تراریختی ریسه‌های قارچ چربی‌ساز alpina Mortierella با استفاده از سیستم تراریختی AMT (Agrobacterium Mediated Transformation)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 استادیار زیست‌شناسی سلولی و مولکولی، پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک و زیست فناوری، تهران، ایران

3 دانشیار بیوتکنولوژی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: قارچ رشته‌ای Mortierella alpina منبع غنی از اسیدهای چرب غیراشباع به‌خصوص آراشیدونیک اسید است. این ماده پیش‌ساز تولید تعدادی از ایکوزانوئید‌هاست که در رئولوژی خون، فعال‌سازی پلاکت‌ها و عملکرد لوکوسیت‌ها و ویژگی‌های عملکردی غشای سلولی نقش دارد. ‏‏

مواد و روش‏‏ ها: در این مطالعه انتقال ژن بتا گلوکورونیداز به قارچ M. alpina CBS754/68 با استفاده از باکتری‌های Agrobacterium rhizogenes  و Agrobacterium tumefaciens  بررسی شد. باکتری‌های حاوی ناقلpBI121  برای تراریختی ریسه‌های قارچ استفاده شد. ریسه‌های سه روزه با سه تیمار یک، دو و سه ساعت در معرض قرارگیری سلول‌های باکتری در حضور استوسیرینگون به‌عنوان بافت هدف استفاده شد. پایداری میتوزی تراژن تا نسل سوم (T2) در قارچ‌های تراریخت با استفاده از رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز بررسی شد. ‏‏

نتایج: نتایج نشان داد بیشترین درصد تراریختی مربوط به باکتری A. tumefaciens و بیشترین پایداری میتوزی در تراریخت‌های حاصل از کاربرد A. rhizogenes است. ‏

بحث و نتیجه‏ گیری: نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که برای حصول نتیجه با بازده تراریختی بیشتر و پایدارتر استفاده از گونه مناسب Agrobacterium  فاکتوری اساسی است. نوع گونه و سویه قارچ و شرایط آزمایش در انتقال ژن به این روش بسیار مؤثر است. این اولین گزارش برای تراریختی قارچ اتوتروف M. alpina  با استفاده از Agrobacterium است. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Transformation of Mortierella alpina (fatty acid supplier) myceliums via AMT system (Agrobacterium Mediated Transformation)

نویسندگان [English]

  • Aida Javanmard 1
  • Forough Sanjarian 2
  • Zohre Hamidy 3
1 M.Sc. of Agricultural biotechnology, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
2 Assistant Professor of Cellular and Molecular biology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Tehran, Iran
3 Associate Professor of Biotechnology, Tarbiat Modares University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Mortierella alpina is one of the most important fungi in food industry because of having ability of synthesizing unsaturated fatty acids, particularly Arashidonic Acid. This is a precursor of Eicosanoidregulate-lipoprotein metabolism which is involved in blood rheology, platelet activation and leukocyte-function, and the functional characteristics of the cell membrane.

Materials and methods: In this study genetic transformation of M. alpina CBS754.68 fungus was evaluated via Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. Agrobacteriums containing pBI121 vector were used for transformation of three days of old mycelia. Three days old hyphae were exposed to the bacteria with three level of time (one, two and three hours) in the present of acetosyringone. Mitotic stability of the third generation of transgenic (T2) was confirmed by GUS assay and amplification of CaMV 35S promoter by polymerase chain reaction.

Results: The highest percentage of transformation and mitotic stability were obtained by using A. tumefaciens and A. rhizogenese, respectively.

Discussion and conclusion: The results showed that to obtain more efficient and more stable transformation, the fundamental factor is the use of suitable species of Agrobacterium. It is the first report for transformation of autothroph strain of M. alpine via Agrobacterium.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Agrobacterium
  • Mortierella alpina
  • GUS assay
  • Transformation
  • Genetic stability

مقدمه.

