سرم خوکچه هندی منبع غنی از آنزیم L-آسپاراژیناز است که دارای فعالیت ضدلنفوما است (6 و 7). سوبسترای L-آسپاراژین برای رشد سلول‌های تومور ضروری است که با تزریق آنزیم L-آسپاراژیناز و به دنبال آن هیدرولیز L-آسپاراژین، تراکم آن در مایعات بدن کاهش یافته و درنتیجه سوبسترای لازم برای تکثیر سلول‌های توموری غیرقابلِ‌دسترس می‌شوند. درواقع، سلول‌های نرمال L-آسپاراژین را با استفاده از آنزیم آسپاراژین‌سینتتاز سنتز می‌کنند؛ درحالی‌که سلول‌های توموری به منبع L-آسپاراژین خارجی جهت عملکردهای سلولی نیازمندند؛ زیرا آنزیم سنتزکننده آن را ندارند (8 و 9). می‌توان سوبسترای L-آسپاراژین را که برای رشد سلول‌های توموری مفید است، با تزریق آنزیم L-آسپاراژیناز کاهش داد و بدین ترتیب سوبسترای موردِنیاز برای تکثیر سلول‌های توموری را از دسترس این سلول‌ها خارج کرد.

آسپاراژیناز به‌طور گسترده میان ارگانیسم‌های مختلف جانور، گیاه و منابع میکروبی توزیع شده‌اند. این آنزیم در باکتری‌های Bacillus subtilis  (10)، Corynebacterium glutamicum، Erwinia chrysanthemi  (11)، Serratia marcescens  (12)، Vibrio succinigenes  (13E.coli  (14)و قارچ‌های Aspergillus terreus  (15) و Candida utilis  (16) گزارش شده است. از نظر تجاری، در میان منابع میکروبی Escherichia coli، Erwinia carotovora و Serratia marcescens بیشترین توجه را به خود جلب کرده‌اند (17 و 18) درحالی‌که L-آسپاراژیناز از این منابع میکروبی باعث تحریک سیستم ایمنی بیماران و ایجاد اثرات جانبی می‌شوند. میکروارگانیسم‌هایی که در محیط‌های شور زندگی می‌کنند دارای ویژگی‌هایی متفاوت از ویژگی‌های پروتئین‌های ارگانیسم‌های غیرنمکی هستند؛ به عبارت دیگر پروتئین‌هایی با ساختار تغییریافته هستند که قادرند غلظت‌های زیاد نمک و فعالیت آبی کم را تحمل کنند. فوکوچی[1] و همکارانش نشان دادند که تفاوت محتوای آمینواسیدی میان پروتئین‌های نمک‌دوست و مزوفیلیک یا گرمادوست بیشتر در سطح آن‌هاست تا درون آن‌ها (19)؛ بنابراین باکتری‌های نمک‌دوست ممکن است دارای آنزیم‌هایی با ویژگی‌های ایمونولوژیکی جدید باشند که بتوان آن‌ها را در بیمارهای فوق‌حساس استفاده کرد؛ در نتیجه می‌توانند نسبت به سویه‌های صنعتی کنونی مانند E.coliبرتر باشند.

طبق مطالب گفته‌شده در این پروژه، تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و شرایط بهینه تولید آن از سویه نمک‌دوست (Vibrio sp.) سویه GBPx3 انجام شد. سرعت رشد باکتریایی نیز در محیط سنجش آنزیمی (حاوی L-آسپاراژین) مطالعه شد.

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

سویه‌های باکتریایی و محیط‌های کشت: از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران، 130 سویه نمک‌دوست و تحمل‌کننده نمک که از مناطق شور ایران جداسازی شده‌اند، دریافت شد و در محیط کشت پیچیده MH2.5%[2] آگار محتوی ترکیبات زیر نگه‌داری شدند (گرم در لیتر آب مقطر):

NaCl 20/25، MgCl2 1/75، MgSO4 2/4، CaCl2 0/09، NaHCO3 0/015، NaBr 0/0065، proteose peptone 5، yeast extract 10، Glucose 1، آگار 15. pH محیط نیز توسط باز تریس در 5/7 تنظیم شد.

