غربال‏ سازی و شناسایی سویه کارا در جذب اکسی ‏آنیون ‏های سلنیوم به منظور تصفیه زیستی فاضلاب

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

2 استاد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی، دانشگاه علوم و فنون دریایی خرمشهر، ایران

چکیده

مقدمه: سلنیوم، عنصری با فعالیت‏های آنتی‏اکسیدانی است که در همئوستاز هورمون تیروئید، ایمنی و باروری نقش دارد. با وجود این،‏ مسمومیت با سلنیوم (سلنوز) موجب ایجاد مشکلاتی برای انسان از جمله اختلالات سیستم عصبی، مشکلات معدی- روده‏ای و ریزش مو می‏‏شود. از‏ این ‏رو، ‏این مطالعه با هدف غربال‏سازی جاذب زیستی باکتریایی مناسب به‏منظور حذف آلاینده ‏سلنیوم از فاضلاب انجام شد. ‏‏‏

مواد و روش ‏‏ها: در این پژوهش، در ابتدا با استفاده از محیط کشت لوریا برتانی آگار تغییر یافته (mLBA) با غلظت معینی از نمک سلنات سدیم، جداسازی جدایه‏های باکتریایی از سه نمونه پساب و لجن جمع‏آوری شده از کارخانجات صنعتی خوزستان، انجام شد. پس از تعیین حداقل غلظت مهاری (MIC) و حداقل غلظت کشندگی (MBC)، میزان جذب و درصد کارایی پاکسازی فلز (%RE) با استفاده از نمونه‏های فعال و غیر فعال متابولیسمی یکی از جدایه‏های کارا و توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی بررسی شد. شناسایی، با روش‏های ریخت‏شناختی‏، بیوشیمیایی و مولکولی انجام شد. ‏‏‏

نتایج: از میان 73 جدایه ‏باکتریایی به‏دست آمده در مرحله ‏اول، 8 جدایه ‏مقاوم به اکسی‏آنیون سلنات به‏دست آمد. در‏ این‏ میان‏ جدایه ‏AMS1-S8 به‏ترتیب با MIC و MBC معادل با 600 و 1200 میلی‏مولار برای مطالعات بیشتر انتخاب شد. نتایج به‏دست آمده در مرحله ‏تعیین مکانیسم جذب نشان داد که میزان جذب در نمونه ‏فعال متابولیسمی از نمونه‏های غیر فعال بیشتر است. بر اساس نتایج شناسایی مشخص شد که این جدایه، به جنس Enterobacter تعلق دارد. این جدایه با شماره ثبت JQ818822 در بانک جهانی ژن، ثبت شده است. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: نتایج نشان داد که زیست توده فعال جدایه ‏منتخب، بیش‏ترین میزان جذب و %RE را داشته و در میان سایر جدایه‏ها، مقاومت نسبی بالایی در برابر سلنات دارد. بنابراین، می‏تواند گزینه‏ای کمابیش ایده‏آل برای اصلاح زیستی محیط‏های آلوده باشد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Screening and identification of efficient strain in selenium oxyanions sorption in order to biological wastewater treatment

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Yaghoobizadeh 1
  • Mohammad Roayaei Ardekani 2
  • Hossein Zolgharnein 3
1 M.Sc. of Microbiology, Shahid Chamran University of Ahwaz, Iran
2 Professor of Microbiology, Shahid Chamran University of Ahwaz, Iran
3 Assistant Professor of Biotechnology, Khurramshahr University of Marine Science and Technology, Khurramshahr, Iran
چکیده [English]

Introduction: Selenium is an element with antioxidant activities that plays roles in thyroid hormone homeostasis, immunity and also fertility. Nevertheless, selenium toxicity (selenosis) causes problems for humans such as abnormalities of the nervous system, gastrointestinal problems and hair loss. Thus, this study was performed with the aim of bacterial biosorbent isolation in order to remove selenium contaminant from wastewater.

Materials and methods: In this research, at first using modified Luria- Bertani agar (mLBA) medium with certain concentration of sodium selenate salt, isolation of bacterial isolates was done from three collected wastewater and sludge samples from Khouzestan industrial factories. After determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC), the sorption capacity and the percentage of metal removal efficiency (%RE) were investigated by atomic absorption spectrophotometer using metabolically active and inactive samples belonging to an efficient isolate. Identification was performed by morphological, biochemical and molecular methods.

Results: Among 73 attained bacterial isolates at the first stage, 8 selenate oxyanion resistant isolates were gathered. Among these, AMS1-S8 isolate with MIC= 600­mM and MBC= 1200­mM were selected for more studies. Attained results in sorption mechanism determination stage showed that the sorption capacity in metabolically active sample is more than the inactive samples. Based on the identification results, it is revealed that this isolate belongs to the Enterobacter genus. This isolate is deposited as accession JQ965667 in the GeneBank database.

Discussion and conclusion: The results showed that active biomass of selected isolate, have most sorption capacity and %RE and among the other isolates, have high partial resistance against selenate. Therefore, it can be a relatively ideal option for the bioremediation of polluted environments.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Selenium
  • Toxicity
  • Screening
  • Biosorbent

مقدمه.

