بررسی سویه ‏های اشرشیاکلی (E.coli) به‏دست آمده از بستنی سنتی بر اساس پروفایل پروتئینی در شهر اصفهان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد علوم و صنایع غذایی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

2 دکترا تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

3 استادیار علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی اصفهان (خوراسگان)، اصفهان، ایران

4 کارشناس ارشد ایمونولوژی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

5 دانشیار آمار زیستی و اپیدمیولوژی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

6 کارشناس ارشد سم ‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

7 کارشناس علوم و صنایع غذایی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‏هایی که در مواد غذایی حضور دارند، تحت تأثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار می‏گیرند. این موارد باعث ایجاد شوک در باکتری‏ها شده و آن‏ها را وادار به تولید پروتئین‏ها ‏و بعضاً تغییراتی در تولید آنزیم‏ها کرده که این امر می‏تواند ویژگی خاصی به آن‏ها ‏‏داده که اطلاع از این ویژگی در تشخیص به موقع و دقیق‏تر کمک کننده است. 

مواد و روش ‏‏ها: در پژوهش حاضر، ‏بیش از 100 نمونه‏ به شکل تصادفی از نقاط مختلف شهر اصفهان جمع‏آوری و تعداد 48 جدایه اندول مثبت از آن‏ها جداسازی شد. این جدایه‏ها ‏بر اساس آزمون‏های فنوتیپی و الکتروفورز پروتئین ارزیابی شدند.‏

‏نتایج: بر اساس آزمون‏های بیوشیمیایی، با بهره‏مندی ‏‏از تحلیل‏‏های عددی و دندروگرام ترسیم شده بر مبنی روش jacard، جدایه‏ها ‏در 8 گروه قرار گرفتند. این گروه‏ها ‏نتیجه تفاوت فنوتیپی بین استرین‏ها ‏و اختلاف آن‏ها ‏‏در استفاده از منابع کربنی مختلف بود. بنابراین، جدایه‏های ‏‏گروه یک و دو به سویه اشرشیا کلی (معادل 79 درصد) تعلق داشتند. جدایه‏های به‏دست آمده از بستنی در الگوی الکتروفورزی دارای دو باند پروتئینی در ناحیه 59/23 و 79/20 کیلو دالتون بودند، که از این لحاظ با جدایه استاندارد تفاوت داشتند. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: به علت وجود تفاوت‏های ‏بیوشیمیایی و مولکولی، به ویژه در دو باند پروتئینی یاد شده در جدایه‏های به‏دست آمده، در مقایسه با جدایه استاندارد، می‏توان نتیجه گرفت جدایه‏های ‏‏باکتریایی موجود در بستنی به علت آنکه تحت تاثیر فرآیند‏‏های ‏‏مختلف دمایی قرار می‏گیرند، تحریک به تولید پروتئین‏ها و بعضاً تغییراتی در تولید آنزیم‏ها شده، که می‏تواند ویژگی خاصی به این جدایه‏ها ‏داده، و در نهایت، ‏باعث ابهام در تشخیص شود‏.‏‏‏ بنابراین بررسی‏های مولکولی بیشتری در این زمینه نیاز است انجام شود. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of the Escherichia coli (E.coli) Strains based on protein profiles obtained from traditional Ice cream in Isfahan City

نویسندگان [English]

  • Maryam Ranjbar 1
  • Reza Nedaeinia 2
  • Mohammad Goli 3
  • Mostafa Manian 4
  • Mohammad Reza Meracy 5
  • Mansour Feizi 6
  • Nafiseh Kargaran 7
1 M.Sc. of Food Science and Technology, Deputy of Food and Drug, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
2 Ph.D. of Medical Biotechnology, Deputy of Food and Drug, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
3 Ph.D. of Food Science and Technology, Isfahan (Khorasgan) Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
4 M.Sc. of Immunology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
5 Ph.D. of Epidemiology, School of Medicine, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
6 M.Sc. of Toxicology, Laboratory control, Deputy of Food and Drug, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
7 B.Sc. of Food Science and Technology, Department of Chemistry, Laboratory control, Deputy of Food and Drug, Isfahan University of Medical Sciences, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Bacterial strains present in food products undergo different thermal processes such as coldness and warmth. Such cases cause a shock in bacteria and force the bacteria to produce proteins and partly, develop a change in the production of enzyme. This can give the strain a special characteristic, knowledge of this characteristic will contribute to a timely and more precise identification.

Materials and methods: During this time more than 100 samples have been examined, out of which, 48 Indol positive isolation samples were examined by phenotypic tests and sodium dodecyle sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS- PAGE).

Results: – The results of numerical analysis of phenotypic characteristics and protein patterns showed that only 79% of the collected isolates (phenon 1 and 2) could be identified as E.coli compared with reference strains. E.coli strains from ice creams were showed some Variation in banding patterns. Major differences were observed in protein bands between 23.59 - and 20.79 -kDa molecular mass range which the isolates were compared with reference strains.

Discussion and conclusion: Our study concluded that food’s bacterial strains are influenced by temperatures in different processes and also it could stimulate the production of proteins or change the enzymes. Therefore, The reason of taking care of the issues is that changes in the proteins’ structures can lead to change in the biochemical properties, and finally this change can misguide us. Further research is being performed to characterize these atypical strains by molecular methods.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Escherichia coli
  • Ice cream
  • Whole-bacteria proteins profile

مقدمه.