.محیط کشت حداقل تغییریافته M9  (20) دارای .ترکیبات زیر، برای بررسی تولید L-آسپاراژیناز استفاده شد (گرم در لیتر آب مقطر): KH2 PO43، NaCl 20/25، MgCl2 1/75، MgSO4 2/4، CaCl2 0/09، L-آسپاراژین، فنل رد 07/0، گلوکز 1، آگار 20. pH محیط توسط محلول باز تریس بر 4/7-2/7 تنظیم شد. محلول ذخیره 5/2درصد فنل‌رد در اتانول مطلق تهیه و pH آن توسط باز تریس در 4/7-2/7 تنظیم شد. به‌عنوان کنترل، در محیط کشت M9 تغییریافته به جای آمینواسید L-آسپاراژین، از NaNO3 به عنوان منبع نیتروژن استفاده شد.

برای بررسی فاکتورهای مختلف دما، pH، درصد سدیم‌کلرید و منبع کربن از محیط مایع M9 با ترکیبات گفته‌شده و بدون فنل‌رد استفاده شد.

کلیه ترکیبات استفاده‌شده در این پروژه از شرکت مرک تهیه شده است.

تولید L-آسپاراژیناز: جهت مشاهده و بررسی تولید آنزیم L-آسپاراژیناز، سویه‌ها در محیط کشت جامد M9 (حاوی 5/2درصد غلظت کلی نمک) کشت و در دمای 34 درجه سانتی‌گراد به‌مدت 48 ساعت گرماگذاری شدند. L-آسپاراژیناز طی واکنش خود آمونیاک تولید می‌کنند و آمونیاک باعث افزایش pH می‌شود؛ بنابراین می‌توان از شاخص pH فنل‌رد برای شناسایی میکروارگانیسم‌های تولیدکننده L-آسپاراژیناز استفاده کرد. تولید آنزیم L-آسپاراژیناز با ایجاد و توسعه هاله صورتی‌رنگ اطراف کلنی‌های باکتریایی تعیین می‌شود. در میان سویه‌های تولیدکننده، بیشترین میزان تولید (با تلقیح یکسان) متعلق به سویه GBPx3­ بود که برای مراحل بعدی انتخاب شد.

 

.رسم هم‌زمان منحنی رشد و سنجش آنزیمی: به‌منظور بررسی میزان رشد با تولید آنزیم، ایزوله منتخب در 70 میلی‌لیتر محیط کشت مایع M9 موجود در ارلن 250 میلی‌لیتری تلقیح شد (به میزان 108×5/1 CFU/ml) و در شیکر انکوباتور در دمای 34 درجه سانتی‌گراد و دور 150 rpm گرماگذاری شد. رشد باکتریایی به‌روش اسپکتروفوتومتری در طول‌موج 620 نانومتر اندازه‌گیری شد. هم‌زمان با رسم منحنی رشد، سنجش آنزیمی نیز براساس روش زیر انجام گرفت.

فعالیت L-آسپاراژیناز با استفاده از معرف نسلر اندازه‌گیری شد. فرآیند سنجش برپایه نسلریزاسیون مستقیم آمونیاک تولیدشده توسط L-آسپاراژیناز صورت گرفت. بدین‌منظور، 500 میکرولیتر محلول L-آسپاراژین 10 میلی‌مولار (در بافر تریس-بیس 50 میلی‌مولار، pH 7) و 450 میکرولیتر بافر تریس-بیس 50 میلی‌مولار، pH 7 به 50 میکرولیتر سوپرناتانت اضافه و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد گرماگذاری شد. سپس واکنش آنزیمی با افزودن 500 میکرولیتر محلول تری‌کلرواستیک‌اسید 5درصد (w/v) متوقف و با سانتریفیوژ در rpm 11500× به‌مدت 10 دقیقه، پروتئین‌های رسوبی حذف و از سوپرناتانت آن برای انجام واکنش نسلریزاسیون استفاده شد. به یک میلی‌لیتر سوپرناتانت، یک میلی‌لیتر آب مقطر و 200 میکرولیتر معرف نسلر اضافه شد و پس از 10 دقیقه گرماگذاری در دمای اتاق، جذب آن در طول موج 490 نانومتر خوانده شد. منحنی استاندارد با غلظت‌های مختلف آمونیوم‌سولفات رسم شد (20).

.بررسی اثر فاکتورهای مختلف (pH، دما، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن) بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: برای بررسی فاکتورهای مختلف، از 25 میلی‌لیتر محیط کشت M9 مایع محتوی L-آسپاراژین در ارلن 100میلی‌لیتری استفاده شد. پس از تلقیح (به‌میزان 5درصد نیم مک‌فارلند)، به‌مدت 72 ساعت گرماگذاری و فعالیت آنزیم‌ها با روش نسلریزاسیون اندازه‌گیری شد (21).