آب به‏عنوان ارزشمندترین منبع طبیعی موجود، حدود 70 درصد از سطح زمین را پوشانده است (1). آلاینده‏های آب به دو گروه آلی و غیر آلی تقسیم می‏شوند. از میان آلاینده‏های غیر آلی، فلزات به‏علت رشد روز افزون کاربرد صنعتی‏شان، موجب آلودگی پایدار محیط زیست می‏شوند (2). در این میان، سلنیوم به چهار شکل: اکسی‏آنیون سلنات، سلنیت، سلنید و سلنیوم عنصری در طبیعت یافت می‏شود که سلنات و سلنیت به‏علت حلالیت بالا در آب، بیش‏ترین دسترسی زیستی و بنابراین،‏ بیش‏ترین سمیت را برای سیستم‏های زیستی‏ دارند (3). گذشته از منابع طبیعی (بیشتر‏ مواد معدنی فلزی- ‏گوگردی، برای مثال ناشی از فعالیت آتشفشان‏ها)، ترکیبات سلنیومی به شکل گسترده در نتیجه ‏فعالیت‏های انسانی مانند سوخت‏های فسیلی، کشاورزی (کودهای سلنیومی) و غیره در محیط پراکنده می‏شوند (4). مقادیر مازاد بر نیاز این عنصر (در حد میکرومول) اتصالات دی‏سولفیدی پروتئین‏ها را هدف قرار داده و به این‏ترتیب، مشکلات پوستی یا عصبی از جمله ریزش مو، آسیب‏پذیری ناخن‏ها، اختلالات عصبی و خستگی را در انسان ایجاد می‏کند. از طرفی، میزان مازاد بر نیاز این عنصر، با تولید رادیکال‏های آزاد موجب آسیب به DNA می‏‏شود (4). اگرچه روش‏های فیزیکی- شیمیایی مرسوم، برای برداشت آلودگی‏های فلزی از پساب‏های صنعتی استفاده می‏شوند، اما این روش‏ها گران بوده، با محیط زیست سازگار نیستند و بیشتر به غلظت مواد زاید وابسته هستند (5 و 6). به‏همین علت امروزه روش‏های زیستی‏ با استفاده از میکروارگانیسم‏هایی مانند مخمر و باکتری با هدف احیا، حذف یا تغییر شکل فلزات سمی مورد توجه ویژه‏ای قرار گرفته‏اند (7).

با توجه به تنوع متابولیکی میکروارگانیسم‏ها و توان استفاده ‏آن‏ها از آلاینده‏های محیطی به‏عنوان منابع غذایی یا تبدیل آن‏ها به شکلی با پایداری بیشتر و سمیت کمتر (8)، هدف اصلی از انجام پژوهش حاضر جداسازی و معرفی جدایه‏ای است که قادر به تبدیل اکسی‏آنیون سلنات به سلنیوم عنصری است‏.

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

نمونه ‏برداری: نمونه‏برداری از پساب و لجن سه کارخانه ‏کربن بلک و فارسیت اهواز و توسعه نیشکر امیر کبیر خوزستان انجام شد. نمونه‏های تهیه شده در ظروف استریل بلافاصله در کنار یخ به آزمایشگاه انتقال یافته و بررسی شد (9).

.غربال‏گری‏ اولیه ‏باکتری‏های مقاوم به فلز:جداسازی باکتری‏های مقاوم از طریق کشت مستقیم در محیط جامد انجام شد. به این منظور نمونه‏های آب و رسوب با سرم فیزیولوژی استریل تا رقت 5-10 رقیق شد. سپس،‏ در محیط کشت لوریا برتانی آگار تغییر یافته[1] (mLBA)(متشکل از 5/0 درصد عصاره مخمر، 1 درصد تریپتون و 5/1 درصد آگار) با غلظت 2/0 میلی‏مولار نمک سلنات سدیم کشت داده و گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 72 ساعت انجام شد. شایان ‏ذکر است که اسیدیته این محیط بر روی 5/7 تنظیم شد‏ (10).

.انتخاب جدایه‏های بهینه باکتریایی مقاوم به اکسی‏آنیون سلنات:در این مرحله، روش تعیین حداقل غلظت مهاری[2] (MIC)و حداقل غلظت کشندگی[3] (MBC)به‏منظور انتخاب جدایه‏هایی با بالاترین مقاومت نسبی، استفاده شد. به‏منظور تعیین MIC با روش رقت‏سازی در محیط مایع، سوسپانسیون باکتریایی (با کدورت معادل 5/0 مک فارلند) در محیط کشت mLB‏broth حاوی غلظت 5/32 تا 1200 میلی‏مولار نمک سلنات سدیم تلقیح شد. نمونه‏ شاهد نیز با تلقیح سوسپانسیون باکتریایی در محیط کشت فاقد فلز، تهیه شد‏. گرماگذاری به‏مدت 48 تا 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور150 دور در دقیقه انجام شد. در پایان، میزان MIC و MBC هر جدایه تعیین شد (11 و 12).

رسم منحنی رشد جدایه ‏منتخب: به این منظور سوسپانسیون باکتریایی به محیط mLB‏broth، در دو گروه واجد 100 میلی‏مولار سلنات سدیم و فاقد نمک، تلقیح و در 30 درجه سانتی‏گراد و 150 دور در دقیقه، گرماگذاری شد‏. در فواصل 4 ساعته، جذب نوری توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج 600 نانومتر اندازه‏گیری و منحنی رسم شد‏ (13).

