بررسی اثر ضد میکروبی و ضد اتصالی لاکتوباسیلوس‏ های ‏پروبیوتیکی بر باکتری اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک ‏‏(UPEC)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی، ‏واحد دامغان، ‏دامغان، ‏ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی، ‏واحد دامغان، ‏دامغان، ‏ایران

3 استادیار علوم سلولی و مولکولی، ‏دانشگاه آزاد اسلامی، ‏واحد دامغان، ‏دامغان، ‏ایران

چکیده

مقدمه: یکی از عوامل مهم در عفونت‏های دستگاه ادراری ناشی از اشریشیاکلای یوروپاتوژنیک، ‏چسبیدن باکتری به سطح سلول میزبان است. بنابراین، ‏مهار اتصال باکتری، ‏راهکاری مناسب برای مهار و پیشگیری از عفونت است‏. هدف از پژوهش حاضر، ‏بررسی خواص ضد میکروبی و به ویژه ضد اتصالی پروبیوتیک‏ها بر روی پاتوژن شایع دستگاه ادرای ‏(‏اشریشیاکلی)، ‏با استفاده از روش‏های ‏میکروبی است.

مواد و روش ‏‏ها: در پژوهش حاضر از دو سویه لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس PTCC 1643 و لاکتوباسیلوس کازه‏ای PTCC 1608 استفاده شد. تعداد 40 باکتری اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک از بیمارستان‏های ‏استان سمنان جمع‏آوری ‏شد. 20 نمونه با بیش‏ترین‏ توانایی در تولید بیوفیلم، ‏برای انجام آزمون‏های ‏میکروبی انتخاب شدند. به منظور بررسی آثار‏ ضد میکروبی لاکتوباسیلوس‏ها در حالت کشت کامل و مایع رویی کشت ‏(‏سوپرناتانت)، ‏به ترتیب از روش‏های ‏کشت دولایه اصلاح شده و رقت‏سازی سوپرناتانت استفاده شد. مکانیسم تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس‏ها با پاتوژن مورد نظر بررسی شد. تشخیص فعالیت ضد اتصالی سوپرناتانت لاکتوباسیلوس‏ها، ‏با استفاده از روش میکروتیترپلیت 96 خانه‏ای انجام شد.

نتایج: در تمامی آزمون‏های ‏میکروبی به‏کار رفته اثر ضد میکروبی و اثر ضد اتصالی لاکتوباسیلوس‏ها بر باکتری‏های ‏اشریشیاکلی یوروپاتوژنیک تایید شد. لاکتوباسیلوس کازه‏ای با اثر مهاری رشد (‏7/42 میلی‏متر) و ضد اتصالی (‏7/46 درصد) به‏عنوان باکتری ﭘروبیوتیک مناسب‏تر در این پژوهش گزارش شد.‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: با توجه به نتایج به دست آمده لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی در جلوگیری از اتصال، ‏تشکیل بیوفیلم و بیماری‏زایی باکتری اشرشیاکلی یوروپاتوژنیک دارای آثار‏ چشمگیری هستند. بنابراین، ‏استفاده از آن‏ها برای پیشگیری و درمان عفونت دستگاه ادرای به‏عنوان راهکاری مهم و عملی، ‏منطقی و قابل قبول است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The study of Antimicrobial and Anti-adhesive effect of ProbioticLactobacilli on Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)

نویسندگان [English]

  • Mahsa Sadri 1
  • Nazila Arbab Soleimani 2
  • Mohammad Mahdi Forghanifard 3
1 M.Sc. of Microbiology, Department of Micribiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Department of Microbiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
3 Assistant Professor of Cell and molecular biology, Department of Biology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
چکیده [English]

Introduction: One of the most important factors in Urinary Tract Infection caused by Uropathogenic Escherichia coli, is the attachment of bacteria to the host cell surface. Thus, inhibition of bacterial attachment is the appropriate action to prevent infection. The aim of this study was to investigate the antimicrobial and especially anti adhesive characteristics of probiotic bacteria against Escherichia coli by using microbial techniques.

Materials and methods: In this study two strains of Lactobacillus acidophilus PTCC 1643 and Lactobacillus casei PTCC 1608 were used .40 Uropathogenic Escherichia coli were collected from Semnan province hospitals.20 samples with the more capability of biofilm production were selected for microbial tests. To evaluate the antimicrobial activity of complete culture and supernatant of probiotic lactobacilli, modified double layer method and dilution of supernatant were used, respectively. The mechanism of co- aggregation of lactobacilli with pathogens was examined. The microtitre plate method was used to detect anti-adhesive activity of Lactobacilli supernatant.

Results: The antimicrobial and anti-adhesive effects of probiotic lactobacilli on Uropathogenic Escherichia coli were confirmed in all tests. In this study, Lactobacillus casie with the growth inhibitory (42/7 mm) and anti-adhesive (46/7mm) effects were reported as a proper probiotic bacterium.