اثر دما بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: اثر دما با تلقیح سویه‌ها (به‌میزان 5درصد کدورت نیم مک‌فارلند، 108×5/1 CFU/ml) در محیط کشت M9 که حاوی L-آسپاراژین است و گرماگذاری در دماهای مختلف 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتی‌گراد بررسی شد (21).

اثر pH بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: برای تعیین اثر pH بر تولید، محیط M9 محتوی L-آسپاراژین در pHهای مختلف 5، 6، 7، 8 و 9 تهیه شد و بعد از استریلیزاسیون به‌میزان 5درصد کدورت نیم مک‌فارلند (108×5/1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از 72 ساعت گرماگذاری، فعالیت آنزیمی بررسی شد (21).

اثر درصد NaCl بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: محیط M9 با درصدهای مختلف NaCl، 0، 5/2، 5، 5/7 و 10درصد تهیه شد و به‌میزان 5درصد کدورت نیم مک‌فارلند (108×5/1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از 72 ساعت گرماگذاری، سنجش آنزیمی بررسی شد.

.اثر درصد گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: محیط M9 با درصدهای مختلف گلوکز 1/0، 5/0 و 1درصد تهیه شد و به‌میزان 5درصد کدورت نیم مک‌فارلند، (108×5/ 1 CFU/ml) تلقیح شد. بعد از مدت‌زمان لازم برای گرماگذاری، سنجش آنزیمی آن انجام شد.

اثر منبع کربن بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: منابع کربنی مختلف مانند گلوکز، سوکروز، مالتوز و فروکتوز به‌میزان 5/0درصد در محیط کشت تولیدی اضافه شدند و بعد گرماگذاری شدند. فعالیت آنزیمی توسط سوپرناتانت حاصل از سانتریفیوژ محیط تخمیر اندازه‌گیری شد.

.بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیم: 25 میلی‌لیتر محیط کشت M9 محتوی L-آسپاراژین در ارلن 100 تهیه شد. شایان ذکر است که در اینجا pH، درصد NaCl و گلوکز و دمای گرماگذاری محیط‌های کشت، همان مقادیر بهینه به‌دست‌آمده است. پس از تلقیح به‌میزان 5درصد کدورت نیم مک‌فارلند، به‌مدت 72 ساعت گرماگذاری شد. بعد از گرماگذاری، در دور 4000× به‌مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و از سوپرناتانت جهت سنجش آنزیمی براساس نسلریزاسیون مطابق مراحل گفته‌شده، استفاده شد.

بررسی اثر فاکتور دما بر فعالیت آنزیم: برای بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم پس از مخلوط‌کردن سوپرناتانت، بافر و سوبسترا، از سه دمای 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتی‌گراد جهت گرماگذاری آن استفاده شد.

بررسی اثر فاکتور pH بر فعالیت آنزیم: در اینجا بافر مخلوط (محتوی بافر استات، فسفات و تریس-بیس 50 میلی‌مولار) در محدوده pH 9-5 تهیه شد و همان بافر برای آماده‌سازی محلول سوبسترا به کار برده شد. از هریک از این بافرها برای انجام سنجش آنزیم استفاده شد و میزان آمونیاک به‌وسیله معرف نسلر اندازه‌گیری شد.

بررسی اثر فاکتور درصد NaCl بر فعالیت آنزیم: مخلوط واکنشی آنزیم با درصدهای مختلف نمک 0، 5/2، 5، 5/7 و 10درصد تهیه شد و سپس گرماگذاری و بررسی میزان آمونیاک تولیدشده به‌وسیله معرف نسلر انجام شد.


نتایج.