وجود مواد مغذی با ارزش شرایط را برای رشد و فعالیت بسیاری از میکروارگانیسم‏ها فراهم می‏کند. مواد غذایی یکی از منابع مهم ایجاد آلودگی توسط عوامل شیمیایی و زیستی محسوب می‏شود‏. به طوری‏که تخمین زده می‏شود 70 درصد بیماری‏های ‏‏عفونی از طریق مواد غذایی ناسالم به انسان سرایت می‏کنند (1). برخی از سویه‏های تولید کننده توکسین نظیر E. coli O26  پس از E. coli O157:H7 مسئول ایجاد اسهال و ادرار خونی در انسان است. گاو به عنوان یک مخزن مهم سویه O26 شناخته شده است. با توجه به بالا بودن اشرشیا کلی تیپیک نسبت به این سویه‏ها که به تعداد کم بیماری‏زا هستند و آزمون‏های مثبت کاذب کمتری نسبت به سویه‏های تولید کننده توکسین دارند. بنابراین، تشخیص زود هنگام آن مهم جلوه می‏کند. سویه‏های به‏دست آمده از گاو و انسان از لحاظ الگوی پلیمورفیسم و ژن‏های بیماری‏زا یکسان هستند بنابراین، انتقال بین دو گونه ممکن است رخ دهد. شیوع با جدایه های تولید کننده توکسین متاسفانه با وجود ارتقای سطح بهداشتی هنوز در تمامی کشورها گزارش می‏شوند. چند صد شیوع از سویه های Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) O157 و سویه های non-O157  تاکنون گزارش شده است. اهمیت موضوع در این موارد به اندازه‏ایی است که در موارد شیوع پایین بررسی‏های گسترده برای پی بردن به منشاء آلودگی انجام می‏شود و گاهی یک چالش بهداشتی محسوب شده تا آنجا که در بسیاری موارد روش‏های تشخیصی جدیدتر جایگزین روش های معمول می‏شود و سیستم سلامت محور تنها به درمان فرد بسنده نکرده بلکه ریشه‏کنی منشاء آلودگی را در دستور کار قرار می‏دهد. بنابراین، برای پی بردن به سلامت میکروبی مواد غذایی شاخص میکروبی تعریف می‏شود‏ (2). شاخص‏های ‏‏میکروبی بیشتر به منظور ارزیابی ایمنی و بهداشت مواد غذایی به کار می‏روند (3). نخستین شاخص آلودگی مدفوعی اشرشیا کلی ‌است (4). به منظور از بین بردن میکروارگانیسم‏های موجود در مواد غذایی، معمولاً مخلوط حاصل را در دمای مناسب پاستوریزه می‏کنند (5). بنابراین، رعایت نکردن موارد بهداشتی در تهیه، نگهداری و عرضه می‏تواند سلامت مصرف کننده را به خطر بیندازد. اشرشیا کلی از مهم‏ترین آلوده کننده‏های مواد غذایی محسوب می‏شود (6). جایگاه اصلی این باکتری کلون انسان و حیوانات خون‏گرم است و در صورتی‏که از طریق مدفوعی- دهانی منتقل شود، اسهال ایجاد می‏کند (7). با توجه به اینکه اشرشیاکلی‏ باکتری مقاومی است که می‏تواند هفته‏ها ‏و ماه‏ها در آب و مواد غذایی به‏ویژه در حرارت صفر درجه زنده بماند و از آنجا که بستنی به عنوان یک ماده غذایی توسط سنین مختلف استفاده می‏شود. از نظر منبع تهیه و شرایط بافری و دمایی بسیار مستعد برای آلودگی با این باکتری‏هاست‏ (8). اگر چه تعداد این باکتری تحت تاثیر سایر فلور طبیعی روده نظیر باکتروئیدز قرار دارد ولی با این وجود میزان آن همواره در روده غالب است‏ (9).

 این باکتری از عوامل اصلی ایجاد کننده اسهال در کشورهای توسعه نیافته است.انتقال بیماری از طریق انسان ـ موادغذایی ـ حیوان است. حداقل در بیماری‏زایی 103 در هر گرم ماده غذایی است. میزان مرگ و میر ناشی از این باکتری در نوزادان بسیار بالاست. در ضمن، عامل اصلی بیماری اسهال مسافران بوده و این بیماری در نقاطی که بهداشت فردی رعایت نمی‏شود شایع است. معمولا اسهال مسافران به سرعت ایجاد نمی‏شود و ممکن است 2 تا 3 روز بعد از خوردن یا هنگام بازگشت به منزل ایجاد شود. برخی مواد غذایی در معرض خطر عبارتند از، گوشت، فراورده های لبنی، شیر، آب آلوده که مهم‏ترین منبع آلودگی، سبزی های خام و سالاد است. پیشگیری از آن شامل، کنترل بهداشت دست اندرکاران تولید و تهیه مواد غذایی، کنترل آب مصرفی و شستن دست ها از عوامل عمده پیشگیری از انتقال بیماری می باشد (10). اشرشیاکلی‏، پاتوژن فرصت طلبی است که در روده بزرگ انسان و سایر حیوانات وجود دارد. وجود این باکتری در آب و مواد غذایی دلیل بر آلودگی آن‏ها ‏‏از طریق منابع مدفوعی است‏. عفونت ادراری‌، سپتی سمی، مننژیت نوزادی و اسهال مسافران، شایع‏ترین ‏عوارض بیماری هستند (11). طبق تخمین سازمان جهانی بهداشت موارد واقعی بیماری‏های ‏‏ناشی از آلودگی غذایی بیش از 30 تا 35 برابر موارد دیگر ثبت شده است (10).

جدایه‏های ‏‏باکتریایی که در مواد غذایی حضور دارند، تحت تاثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار می‏گیرند. این فرآیندها باعث ایجاد شوک در باکتری‏ها شده و باکتری‏ها را وادار به تولید پروتئین‏ها‏ ‏و در برخی موارد‏ تغییراتی در تولید آنزیم‏ها ‏ایجاد می‏کند. تغییر در بیان پروتئین‏ها ‏و آنزیم‏ها ‏باعث شده ویژگی‏های بیوشیمیایی و احتیاجات تغذیه‏ای این باکتری‏ها نسبت به جدایه‏هایی ‏که در این شرایط قرار نگرفته‏اند ‏تغییر کند و این تغییر در ویژگی‏ها‏ می‏تواند باعث خطا در تشخیص ‏شود‏. این امر باعث شده اطلاع از الگوی پروتئینی از اهمیت ویژه‏ای برخوردار باشد و نشان دهد جدایه‏های ‏‏حاصل دچار تغییراتی به علت شوک دمایی شد‏ه‏اند ‏یا خیر. به نظر می‏رسد این تغییرات ویژگی خاصی به جدایه‏ها ‏داده و اطلاع از این ویژگی‏ها‏ می‏تواند در تشخیص به موقع و دقیق‏تر کمک کننده باشد. هدف از پژوهش حاضر مقایسه نتایج آزمون‏های بیوشیمیایی و الگوی الکتروفورزی پروتئین بین سویه‏های E.coli به‏دست آمده از بستنی و سویه استاندارد برای پی بردن به وجود تنوع در سویه‏های اشرشیا کلی به‏دست آمده از بستنی در شهر اصفهان است.

‏‏مواد و روش ‏ها.

نمونه‏برداری: برای تعیین آلودگی بستنی‏های ‏‏سنتی به شکل تصادفی از نقاط مختلف شهر اصفهان در یک طرح کاملاً تصادفی نمونه‏گیری انجام شد‏ تا تمام نمونه‏ها ‏دارای شانس مساوی باشند. نمونه‏ها ‏تا زمان آزمایش در فریزر منفی 10 درجه سانتی‏گراد به مدت 2تا 4 ساعت نگهداری شدند.