Discussion and conclusion: According to the results, the probiotic lactobacilli have spectacular effects to prevent attachment, biofilm formation and pathogenicity of UPEC, so using them to prevent and treat Urinary tract infection is a practical, reasonable and acceptable method.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Uropathogenic Escherichia coli
  • Probiotic lactobacilli
  • Urinary tract infection
  • Antimicrobial and Antiadhesive Effect

مقدمه.

یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی[1] عامل اولیه عفونت دستگاه ادراری[2] در کشورهای توسعه یافته محسوب می‏شود ‏(‏1). در ایالات متحده امریکا سالانه 6/1 میلیارد دلار هزینه صرف درمان این بیماری می‏شود‏ و تخمین زده می‏شود 40 تا 50 درصد از زنان سالم بالغ در طول دوره زندگی خود حداقل یک‏بار عفونت دستگاه ادراری را تجربه می‏کنند ‏(‏2). این بیماری ابتدا با عفونت مثانه شروع می‏شود، ‏بیشتر با فرا گرفتن کلیه‏ها توسعه پیدا کرده و سرانجام ممکن است به نارسایی کلیوی منجر شود و حتی به خون هم راه یابد ‏(‏1). توانایی این باکتری برای اتصال به بافت‏های ‏میزبان یکی از برترین عامل‏هاست که کلونیزاسیون را در دستگاه ادراری تسهیل می‏کند و اجازه ﭘایداری باکتری در برابر جریان ادراری و هجوم آن به اپیتلیال مثانه را می‏دهد. پدیده اتصال، ‏ورود باکتری به داخل سلول‏های ‏اپیتلیال را تحریک می‏کند ‏(‏‏2).

یکی از راه‏های ‏کنترل عفونت‏های ‏حاد ادراری استفاده از آنتی‏بیوتیک ‏است که در حال حاضر سویه‏های ‏مقاوم به آنتی‏بیوتیک ‏در حال افزایش هستند. در سال‏های اخیر مطالعات انجام گرفته، ‏تأیید کننده آثار‏ ضد بیماری‏زایی پروبیوتیک‏هاست. به علت تولید عامل‏های ضد میکروبی متعدد، ‏پروبیوتیک‏ها به عنوان عوامل درمانی و پیشگیری کننده از بیماری‏های عفونی ایجاد شده با پاتوژن‏های دهانی، ‏روده‏ای و ادراری- تناسلی مطرح شده‏اند (‏3). ویژگی مهم باکتری‏های ‏پروبیوتیک، ‏توانایی این باکتری‏ها به منظور مهار اقزایش تعداد میکروارگانیسم‏های ‏بیماری‏زا و نیز مهار قدرت بیماری‏زایی آن‏ها است‏. باکتری‏های ‏اسید لاکتیک از قبیل جنس لاکتوباسیلوس، ‏با تولید عامل‏های ضد میکروبی و نیز به‏کارگیری مکانیسم‏های ‏مختلف، ‏دارای عملکرد بسیار موثری در این راستا هستند (‏4- 6).

به‏طور کلی نحوه عملکرد لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی در تداخل با بیماری‏زا‌های دستگاه ادراری تناسلی بسیار متنوع است ‏و این تنوع به علت چهار ویژگی‏ اصلی این باکتری‌ها از جمله توانایی اتصال، ‏قدرت رقابت و قدرت مهار یوروپاتوژن‏هاست ‏(‏7). همچنین، ‏باکتری‏های ‏پروبیوتیک با توانایی تجمع سلولی[3] با میکروب‏های ‏بیماری‏زا مجتمع می‏شوند و با آثار‏ ضد اتصالی خود مانع از رسیدن و اتصال باکتری‏های ‏پاتوژن به سلول هدف در میزبانشان می‏شوند (‏8). بنابراین، ‏پژوهش حاضر به منظور بررسی آثار‏ ضد میکروبی و ضد اتصالی لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و نیز معرفی و پیشنهاد این باکتری‏ها در پیشگیری و درمان عفونت‏های ‏ادراری انجام گرفت.

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

جمع ‏آوری ‏و تهیه نمونه‏ ها: ابتدا تعداد 40 نمونه ادرار از افراد مبتلا به عفونت ادراری از بیمارستان‏های ‏استان سمنان ‏(‏بیمارستان امام حسین و خاتم الانبیا در شهرستان شاهرود و بیمارستان امام رضا در شهرستان دامغان) جمع‏آوری ‏شد. پس از کشت روی محیط ائوزین متیلن بلو[4] و مشاهده کلونی‏‏های ‏دارای جلای فلزی، ‏آزمون‏های ‏بیوشیمیایی متداول، ‏‏رنگ آمیزی گرم و مشاهده میکروسکوپی، ‏حضور 30 ایزوله یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در بین نمونه‏ها تایید شد. دو سویه[5] لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس[6] PTCC 1643 و لاکتوباسیلوس کازه‏ای [7]PTCC 1608 از مرکز کلکسیون میکروبی علمی صنعتی ایران خریداری شد. سپس، به منظور فعال‏سازی، ‏سویه‏ها در محیط MRS براث[8] و MRS آگار[9] در شرایط بی‏هوازی کشت داده شدند. اشرشیاکلی PTCC1399 که در این پژوهش به عنوان شاهد به‏کار رفت از مرکز کلکسیون میکروبی علمی صنعتی ایران خریداری شد.