.تولید L-آسپاراژیناز، بررسی رشد باکتریایی و سنجش آنزیمی: از میان 130 سویه باکتریایی 40 سویه تولیدکننده آنزیم L-آسپاراژیناز تولید شد که بیشترین میزان تولید آنزیم در سویه GBPx3 از جنس Vibrio مشاهده شد. سویه مدنظر نیز در محیط کشت M9 دارای فنل‌رد، پس از 24 ساعت هاله صورتی‌رنگی تولید کرد (شکل 1)

 

 

شکل 1- هاله صورتی ایجادشده نشان‌دهنده تولید L-آسپاراژیناز

 

همان‌طور که در شکل 2 دیده می‌شود، هم‌زمان با رشد سویه، آنزیم نیز تولید می‌شود و در طی فاز لگاریتمی نیز میزان تولید افزایش می‌یابد؛ به‌نحوی‌که فعالیت آنزیمی در انتهای فاز لگاریتمی و فاز سکون به بیشترین میزان خود می‌رسد و بعد ثابت می‌ماند. بیشترین میزان تولید آنزیم 81/0 IU/ml است.

 

 


اثر فاکتورهای دما، pH، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن بر تولید آنزیم: این سویه در محدوده دمایی 40-30 درجه سانتی‌گراد رشد می‌کند و دارای فعالیت آنزیمی است؛ اما دمای ایده­آل برای تولید آنزیم‌ L–آسپاراژیناز 35 درجه سانتی‌گراد است که در این دما فعالیت آنزیمی آن 65/0 IU/ml و رشد 645/0 (A620 nm) بود (شکل 3). pH بهینه برای تولید آنزیم 8 است که در این pH بهینه دارای فعالیت آنزیمی 926/0 IU/ml و جذب در طول موج 620 نانومتر 73/0 بود (شکل 4). این آنزیم در سدیم‌کلرید و گلوکز با درصد به‌ترتیب 5/2 و 5/0 درصد و با منبع کربن ساکاروز بیشترین میزان تولید آنزیم را نشان می‌دهد که به‌ترتیب دارای فعالیت 903/0، 948/0 و 971/0 IU/ml بودند (شکل 5، 6 و 7). سویه بررسی‌شده در صفر درصد سدیم‌کلرید هیچ‌گونه رشدی نداشته است؛ اما در محدوده 5/2 تا 10درصد سیر نزولی رشد و تولید آنزیم را نشان داد.

 

 

شکل 2- منحنی رشد و فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 3- اثر دما بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3 (Vibrio sp.)

 

شکل 4- اثر pH بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 5- اثر درصد سدیم‌کلرید بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 6- اثر درصد گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 


 

 

بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیم‌ها: بیشترین فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز در دمای 35 درجه سانتی‌گراد مشاهده شد و در دماهای 25 و 45 درجه سانتی‌گراد فعالیت آنزیم دیده نشد (شکل 8). pH بهینه فعالیت آنزیم 8 بود که فعالیت آنزیمی آن 82/0 IU/ml بوده است (شکل 9). بهترین شرایط فعالیت آنزیم در محیط بدون نمک بود که در این حالت فعالیت آنزیمی 806/0 IU/ml بود (شکل 10). با افزایش میزان سدیم‌کلرید، فعالیت آنزیمی کاهش یافت که نشان‌دهنده طبیعت هالوتولرانت‌بودن آنزیم است.

 

 

 

شکل 7- اثر منبع کربن بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز و رشد سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 8- اثر دما بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 9- اثر pH بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 

 

شکل 10- اثر درصد NaCl بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز سویه GBPx3  (Vibrio sp.)

 