قارچ‌ها جزء یوکاریوت‌های پستی هستند که فضای امیدبخشی را در پژوهش‌های زیست‌فناوری ایجاد کرده‌اند. این موجودات به‌ دلیل داشتن ویژگی رشد خوب در محیط‌های متفاوت، پژوهش‌های بسیاری را به خود جلب کرده است (1- 2). امروزه از قارچ‌ها به‌شکل گسترده‌ای در صنعت کشاورزی و پزشکی استفاده می‌شود که این امر مرهون قابلیت این موجودات در سنتز آنزیم‌های تک‌یاخته‌ای، انواع اسیدهای آلی، پروتئین و روغن‌های تک‌سلولی[1] است (3- 4).

قارچ Mortierella alpina قارچی رشته‌ای، خاکزی و از راسته زیگومیست‌ها[2] است که منبع مهم و سرشاری از انواع اسیدهای چرب غیراشباع به‌ویژه آراشیدونیک اسید است (5). آراشیدونیک اسید میکروبی از سال 1998 در فرمول غذایی کودک در استرالیا و نیوزلند استفاده می‌شد. در برخی از کشورهای اروپایی نیز از سال 1994 در فرمول غذای کودک اضافه شد. در سال 2001 تا 17درصد فرمول غذای کودک آراشیدونیک اسید میکروبی استفاده می‌شد که در مدت 6 ماه به‌حدود 78درصد رسید (6). کارلسون[3] و همکاران در سال 1993 پیشنهاد دادند که آراشیدونیک اسید بهبود رشد کودکان نارس در سال اول زندگی‌شان را به دنبال دارد (7).

تاکنون روش‌های مختلف تراریختی از جمله تراریختی پروتوپلاست قارچی، استفاده از تفنگ ژنی، تیمار با لیتیوم استات، الکتروپوریشن و استفاده از Agrobacterium در قارچ‌ها به کار برده شده است (8- 16). ویژگی‌های بارز تراریختی با واسطه Agrobacterium از این قرار است: بازده بالای تراریختی، پایین‌بودن هزینه تراریختی و قابلیت استفاده از بافت‌های هدف مختلف (17). تراریختی مخمر Sacharomyces cerevisaeبا کمک A. tumefaciens در سال 1995 بانداک[4] و همکاران گزارش شد (18). گووکا[5] و همکاران نیز در سال 1999 تراریختی‌های موفقی را در قارچ‌های رشته‌ای توسط A. tumefaciensگزارش کرده‌اند(18 و 19). اولین گزارش تراریختی قارچ رشته‌ای با استفاده از A. rhizogenes توسط وی[6] و همکارانش در سال 2010 ارایه شد (20).

 با توجه به بررسی مطالعات پیشین هدف از اجرای این پژوهش، بررسی و معرفی روشی با بازده بالا و کم‌هزینه جهت تراریختی قارچ M. alpina بود. به این منظور با استفاده از باکتری‌های A. tumefaciens و A. rhizogenes، میسلیوم‌های قارچ تراریخت شدند و بازده تراریختی و پایداری میتوزی بررسی و مقایسه شد.

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

در این پژوهش از قارچ 754/68 alpina CBS M. که از مجموعه میکروبی کشور هلند به‌صورت میسیلیوم در لوله آزمایش شیب‌دار خریداری شده بود و از باکتری‌های A. rhizogenes سویه ATCC15834 و A. tumefaciens سویه LBA4404 که هر دو حاوی ناقل pBI121 بودند استفاده شد.

به‌منظور شناسایی نشانگر مناسب برای تراریختی قارچ چهار نشانگر، آنتی بیوتیک کانامایسین و هیگرومایسین B با غلظت‌های 50 تا 400 میلی‌گرم بر میلی‌لیتر، سنجش فلوروسنت داخلی (بررسی میسیلیوم‌های قارچی زیر میکروسکوپ فلوروسنت) و ژن نشانگر gus بررسی شد.

جهت تراریختی این قارچ از محیط‌های کشت القا[7] و هم کشتی[8] (16)، برای رشد و نگهداری قارچ از محیط کشت مالت اکسترکت آگار و برای رشد باکتری‌ها از محیط کشت Luria-Bertani استفاده شد.