.بررسی چگونگی تشکیل بیوفیلم باکتری .یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی با استفاده از روش میکروتیتر پلیت[10]96 خانه‏ای: ابتدا 1 میلی‏‏لیتر از سوسپانسیون باکتری تازه کشت یافته به لوله آزمایش حاوی 10 میلی‏‏لیتر محیط استریل لوریا برتانی[11] تلقیح شد. سپس، مقدار 200 میکرولیتر از محیط 10 میلی‏‏لیتری به داخل چاهک‏های ‏میکروتیتر پلیت ریخته شد. در چاهک شاهد فقط محیط کشت استریل لوریا برتانی ریخته شد. پس از گذاشتن درب پلیت، گرماگذاری به مدت 24 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد‏‏ انجام شد. پس از گذشت این مدت، ‏محتویات چاهک‏ها خالی و با سرم فیزیولوژی استریل 3 بار شستشو داده شد. 200 میکرولیتر اتانول 96 درصد برای تثبیت سلول‏ها به چاهک‏ها اضافه شد. پس از گذشت 15 دقیقه، ‏محتویات چاهک‏ها تخلیه و در دمای آزمایشگاه سطح پلیت خشک شد. در مرحله بعد، هر چاهک با 200 میکرولیتر از کریستال ویوله 2 درصد به مدت 5 دقیقه رنگ‏آمیزی شد. چاهک‏ها با آب شهری به آرامی شسته و با استیک‏اسید 33 درصد به عنوان حلال پر شدند. پس از 15 دقیقه گرماگذاری، پلیت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد‏‏، ‏جذب نوری چاهک‏ها در 492 نانومتر توسط دستگاه الایزا ریدر مدل[12] (‏اسات فاکس 3200) ساخت شرکت آمریکا خوانده شد (‏9).

 

.بررسی اثر ضد میکروبی کشت کامل پروپیوتیک‏ها با روش کشت دولایه[13] اصلاح شده: برای بررسی آثار‏ ضد میکروبی پروبیوتیک ها، ‏تعداد 20 ایزوله یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی که دارای قدرت بالا در تشکیل بیوفیلم و در نتیجه دارای توانایی اتصال و بیماری‏زایی بالا نیز بودند، ‏انتخاب شدند. ابتدا 50 میکرولیتر از لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی تازه رشد یافته، در مرکز پلیت MRS آگار قرار داده شد. پس از 24 ساعت گرماگذاری و رشد لاکتوباسیلوس، ‏محیط مولر هینتون آگار[14] مذاب بر روی آن ریخته و اجازه داده شد تا ببندد. سپس، از سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری پاتوژن بر روی این محیط، ‏کشت متراکم داده شد و به مدت 24 ساعت در 37 درجه گرماگذاری شد. این آزمایش برای 20 نمونه باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و نمونه شاهد در حضور هر دو لاکتوباسیلوس به‏طور جداگانه انجام و نمونه‏ها از لحاظ هاله عدم رشد ایجاد شده، بررسی شدند (‏10).

.بررسی اثر ضد میکروبی سوپرناتانت پروبیوتیک‏ها با روش رقت‏سازی: به منظور تهیه مایع رویی کشت سلولی[15] از لاکتوباسیلوس‏ها، ‏ابتدا کشت تازه از آن‏ها در محیط MRS براث تهیه شد. سپس، محیط کشت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد‏‏ با دور[16] 10000 در دقیقه سانتریفیوژ و برای اطمینان از عدم وجود هرگونه سلول میکروبی از فیلتر ‏(‏22/0 میکرون) عبور داده شد (‏2). سپس، 10 لوله محتوی 5 میلی‏‏لیترمحیط مولر هینتون براث[17] تهیه واز هر کدام از لوله‏های ‏1 تا 10 به ترتیب 100 تا 1000 میکرولیتر از محیط کشت خارج و به همان میزان سوپرناتانت اضافه شد. در نهایت، 50 میکرولیتر از سوسپانسیون نیم مک فارلند باکتری پاتوژن به لوله‏ها اضافه و 24 ساعت در 37 درجه گرماگزاری شد. آزمایش برای 20 نمونه پاتوژن در حضور سوپرناتانت هر دو لاکتوباسیلوس و نیز هر نمونه به تنهایی به عنوان شاهد، ‏به شکل جداگانه انجام و لوله‏ها از برای کدورت محیط کشت حاصل از رشد بررسی شدند (‏11).