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

براین‌اساس که آنزیم L-آسپاراژیناز طی واکنش خود آمونیاک تولید می‌کنند و آمونیاک باعث افزایش pH می‌شود می‌توان از شاخص pH برای شناسایی میکروارگانیسم‌های تولیدکننده آن‌ها استفاده کرد. گالتی[iii] و همکاران در سال 1996، یک روش سریع برپایه pH و رنگ (فنل‌رد) جهت بررسی تولید L-اسپاراژیناز توسط میکروارگانیسم‌ها گزارش کردند که نتایج آن با تخمین کمی در محیط مایع هماهنگ بود. در این مطالعه غلظت‌های مختلف فنل‌رد را بررسی کردند و غلظت مناسب رنگ را براساس توانایی رشد میکروارگانیسم و مشخص‌بودن هاله تولید آنزیم گزارش کردند (22). همچنین قاسمی[iv] و همکاران در سال 2008، یک محیط بهینه شده برای بررسی تولید L-آسپاراژیناز Escherichia coli گزارش کردند و طبق نتایج به‌دست‌آمده اعلام کردند که می‌توان از آن در بررسی تولید L-آسپاراژیناز در سایر میکروارگانیسم‌ها (باکتری‌ها و قارچ‌ها) استفاده کرد (23). در این پروژه جهت بررسی سریع و پلیتی L-اسپاراژیناز از شاخص pH فنل‌رد (007/0درصد w/v) استفاده شد که این مقدار از رنگ فنل‌رد باعث ایجاد رنگ زرد-نارنجی شد و درنتیجه تغییر رنگ محیط در اثر تولید آنزیم قابلِ‌تشخیص است؛ در دو گزارش ذکرشده نیز از همین میزان فنل‌رد در محیط استفاده شده است. محیط M9 دارای ترکیب KH2PO4 و K2HPO4، به‌عنوان عوامل بافری است اما در این پروژه K2HPO4حذف شد زیرا با حذف آن خاصیت بافری محیط کاهش یافت و درنتیجه مقادیر کم آمونیاک در محیط قابلِ‌تشخیص بود؛ قاسمی و همکاران نیز در گزارش خود به این نتیجه رسیده بودند (23). دیستاسیو[v] و همکاران در سال 1976، L-آسپاراژیناز را از باکتری بی‌هوازی Vibrio succinogenes روده گاو جداسازی و تخلیص کردند؛ این آنزیم فاقد فعالیت گلوتامینازی بود (13، 24 و 25). تاکنون آنزیم L-آسپاراژیناز از تعدادی باکتری از جنس Pseudomonas sp. یافت و بعضی از آن‌ها تخلیص شده است؛ مانند Pseudomonas aeruginosa (26)، Pseudomonas stutzeri MB-405  (27Pseudomonas acidovorans. (28).

آلبانس[vi] و همکاران در سال 1978 گزارش کردند که Vibrio succinogenesدر طول مرحله رشد لگاریتمی و ابتدای فاز سکون آنزیم L-آسپاراژیناز را تولید می‌کند (29). در این پژوهش نیز تولید آنزیم L-آسپاراژیناز از سویه بررسی‌شده، در طی فاز لگاریتمی افزایش یافت و در فاز سکون به حداکثر میزان تولید خود رسید.

.بررسی اثر فاکتورهای مختلف (pH، دما، درصد NaCl، درصد گلوکز و منبع کربن) بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز: طبق نتایج به‌دست‌آمده مشخص شد که دما، pH، درصد NaCl و منبع کربن مناسب برای تولید حداکثر میزان آنزیم همان میزانی هستند که برای رشد بهینه سویه، نیاز است؛ چراکه با حداکثر میزان بیومس تولیدشده، مقدار تولید آنزیم نیز افزایش می‌یابد. همان‌طور که در نمودارها نیز نشان داده شده است، در شرایطی که بیشترین میزان جذب در 620 نانومتر وجود داشت، بیشترین میزان تولید آنزیم‌ها نیز دیده شد. آلبانس و همکاران در سال 1978، در طی بررسی اثر ترکیبات محیط کشت در رشد و تولید L-آسپاراژیناز از Vibrio succinogenes، pH محیط را 4/7 در نظر گرفتند. مهاجا[vii] و همکاران در سال 2012، با بررسی اثر فاکتورهای مختلف بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز در Bacillus licheniformisبه این نتیجه رسیدند که در pH 6 و دمای 37 درجه سانتی‌گراد بیشترین میزان تولید آنزیم وجود دارد (البته تولید آنزیم در دماهای 50-35 درجه سانتی‌گراد وجود داشت) و تغییرات میزان NaCl (0/25-1/25 g/l) اثری بر تولید آنزیم نگذاشته است (30). بهترین pH برای حداکثر میزان تولید آنزیم L-آسپاراژیناز توسط Staphylococcus، 5/7 بود (31). مورسی[viii] و همکاران در سال 2010، دمای 37 درجه سانتی‌گراد را دمای بهینه تولید L-آسپاراژیناز از سویه از جنس Bacillusگزارش کرد (32)؛ درحالی‌که pH و دمای بهینه برای E.coli  (33Erwinia carotovora (34)، به‌ترتیب 7 و 37 درجه سانتی‌گراد بود. جنینگس[ix] و همکاران در سال 1989 نشان دادند که ژن ansB (کدکننده آنزیم L-آسپارزیناز II) در E.coliرا پروتئین فعال‌کننده کاتابولیت[x] (CAP) (پروتئین پذیرنده AMP حلقوی[xi] نیز نامیده می‌شود) تنظیم می‌کند. مقادیر کم گلوکز درون‌سلولی باعث افزایش سطح AMP حلقوی و به دنبال آن افزایش کمپلکس AMP حلقوی-CAP می‌شود. این کمپلکس به یک جایگاه اختصاصی بر DNA که در مجاورت پروموتور ژن‌های تنظیم‌شونده توسط CAP قرار دارد متصل می‌شود و اتصال 70σRNA پلی‌مراز را افزایش می‌دهد و بدین ترتیب باعث افزایش بیان ژن می‌شود؛ بنابراین گلوکز در E.coliیک مهارکننده برای ژن ansB است (35)؛ اما در این پژوهش، میزان تولید L-آسپاراژیناز توسط سویه موردِنظر در غلظت 5/0درصد گلوکز بیش از غلظت 1/0درصد بود ولی غلظت 1درصد بر تولید آنزیم اثر مهاری داشت. پرما[xii] و همکاران در سال 2013 طی بررسی اثر غلظت‌های مختلف گلوکز بر تولید آنزیم L-آسپاراژیناز از سویه‌های موتانت و وحشی Pseudomonas fluorescensنتیجه گرفتند که غلظت 1درصد گلوکز باعث مهار کلی فعالیت آنزیم می‌شود درحالی‌که غلظت 1/0درصد اثر تحریکی کمی بر تولید این آنزیم دارد (36).