جداسازی: با استفاده از پیپت سترون مقدار 10 میلی‏لیتر‏ از آزمونه با رقت 1/0 را به 10 میلی‏لیتر‏ لوله حاوی محیط کشت [1]LMX با غلظت مضاعف (68 گرم در لیتر) محتوی لوله درهم اضافه شد‏ و به مدت7 ساعت در 35 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد. تغییر رنگ محیط مایع به سبز مایل به آبی و ایجاد گاز به عنوان شاخص حضور اشرشیاکلی در محیط کشت است. سپس، به هر یک از لوله‏ها ‏مقدار 5/0 میلی‏لیتر‏ محلول سدیم هیدروکسید یک مولار اضافه شد در صورت ایجاد نور فلورسانس در طول موج 366 نانومتر و ایجاد حلقه قرمز با افزودن معرف کواکس[2] حضور اشرشیاکلی تایید شد. در صورت عدم تغییر رنگ و ایجاد گاز، گرمخانه‏گذاری تا 24 ساعت دیگر افزایش یافت. قبل از اضافه کردن معرف اندول، برای جداسازی جدایه‏ها ‏با استفاده از یک لوپ سترون روی محیط کروموکالت آگار کشت خطی داده و به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد‏. اشرشیاکلی‏ به شکل کلونی‏های آبی تیره و بنفش، سایر گروهای کلی فرم به شکل کلونی‏های ‏‏قرمز رنگ و میکرو فلورها به شکل بی‏رنگ مشاهده شد‏. کلونی‏های ‏‏بنفش و آبی انتخاب و روی محیط آگار مغذی[3] کشت، به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتی‏گراد گرمخانه گذاری شد‏. در این روش پس از تهیه رقت‏های ‏‏1/0، آزمون‏های ‏‏میکروبی با توجه به روش‏های استاندارد انجام شد‏ (12). تعداد 48 جدایه اندول ‏‏‏مثبت، بررسی شدند. جدایه‏های ‏‏خالص به آگار مغذی درون لوله منتقل و برای آزمون تکمیلی در 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. همچنین، برای نگهداری تمام جدایه‏ها در سرم فیزیولوژی، تعدادی کلونی از کشت تازه هر جدایه به اپندورف‏های حاوی سرم فیزیولوژی سترون منتقل و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد‏. برای نگهداری دراز مدت، جدایه‏های خالص به لوله‏های حاوی محیط آگار مغذی منتقل و به مدت 24 ساعت در 35 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد‏. سپس، پارافین مایع سترون به لوله‏های کشت اضافه و در 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد‏ند.

ویژگی‏های کشت و واکنش‏های بیو شیمیایی: تمامی جدایه‏ها ‏با جدایه استاندارد اشرشیا کلی کد 1399 [4]تهیه شده از انیستیتو پاستور ایران در آزمون‏های بیوشیمیایی مقایسه شد‏ند. واکنش گرم باکتری‏ها ‏به دو روش رنگ‏آمیزی بر اساس روش اصلاح شده هوکر[5] و حلالیت در هیدروکسید پتاسیم 3 درصد انجام شد‏ (13- 15). برای بررسی ریخت‏شناختی میکروارگانیسم از رنگ‏آمیزی ساده استفاده شد (15). آزمون‏های کاتالاز[6]، اکسیداز[7]، ذوب ژلاتین، تولید گاز از گلوکز به روش شاد[8] انجام شد‏ (16). برای تمایز بین متابولیسم تخمیری از اکسیدی از محیط O/F ساخت شرکت مرک آلمان استفاده شد‏. تولید متیل رد و استوئین[9] در محیط آماده MR/VP، احیای نیترات در محیط آماده نیترات برات ساخت شرکت مرک آلمان[10] انجام شد‏. برای انجام آزمون تولید اوره آز از محیط پایه اوره آگار [11] حاوی 40 درصد اوره فیلترشده (22/0 میکرون) استفاده شد‏. بقیه آزمون‏ها ‏از جمله تولید سولفور، اندول، حرکت، مصرف سیترات، مصرف گلوکز، لاکتوز و سوکروز [12] روی محیط آماده ساخت شرکت مرک کشور آلمان انجام شد‏. برای بررسی پروفایل پروتئین‏ها ‏از کیت شرکت سیتومتین ژن[13] ساخت ایران مطابق دستور سازنده استفاده شد‏.

تحلیل‏‏ عددی[14]: برای دسته‏بندی جدایه‏ها ‏بر اساس متغیرهای بیوشیمیایی مهم و ترسیم دندروگرام از روش تحلیل‏‏ عددی استفاده شد‏. برای گروه‏بندی جدایه‏ها ‏از تجزیه خوشه ای[15] و برنامه[16] ترسیم نمودار استفاده شد (17).

روش انجام الکتروفورز پروتئین: الکتروفورز در قالب دو ژل دارای یک بخش متراکم کننده[17] در بالا و یک بخش جدا کننده[18] در پایین انجام شد. ژل جداکننده با غلظت 12 درصد و ژل متراکم کننده با غلظت 6 درصد به روش اصلاح شده لاملی[19] به شکل عمودی[20] انجام شد (18). قبل از قرار دادن نمونه‏ها ‏در حفره‏های ژل، از محلول 002/0 درصد برم فنل بلو حاوی 15 درصد گلیسرول به‏عنوان نشانگر استفاده شد‏. سپس، 30 میکرولیتر از نمونه‏ها ‏در حفره‏های ژل قرار داده شدند. پس از قرار گرفتن نمونه‏ها ‏در چاهک‏های ژل، الکتروفورز به مدت 4 ساعت در 100 ولت با شدت جریان 20 میلی‏آمپر و دمای ثابت 10 درجه سانتی‏گراد انجام شد‏. پس از رسیدن نشان گر به انتهای ژل صفحات شیشه‏ای از دستگاه خارج و ژل از بین آن بیرون آورده شد. رنگ‏آمیزی با محلول 1/0 درصد کوماسی بلو در محلول آب، متانول، اسید استیک به نسبت 1:5:5 به مدت یک شبانه روز روی شیکر با سرعت Rpm  59 انجام شد. سپس، رنگ بری با متانل، آب، اسید استیک به نسبت 1:5:5 به مدت 3 ساعت انجام شد و ژل در محلول 7 درصد اسید استیک نگهداری شد. برای ترسیم رگرسیون از مارکر مولکولی LMW-SDS Marker Kit [21] استفاد شد‏. لگاریتم وزن مولکولی مارکر و فاصله طی شده از سطح ژل برای هر باند مارکر محاسبه تا معادله رگرسیون برای نشان دادن وزن مولکولی باندهای مجهول ترسیم شود.

 

نتایج.