روش به‏دست آوردن میزان کمی جذب فلز:برای دستیابی به این مهم، ابتدا زیست توده جدایه ‏منتخب در محیط mLB broth تهیه شد. به این شکل که پس از کشت باکتری در این محیط، تا رسیدن مرحله ‏رشد جدایه به اواسط فاز نمایی، گرماگذاری در30 درجه سانتی‏گراد و 150 دور در دقیقه انجام شد. سپس،‏ سوسپانسیون باکتریایی در دور 6000 دور در دقیقه و دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوب حاصل در شرایط یاد شده 2 بار با آب 2 بار تقطیر استریل شستشو داده و سانتریفیوژ شد‏ (14). حدود 4/0 گرم از وزن تر زیست توده با 40 میلی‏لیتر محلول فلزی محتوی 7896 میلی‏گرم در لیتر (ppm) اکسی‏آنیون سلنات با اسیدیته 8 در 30 درجه سانتی‏گراد و 150 دور در دقیقه مجاور شد. مجاور‏سازی تا رسیدن تعادل بین محلول فلزی و توده ‏باکتریایی ادامه یافت (13 و 15).

میزان محتوی فلز در فاز رویی حاصل از سانتریفیوژ توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی، مدل SAVANtAA A7104 ساخت کشور استرالیا، سنجیده شد. میزان فلز جذب شده به زیست توده با کسر میزان فلز مایع رویی از میزان اولیه محاسبه شد. تمام آزمایشات در 3 تکرار انجام و میانگین آن‏ها به شکل عدد نهایی جذب گزارش شد‏ (16 و 17).

رسم منحنی استاندارد غلظت سلنات:قبل از خواندن میزان جذب فلز توسط نمونه‏ها، ابتدا به کمک محلول‏های با غلظت‏های 80، 200 و 500 میلی‏گرم در لیتر از آنیون سلنات، منحنی استاندارد جذب فلز توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی در طول موج 00/204 نانومتر رسم شد. دقت دستگاه در حد میلی‏گرم در لیتر و نوع سوخت آن air/acetylene بود. میزان جذب هر یک از محلول‏های استاندارد با 3 تکرار خوانده و نتیجه به شکل میانگین گزارش شد‏ (9).

محاسبه میزان جذب فلز: پس از رسم منحنی استاندارد و تعیین غلظت فلز در فاز رویی هر نمونه، برای محاسبه ‏میزان جذب فلز توسط زیست توده‏های موجود، از فرمول زیر استفاده شد:

q = V (Ci – Cf) / S

که در آن شاخص‏ q معرف میزان جذب فلز توسط زیست توده است که با واحد میلی‏گرم فلز جذب شده در هر گرم وزن خشک باکتری[4] گزارش می‏‏شود. شاخص‏ V معرف حجم محلول مجاور‏سازی بر حسب لیتر، Ci غلظت اولیه ‏محلول فلزی بر حسب میلی‏گرم در لیتر، Cf غلظت فلز پس از مجاور‏سازی بر حسب میلی‏گرم در لیتر و شاخص‏ S وزن خشک زیست توده با واحد گرم است‏. به‏منظور محاسبه وزن خشک، زیست توده باکتری به‏مدت یک‏شب در فور 100 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد (9 و 18).

بررسی مکانیسم جذب اکسی‏آنیون سلنات: برای تعیین نوع فرآیند جذب توسط باکتری (وابسته و یا مستقل از متابولیسم) از دو روش برای غیر فعال کردن باکتری استفاده و همزمان مقایسه‏ای میان میزان جذب این نمونه‏ها با نمونه ‏فعال متابولیسمی (شاهد) انجام شد (9).

در این مرحله نیز به‏منظور تهیه ‏زیست توده، مطابق با مرحله ‏تعیین میزان جذب فلز عمل شد. سپس، از دو روش زیر به‏منظور غیر فعال کردن زیست توده استفاده شد: 1- سلول‏ها به‏مدت 15 دقیقه، در فشار 1 اتمسفر و دمای121 درجه سانتی‏گراد اتوکلاو شد. 2- زیست توده به‏دست آمده به‏مدت یک شب در فور 100 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. پس از کشت روی محیط نوترینت آگار و اطمینان از کشته‏شدن زیست توده‏ها، میزان 4/0 گرم از وزن تر هر نمونه با 40 میلی‏لیتر محلول فلزی با غلظت سلنات معادل 7896 میلی‏گرم در لیتر مجاور شد. گرماگذاری در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و 150 دور در دقیقه انجام گرفت و پس از گذشت زمان لازم برای مجاورسازی، نمونه‏ها در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و 6000 دور در دقیقه، به‏مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ شد. فاز رویی نمونه‏ها برای تعیین غلظت فلز تحلیل شد (9).

محاسبه‏ درصد کارایی پاکسازی فلز[5](%RE):پس از تعیین غلظت فلز در فاز رویی هر نمونه، برای محاسبه ‏%RE، از فرمول %RE= (Ci – Cf) ×100/ Ci استفاده شد. Ci و Cf به‏ ترتیب معرف غلظت اولیه ‏محلول فلزی و غلظت فلز پس از مجاور‏سازی بر حسب میلی‏گرم در لیتر هستند. نمونه‏ای که حداکثر کاهش درصد غلظت فلز را در محلول رویی حاصل از سانتریفیوژ داراست، معرف حداکثر میزان جذب فلز توسط باکتری است‏ (19).