بررسی اثر فاکتورهای مختلف دما، pH و درصد NaCl بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز: به دلیل خارج‌سلولی‌بودن آنزیم‌های بررسی‌شده، از سوپرناتانت محیط‌های تلقیح‌شده با سویه مثبت برای بررسی اثر فاکتورهای مختلف بر فعالیت آنزیم‌ها استفاده شد.

دیستاسیو و همکاران در سال 1976، pH بهینه فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز Vibrio succinogenesرا 3/7 گزارش کردند (24). کوشواها[xiii] و همکاران در سال 2012، اثر فاکتورهای مختلف pH و دما را بر فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز از سویه منتخب A2 که به‌عنوان Bacillus subtilisشناخته شده بود، بررسی کردند. این آنزیم در دامنه pH 9-7 و دمای 50-25 درجه سانتی‌گراد دارای فعالیت آنزیمی بود؛ اما بیشترین میزان فعالیت آنزیم در pH 7 با فعالیت آنزیمی 436/0 IU/mg و دمای 37 درجه سانتی‌گراد با فعالیت آنزیمی 44/0 IU/mg بود (37). طبق گزارشات قبلی دمای بهینه برای فعالیت آنزیم L-آسپاراژیناز از E.coli، Bacillus sp.، E.coliپاتوژنیک و Aspergillus terreus 37 درجه سانتی‌گراد است (38 و 39). در این پژوهش، L-آسپاراژیناز از سویه نمک‌دوست بررسی‌شده دارای دمای بهینه 35 درجه سانتی‌گراد و pH بهینه 8 بود؛ بیشترین میزان فعالیت در نبود NaCl بود ولی با افزایش غلظت نمک در مخلوط واکنشی، میزان فعالیت کاهش یافت که نشان از این است که این آنزیم تحمل‌کننده NaCl است.

محیط‌های شور، دارای انواع وسیعی از میکروارگانیسم‌ها با ویژگی‌های نوین بیوتکنولوژیک هستند. نتایج این پروژه نشان می‌دهد که باکتری Vibrio sp. GBPx3 از نظر تولید آنزیم ضدتومور L-آسپاراژیناز توانمند است؛ بنابراین برای ادامه پژوهش‌ها به آن توجه شده است.



[1]- Fukuchi

[2]- Moderate halophilic

[iii]- Gulti

[iv]- Ghasemi

[v]- Distasio

[vi]- Albanese

[vii]- Mahaja

[viii]- Moorthy

[ix]- Jennings

[x]- Catabolite activator protein

[xi]- Cyclic AMP receptor protein

[xii]- Perma

[xiii]- Kushwaha

(1)               Patyar S., Joshi R., Byrav DP., Prakash A., Medhi B., Das B. Review Bacteria in cancer therapy: a novel experimental strategy. Journal Biomedical Science 2010; 17 (1): 21- 30.

(2)               Ciardiello F., Tortora G. A novel approach in the treatment of cancer: targeting the epidermal growth factor receptor. Clinical Cancer Research 2001; 7 (10): 2958- 70.