.ویژگی‏های بیوشیمیایی کلی فرم‏های جدا شده: از نمونه‏های ‏‏مختلف بستنی سنتی جمع‏آوری شده از نقاط ‏‏مختلف شهر اصفهان باکتری‏های ‏‏گرم منفی، میله‏ای شکل با طول 2 تا 6 میکرون و عرض 1 تا 5/1 میکرون، متحرک، واجد تاژک محیطی، فاقد اسپور، کاتالاز مثبت و اکسیداز منفی، قادر به احیای نیترات، تخمیری، از نظر کپسول بعضی کلونی‏های ‏‏موکوئیدی و واجد کپسول ولی بیشتر آن‏ها فاقد کپسول قادر به تولید اندول که به طور قابل توجهی به سویه اشرشیا کلی شباهت داشتند، جداسازی شد. پس از خالص‏سازی جدایه‏ها، ‏سایر آزمون‏های ‏‏بیوشیمیایی برای تشخیص قطعی تر انجام شد‏. تمامی جدایه‏های ‏‏به‏دست آمده از بستنی‏ها ‏روی محیط آگار مغذی در دمای 35 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت گرمخانه‏گذاری شد‏ند. ایجاد کلونی‏های ‏‏صاف، مدور، خاکستری با سطح براق و لبه‏های ‏‏گرد به اندازه 1 تا 3 میلی‏متر دارای قوام کره‏ای و روی محیط‏های کشت ائورین متیلن بلو و کرومو کالت آگار قادر به رشد بودند، محیط آبگوشت مغذی را به طور یکنواخت کدر می‏کنند و رسوبی در ته لوله بوجود می‏آورند که با تکان دادن حل می‏شود قادر به تولید گاز از لاکتوز در محیط LMX بودند(شکل 1). از میان 48 جدایه اندول مثبت به‏دست آمده (شکل2)، 71 درصد قادر به ایجاد رنگ سبزمتالیک در محیط ائوزین متیلن بلو، 83 درصد قادر به ایجاد کلونی آبی بنفش روی محیط کروموکالت آگار، واکنش متیل رد و تولید استوئین به ترتیب 96 و 2 درصد مثبت، 8 درصد قادر به هیدرولیز ژلاتین، 71 درصد قادر به ایجاد رنگ فلورسانت در محیط LMX در مقابل نور فرابنفش ‌با طول موج 366 نانومتر، 84 درصد جدایه‏ها ‏قادر به ایجاد رنگ آبی در محیط LMX، 13 درصد قادر به تولید اوره آز و 88 درصد قادر به حرکت بودند. 85 درصد جدایه‏ها ‏روی محیط مک کانکی به علت تخمیر لاکتوز کلونی‏های ‏‏قرمز رنگ بوجود آوردند. نتایج ویژگی‏های بیوشیمیایی در جدول 1 مشخص شد‏ه است.

تحلیل‏‏ عددی: به علت وجود تنوع بیوشیمیایی میان جدایه‏ها ‏و عدم تشخیص قطعی از دسته‏بندی جدایه‏ها ‏استفاده شد‏. خوشه‏ها ‏بر حسب متغیرهای مهم دسته‏بندی شد‏. تحلیل‏‏ عددی بیان گر قرار گرفتن جدایه‏ها ‏در 8 گروه بر اساس اختلاف در آزمون‏های ‏‏بیوشیمیایی بودند (شکل 3).

 

 

شکل 1- رنگ آبی مایل به سبز در لوله سمت چپ و تولید اندول در لوله وسط در مقایسه با لوله شاهد سمت راست

 

 

شکل 2- واکنش اشرشیاکلی‏، تولید گاز در محیط Triple sugar iron agar عدم مصرف سیترات در محیط سیمون سیترات و تولید اندول در محیط تریپتون واتر برات

 

جدول 1- ویژگی‏های گروه‏های انتروباکتریاسه جداشده از بستنی

شماره گروه

 

آزمون

درصد استرین‏های ‏‏مثبت هر گروه

E.coli

ATCC1399

1

(34)

2

(4)

3

(2)

4

(1)

5

(1)

6

(1)

7

(4)

8

(1)

گرم

کاتالاز

+

+

+

+

+

+

+

+

+

اکسیداز

احیای نیترات

+

+

+

+

+

+

+

+

+

متابولیسم تخمیری

+

+

+

+

+

+

+

+

+

ایجاد رنگ فلورسانت روی LMX

+

+

ایجاد رنگ سبز متالیک روی EMB

+

+

ایجاد رنگ سبز آبی روی LMX

+

+

+

+

+

ایجاد کلونی قرمز روی مک کانکی آگار

+

+

+

+

+

ایجاد کلونی بنفش روی کروموکالت آگار

+

+

50

+

+

تولید پیگمان

+

هیدرولیز اوره

+

+

+

مصرف سیترات

+

+

متیل رد (MR)

+

+

+

+

+

+

+

تولید استوئین (VP)

+

هیدرولیز ژلاتین

9

11

25

هیدرولیز لیزین

60

50

+

+

50

+

تولید اندول

(+)

(+)

+

+

+

+

+

+

+

حرکت

+

+

+

+

+

+

تولید گاز از گلوکز

+

+

+

+

+

تولید H2S از سیستئن

واکنش اسیدی

(ACID /acid +G)

+

+

+

+

+

تولید قلیا (ALK/acid)

+

+

+

سیترات

+

+

سوکروز

(+)

(+)

ND

+

ND

+

مالتوز

(+)

(+)

ND

(+)

+

ND

(+)

ملیبیوز

(+)

(+)

ND

(+)

+

ND

(+)

سلوبیوز

ND

+

ND

ترهالوز

+

+

ND

+

+

ND

+

سوربیتول

(+)

(+)

ND

(+)

+

ND

(+)

ملونات

ND

+

ND

+: بیش از 80 درصد جدایه‏ها ‏در مدت 24 تا 48 ساعت مثبت بودند.

-: بیش از 80 درصد جدایه‏ها ‏در مدت 5 روز منفی بودند.

(+): بیش از 80 درصد جدایه‏ها ‏پس از 72 ساعت مثبت تاخیری بودند.

ND: Not Determine

 

شکل 3 - گروه‏بندی جدایه‏ها ‏بر اساس شباهت در آزمون‏های بیوشیمیایی شامل گروه اول (از جدایه 1تا جدایه 16)، گروه دوم (از جدایه 22 تا جدایه 29)، گروه سوم (از جدایه 39 تا جدایه 42)، گروه چهارم (جدایه 2)، گروه پنجم (جدایه 6)، گروه ششم (جدایه 32)، گروه هفتم (از جدایه 21تا جدایه 35) و گروه هشتم (جدایه 46)

 

 

در نتایج 31 آزمون فنوتیپی تنوع ما بین زیر گونه استاندارد و جدایه‏های ‏‏به‏دست آمده مشاهده شد‏. با استفاده از تحلیل‏‏ عددی و ترسیم دندروگرام جدایه‏ها ‏در 8 گروه قرار گرفتند. این گروه‏ها ‏نتیجه تفاوت فنوتیپی بین استرین‏ها ‏و اختلاف آن‏ها ‏‏در تولید اسید با استفاده از منابع کربنی مختلف بود.