.بررسی تجمع‏پذیری ‏پروبیوتیک‏ها با باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی: ابتدا کشت تازه از باکتری‏های ‏پاتوژن و لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی در محیط مایع تهیه و از رسوب باکتریایی سوسپانسیون معادل نیم مک فارلند در بافر فسفات سالین[18] تهیه شد. 500 میکرولیتر از سوسپانسیون باکتری‏های ‏پروبیوتیک و باکتری‏های ‏پاتوژن در یک اپندورف استریل با یکدیگر مخلوط و بلافاصله جذب نوری آن در طول موج 660 نانومتر با دستگاه اﺳﭘﮐﺗوفوتومتر اندازه گیری شد. اپندورف‏های ‏حاوی مخلوط باکتری‏ها به مدت 4 ساعت در 37 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. پس از مدت زمان یاد شده، مایع رویی هر اپندورف از نظر میزان جذب نوری در طول موج 600 نانومتر بررسی و میزان تجمع یافتن بر اساس فرمول زیر محاسبه شد:

 

100×

A1- A2

= درصد تجمع یافتن

A1

 

A1 میزان جذب نوری بلافاصله پس از مخلوط کردن باکتری‏ها و A2 میزان جذب نوری پس از 4 ساعت است‏. آزمون برای 20 نمونه باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی ونمونه شاهددر حضور هر دو لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی به شکل جداگانه انجام شد ‏(‏12).

.بررسی اثر ضد اتصالی سوپرناتانت پروبیوتیک‏ها با استفاده از میکروتیترپلیت 96 خانه ای: به منظور بررسی اثر ضد اتصالی پروبیوتیک‏ها از میکروتیتر پلیت پلی‏استیرنی 96 خانه استفاده شد. ابتدا 75 میکرولیتر از سوپرناتانت باکتری‏های ‏پروبیوتیک و سپس، 75 میکرولیتر از سوسپانسیون نیم مک فارلند نمونه باکتری پاتوژن به چاهک‏ها اضافه شد.

میکروتیترپلیت به مدت 24 ساعت در 37 درجه گرماگذاری شد. در چاهک‏های ‏شاهد تنها باکتری‏های ‏پاتوژن و محیط کشت استریل ریخته شد. سپس، محتویات چاهک‏ها خارج و هر چاهک سه بار توسط بافرفسفات شستشو داده شد. برای تثبیت سلول‏ها از اتانل 96 درصد به مدت 15 دقیقه و به منظور رنگ‏آمیزی از کریستال ویوله 2 درصد به مدت 10 دقیقه استفاده شد. سپس، میکروتیترپلیت با جریان ملایم آب شیر شسته شد. پس از خشک شدن چاهک‏ها در معرض هوا، ‏استیک‏اسید 33 درصد به عنوان حلال به چاهک‏ها اضافه و میزان جذب نوری در طول موج 490 نانومتر با دستگاه الایزا ریدر برای هر چاهک اندازه‏گیری شد. آزمایش برای هرکدام از نمونه‏های ‏پاتوژن در مجاورت هردو پروبیوتیک 2 بار تکرار و به‏طور جداگانه انجام شد. در نهایت، میزان کاهش اتصال از فرمول زیر محاسبه شد:

 

100×

ODa – ODb

= درصد کاهش اتصال

ODa

 

ODa بیانگر جذب نوری چاهک کنترل و ODb جذب نوری چاهک مورد آزمایش است ‏(‏3).

مقایسه عملکرد ضد میکروبی پروبیوتیک‏ها در آزمون‏های ‏میکروبی انجام شده، ‏با استفاده از روش‏های ‏آماری و به کمک نرم افزار SPSS بررسی و نتایج گزارش شد.

 

نتایج.

نتایج ارزیابی تشکیل بیوفیلم باکتری‏های ‏اشریشیاکلای یوروپاتوژنیک نشان داد که از میان 30 باکتری تشکیل دهنده بیوفیلم، 25 درصد قدرت ضعیف، ‏5/42 درصد قدرت متوسط و50 درصد دارای قدرت بسیار بالا برای اتصال و تشکیل بیوفیلم بودند که آزمون‏های میکروبی در حضور باکتری‏های ‏پروبیوتیک روی آن‏ها انجام شد ‏(‏شکل 1).

 

 

شکل 1- تشکیل بیوفیلم اشریشیاکلای یوروپاتوژنیک در میکروتیتر پلیت 96 خانه‏ای براساس شدت رنگ کریستال ویوله در چاهک‏ها


در آزمون کشت کامل باکتری‏های ‏پروبیوتیک، ‏میانگین قطرهاله عدم رشد اشریشیاکلی یوروپاتوژن توسط لاکتوباسیلوس کازه‏ای 7/42 میلی‏متر و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس5/29 میلی‏متر بود ومیانگین قطرهاله عدم رشد اشرشیاکلی شاهد در حضور لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس به ترتیب 34 و 22 میلی‏متر به‏دست آمد (‏شکل 2).