تحلیل آماری: میزان تفاوت و سطح معنا‏داری نمونه‏ها در مرحله ‏تعیین جذب نوری، توسط آزمون تحلیل واریانس یک‏طرفه (آنوا[6])، نسخه 19 نرم افزار اس. ‏پی. ‏اس. ‏اس[7] تعیین شد. نتایج به‏دست آمده از آزمون‏های MIC، MBC، تعیین درصد کارایی پاک‏سازی و تعیین نوع فرآیند جذب فلز با استفاده از آزمون مربع کای[8] (سطح اطمینان 95/0) بررسی شد.

شناسایی جدایه ‏منتخب:پس از بررسی‏های انجام شده، جدایه‏ای که در تمام مراحل، نسبت به سایر جدایه‏های این پژوهش، کارایی بهتری را نشان داد و در مقایسه با سایر مطالعات انجام شده در این زمینه، میزان MIC، MBC و کارایی بالاتری داشت، بر اساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی کلونی، رنگ‏آمیزی گرم، انجام آزمون‏های مختلف بیوشیمیایی و در نهایت، شناسایی مولکولی و تعیین توالی 16 SrRNA شناسایی شد. شایان ذکر است که در مرحله ‏شناسایی مولکولی، پس از استخراج ژنوم با 2 روش جوشاندن و استخراج با کیت، با توجه به منابع معتبر موجود، جفت پرایمری انتخاب شد‏ که قابلیت تکثیر ناحیه ‏ژنوم 16 SrRNA یوباکتر را داشت. توالی این جفت پرایمر در زیر آورده شده است (20).

 

 

توالی پرایمر رفت[9] (37 باز)

5'-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3'

توالی پرایمر برگشت[10] (37 باز)

5'-CCCGGGATCCAAGCTTACGGTTACCTTGTTACGACTT- 3'

 

نتایج.

پس از کشت نمونه‏ها در محیط mLBA با غلظت 2/0 میلی‏مولار نمک سلنات سدیم و 72 ساعت گرماگذاری در 30 درجه سانتی‏گراد، از میان 73 جدایه ‏اولیه، تنها 8 جدایه قادر به تولید کلونی‏هایی با رنگ قرمز بر روی پلیت بودند. با توجه به اینکه ظهور این رنگ به‏عنوان مکانیسم احتمالی سم‏زدایی سلنات شناخته می‏شود، این 8 جدایه برای مطالعات بیشتر انتخاب شدند. در ادامه، خالص‏سازی با استفاده از محیط نوترینت آگار انجام و کلونی‏های خالص شده بررسی شد‏.

.انتخاب جدایه‏های بهینه باکتریایی مقاوم به اکسی‏آنیون سلنات: در این مرحله جدایه‏های مورد بررسی به شکل جداگانه در گستره ‏غلظتی 5/32 تا 1200 میلی‏مولار سلنات سدیم کشت داده شدند. همان‏گونه که در جدول 1 مشخص است و نتایج تحلیل آماری توسط آزمون مربع کای نیز نشان داد، از این میان، تنها جدایه ‏AMS1-S8 با 600=MIC‏ میلی‏مولار و 1200=‏MBC میلی‏مولار، بیش‏ترین اختلاف معنا‏دار را با سایر جدایه‏ها دارد (991/5 X20.05,2>). از این‏رو این جدایه برای مطالعات بعدی انتخاب شد.

رسم منحنی رشد:پس از کشت جدایه در محیط mLB‏broth و تلقیح به محیط مشابه، گرماگذاری در شرایط 150 دور در دقیقه، 30 درجه سانتی‏گراد انجام و نمونه‏برداری برای خواندن میزان جذب نوری انجام شد. نتایج نشان داد منحنی رشد در محیط فاقد سلنات از حدود ساعت 24 وارد فاز سکون می‏شود و در محیط دارای سلنات، از ساعت 16به‏علت تولید سلنیوم عنصری، جذب نوری[11] افزایش در خور توجهی می‏یابد (شکل 1). زمان مناسب تهیه ‏زیست توده در مرحله ‏تعیین میزان جذب، با توجه به این منحنی انتخاب شد.

 

جدول 1- تعیین MIC و MBC‏ جدایه‏های سلنات

جدایه

آزمون

MIC (میلی‏مولار)

MBC (میلی‏مولار)

AMW2-S2

300

300

CBW-S3

600

600

CBW-S4

600

600

AMW2-S5

300

300

AMW2-S6

600

600

AMS1-S7

150

150

AMS1-S8

600

1200

CBS-S9

300

300

 

 

 

 

شکل 1- منحنی رشد جدایه ‏AMS1-S8

 

شکل 2- منحنی و معادله‏ خط استاندارد جذب سلنات

 


نتایج حاصل از به‏دست آوردن میزان کمی جذب فلز:پس از رسم منحنی استاندارد جذب و محاسبه ‏معادله ‏خط (شکل 2)، غلظت نمونه ‏مجهول (Cf) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر جذب اتمی تعیین شد. سپس، میزان جذب اکسی‏آنیون سلنات (q) توسط جدایه ‏مورد مطالعه، محاسبه شد‏.