جدایه‏ها‏ی گروه اول قادر به ایجادکلونی‏هایی با رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو، کلونی‏هایی با رنگ بنفش روی کروموکالت آگار و رنگ فلورسانت در مقابل لامپ ماوراء بنفش با طول موج 366 نانومتر، متیل رد مثبت، تولید استوئین منفی، متحرک، ‌فاقد توانایی هیدرولیز اوره و فاقد توانایی مصرف سیترات بودند، همچنین، قادر به هیدرولیز لیزین و قادر به تخمیر گلوکز در شرایط بی‏هوازی بوده که از این جهات کاملاً شبیه جدایه‏های ‏‏استاندارد بودند. ولی تنها 9 درصد جدایه‏های ‏‏گروه یک قادر به هیدرولیز ژلاتین بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند.

استرین گروه دوم قادر به ایجاد رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو نبودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. ولی همگی توانایی تولید کلونی قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار را داشتند. تمامی‏ جدایه‏ها ‏قادربه ایجاد رنگ آبی در محیط LMX بوده ولی هیچکدام قادر به ایجاد رنگ فلورسانت در مقابل نور فرابنفش با طول موج 366 نانومتر نبودند که از این لحاظ با جدایه‏های ‏‏استاندارد اختلاف داشتند. تمامی‏ جدایه‏ها ‏متحرک، فاقد توانایی هیدرولیز اوره و فاقد توانایی مصرف سیترات بودند. متیل رد مثبت و تولید استوئین منفی، فاقد توانایی هیدرولیز ژلاتین، متحرک، قادر به ایجاد واکنش Acid /Acid+G و تنها 50 درصد جدایه‏ها ‏قادر به هیدرولیز لیزین بودند، که از این لحاظ بسیار شبیه به جدایه استاندارد بودند. همچنین، نقوش الکتروفورزی جدایه‏های ‏‏فوق شباهت بسیار زیادی به جدایه استاندارد داشتند. اما جدایه‏های ‏‏این گروه مانند جدایه‏های ‏‏گروه 2 شدیداً تخمیری نبودند.

جدایه‏های ‏‏گروه سوم عدم توانایی تولید رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو و کلونی‏های ‏‏قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار را داشته، 50 درصد جدایه‏ها ‏قادر به ایجاد کلونی‏های ‏‏آبی بنفش روی محیط کروموکالت آگار بودند. همگی قادر به ایجاد رنگ آبی در محیط LMX broth ‌بودند، ولی فاقد توانایی ایجاد فلورسانت در مقابل نور فرابنفش ‌با طول موج 366 نانومتر بودند. تمامی‏ جدایه‏ها ‏قادر به تولید پیگمان زرد روی محیط آگار مغذی، فاقد توانایی هیدرولیز اوره، فاقد توانایی مصرف سیترات، قادر به تولید متیل رد، فاقد توانایی تولید استوئین، فاقد توانایی هیدرولیز ژلاتین، متحرک، قادر به تولید واکنش Acid /Acid+G در محیط TSI و فاقد توانایی هیدرولیز لیزین بودند که از این لحاظ به Escherichia hermaniشباهت داشتند.

جدایه‏های ‏‏گروه چهارم فاقد توانایی تولید رنگ سبز متالیک روی محیط ائوزین متیلن بلو ‌و فاقد توانایی ایجاد کلونی‏ها ‏‏به رنگ قرمز در محیط مک کانگی آگار بوده، ولی قادر به ایجاد کلونی‏هایی به رنگ آبی بنفش در محیط کروموکالت آگار و ایجاد رنگ آبی فاقد فلورسانت در محیط LMX broth بودند. آن‏ها ‏‏‏فاقد پیگمان، فاقد هیدرولیز اوره، فاقد توانایی مصرف سیترات، متیل رد منفی و فاقد توانایی تولید استوئین،
غیر متحرک ولی قادر به هیدرولیز لیزین بوده که بر اساس آزمون‏های ‏‏بیو شیمیایی به E.coli (Metabolically Inactive Strains) شباهت داشتند، ولی با اشرشیاکلی‏ تیپیک کاملاً متفاوت بودند.

جدایه‏های ‏‏گروه پنجم فاقد توانایی تولید رنگ سبز متالیک در محیط ائوزین متیلن بلو و فقدان تولیدکلونی‏های ‏‏قرمز رنگ در محیط مک کانگی آگار، فقدان تولید کلونی‏های ‏‏آبی بنفش در محیط کروموکالت آگار، فقدان تولید رنگ آبی و فلورسانت در محیط LMX broth قادر به هیدرولیز اوره، قادر به مصرف سیترات، متیل رد مثبت، متحرک و ایجاد واکنش ALK/acid در محیط TSI، فاقد توانایی هیدرولیز لیزین بوده و به Providencia rettgeri شباهت داشتند.

جدایه‏های ‏‏گروه ششم به علت هیدرولیزه اوره، مصرف سیترات، ایجاد کلونی‏های ‏‏قرمز رنگ روی محیط مک کانگی آگار، متیل رد منفی، قادر به تولید استوئین، غیر متحرک، ایجاد واکنش
 Acid /Acid+G و توانایی هیدرولیز لیزین به Klebsiella oxytoca شباهت داشتند.

جدایه‏های ‏‏گروه هفتم به علت هیدرولیز اوره، عدم مصرف سیترات، تولید اسید مخلوط (متیل رد مثبت) فاقد تولید استوئین ایجاد واکنش ALK/acid در محیط TSI، فقدان تولید کلونی‏های ‏‏قرمز رنگ در محیط مک کانگی آگار، فقدان ایجاد رنگ سبز متالیک در محیط ائوزین متیلن بلو[22]، فقدان ایجاد رنگ آبی همراه با فلورسانت در محیط LMX broth شباهت زیادی به Morganella morganiداشتند.

جدایه گروه هشتم نیز به علت تولید اسید مخلوط، متیل رد مثبت، ایجاد واکنش ALK/acid در دندروگرام به جدایه M.morgani شباهت داشت ولی به علت عدم توانایی در هیدرولیز اوره و متحرک بودن با‌آن اختلاف داشت و به علت آنکه از لحاظ سایر ویژگی‏های متابولیکی ضعیف بود و واکنش‏هایی بینابینی با سایر جنس‏های ‏‏خانواده انتروباکتریاسه نشان می‏داد نظیر شباهت‏هایی که با (Metabolic inactive) E.coliداشت در هیچ گروه شناخته شده‏ای طبقه‏بندی نشد‏.