جهت شناسایی بهترین سن ریسه برای تراریختی از ریسه‌های 1، 3 و 6 روزه استفاده شد. برای القای تراریختی قارچ توسط باکتری از محیط کشت القا استفاده شد. اجزای این محیط کشت عبارت بودند از (16):

(10 mM K2HPO4, 2.5 mM NaCl, 10mMKH2PO4, 2mMMgSO4.7H2O, 0.7mM CaCl2, 9 μM FeSO4.7H2O, 4 mM (NH4)2SO4, 10 mM glucose, 0.5% glycerol (w/v), 200 μM acetosyringone, 40 mM 2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid (MES), pH:5.3 )

 

محیط کشت هم کشتی دارای اجزایی تقریباً مشابه با محیط کشت القاء بود؛ با این تفاوت که مقدار گلوکز از 10 میلی‌مولار به 5 میلی‌مولار تقلیل یافته بود و 5/1درصد آگار برای ایجاد محیط کشت جامد به آن افزوده شده بود (16).

از محیط کشت مالت اکسترکت آگار حاوی 200 ماکرومولار آنتی‌بیوتیک سفوتاکسیم[9] برای حذف سلول‌های باکتریایی استفاده شد.

برای تهیه سلول‌های قارچی موردنیاز جهت تراریختی 3 روز پس از کشت سویه قارچی، به کمک لوپ، ریسه‌های قارچی از روی محیط کشت مالت اکسترکت آگار جمع‌آوری شد و در دو و نیم میلی‌لیتر آب مقطر استریل محلول شد. به هر 10 میلی‌لیتر محیط کشت القاء 100 ماکرولیتر سلول‌های باکتریای تازه از کشت شبانه (OD660=0.6) و 100 ماکرولیتر از سوسپانسیون سلول‌های قارچی اضافه شد. استوسیرنگون در این محیط کشت به‌منظور فعال‌سازی ژن‌های vir باکتریایی اضافه شد.

سپس محیط کشت در شیکر انکوباتور با دمای 27 درجه سانتی‌گراد و سرعت 150 دور در دقیقه نگهداری شد. پس از طی تیمارهای 1، ۲ و 3 ساعته محیط کشت القاء به‌مدت 3 دقیقه با دور 4000 در دمای اتاق سانتریفوژ شد. 7 میلی لیتر از مایع رویی بیرون ریخته شد و مابقی به محیط کشت هم کشتی که سطح آن با فیلترهای غشایی پوشانده شده بود، منتقل شد. مخلوط سوسپانسیون سلول‌های قارچی و باکتریایی به‌مدت 5 روز در این محیط و در انکوباتور 25 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. سپس جهت جلوگیری از رشد سلول‌های باکتریایی، فیلترهای غشایی به محیط کشت انتخاب‌گر مالت اکسترکت آگار حاوی سفوتاکسیم منتقل شدند که این عمل 4 تا 5 بار به فواصل یک تا دو روز تکرار شد. پس از گذشت حدود 7 روز از ظاهرشدن کلونی‌های قارچی و با اطمینان از نابودی تمام سلول‌های باکتریای از طریق مشاهده زیر میکروسکوپ و کشت دوباره در محیط کشت بدون آنتی‌بیوتیک و رشدنکردن سلول‌های باکتری در روی محیط کشت، رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS با جداکردن قسمتی از کلونی‌های قارچی رشدکرده انجام شد و در محلول رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS در تاریکی به‌مدت 5 تا 7 روز قرار داده شد (21). با به‌دست‌آوردن نسبت تعداد کلونی‌هایی که به آزمون GUS جواب مثبت داده بودند به کل کلونی‌های رشدکرده، راندمان تراریختی به دست آمد. به‌طور تصادفی از قارچ‌هایی که بیان ژن gus  در آن‌ها مثبت بود هشت کلونی انتخاب و استخراج DNA به‌روش صفایی و همکاران[10] در سال 1384 انجام گرفت (22). این DNA جهت آزمون PCR استفاده شد. آزمون واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای[11] پیش‌برنده و معکوس برای راه‌انداز[12] انجام گرفت. اثبات وجود این راه‌انداز در قارچ، درواقع اثبات ورود قطعه خارجی به قارچ و تراریخت‌شدن آن است.