نتایج حاصل از تعیین نوع فرآیند جذب فلز:در این بررسی که برای تعیین مکانیسم جذب جدایه انجام شد، از دو روش خشک کردن و اتوکلاو به‏منظور غیر فعال کردن (حذف فرآیندهای متابولیسمی و حیاتی) میکروارگانیسم استفاده شد. جدول 2 و شکل‏های 3 و 4 نشان می‏دهد که میزان جذب و %RE نمونه ‏فعال از نمونه‏های غیر فعال بیشتر است که نشان می‏دهد نمونه‏ فعال متابولیسمی علاوه ‏بر ‏اینکه از همان مکانیسم جذب در نمونه‏های غیر فعال (جذب زیستی) برخوردار است، از روش تجمع زیستی نیز به‏منظور ذخیره ‏فلز در درون خود استفاده می‏کند. با وجود این، با توجه به اعداد به‏دست آمده جذب فعال بازده بالایی نداشته و به‏عبارت دیگر این جدایه قسمت زیادی از جذب را به‏روش مستقل از متابولیسم انجام می‏دهد.

جدول 2- میزان جذب و %RE سلنات در نمونه‏های فعال و غیر فعال متابولیسمی

نوع تیمار

شاخص‏

فعال متابولیسمی

غیر فعال متابولیسمی

شاهد

خشک در 100 درجه سانتی‏گراد

اتوکلاو

میزان جذب سلنیوم (سلنات) (mg/gdw)

9/558

7/397

2/506

%RE

68/11 درصد

44/9

درصد

58/10 درصد

 

 

شکل 3- میزان جذب سلنات توسط زیست توده فعال و غیر فعال

 

به‏منظور بررسی آماری، تمام آزمایش‏ها در 3 تکرار انجام و نتایج به‏دست آمده با استفاده از آزمون مربع کای با سطح اطمینان 95/0 بررسی شد‏. در مورد میزان جذب، این نتایج اختلاف معنا‏داری را بین نتایج روش تیماری اتوکلاو و شاهد فعال (85/1019=X20.05,2، که بیانگر کارایی بیشتر نمونه ‏شاهد فعال است)، خشک‏شده با فور و شاهد فعال (39/102=X20.05,2، که بیانگر کارایی بیشتر نمونه ‏شاهد فعال است) و اتوکلاو و خشک‏شده با فور (41/144=X20.05,2، که نشان‏دهنده ‏کارایی بیشتر نمونه ‏تیمار‏شده با اتوکلاو است) نشان داد.

نتایج تحلیل آماری %RE نشان داد که اختلاف معنا‏داری بین نمونه ‏شاهد فعال و خشک‏شده با فور (8281/11=X20.05,2) وجود دارد که به معنای کارایی بیشتر نمونه ‏شاهد است. از‏ این گذشته مقایسه ‏دو روش تیماری اتوکلاو و خشک‏سازی با فور، نشان‏دهنده‏ اختلاف معنا‏دار این دو تیمار و کارایی بیشتر نمونه ‏تیمار‏شده با اتوکلاو بود (6689/15=X20.05,2).
نتایج شناسایی جدایه ‏باکتریایی:با توجه به مطالب ذکرشده، در این مرحله جدایه ‏AMS1-S8 مورد شناسایی دقیق بیوشیمیایی و مولکولی قرار گرفت (شکل 5 و 6 و جدول 3). در نهایت، پس از انجام PCR و الکتروفورز و انجام تعیین توالی، این جدایه به‏عنوان باکتری Enterobacter ludwigiiمعرفی شد و درخت فیلوژنتیکی مربوط به آن، با استفاده از نرم‏افزار Mega4.0 رسم شد‏ (شکل 7). این جدایه، با شماره ‏ثبت JQ818822 در بانک جهانی ژن، ثبت شده است.

 

شکل 4- درصد RE سلنات توسط زیست توده فعال و غیر فعال

 

 

 

شکل 5- تصویر میکروسکوپی و پلیت جدایه ‏AMS1-S

 

 

جدول 2- نتایج آزمون‏های بیوشیمیایی

 

 

 

شکل 6- الکتروفورز محصول واکنش زنجیره‏ای پلیمراز؛ 1: کنترل مثبت، 2: جدایه ‏AMS1-S8

 

 

 

شکل 7- درخت فیلوژنی رسم شده به روش Neighbor-Joining برای جدایه ‏AMS1-S8


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

در جداسازی باکتری‏های مقاوم به فلزات سنگین دو روش کشت مستقیم و کشت با غنی‏سازی اولیه[xii] وجود دارد. در این پژوهش، به دو علت از روش مستقیم استفاده شد: اول اینکه یک محیط کشت غنی دارای ترکیباتی است که باعث به‏دام انداختن یون‏های فلزی شده و بدین ترتیب موجب کاهش دسترسی زیستی می‏‏شود؛ دوم اینکه محیط غنی موجب افزایش توان جذب فلز توسط باکتری شده و یک جذب غیر واقعی مشاهده می‏شود (21).