الکتروفورز پروتئین سلولی: باکتری‏ها ‏روی محیط آگار مغذی کشت و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد‏ند. سپس، کلونی‏ها ‏در آب مقطر سترون سوسپانسیون و OD آن‏ها ‏‏روی 3/2 تا 3 واحد در 600 نانومتر با اسپکتروفوتومتر تنظیم شد‏. به نمونه‏ها ‏بافر حاوی سدیم دودسیل سولفات،
2- مرکاپتواتانول[23] اضافه و به مدت 5 دقیقه در 95 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. پس از لیز شدن و استخراج پروتئین، الکترو فورز در ژل 12درصد پلی‏اکریل آمید درسیستم ناپیوسته مطابق دستورالعمل کیت انجام شد. نمودار رگرسیون برای نشان دادن وزن مولکولی ترسیم شد‏، که نشان می‏دهد با هر واحد افزایش فاصله از سطح ژل، در حدود 14/0 از لگاریتم وزن مولکولی مارکر کاسته خواهد شد و در حالت کلی 95/0 از تغییرات لگاریتمی وزن مولکولی توسط فاصله طی شده در ژل جدا کننده بر مبنی کیلودالتون قابل پیشگویی است (شکل 4).

در مقایسه الکتروفورز پروتئین‏ها‏ی جدایه‏ها ‏با یکدیگر و جدایه استاندارد اشرشیا کلی کد 1399، شباهت بسیار زیادی بین جدایه‏های جداسازی شده با یکدیگر و جدایه استاندارد قابل مشاهده بود. ولی اختلافاتی نیز وجود داشت. در جدایه شماره 3 پنج باند پروتئینی به وزن مولکولی 95/80، 35/24، 15/22، 75/17 و 15/12 کیلو دالتون وجود داشت. که ازاین نظر با جدایه‏های ‏‏استاندارد اختلاف داشتند. جدایه شماره 42 دارای یک باند به وزن 59/23 کیلو دالتون و باند دیگر به وزن 79/20 کیلو دالتون بود که با جدایه استاندارد اختلاف داشت. جدایه‏های شماره 2، 3، 4، 6، 7، 8 و 1 دارای یک باند پروتئینی به وزن مولکولی 73/9 کیلودالتون بودند که با جدایه استاندارد اختلاف داشت. همچنین، جدایه‏های ‏‏شماره 11 و 12 دارای یک باند پروتئینی به وزن مولکولی 66/16 کیلودالتون بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. نمونه‏گیری مجدد با تعداد بیشتر جدایه‏ها ‏انجام شد‏ تا الگوی دقیق‏تری از پروفایل‏های پروتئینی جدایه‏های ‏‏اشرشیاکلی‏ به‏دست آید. در الگوهای الکتروفورزی سایر سویه‏های به‏دست آمده از بستنی این اختلاف با جدایه استاندارد قابل مشاهده بود (شکل 5).

 

 

شکل4- رگرسیون بین وزن مولکولی مارکر و فاصله طی شده در ژل جدا کننده

 

 

Lane 1, 13; Lane 2, 1; Lane 3, 2; Lane 4, 3; Lane 5, 5; Lane 6, 7; Lane 7, 11; Lane 8 ,12 ; Lane 9, 10 and Lane 10, Reference strains E. coli ATCC ; Lane 11, Marker

 

شکل5- نقوش الکتروفورزی جدایه‏های ‏‏به‏دست آمده در مقایسه با جدایه استاندارد

 

 

 

 


بحث و نتیجه ‏‏گیری.

باکتری‏هایی که در مواد غذایی حضور دارند تحت تاثیر فرآیندهای مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار می‏گیرند. این موارد باعث ایجاد شوک در باکتری‏ها شده و باکتری را وادار به تولید پروتئین‏ها ‏و در برخی موارد‏ تغییراتی در تولید آنزیم‏ها ‏نموده که این امر می‏تواند ویژگی‏های خاصی به آن‏ها ‏‏داده که اطلاع از این ویژگی در تشخیص به موقع و دقیق‏تر کمک کننده است. در این بررسی جدایه‏های ‏‏اندول مثبت نظیرinactive) )E.coli، E.hermani، P.rettgeri، K.oxytoca، M.mogani می‏توانستند در نتیجه نهایی خطا ایجاد کنند، اما تحلیل‏‏‏های ‏‏انجام شده با استفاده از محیط‏های ‏‏حاوی مواد کروموژنیک نظیر LMX broth و کرموکالت آگار و و ایجاد فلورسانت در طول موج 366 نانومتر نشان داد، که با حداقل خطای احتمالی می‏توان اشرشیا کلی را شناسایی کرد. البته باید به این نکته توجه کرد که در این روش بستنی‏های ‏‏حاوی مواد رنگی نظیر زعفران، کاکائو، توت فرنگی و ... به علت ایجاد تغییر رنگ محیط و اختلال در فلورسانت حاصل می‏تواند باعث ایجاد خطا در نتیجه آزمون شود ‏و از آنجا که رنگ فلورسانت اهمیت زیادی دارد، در این بررسی کوشش شد تا بیشتر از نمونه‏های ‏‏شیری پاستوریزه استفاده ‏شود،‏ هر چند از نمونه‏های ‏‏حاوی مواد رنگی نیز استفاده شد‏، ولی به علت ایجاد رقت بالا برای حل این مشکل، زمان جواب در این روش طولانی‏تر شد‏. اگر از رقت یک‏دهم استفاده ‏شود‏ بسته به تعداد اشرشیاکلی در نمونه، جواب آزمون بین 7 تا 24 ساعت زمان لازم دارد. در بررسی‏های ‏‏انجام شده نتایج حاصل از میزان آلودگی به اشرشیاکلی‏ با نتایج کریم[xxiv] و همکاران مطابقت داشت. بررسی‏های انجام شده نشان داد جدایه‏های به‏دست آمده از بستنی‏های سنتی در الگوی الکتروفورزی دارای دو باند پروتئینی در ناحیه 59/23 و 79/20 بودند که از این لحاظ با جدایه استاندارد اختلاف داشتند. به نظر می‏رسد این جدایه‏ها ‏به علت قرار گرفتن در شرایط مختلف دمایی نظیر پاستوریزاسیون و انجماد دچار تغییراتی در ویژگی‏های‏ آنزیمی و پروتئین‏های ساختمانی شد‏ند. بنابراین، لازم است در روند تشخیص این جدایه‏ها ‏این نکات مد نظر قرار بگیرد، زیرا تغییر در پروفایل پروتئینی می‏تواند باعث تغییر در ویژگی‏های‏ بیوشیمیایی ‏شود‏ و در نهایت، ‏باعث ابهام در تشخیص ‏شود‏. بررسی‏های انجام شده نشان داد بین جدایه‏های به‏دست آمده از بستنی و جدایه استاندارد تفاوت‏هایی ‏وجود دارد. جدایه استاندارد دارای یک باند پروتئینی مشخص با وزن مولکولی 86/22 کیلودالتون بود ولی جدایه‏های به‏دست آمده بیشتر دارای وزن مولکولی 59/23 کیلودالتون و 79/20 کیلودالتون بودند که یک تفاوت کاملا مشخص بین این جدایه‏ها ‏با جدایه استاندارد بود. این امر می‏تواند یک شاخص مهم برای جدایه‏هایی ‏باشد که تحت تاثیر شوک‏های حرارتی قرار می‏گیرند. با توجه به وجود تفاوت‏هایی ‏که این دو باند با جدایه استاندارد نشان می‏دهد  شاید بتوان نتیجه گرفت، جدایه‏های ‏‏باکتریایی که در مواد غذایی حضور دارند به علت آنکه تحت تاثیر فرآیند‏‏های ‏‏مختلف دمایی نظیر سرما و گرما قرار می‏گیرند، باکتری را وادار به تولید پروتئین‏ها ‏ و در برخی موارد‏ تغییراتی در تولید آنزیم نموده که این امر باعث شده جدایه‏های ‏‏حاصل دچار تغییراتی به علت شوک سرد شد‏ه که می‏تواند ویژگی‏های خاصی به جدایه‏ها جهت مقاومت در مقابل این عوامل مخرب ‏بدهد. تفاوت در ویژگی‏های‏ جدایه‏های ‏‏گروه یک و دو با جدایه استاندارد نشان دهنده این مهم است.