توالی آغازگر برای راه‌انداز CaMV 35S عبارت بودند از: آغازگر پیش‌برنده

5′ GCTCCTACAAATGCCATCA 3′

و آغازگر معکوس

 5′ GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA 3′

شرایط دمایی واکنش PCR عبارت بود از واسرشت‌سازی 94 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه، اتصال 64 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه و طویل‌شدن 72 درجه سانتی‌گراد یک دقیقه که 30 سیکل تکرار می‌شد.

به‌منظور بررسی میزان پایداری ژنتیکی در کلونی‌های قارچی تراریخت 10 روز پس از کشت در محیط کشت مالت اکسترکت آگار جدید بار دیگر آزمون رنگ‌آمیزی هیستوشیمیایی GUS بر روی قارچ‌های تراریخت انجام گرفت. ورود و بیان ژن خارجی gus با این رنگ‌آمیزی اثبات می‌شود. با بررسی تعداد کلونی‌های قارچ‌هایی که تغییر رنگ داده بودند نسبت به تعداد کل کلونی‌های آزمون‌شده هیستوشیمیایی، میزان پایداری میتوزی ژنتیکی برآورد می‌شد. این آزمون برای نسل T2 نیز تکرار شد.

 

 

نتایج.

مقایسه میزان رشد میسلیوم‌های قارچی در محیط‌های کشت حاوی کانامایسین و هیگرو مایسین B نشان داد که هیچ‌کدام از این آنتی‌بیوتیک‌ها، اثر بازدارنده‌ای بر روی رشد قارچ ندارند. بررسی میسیلیوم‌های قارچی زیر میکروسکوپ فلوروسنت، وجود میزان زیادی از فلوروسنت داخلی را در تیپ وحشی این قارچ نشان داد که این امکان استفاده از ژن gfp به‌عنوان ژن گزارشگر را سلب می‌کرد (شکل 1).

 

 

شکل 1- میزان بیان بالای فلورسنت داخلی در تیپ وحشی قارچ M. alpinaسویه CBS 754/68

 

شکل 2- مقایسه بافت قارچی تراریخت A) و غیرتراریخت (B) M. alpina در پاسخ به رنگ‌آمیزی هیستو شیمیایی GUS

 

 

با مقایسه نشانگرهای آزمون‌شده ژن نشانگر gus  برای تراریختی این قارچ انتخاب شد)شکل 2).

در بررسی سن مناسب ریسه برای تراریختی، نتایج نشان از مناسب‌بودن ریسه 3روزه بود. زیرا با توجه به رشد اندک میسیلیوم‌ها بر روی محیط کشت در روز اول جداسازی میسیلیوم‌های قارچی امکان‌پذیر نبود و در قارچ‌های 6روزه پلیت قارچی تشکیل‌شده پس از جدایی از محیط کشت به‌سختی در آب استریل از هم جدا می‌شد و سلول‌های قارچی اغلب به‌صورت توده‌ای به‌هم‌پیوسته بودند که بی‌تردید بر روی انتقال ژن به‌طور مستقیم بر روی تک‌تک سلول‌های قارچی اثر عکس به جا می‌گذاشت. جداسازی سلول‌های میسیلیومی 3روزه از هم، با ورتکس شدید راحت‌تر انجام می‌گرفت و سوسپانسیون سلولی مناسب‌تر و یکنواخت‌تری را ایجاد می‌کرد. به‌این‌ترتیب، تک‌ریسه‌های سه‌روزه با باکتری دارای پلاسمید pBI121 تراریخت شد و بیان ژن gus در کلونی‌های رشدیافته از تک‌ریسه تراریخت، ارزیابی شد (شکل 3).

 بررسی داده‌های به‌دست‌آمده از آزمایش مدت‌زمان القا و نوع باکتری (جدول 1) به‌وضوح بیانگر این نکته بود که مدت‌زمان القای سلول‌های قارچی بااگرو باکتریوم به‌میزان زیادی بر روی فراوانی سلول‏های تراریخت اثرگذار است؛ به این دلیل که استوسیرینگون اضافه‌شده به محیط کشت القا بر ژن‏های vir باکتری تأثیر مستقیم دارد و درنهایت باعث افزایش بازده تراریختی می‌شود (جدول 1).