بررسی مقاومت با روش MIC و MBC:MIC به‏عنوان کم‏ترین غلظت فلز در محیط است که از رشد میکروارگانیسم جلوگیری می‏کند. در مطالعه ‏این شاخص‏، از دو روش استفاده می‏شود: 1- رقت‏سازی فلز در آگار و 2- رقت‏سازی در محیط مایع (22). از آن‏جا که در مرحله ‏غربال‏گری‏ باکتری‏های مقاوم، مشاهده شد که جدایه‏های مورد بررسی توان رشد در تراکم‏های بالای فلز را دارند ، گستره ‏غلظتی مربوط به مرحله ‏MIC در مقایسه با سایر مطالعات بسیار بالاتر بود. بنابراین،‏ در این پژوهش به‏منظورتعیین میزان رشد جدایه‏ها از روش رقت‏سازی در محیط مایع استفاده شد (23). در این مطالعه MIC ‏جدایه ‏AMS1-S8 در مقایسه با سایر مطالعات انجام شده قابل ملاحظه است‏. تنها در مطالعه ‏انجام شده توسط گُش[xiii] و همکاران، با به‏کارگیری غلظت‏های 10 تا 1000 میلی‏مولار، این مقدار در گستره 650 تا ‏750 میلی‏مولار به ‏دست آمد (24). لَمپیس[xiv] نیز جدایه‏هایی با میزان MIC ‏حدود 200‏میلی‏مولار را گزارش کرده است (25). در سال 2001، سَباتی[xv] و همکاران در مطالعه‏ای که به منظور جداسازی جدایه‏های مقاوم به تلوریت و سلنات انجام دادند، موفق به جداسازی جدایه‏هایی با MIC ‏در حد ppm شدند (26).

روش به‏دست آودن میزان کمی جذب فلز:در مطالعات جداگانه ‏عبد‏النبی[xvi] و همکاران، صدیق[xvii] و همکاران، ایلماز[xviii] و همکاران، امین[xix]، تلی‏دلیر[xx] و مطالعات متعدد دیگر، به منظور بررسی میزان حذف فلزات مختلف از زیست توده باکتریایی استفاده شده است که این زیست توده، پیش از مجاور‏سازی با فلز به‏دست آمده است (19، 27- 30). با وجود این‏، در برخی مطالعات از جمله مطالعه ‏ایلماز و همکاران و آندرئونی[xxi] و همکاران، از سلول‏های در حال رشد به منظور برداشت فلز از محلول استفاده شده است (28 و 31). در این راستا، چنین بیان شده است که حذف فلز با استفاده از سلول‏های در حال رشد، نیازمند صرف زمانی است که به منظور رشد میکروارگانیسم در محیط تحت تنش فلزی مورد نیاز است‏. با وجود این‏، مایرز[xxii] بیش‏ترین مقدار کاهش سلنات را همزمان با فاز نمایی رشد جدایه‏هایش (2 تا 4 روز) مشاهده کرده است (32).

از طرف دیگر در مطالعه ‏هالتونن[xxiii] بیان شده است که چگالی سطحی و ثابت دپروتونه شدن گروه‏های عملکردی سطحی Baciilus subtilis بسته به فاز رشد تغییر می‏کند. به‏طوری‏که این پژوهشگر به نقل از دافنی[xxiv] و همکاران اظهار داشته است که با ورود زیست توده از فاز نمایی به فاز سکون رشد، چگالی سطحی و ثابت دپروتونه شدن گروه‏های کربوکسیل، فسفوریل و آمین کاهش می‏یابد. همچنین، هالتونن در تایید این نتایج گفته است که استفاده از سلول‏های پیرتر Pseudomonas aeruginosa، موجب کاهش حذف کادمیوم می‏‏شود (5). از این‏رو در پژوهش ‏حاضر، از سلول‏های رشد کرده‏ای استفاده شد که پیش از مجاورسازی با فلز، در محیطی کشت داده شده و با رسیدن به اواسط مرحله ‏لگاریتمی رشدشان، سانتریفیوژ و برای مجاورسازی استفاده شد‏ند.

همچنین، بیان این موضوع دارای اهمیت است که استفاده از سلول‏های مرحله ‏لگاریتمی با فرض این علت بود که در این حالت، جدایه‏ها در برابر استرس فلزی و برداشت فلزات کاراتر می‏باشند و این حالت مشابه با مطالعاتی است که توسط تَرانجینی[xxv]، سّرِت[xxvi] و همکاران، مرتضوی[xxvii] و همکاران و بسیاری از مطالعات دیگر، گزارش شده است (33- 35).

تعیین نوع فرآیند جذب:به طور کلی جذب فلزات سنگین توسط زیست توده غیر زنده ‏میکروارگانیسم‏ها، به روش جذب زیستی انجام می‏شود. در عوض همان زیست توده، در شرایط فعال متابولیسمی علاوه‏ بر جذب یاد شده، ممکن‏است بتواند فلزات را به روش تجمع زیستی نیز در خود ذخیره سازد.

نتایج مربوط به جدایه ‏AMS1-S8 نشان داد که کارایی نمونه ‏شاهد فعال در جذب فلز بالاتر است؛ پس از آن نمونه ‏غیر فعال شده با اتوکلاو بیش‏ترین کارایی را نشان می‏دهد و نمونه‏ای تیمار شده با حرارت 100 درجه سانتی‏گراد، کم‏ترین بازده جذب را داراست. با توجه به مقالات مختلف، میکروارگانیسم‏ها رفتار‏های متناقضی را در رابطه با مکانیسم جذب فلز نشان می‏دهند. جان‏لیان[xxviii] و همکاران بیان داشتند که تخریب شدید ساختار سطحی سلول می‏تواند بر ظرفیت جذب زیست توده، موثر باشد. مقایسه‏هایی که این پژوهشگر با استفاده از میکروسکوپ TEM انجام داد، نشان داد که عوامل تیماری قوی، به‏علت تجزیه ‏پپتیدوگلیکان، لیپیدها و پروتئین‏ها، ساختار سطح سلول را تخریب کرده و به طور معمول موجب کاهش ظرفیت جذب زیستی فلزات می‏شوند (36). از سویی برخی از مطالعات، نشان‏دهنده ‏آثار متفاوت تیمار با اتوکلاو بر رفتار جذبی زیست توده هستند. برای مثال، افزایش جذب منگنز توسط زیست توده دو جلبک Spirogyra sp.و Nostoc commune، پس از تیمار با اتوکلاو مشاهده شده است (37). در مقابل، ابراهیمی‏پور[xxix] و همکاران بیان داشتند که علت کاهش جذب سرب در حالت اتوکلاو کردن، احتمالا به دو علت است: 1- در این حالت جذب فقط به شکل سطحی خواهد بود و جذب درونی وجود نخواهد داشت. 2- در حین اتوکلاو، برخی از سایت‏های اتصال Pb2+ در اثر شوک ناشی از دمای بالا، دناتوره می‏شوند (1).