 همچنین، بررسی نتایج آزمون تی مستقل (‏T test) نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معنا‏داری بین لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس وجود دارد. نتایج نشان داد که اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازه‏ای برروی اشریشیاکلی یوروپاتوژن در حالتی که از کشت کامل باکتری‏های ‏پروبیوتیک استفاده می‏شود، ‏به مراتب بیشتر از حالت مشابه در لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بود ‏(‏شکل 3).

 

 

 

 

شکل 2- هاله عدم رشد اشریشیاکلی یوروپاتوژن در حضور لاکتوباسیلوس کازه ای (‏سمت راست) و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ‏(‏سمت چپ)

 

 

 

شکل 3- نمودار میانگین قطر هاله عدم رشد باکتری اشریشیاکلی یوروپاتوژن و شاهد اشرشیاکلی ‏(‏PTCC1399)در حضور لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ‏(‏A) و لاکتوباسیلوس کازه‏ای ‏(‏C) بر حسب میلی‏متر

 

 

در آزمون بررسی اثر ضد میکروبی سوپرناتانت، ‏بررسی کدورت لوله‏ها در نمونه‏های ‏یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نشان داد، میانگین حداقل غلظت مهارکننده رشد سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه‏ای 12 درصد و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس 18 درصد است‏. بنابراین، ‏اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازه‏ای در مقایسه با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوسدر حالتی‏ که از سوپرناتانت پروبیوتیکی استفاده می‏شود نیز بیشتر بود.

نتایج آزمایش بررسی تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس‏ها نشان داد که هر دو باکتری پروبیوتیک قادر به تجمع با باکتری‏های ‏یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی با درصد بالایی بودند که از این میان لاکتوباسیلوس کازه‏ای با میانگین 9/61 درصد نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با میانگین 7/46 درصد، ‏دارای تجمع‏پذیری بیشتری با یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی بود. میزان تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با اشرشیاکلی شاهد به ترتیب 53 و 26 درصد به‏دست آمد. همچنین، نتایج بررسی آزمون تی مستقل نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معنا‏داری بین دو لاکتوباسیلوس وجود دارد ‏(‏شکل 4).

 

 

 

شکل 4- نمودار میانگین درصد تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس کازه‏ای ‏(‏C) و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (‏A) با باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی و شاهد اشرشیاکلی ‏(‏PTCC1399)

 

بررسی اثر ضد اتصالی پروبیوتیک‏ها بر باکتری بیماری‏زا، ‏از این جهت که سبب جلوگیری از شروع بیماری می‏شود دارای اهمیت است. نتایج نشان داد که سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه‏ای با میانگین 7/46 درصد دارای اثر ضد اتصالی بیشتری نسبت به سوپرناتانت لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با میانگین 6/25 درصد ‏است. همچنین، نتایج بررسی آزمون تی مستقل نشان داد در سطح خطای 1 درصد تفاوت معنا‏داری بین دو لاکتوباسیلوس وجود دارد (‏شکل 5).

 

 

شکل 5- نمودار میانگین کاهش اتصال باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در حضور سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه ای (‏C) و
 لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (‏A)

 

 

بحث و نتیجه گیری.

عفونت دستگاه ادراری یکی از متداول‌ترین عفونت‌های انسانی است. باکتری اشریشیاکلی یکیاز شایع‏ترین عوامل ایجاد کننده عفونت مجاری ادراری در افراد با دستگاه ادراری سالم است‏ و مسؤول 90 درصد از کل عفونت مجاری ادراری باکتریال اکتسابی از جامعه است (‏13). از آنجا که ایـن باکتری مقـاوم بـه درمان آنتی‏بیوتیکی شده است، ‏روش‌های ضـد میکروبی غیر آنتی‏بیوتیکی نظیر پروبیوتیک‌ها بسیـار مـورد توجـه است. پژوهش حاضر به منظور بررسی خواص ضد میکروبی و ضد اتصالی باکتری‏های ‏پروبیوتیک (‏لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس) بر پاتوژن شایع دستگاه ادرای ‏(‏اشریشیاکلی)، ‏انجام شد.