راندمان تراریختی در هنگام استفاده از
A. tumefaciens بیش از A. rhizogenesبود؛ اما پایداری میتوزی تراریخت‌های حاصل از A. rhizogenesبیش از تراریخت‌های حاصل از A. tumefaciensبود (جدول 1).

با مشاهده باند موردنظر ( قطعه 200 جفت بازی) در نتایج آزمون زنجیره‌ای پلیمراز انجام‌شده با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز CaMV 35S  بر روی هشت کلونی منتخب، انتقال ژن gus را در سطح مولکولی تأیید کرد (شکل 4).

 

 

شکل 3- عکس میکروسکوپی تک‌ریسه (10X) بافت قارچی تراریخت M. alpina با پلاسمید pBI121 حاوی ژن gus

 

 

جدول 1- اثر نوع باکتری و مدت‌زمان تیمار بر روی درصد تراریختی و اثر نوع باکتری بر روی پایداری میتوزی

تیمار

درصد تراریختی

پایداری میتوزی نسل 2

پایداری میتوزی نسل 3

باکتری

مدت‌زمان القا (ساعت)

A. tumefacines

1

4درصد

 

 

2

20درصد

20درصد

35درصد

3

70درصد

 

 

A. rhizogenese

1

0درصد

 

 

2

5درصد

55درصد

70درصد

3

47درصد

 

 

شکل 4- محصولات PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی راه‌انداز CaMV 35S از ژنومقارچ M. alpina. M: 1Kb ladder (Fermentas). 1: کنترل مثبت (ناقل(pBI121،2 و 7: قارچ M. alpina غیرتراریخت بدون بیان ژنgus، 4-6: قارچ‌های تراریخت دارای بیان ژن gus، 3: کنترل منفی (واکنش بدون الگو)

 


بحث و نتیجه ‏‏گیری.

به‌طورکلی برای تراریخت‌کردن قارچ‌های رشته‌ای از روش‌های مختلفی استفاده شده است. در این مطالعه با اشاره به این نکته که هرکدام از روش‌ها معیارهای خاص خود را دارند و به‌منظور بهینه‌سازی آن‌ها نیاز به وقت و هزینه زیادی است، از سامانه AMT استفاده شد. با توجه به اینکه قارچM. alpina 1S-4  از جمله قارچ‌های صنعتی مهم در تولید آراشیدونیک اسید است، انتقال ژن‌های مؤثر در تولید این ماده (23) توسط تراریختی کارآمد و پایدار می‌تواند در معرفی سویه‌هایی از قارچ با توان افزایش‌یافته در تولید آراشیدونیک اسید مؤثر باشد. با آزمایش‌های مختلف و مقایسه روش‌های مختلف تراریختی شناخته‌شده، روشی سراسری برای تراریختی این قارچ با استفاده از بمباران ژنی را تاکنو[xiii] و همکاران در سال 2004 تعریف کردند. در روش آن‌ها از اسپورهای قارچی M. alpina 1S-4 جهش‌یافته اگزوتروف اوراسیل استفاده شده است (24). در سال 2009، آندو[xiv] و همکارانش سامانه [xv]ATMT (با استفاده از باکتری A. tumefaciens سویه  C58C1 و ناقل pBIG2RHPH2) را برای تراریخت‌کردن قارچ M. alpina 1S-4 اگزوتروف یوراسیل به کار بردند و این فناوری را برای ایجاد تراریخت‌های با ثبات میتوزی را موفقیت‌آمیز توصیف کردند. بافت هدف آن‌ها برای تراریختی به این روش، اسپورهای قارچی به‌دست‌آمده با استفاده از کشت قارچ در محیط Czapek-Dox بود (16).