همان‏طور که بیان شد، نمونه ‏فعال متابولیسمی جدایه ‏معرفی شده بیش‏ترین میزان جذب و %RE را دارد. بزرگ‏ترین مزیت استفاده از کشت زنده ‏میکروبی برای تولید زیست توده، عدم نیاز به مراحل جداگانه‏ای مثل کشت، جمع‏آوری، خشک کردن، آماده‏سازی و ذخیره است. از طرفی با توجه به این نتایج و نتایج به‏دست آمده از مرحله ‏تعیین MIC و MBC، و با یادآوری مروری بر مطالعات انجام‏شده، می‏توان اینگونه استنباط کرد که این جدایه، گزینه کمابیش ایده آل برای کاربردهای صنعتی در راستای پاکسازی محیط زیست است.



[1]- Modified Luria-‏bertani agar

[2]- Minimum Inhibitory Concentration

[3]- Minimum Bactericidal Concentration

[4]- mg/ gdw

[5]- Metal Removal Efficiency

[6]- ANOVA

[7]- SPSS

[8]- Chi-Square

[9]- Forward

[10]- Reverse

[11]- OD

[xii]- Primary enrichment culture method

[xiii]- Ghosh

[xiv]- Lampis

[xv]- Sabaty

[xvi]- Abd-Elnaby

[xvii]- Siddique

[xviii]- Yilmaz

[xix]- Amin

[xx]- Telly Dalir

[xxi]- Andreoni

[xxii]- Maiers

[xxiii]- Halttunen

[xxiv]- Doughney

[xxv]- Tarangini

[xxvi]- Sarret

[xxvii]- Mortazavi

[xxviii]- Junlian

[xxix]- Ebrahimipour

  

(1)               Ebrahimipour Gh., Foladi J., Telly Dalir S., Tafakori V. Screening and selecting a lead absorbing bacterium. Environmental Sciences 2005; 7: 1- 12.

(2)               Nayeri R., Ghaemi N., Noohi AS. Evaluation of isolated bacteria from industrial wastewater in removal of lead pollutant. Qom University of Medical Sciences Journal 2011; 5 (1):75- 82.

(3)               Burra R. Determination of selenium and tellurium oxyanion toxicity, detection of metalloid-containing headspace compounds, and quantification of metalloid oxyanions in bacterial culture media [dissertation]. Huntsville, Alabama: Sam Houston State University; 2009.

(4)               Lenz M., Lens PNL. The essential toxin: The changing perception of selenium in environmental sciences. Science of the Total Environment 2009; 407:3620- 33.

(5)               Halttunen T. Removal of cadmium, lead and arsenic from water by lactic acid bacteria [disertation] Turku: Finland University; 2007.

(6)               Khanaferi A., Shirdam R., Tabatabaee A. Isolation and identification of capable bacteria to reduction of cadmium, vanadium and nickel. Scientific Journal of Life Environment 2007; 44: 33- 43.

(7)               Geets J., Vangronsveld J., Diels L., Taghavi S., Lelie D. Microbial activities, monitoring and application as part of a management strategy for heavy metal- contaminated soil and ground water. Developments in Soil Science 2008; 32: 521- 59.

(8)               Ashengroph M. Isolation and characterization of a native strain of Aspergillus niger ZRS14 with capability of high resistance to zinc and its supernatant application towards extracellular synthesis of zinc oxide nanoparticles. Biological Journal of Microorganism 2013; 2(7): 29-44.

(9)               Pre´ve´ral S., Gayet L., Moldes C., Hoffmann J., Mounicou S., Gruet A., et al. A common highly conserved cadmium detoxification mechanism from bacteria to humans. Journal of Biological Chemistry 2009; 284 (8): 4936- 43.

(10) Choudhary S., Sar P. Characterization of a metal resistant Pseudomonas sp. isolated from uranium mine for its potential in heavy metal (Ni2+, Co2+, Cu2+, and Cd2+) sequestration. Bioresource Technology 2009; 100: 2482- 92.

(11) Ruanchaiman S., Kumsopa A., Boontanonand N., Prapagdee B. Dispersion of cadmium-resistant bacteria in cadmium-contaminated soils at Mae Sot district, Tak province. Journal of Environmental Research 2009; 31 (2): 35- 48.

(12) Leedjarv A., Ivask A., Virta M. Interplay of different transporters in the mediation of divalent heavy metal resistance in Pseudomonas putida KT2440. Journal of Bacteriology 2008; 190 (8): 2680- 9.

(13) Abdelatey L.M., Khalil WKB., Ali TH., Mahrous KF. Heavy metal resistance and gene expression analysis of metal resistance genes in gram-positive and gram-negative bacteria present in Egyptian soils. Journal of Applied Sciences in Environmental Sanitation 2011; 6 (2): 201- 11.