روش‏های ‏متعددی برای بررسی ویژگی ضد میکروبی باکتری‏های ‏پروبیوتیک علیه باکتری‏های ‏بیماری‏زا با استفاده از کشت کامل و سوپرناتانت آن‏ها وجود دارد. بهترین روش برای بررسی اثر کشت کامل پروبیوتیک‏ها روشی است که توسط مک گیون و تگ[xix] در سال 1971 با عنوان Spot on – lawn method ارایه شد که در سال 2001 مایا[xx] نام آن را به روش کشت دو لایه[xxi] تغییر داد و در سال 2010 ارباب سلیمانی[xxii] و همکاران این روش را با کمی اصلاح با نام روش کشت دو لایه اصلاح شده[xxiii] عنوان کردند. در این روش اثر ضد میکروبی کشت کامل پروبیوتیک با وجود هاله عدم رشد باکتری‏های ‏یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در لایه دوم محیط کشت به خوبی قابل مشاهده بود (‏10). درپژوهش حاضر نیز از روش کشت دولایه اصلاح شده استفاده شد و نتایج نشان داد که اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازه‏ای بر روی یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس بیشتربود. در سال 2001 اثر ضد میکروبی لاکتوباسیلوس کازه‏ای سویه شیروتا علیه اشرشیاکلی توسط آساهارا[xxiv] گزارش شد ‏(‏7). در سال 2008 آناس[xxv] و همکارانش اعلام کردند کشت کامل باکتری لاکتوباسیلوس پلانتاروم[xxvi] دارای آثار‏ ضد میکروبی علیه باکتری‏های ‏بیماری‏زای اشریشیا کلی و استافیلوکوکوس اورئوس[xxvii] است‏ (‏14). ارباب سلیمانی و همکاران نیز در سال 2010، ‏نشان دادند کشت کامل لاکتوباسیلوس کازه‏ای دارای بیش‏ترین‏ اثر ضد میکروبیبر روی یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در میان سایر باکتری‏های ‏پروبیوتیک‌ مورد آزمایش بود. ‏(‏10).

اثر ضد میکروبی سوپرناتانت حاصل از باکتری‏های ‏پروبیوتیک را می‏توان به تولید اسید لاکتیک نسبت داد زیرا در طی رشد باکتری‏های پروبیوتیک، ‏اسیدیته محیط به شدت اسیدی شده و باکتری‏های بیماری‏زا به‏طور طبیعی به شرایط اسیدی حساس بوده و در ‏اسیدیته پایین از بین می‌روند (‏15 و 16). در این مطالعه بررسی حداقل غلظت بازدارنده از سوپرناتانت باکتری‏های ‏پروبیوتیک نشان دادکه سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه ایدر غلظت پایین تر ‏(‏12 درصد) دارای اثر ضد میکروبی بیشتر بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس (‏18 درصد)بود. در سال 2003 اگانبانو[xxviii] و همکاران نشان دادند سوپرناتانت حاصل از دو پروبیوتیک لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس برویس[xxix] دارای فعالیت ضد میکروبی علیه باکتری‏های ‏اشریشیا کلی، ‏باسیلوس سرئوس[xxx]و یرسینیا انتروکلی تیکا[xxxi] بوده و از رشد آن‏ها جلوگیری می‏کند (‏17). ارباب سلیمانی و همکاران در سال 2010 غلظت 5 درصد از سوپرناتانت لاکتوباسیلوس کازه‏ای را برای مهار رشد باکتری‏های ‏یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی جدا شده از ادرار افراد مبتلا به عفونت ادراری، ‏گزارش کردند (‏10).

توانایی باکتری‏های ‏اسیدلاکتیک برای تجمع با باکتری‏های ‏روده‏ای در شرایط in vitro و in vivo از دیرباز بسیار مورد توجه بوده و به عنوان مکانیسم کارامدی برای جلوگیری از عفونت مطرح شده است (‏18). در پژوهش حاضر، اثر مهاری این مکانیسم بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی آزمایش شد. درصد تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس با یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی به ترتیبدر حدود 60 و 45 درصد به‏دست آمد که لاکتوباسیلوس کازه‏ای دارای اثر بهتری بود. راید[xxxii] و همکارانش در سال 1988 اثر مهاری لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس رامنوزوس[xxxiii] سویه GR-1 و اثر تجمع‏پذیری این باکتری‌ها را با اشرشیاکلی جدا شده از دستگاه ادراری گزارش کردند (‏19). در سال 2002، ‏ساسکوویچ[xxxiv] قابلیت تجمع یافتن لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را با باکتری‏های ‏پاتوژن اشرشیاکلی حدود 4/19 درصد بیان کرد. همچنین، در سال 2010 ارباب سلیمانی و همکارانش در پژوهشی اثر تجمع‏پذیری ‏لاکتوباسیلوس کازه‏ای با اشرشیاکلی را بیش از سایر پروبیوتیک‏ها اعلام کردند (‏10 و 20).