 پژوهش حاضر، نخستین پژوهش در رابطه با تراریختی میسیلیوم‌های قارچ M. alpina  و اولین گزارش تراریختی بر قارچ M. alpina  سویه CBS754.68 است. تاکنون اغلب پژوهش‌های انجام‌گرفته بر قارچ‌های اگزوتروف بوده است و با توجه به ضعیف‌بودن قارچ‌های جهش‌یافته نسبت به تیپ وحشی معرفی ژن نشانگر مناسب و بهینه‌سازی روش تراریختی برای قارچ تیپ وحشی، ضروری به نظر می‌رسد. با توجه به این نکته که راه‌انداز استفاده‌شده در این تراریختی قارچ نیز برای نخستین بار استفاده شد و در سایر قارچ‌های رشته‌ای نیز به‌ندرت استفاده شده است. میزان بیان بالای ژن بتاگلوآورونیداز (gus) در قارچ‌های تراریخت به‌دست‌آمده، این راه‌انداز را راه‌اندازی مناسب برای تراریختی قارچ‌ها به‌خصوص این قارچ معرفی می‌کند.

 با وجود تازگی این روش تراریختی در قارچ‌های رشته‌ای، مطالعات نسبتاً وسیعی در این زمینه انجام شده است. ولی توجه به این نکته با اهمیت است که نوع گونه و سویه قارچ و شرایط آزمایش در این روش بسیار مؤثر است. با مقایسه تیمار مدت‌زمان القا با استوسیرینگون می‌توان گفت اضافه‌کردن استوسیرینگون برای فعال‌سازی ژن‌های vir باکتری و انتقال ژن مؤثر، مهم است. نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که برای حصول نتیجه با بازده تراریختی بالاتر و پایدارتر استفاده از گونه مناسب اگروباکتریوم، فاکتوری اساسی است. براساس یافته‌های به‌دست‌آمده، بازده تراریختی با
 A. tumefaciens بالاتر بود ولی پایداری میتوزی بیشتر زمانی به دست آمد که از A. rhizogenese برای تراریختی میسیلیوم‌های قارچی استفاده شده بود. اشاره به این نکته ضروری به نظر می‌رسد که چون انتقال ژن با استفاده از A. rhizogenese تاکنون در قارچ‌های رشته‌ای تنها یک بار گزارش شده است (20)، برای اطلاع از علت پایداری میتوزی بیشتر تراریختی به‌هنگام استفاده از این باکتری نیاز به مطالعه و بررسی‌های بیشتر است.

تشکر و قدردانی

 این طرح قسمتی از پایان‌نامه کارشناسی ارشد نگارنده اول است. نویسندگان از دانشکده کشاورزی دانشگاه تربیت مدرس و پژوهشگاه ملی مهندسی ژنتیک به‌دلیل فراهم‌کردن امکان این پژوهش تشکر و قدردانی می‌کنند.

 



[1]- Single cell protein and oil

[2]- Zygomycota

[3]- Carlson

[4]- Bundock

[5]- Gouka

[6]- Wei

[7]- Incubation

[8]- Co-Coltivation

[9]- Cefotaxime

[10]- Safaee et al

[11]- Primer

[12]- Promoter

[xiii]- Takeno

[xiv]- Ando

[xv]- Agrobacterium Tumefaciens Mediated Transformation

  

(1)               Iwashita K. Recent studies of protein secretion by filamentous fungi-review. Bioscience and Bioengineering 2000; 94 (6): 530- 5.

(2)               Ashengroph M. Isolation and characterization of a native strain of Aspergillus niger ZRS14 with capability of high resistance to zinc and its supernatant application towards extracellular synthesis of zinc oxide nanoparticles. Biological Journal of Microorganisms 2013; 2 (7): 29-44.

(3)               Magnuson JK., Lasure LL. Advances in fungal biotechnology for industry, agriculture, and medicine. NewYork: Kluwer Academic/Plenum Publishers; 2004.

(4)               Wiebe MG. Stable production of recombinant proteins in filamentous fungi- problems and improvements. Mycologist 2003; 17(3): 140- 5.

(5)               Nisha A., Kumar Rastogi N., Venkateswaran G. Optimization of Media Components for Enhanced Arachidonic Acid Production by Mortierella alpina under Submerged Cultivation. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2011; 16: 229- 37.

(6)               Food Standards Australia New Zealand. DHASCO and ARASCO oils as sources of long chain polyunsaturated fatty acids in infant formula. A safety assessment. Technical report Series NO.22., Canberra, Australia: FSANZ; 2003.