(14) Nasrazadani A., Tahmourespour A., Hoodaji M. Determination of bacteria resistance threshold to lead, zinc and cadmium in three industrial wastewater samples. Journal of Environmental Studies 2011; 36 (56): 25- 7.

(15) Al- Garni SM., Ghanem KM., Ibrahim AS. Biosorption of mercury by capsulated and slime layer-forming Gram-ve bacilli from an aqueous solution. African Journal of Biotechnology 2010; 9 (38): 6413- 21.

(16) Hussein H., Ibrahim SF., Kandeel K., Moawad H. Biosorption of heavy metals from waste water using Pseudomonas sp. . Electronic Journal of Biotechnology 2004; 7 (1): 38- 46.

(17) Bai HJ., Zhang ZM., Yang GE., Li BZ. Bioremediation of cadmium by growing Rhodobacter sphaeroides: Kinetic characteristic and mechanism studies. Bioresource Technology 2008; 99: 7716- 22.

(18) Narasimhulu K., Rao PS. Studies on removal of toxic metals from wastewater using Pseudomonas species. ARPN Journal of Engineering and Applied Sciences 2009; 4 (7): 58- 63.

(19) Rao KS., Mohapatra M., Venkateswarlu P. Review on cadmium removal from aqueous solutions. International Journal of Engineering, Science and Technology 2010; 2 (7): 81- 103.

(20) Abd-Elnaby H., Abou-Elela GM., El-Sersy NA. Cadmium resisting bacteria in Alexandria Eastern Harbor (Egypt) and optimization of cadmium bioaccumulation by Vibrio harveyi. African Journal of Biotechnology 2011; 10 (17): 3412- 23.

(21) Giri S. Isolation and biochemical characterization of mercuryresistant bacteria (mrb) from soil samples [disertation]. Rourkela: National institute of Technology Rourkela, Orissa; 2011.

(22) Sarin C., Sarin S. Removal of cadmium and zinc from soil using immobilized cell of biosurfactant producing bacteria. EnvironmentAsia 2010; 3 (2): 49- 53.

(23) Chihching C., Yumei K., Changchieh C., Chunwei H., Chihwei Y., Weijen Y. Microbial diversity of soil bacteria in agricultural field contaminated with heavy metals. Journal of Environmental Sciences 2008; 20: 359- 63.

(24) Ghosh A., Mohod AM., Paknikar KM., Jain RK. Isolation and characterization of selenite- and selenate-tolerant microorganisms from selenium-contaminated sites. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2008; 24: 1607- 11.

(25)           LampisS. New insights in microbial transformation of selenium: a biotechnological perspective. [disertation]. University of Degli Studi Di Verona. 2005.

(26) Sabaty M., Avazeri C., Pignol D., Vermeglio A. Characterization of the reduction of selenate and tellurite by nitrate reductases. Applied and Environmental Microbiology 2001; 67 (11): 5122- 6.

(27) Siddique T., Arocena JM., Thring RW., Zhang Y. Bacterial reduction of selenium in coal mine tailings pond sediment. Journal of Environmental Quality 2007; 36: 622- 7.

(28) Yilmaz EI., Ensari NY. Cadmium biosorption by Bacillus circulans strain EB1. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2005; 21: 777- 9.

(29) Amin P. Microbial adsorption and accumulation of cadmium. [disertation]. Tehran, Iran: Al-Zahra University, 2000

(30) Telly Dalir S. Screeninig, isolation and identification of a lead sorbing bacterium from industrial effluent and optimization of its biosorption conditions. [disertation]. Tehran, Iran: Al-Zahra University, 2003.

(31) Andreoni V., Colombo M., Colombo A., Vecchio A., Finoli C. Cadmium and zinc removal by growing cells of Pseudomonas putida strain B14 isolated from a metal-impacted soil. Annals of Microbiology 2003; 53: 135- 48.

(32) Maiers DT., Wichlacz PL., Thompson D.L., Bruhn DF. Selenate reduction by bacteria from a selenium-rich environment. Applied and Environmental Microbiology 1988; 54 (10): 2591- 3.

(33) Tarangini K. Biosorption of heavy metals using individual and mixed cultures of Pseudomonas aeruginosa and Bacillus subtilis. [disertation]. Rourkela, Orissa, India: National Institute of Technology, 2009

(34) Sarret G., Avoscan L., Carrie`re M., Collins R., Geoffroy N., Carrot F., et al. Chemical forms of selenium in the metal- resistant bacterium Ralstonia metallidurans CH34 exposed to selenite and selenate. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71 (5): 2331- 7.

(35) Mortazavi S., Rezaee A., Khavanin A., Varmazyar S., Jafarzadeh M. Removal of mercuric chloride by a mercury resistant Pseudomonas putida strain. Journal of Biological Sciences 2005; 5 (3): 269- 73.

(36) Junlian Q., Lei W., XiaoHua F., GuangHong Z. Comparative study on the Ni2+ biosorption capacity and properties of living and dead Pseudomonas putida cells. Iranian Journal of Chemistry & Chemical Engineering-International English Edition 2010; 28 (1): 159- 67.

(37) Mane PC., Bhosle AB., Vishwakarma CV., Tupkar LG. Effect of pretreatment of algal biomass on bioadsorption of manganese. International Journal of Engineering Science and Technology 2010; 2 (12): 7550- 4.