در مطالعاتی که توسط ندایی نیا[xxv] و همکاران در شهر اصفهان انجام شد، نتایج مشابهی از تفاوت باندهای پروتئینی در جدایه‏های حاصل از بستنی و جدایه استاندارد وجود داشت که با یافته‏های این مطالعه مطابقت می‏کند (19). بیشتر مطالعات انجام شده در مورد بررسی آلودگی نمونه‏های غذایی با رویکرد سلامت محور مد نظر قرار گرفته که نمونه‏هایی ‏از آن آورده شده است ولی از لحاظ مولکولی نیاز است در این مورد بررسی‏های بیشتری در نقاط مختلف روی نمونه‏های غذایی مختلف انجام گیرد. مطالعات انجام شده در پاکستان توسط سومور[xxvi] نشان داد که نزدیک به 60 درصد نمونه‏های ‏‏شیر خام به اشرشیاکلی‏ آلوده بود و این جدایه‏ها ‏تحت تاثیر فرآیندهای حرارتی می‏تواند دچار ویژگی‏های‏ متفاوتی ‏شود‏ که باعث تشخیص مشکل تر آن در محصول می‏شود ‏(9). در بررسی‏های ‏‏انجام شده در شهرکرد توسط شاکریان[xxvii] و همکاران، 200 نمونه بستنی سنتی از سطح شهرستان جمع‏آوری و از نظر آلودگی میکروبی آزمایش شد. از این تعداد 100 نمونه آلودگی به باکتری‏های هوازی مزوفیل، 114 نمونه آلودگی به استافیلوکوکوس اورئوس، 99 نمونه آلودگی به انتروباکتریاسه و 2 نمونه به اشرشیاکلی‏ آلوده بودند (20). در بررسی دیگری که در شهرستان مشهد انجام شد‏ 91 درصد از نمونه‏های ‏‏بستنی سنتی دارای آلودگی میکروبی بودند، که از این تعداد 84 درصد به باکتری خانواده انتروباکتریاسه، 67 درصد به استاف اورئوس و 11 درصد به اشرشیاکلی‏ آلوده بودند (19). در بررسی دیگری که در شهرستان گناباد توسط محمدزاده[xxviii] و همکاران روی بستنی سنتی انجام شده میزان 32 درصد از نمونه‏ها ‏آلوده به اشرشیاکلی‏ بودند (21). در بررسی دیگری که توسط پورمحمودی[xxix] و همکاران در شهر یاسوج انجام شد، 70 درصد مراکز تهیه و توزیع بستنی سنتی آلودگی میکروبی داشتند که از این مقدار 17 درصد کل نمونه‏ها ‏آلوده به اشرشیاکلی‏ بودند (1). نتایج پژوهش کریم[xxx] و همکاران نیز نشان داد که در پنج منطقه تهران (شمال – جنوب – شرق – غرب و مرکز) 61/63 درصد در شمال، 08/81 درصد در جنوب، 9/72 درصد در شرق، 8/75 درصد در غرب و 7/85 درصد در مرکز به اشرشیاکلی‏ آلوده بودند (22). ارزیابی وضعیت فیزیکی- شیمیایی و میکروبی بستنی‏های ‏‏سنتی تولید شده در شهر زاهدان توسط شادان[xxxi] و همکاران نشان داد که 2 درصد نمونه‏ها ‏در فصل بهار و 3/5 درصد نمونه‏ها ‏در فصل تابستان آلوده بودند (23). در بررسی دیگری در شیراز توسط شکر فروش[xxxii] و همکاران انجام شد، نشان داد که از 70 واحد تولید و عرضه بستنی سنتی 20 درصد نمونه‏ها ‏به اشرشیاکلی‏ آلوده بودند (24). بررسی‏هایی انجام شده توسط صالحیان[xxxiii] و همکاران در شهر ساری نشان داد که 84 درصد بستنی‏های ‏‏سنتی آلوده هستند، که آلودگی به اشرشیا کلی 52 درصد را به خود اختصاص داده است (25). بنابراین، بر اساس بررسی‏های انجام شده از ظاهر واحدهای تهیه، تولید و توزیع بستنی‏های سنتی نمی‏توان از بهداشتی بودن سلامت محصول اطمینان حاصل کرد. با توجه به موارد مطرح شده در مورد میزان آلودگی و اهمیت اشرشیا کلی به عنوان شاخص بهداشتی لازم است بررسی‏های بیشتر با رویکرد مولکولی به‏ویژه در زمینه غذایی انجام شود.

تشکر و قدردانی

از معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، واحد تحقیق و توسعه معاونت غذا و دارو، مدیریت و همکاران محترم بخش میکروب‏شناسی آزمایشگاه کنترل مواد غذایی، آشامیدنی، آرایشی و بهداشتی که با حمایت‏های مالی و با در اختیار قرار دادن امکانات ما را در انجام این پژوهش یاری فرمودند تشکر و قدردانی می‏شود.