با بررسی اثر ضد اتصالی سوپرناتانت باکتری‏های ‏پروبیوتیک بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی در این مطالعه، ‏این نتیجه حاصل شد که هر دو لاکتوباسیلوس دارای اثر ضد اتصالی مناسبی بودند که از این میان لاکتوباسیلوس کازه‏ای اثر ضد اتصالی (‏7/46 درصد) بیشتری را نسبت به لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس ‏(‏6/25 درصد)، ‏بر باکتری یوروپاتوژنیک اشرشیاکلی اعمال کرد. عابدی[xxxv] و همکارانش در سال 2013 اعلام کردند که لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی دارای اثر ضد اتصالی هستند. بر اساس گزارش آن‏ها لاکتوباسیلوس دلبروکی قادر بود حدود 80 درصد از اتصال اشرشیاکلی به سلول‏های ‏Caco-2 جلوگیری کند و مکانیسم آن‏را جایگزینی رقابتی دانستند. یکی از علت‏های تفاوت نتیجه به‏دست آمده در پژوهش حاضر با نتیجه به‏دست آمده از پژوهش عابدی و همکارانش تفاوت سطوح اتصال است. در کشت سلولی Caco-2 در رقابت میان لاکتوباسیلوس پروبیوتیکی و باکتری اشرشیاکلی برای اتصال به گیرنده سلولی لاکتوباسیلوس موفق‏تر بوده و با اشغال این جایگاه از اتصال باکتری بیماری‏زا جلوگیری می‏کند اما در میکروتیتر ﭘلیت ﭘلی استیرنی شرایط کشت سلولی محیا نیست (‏21). به‏طور کلی در مطالعات انجام شده نشان داده شده است، ‏درشرایطی که از کشت کامل باکتری‏های ‏پروبیوتیک استفاده می‏شود نسبت به استفاده از سوپرناتانت آن‏ها، ‏اثر ضد اتصالی بیشتری بر باکتری‏های ‏بیماری‏زا اعمال می‏شود. می‏توان چنین استنباط کرد که در کشت کامل اثر ضد اتصالی پروبیوتیک به علت تولید متابولیت‏های ‏ضد میکروبی و در برخی موارد به واسطه رقابت مستقیم با پاتوژن برای جایگاه اتصال، ‏علاوه بر ایجاد شرایط اسیدی است. چنانچه اینگراسیا[xxxvi] و همکارانش در سال 2005 اثر ضد اتصالی کشت کامل لاکتوباسیلوس کازه‏ای سویه
DN-114001 را بر اشرشیاکلی در شرایط in vitro بررسی و حدود 57 درصد گزارش کردند (‏10 و 22).

بر اساس یافته‏های ‏این مطالعه می‏توان چنین نتیجه‏گیری کردکه کشت کامل و سوپرناتانت حاصل از لاکتوباسیلوس کازه‏ای و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس دارای آثار‏ مهاری علیه اشرشیاکلی یوروﭘاتوژنیک هستند و این باکتری‏های ‏پروبیوتیک قادرند از اتصال و در نهایت، تشکیل بیوفیلم این باکتری جلوگیری کنند. یکی از مکانیسم‏هایی که امروزه به عنوان برتری لاکتوباسیلوس‏های ‏پروبیوتیکی مطرح است قدرت به دام انداختن باکتری بیماری‏زا بر اساس تجمع‏پذیری است. اگر چه در گذشته پژوهشگران بر این باور بودند که تجمع‏پذیری باکتری‏های ‏پروبیوتیک با عوامل بیماری‏زا به ویژگی ضد میکروبی آن‏ها مربوط است اما در سال‏های ‏اخیر ارتباط میان تجمع‏پذیری این باکتری‏ها و قدرت ضد اتصالی مطرح شده است. بر اساس یافته‏های ‏پژوهش حاضر مشخص شد هر چقدر قدرت ضد میکروبی و تجمع‏پذیری لاکتوباسیلوس‏های پروبیوتیکی بیشتر می‏شود قدرت ضد اتصالی آن‏ها نیز افزایش می‏یابد و شاید بتوان این فرضیه را مطرح کرد که تجمع‏پذیری می‏تواند در ارتباط با هر دو عامل‏ ضد میکروبی و ضد اتصالی باشد. امید است که بتوان با پژوهش‏های بیشتر و درک بهتر از مکانیسم ضد اتصالی باکتری‏های ‏پروبیوتیک بتوان از آن‏ها در درمان و پیشگیری از عفونت دستگاه ادراری استفاده کرد و از پیدایش سویه‏ای مقاوم به آنتی‏بیوتیک ‏جلوگیری کرد.

 

 