(7)               Carlson SE., Werkman SH., Peeples JM., Cooke RJ., Tolley EA. Arachidonic acid status correlates with first year growth in preterm infants. Proceeding of National Academic Science of USA 1993; 97: 1073- 7.

(8)               Moradi S., Sanjarian F., Mousavi A. Optimization of transformation of Fusarium graminearum by Helios gene gun...The 16th national and 4th international conference of biology. Mashhad, Iran; 2010.

(9)               Turgeon BG., Condon B., Liu J., Zhang N. Protoplast transformation of filamentous fungi. Methods in Molecular Biology 2010; 638: 3- 19.

(10)           Leclerque A., Wan H., Abschutz A., Chen S., Mitina GV., Zimmermann G., et al. Agrobacterium -mediated insertional mutagenesis (AIM) of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana. Current Geneicts 2004; 45: 111- 19.

(11)           Ruiz- DõÂez B. Strategies for the transformation of ®lamentous fungi. Journal of Applied Microbiology 2002; 92, 189- 95.

(12)           Kawai S., Hashimoto W., Murata K. Transformation of Saccharomyces cerevisiaeand other fungi. Bioengineered Bugs 2010; 1(6): 395- 403.

(13)           Kumar JA. Development of electroporation- mediated transformation system for axenically cultivable root endophyte fungus Piriformospora indica. Protocol Exchange 2010; doi: 10.1038/nprot.2010.57

(14)           Wood JP., Helinecke EL., Goldman WE. Electro-transformation and Expression of Bacterial Genes Encoding Hygromycin Phosphotransferase and b-Galactosidase in the Pathogenic Fungus Histoplasma capsulatum. Infection and Immunity 1998; 66 (4): 1697- 707.

(15)           Zhang T., Qi Z., Wang Y., Zhang F., Li R., Yu Q., et al. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Penicillium expansum PE-12 and its application in molecular breeding. Microbiological Research. 2013; 168: 130- 7.

(16)           Ando A., Sumida Y., Negoro H., Anggraini Suroto D.,Ogawa J., Sakuradani E., et al. Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of an oleaginous fungus, Mortierella alpina 1S-4, and its application for eicosapentaenoic acid producer breeding. Environmental Microbiology 2009; 75(17): 5529- 35.

(17)           Meyer V. Genetic engineering of filamentous fungi-Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances 2008; 26 (2): 177- 85.

(18)           Bundock P., den Dulk-Ras A., Beijersbergen A., Hoykaas PJJ. Trans-kingdom T-DNA transfer from Agrobacterium tumefaciens to Saccharomyces cerevisiae. European Molecular Biology Organization 1995; 14 (13): 3206- 14.

(19)           Gouka RJ., Gerk C., Hooykaas PJJ., Bundock P., Musters W., Verrips CT., et al. Transformation of Aspergillus awamori by Agrobacterium tumefaciens- mediated homologous recombination. Nature Biotechnology 1999; 17 (6): 598- 601.

(20)           Wei DS., Zhang Y-H., Li M-C. Agrobacterium rhizogenese mediated transformation of a high oil producing filamentous fungus Umbelopsis isabellina. Applied Genetics 2010; 51 (2): 225- 32.

(21)           Cervera M. Histochemical and fluorometric assays for uidA (GUS) gene detection. Transgenic Plants: methods and Protocols 2004; 203- 13.

(22)           Safaee N., Alizade E., Saidi A., Rahimian H., Adam G. Molecular identification and genetic diversity among Iranian populations of Fusarium graminearum, the causal agent of wheat. Iranian Journal of Plant Patology 2005; 41: 171- 89.

(23)           Sakuradani E., Nojiri M., Suzuki H., Shimizu S. Identification of a novel fatty acid elongase with a wide substrate specificity from arachidonic acid-producing fungus Mortierella alpina 1S-4. Applied Microbiology and Biotechnology 2009; 84 (4): 709- 16.

(24)           Takeno S., Sakuradani E., Murata S., Inohara-Ochiai M., Kawashima H., Ashikari T., et al. Establishment of an overall transformation system for an oil-producing filamentous fungus, Mortierella alpina 1S-4. Microbiology and Biotechnology 2004; 65 (4): 419- 25.