[1]- Fluorocult LMX Broth Modified (Merck 1.10620)

[2]- Kovac's reagent

[3]- Nutrient agar

[4]- ATCC1399 E. coli

[5]- Hucker

[6]- Catalase

[7]- Oxidase test

[8]- Schaad

[9]- Clark and Lubs medium

[10]- Merck, Germany

[11]- Christensen

[12]- Triple sugar Iron agar

[13]- cyto Matin GeneImmune, IRAN

[14]- Numerical analysis

[15]- UPGMA

[16]- NTSYSPC VER .2.02e

[17]- Stacking Gel

[18]- Separating Gel

[19]- Laemmmli

[20]- Vertical slab unit

[21]- LMW-SDS Marker Kit (14 kDa−97 KDa) (Uppsala, Sweden)

[22]- EMB

[23]- 2ME

[xxiv]- Karim

[xxv]- Nedaeinia

[xxvi]- Soomro

[xxvii]- Shakerian

[xxviii]- Mohamadzadeh

[xxix]- Pourmahmoodi

[xxx]- Karim, G

[xxxi]- Shadan

[xxxii]- Shekarforoush

[xxxiii]- Salehian

 

(1)               Pourmahmoodi A., Mohammadi j., Mirzai A., Momeni Negad M., Afshar R. Epidemiological study of traditional ice cream in YASUJ. Armaghan danesh 2002; 8 (29): 59- 65. [In Persian].

(2)               Black RE., Brown KH., Becker S., Alim ARMA., Merson MH. Contamination of weaning foods and transmission of enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea in children in rural Bangladesh. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 1982; 76 (2): 259- 64.

(3)               Claeys WL., Cardoen S., Daube G., De Block J., Dewettinck K., Dierick K., et al. Raw or heated cow milk consumption: Review of risks and benefits. Food Control 2013; 31 (1): 251- 62.

(4)               Domenech E., Amoros JA., Escriche I. Effectiveness of prerequisites and the HACCP plan in the control of microbial contamination in ice cream and cheese companies. Foodborne pathogens and disease 2013; 10 (3): 222- 8. PubMed PMID: 23405882. Epub 2013.

(5)               Jooste PJ., Anelich L., Motarjemi Y. Safety of Food and Beverages: Milk and Dairy Products. In: Motarjemi Y, editor. Encyclopedia of Food Safety. Waltham: Academic Press; 2014.

(6)               Motarjemi Y., Moy GG., Jooste PJ., Anelich LE. Chapter 5 - Milk and Dairy Products. In: Motarjemi Y., Lelieveld H., editors. Food Safety Management. San Diego: Academic Press; 2014.

(7)               Moyo SJ., Maselle SY., Matee MI., Longeland N. Identification of diarregenic Esherchia Coli isolated from. Infants and children in Dar es salam, Tanzania. BMC Infectious Diseases 2007; 7 (92): 1471- 2334.

(8)               Oliver SP., Jayarao BM., Almeida RA. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne pathogens and disease 2005 Summer; 2 (2): 115- 29. PubMed PMID: 15992306. Epub 2005.

(9)               Soomro AH., Arion MA., Khaskheli M., Bhutto B. Isolation of Escherichia coli from row milk productions in relation to public health sold under market conditions at tandojam. Pakistam Journal of Nutrition 2002; 1 (3): 151- 2.

(10)           Hill, Bruce, Smythe, Betty, Lindsay, Denise, & Shepherd, Joanna. Microbiology of raw milk in New Zealand. International Journal of Food Microbiology, 2012; 157(2), 305-308.

(11)           Hosseini Jazani N., hadizadeh O., Farzaneh H., Moloudizargari M. Synergistic antibacterial effects of β- Chloro- L- alanine and phosphomycin on urinary tract isolates of E. coli. Biological Journal of Microorganism 2013; 1 (4): 1- 6.

(12)           Murray P. R., Baron E. J., Jorgensen J. H., Landry M. L., Pfaller M. A. (ed.), Manual of clinical microbiology. vol. 9. Washington, DC: ASM Press; 2007.

(13)           Finegold SM, Martin WJ. Determination of susceptibility of bacteria to antimicrobial agents; assay of antimicrobial agents. Bailey and Scott's diagnostic microbiology, 6th ed. United States: Mosby;1982.

(14)           Forbes BA, Sahm DF, Weissfeld AS, Bailey SS. Diagnostic microbiology 12th Edition: Mosby Elsevier, St. Louis, MO. 2007:778-81..

(15)           Murray PR., Rosenthal KS., Pfaller MA. Medical microbiology. Netherlands: Elsevier Health Sciences; 2015.

(16)           Schaad NW., Jones JB., Chun W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. Minessota: APS press, 2001.

(17)           Sneath PHA., Sokal RR. Numerical Taxonomy: The Principles of Numerical Classification. San Francisco, CA, USA: Freeman, 1973.

(18)           Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227 (5259): 680- 5.

(19)           Nedaeinia R., Hejazi M., Javadi S., Feyzie M., Merasie MR. Statistical Study of the Rate of Contamination of Ice- cream made Traditionally and Industrially with Escherichia coli Bacteria and Optimizing Methods of Identifying Escherichia coli in Isfahan City in 2007: Isfahan University of Medical Sciences; 2009.

(20)           Shakerian A., Karim G., Tajbakhsh E., Shafiei M. Investigating the microbial contamination of traditional ice creams in shahr- e- kord. IJFST 2006; 2 (4): 7- 21. [In Persian].

(21)            Mohamadzadeh M., Ghahramani H., Mokhtarian D., Shariatifar N. The survey on the bacterial contamination of traditional ice cream produced in Gonabad city. Ofogh- e- Danesh; Journal of Gonabad University of Medical Sciences 2009 15 (1): 45- 52. [In Persian].

(22)           Karim G., Razavilar V., Akhondzadeh A. Survey on the contamination of Traditional Iranian ice cream with important bacteria associated with foodborn infection and intoxication. Journal Of Veterinary Reasearch 1995; 50 (1 and 2). [In Persian].

(23)           Shadan M., Juice F., Saffari F. Physicochemical and microbiological status of traditional ice cream Zahedan. Journal of Materials Science and Engineering (Doctor East) Winter 1381; 4 (4): 215- 22. [In Persian].

(24)           Shekarforoush SS., Jafarpor B. Comparison of the Bacterial and Chemical Properties of Traditional Iranian Ice Cream Produced in Shiraz with Iran National Standard. IJFST 2006; 3 (2): 11- 7. [In Persian].

(25)           Maryam Salehian., Ebrahim Salehifar., Mohammad Esfahanizadeh., Laleh Karimzadeh., Roghieh Rezaei., Mehdi Molanejad. Microbial Contamination in Traditional Ice cream and Effective Factors. Journal of Mazandaran University of Medical Sciences 2013; 23 (99): 28- 33. [In Persian].