(3)               Vellard M. The enzyme as drug: application of enzymes as pharmaceuticals. Current opinion in biotechnology 2003; 14 (4): 444- 50.

(4)               Vynnytska-Myronovska B., Kurlishchuk Y., Bobak Y., Dittfeld C., Kunz-Schughart LA., Stasyk O. Three-dimensional environment renders cancer cells profoundly less susceptible to a single amino acid starvation. Amino acids 2013; 45 (5): 1221- 30.

(5)               Cantor JR., Panayiotou V., Agnello G., Georgiou G., Stone EM. Engineering reduced-immunogenicity enzymes for amino acid depletion therapy in cancer. Methods Enzymology 2012; 502 (29): 291- 319.

(6)               Clementi A. La Désamidation Enzymatique De L'asparagine Chez Les Différentes Espéces Animales Et La Signification Physio Logique De Sa Presence Dans L'organisme. Archives of Physiology and Biochemistry 1922; 19 (4): 369- 98.

(7)               Broome J. Evidence that the L-asparaginase activity of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects. Nature 1961; 191 (11): 1114 - 15.

(8)               Hill JM., Roberts J., Loeb E., Khan A., MacLellan A., Hill RW. L-asparaginase therapy for leukemia and other malignant neoplasms: remission in human leukemia. Jama 1967; 202 (9): 882- 8.

(9)               Broome J. Evidence that the L-asparaginase of guinea pig serum is responsible for its antilymphoma effects II. Lymphoma 6C3HED cells cultured in a medium devoid of L-asparagine lose their susceptibility to the effects of guinea pig serum in vivo. The Journal of experimental medicine 1963; 118 (1): 121- 48.

(10)           Fisher SH., Wray LV. Bacillus subtilis 168 contains two differentially regulated genes encoding L-asparaginase. Journal of bacteriology 2002; 184 (8): 2148- 54.

(11)           Aghaiypour K., Wlodawer A., Lubkowski J. Structural basis for the activity and substrate specificity of Erwinia chrysanthemi L-asparaginase. Biochemistry 2000; 40 (19): 64- 5655.

(12)           Stern ML., Phillips AW., Gottlieb AJ. Physical properties of L-asparaginase from Serratia marcescens. Journal of bacteriology 1976; 125 (2): 719- 27.

(13)           Distasio JA., Salazar AM., Nadji M., Durden DL. Glutaminase-free asparaginase from vibriosuccinogenes: An antilymphoma enzyme lacking hepatotoxicity. International Journal of Cancer 1982; 30 (3): 343- 7.

(14)           Campbell H., Mashburn L., Boyse E., Old L. Two L-Asparaginases from Escherichia coli B. Their Separation, Purification, and Antitumor Activity. Biochemistry 1967; 6 (3): 721- 30.

(15)           de-Angeli LC., Pocchiari F., Russi S., Tonolo A., Zurita VE., Ciaranfi E., et al. Effect of L-asparaginase from Aspergillus terreus on ascites sarcoma in the rat. Nature 1970; 225 (54): 9- 550.

(16)           Kil J-O., Kim G-N., Park I. Extraction of extracellular L-asparaginase from Candida utilis. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 1995; 59 (4): 749- 50.

(17)           Howard JB., Carpenter FH. L-asparaginase from Erwinia carotovora substrate specificity and enzymatic properties. Journal of Biological Chemistry 1972; (4) 247: 102- 30.

(18)                Heinemann B., Howard AJ. Production of tumor-inhibitory L-asparaginase by submerged growth of Serratia marcescens. Applied microbiology 1969; 18 (4): 550- 4.

(19)           Fukuchi S., Yoshimune K., Wakayama M., Moriguchi M., Nishikawa K. Unique amino acid composition of proteins in halophilic bacteria. Journal of molecular biology 2003; 327 (2): 347- 57.

(20)           Upadhyay R., Saxena A., Kango N. screening and production of tumour inhibitory l-asparaginase by bacteria isolated from soil. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research 2012; 5 (12): 135- 7.

(21)           Kavitha A., Vijayalakshmi M. A Study on L-Asparaginase of Nocardia levis MK-VL_113. The Scientific World Journal 2012; 1604 (34): 33- 493.

(22)           Gulati R., Saxena R., Gupta R. A rapid plate assay for screening l‐asparaginase producing micro‐organisms. Letters in applied microbiology 1997; 24 (1): 23- 6.

(23)           Ghasemi Y., Ebrahimzadeh A.R, Rasool-Amini S., Zarrini Gh.R, Ghoshoon MB., Raee MJ., et al. An Optimized Medium for Screening of L-Asparaginase production by Escherichia coli. American Journal of Biochemistry and Biotechnology 2008; 4 (4): 422- 4.

(24)           Distasio JA., Niederman RA., Kafkewitz D., Goodman D. Purification and characterization of L-asparaginase with anti-lymphoma activity from Vibrio succinogenes. Journal of Biological Chemistry 1976; 251 (22): 6929- 33.

(25)           Kafkewitz D., Goodman D. L-Asparaginase production by the rumen anaerobe Vibrio succinogenes. Applied microbiology 1974; 27 (1): 206- 9.

(26)           El-Bessoumy AA., Sarhan M., Mansour J. Production, isolation, and purification of L-asparaginase from Pseudomonas aeruginosa 50071 using solid-state fermentation. Journal of biochemistry and molecular biology 2004; 37 (4): 387- 93.

(27)           Manna S., Sinha A., Sadhukhan R., Chakrabarty S. Purification, characterization and antitumor activity of L-asparaginase isolated from Pseudomonas stutzeri MB-405. Current microbiology 1995; 30 (5): 291- 8.

(28)           Davidson L., Brear DR., Wingard P., Hawkins J., Kitto GB. Purification and properties of L-glutaminase-L-asparaginase from Pseudomonas acidovorans. Journalof bacteriology 1977; 129 (3): 1379- 86.

(29)           Albanese E., Kafkewitz K. Effect of medium composition on the growth and asparaginase production of Vibrio succinogenes. Applied and environmental microbiology 1978; 36 (1): 25- 30.

(30)           Mahajan RV., Saran S., Kameswaran K., Kumar V., Saxena R. Efficient production of l-asparaginase from Bacillus licheniformis with low-glutaminase activity: Optimization, scale up and acrylamide degradation studies. Bioresource technology 2012; 12 (5): 11- 6.

(31)           Prakasham R., Rao C., Rao RS., Lakshmi GS., Sarma P. l‐asparaginase production by isolated Staphylococcus sp.–6A: design of experiment considering interaction effect for process parameter optimization. Journal of applied microbiology 2007; 102 (5): 1382- 91.

(32)           Moorthy V., Ramalingam A., Sumantha A., Shankaranaya RT. Production, purification and characterisation of extracellular L-asparaginase from a soil isolate of Bacillus sp. African Journal of Microbiology Research 2010; 4 (18): 1862- 7.

(33)           Kenari SLD., Alemzadeh I., Maghsodi V. Production of l-asparaginase from Escherichia coli ATCC 11303: Optimization by response surface methodology. Food and Bioproducts Processing 2011; 89 (4): 315- 21.

(34)           Abbas MA., Askar SN. Production, Purification and characterization of extracellular L-Asparaginase from Erwinia Carotovora. International Journal of Bioassays 2014; 3 (12): 3553- 9.

(35)           Jennings MP., Beacham IR. Analysis of the Escherichia coli gene encoding L-asparaginase II, ansB, and its regulation by cyclic AMP receptor and FNR proteins. Journal of bacteriology 1990; 172 (3): 1491- 8.

(36)           Prema P., Devi MN., Alagumanikumaran N. production of tumor inhibitory L-asparaginase by wild and mutant strains of Psuedomonas fluorescens.Manuscript Info Abstract.  International Journal 2013; 1 (4): 163- 71.

(37)           Kushwaha A., Ahmed F. Jayanand and Pushpendra Singh. Production and Purification of L-Asparaginase from bacterial sources. International Journal of Universal Pharmacy and Life Sciences 2012; 132 (12): 34- 82.

(38)           Li L-Z., Xie T-H., Li H-J., Qing C., Zhang G-M., Sun M-S. Enhancing the thermostability of Escherichia coli l-asparaginase II by substitution with pro in predicted hydrogen-bonded turn structures. Enzyme and microbial technology 2007; 41 (4): 523- 7.

(39)           Aljewari HS., Nader MI., Alfaisal AHM., Weerapreeyakul N., Sahapat S. High efficiency, selectivity against cancer cell line of purified L-asparaginase from pathogenic Escherichia coli. World Academy of Science, Engineering and Technology 2010; 65: 416- 21.