[1]- Uropathogenic Escherichia coli

[2]- Urinary Tract Infection

[3]- Coaggregation

[4]- Eosin Methylene Blue

[5]- Persian Type Culture Collection

[6]- Lactobacillus acidophilus

[7]- Lactobacillus casei

[8]- Man Rogasa Sharp Broth

[9]- Man Rogasa Sharp Agar

[10]- Microtiter Plate

[11]- Luria Bertani

[12]- Stat Fax 3200

[13]- Modified Double Layer Method

[14]- Muller Hinton Agar

[15]- Cell Free Supernatant

[16]- RPM

[17]- Muller Hinton Broth

[18]- Phosphate Buffer Saline

[xix]- Mc given and Tagg

[xx]- Maya

[xxi]- Double layer method

[xxii]- Arbab Soleimani

[xxiii]- Modified double layer method

[xxiv]- Asahara

[xxv]- Anas

[xxvi]- Lactobacillus plantarum

[xxvii]- Staphylococcus aureus

[xxviii]- Ogunbanwo

[xxix]- Lactobacillus brevis

[xxx]- Bacillus cereus

[xxxi]- Yersinia enterocolitica

[xxxii]- Reid

[xxxiii]- Lactobacillus rhamnosus

[xxxiv]- Šušković

[xxxv]- Abedi

[xxxvi]- Ingrassia

(1)               Matiuzzi da Costa M., Drescher G., Maboni F., Weber Sh dABS., Henning Vainstein M., Schrank I., et al. Virulence factors and antimicrobial resistance of Escherichia coli isolated from urinary tract of swine in southern of brazile. Brazilian Journal of Microbiology 2008; 39: 741- 3.

(2)               Snyder JA., Haugen BJ., Lockatell CV., Maroncle N., Hagan EC., Johnson DE., et al. Coordinate expression of fimbriae in uropathogenic Escherichia coli. Infection and immunity 2005; 73 (‏11): 7588- 96.

(3)               Spinler JK., Taweechotipatr M., Rognerud CL., Ou CN., Tumwasorn S., Versalovic J. Human- derived probiotic Lactobacillus reuteri demonstrate antimicrobial activities targeting diverse enteric bacterial pathogens. Anaerobe 2008; 14 (3): 166- 71.

(4)               Darsanaki RK., Rokhi ML., Aliabadi MA., Issazadeh K. Antimicrobial activities of Lactobacillus strains isolated from fresh vegetables. Middle- east Journal of Scientific Research 2012; 11 (9): 1216- 19.

(5)               Fracchia L., Cavallo M., Allegrone G., Martinotti M. A Lactobacillus- derived biosurfactant inhibits biofilm formation of human pathogenic Candida albicans biofilm producers. Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology 2010; 2: 827- 837.

(6)               Servin AL. Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial pathogens. FEMS Microbiology Reviews 2004; 28 (4): 405- 40.

(7)               Asahara T., Nomoto K., Watanuki M., Yokokura T. Antimicrobial activity of intraurethrally administered probiotic Lactobacillus casei in a murine model of Escherichia coli urinary tract infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy2001; 45 (6): 1751- 60.

(8)               Collado MC., Meriluoto J., Salminen S. Measurement of aggregation properties between probiotics and pathogens. Journal of Microbiological methods 2007; 71 (1): 71- 4.

(9)               Stepanović S., Vuković D., Hola V., Bonaventura GD., Djukić S., Ćirković I., et al. Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm production by staphylococci. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand 2007; 115 (8): 891- 9.

(10)           Soleimani NA., Kermanshahi RK., Yakhchali B., Sattari TN. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli against Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. African Journal of Microbiology Research 2010; 4 (20): 2169- 73.

(11)           Kasra Kermanshahi R., Beheshti Maal K., Mobini Dehkordi M. Cellular and Molecular Biology of Bacterial Structure. 2nd Ed. Esfahan: University of Esfahan; 2008.

(12)           Todorov SD., Von Mollendorff JW., Moelich E., Muller N., Witthuhn RC., Dicks LM. Evaluation of Potential Probiotic Properties of Enterococcus mundtii., Its Survival in Boza and in situ Bacteriocin Production. Food Technology & Biotechnology 2009; 47 (2): 178- 91.

(13)           Mandell GL. Mandell., Douglas., Bennett's. Principles and practice of infectious diseases. 6th ed. Philadelphia: Churchill Livingstone Elsevier; 2005.

(14)           Anas M., Eddine HJ., Mebrouk K. Antimicrobial activity of Lactobacillus species isolated from Algerian raw goat’s milk against Staphylococcus aureus. World Journal Dairy Food Science 2008; 3 (2): 39- 49.

(15)            Heller KJ. Probiotic bacteria in fermented foods: product characteristics and starter organisms. The American journal of Clinical Nutrition 2001; 73 (2): 374s- 379.

(16)            Elham Sarmast Ghahfarokhi., Mohsen Mobini Dehkordi., Keyvan Beheshtimaal. Isolation and evaluation of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (3): 41- 52.

(17)            Ogunbanwo ST., Sanni AL., Onilude AA. Characterization of bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum F1 and Lactobacillus brevis OG1. African Jurnal of Biotechnology 2003; 2 (‏8): 219- 27.

(18)           Kolenbrander PE., Ganeshkumar N., Cassels F., Hughes C. Coaggregation: specific adherence among human oral plaque bacteria. The FASEB Journal 1993; 7 (5): 406- 13.

(19)           Reid G., McGroarty JA., Angotti R., Cook RL. Lactobacillus inhibitor production against Escherichia coli and co aggregation ability with uropathogens, Canadian Journal of Microbiology 1988; 34: 344- 51.

(20)           Kos B., Šušković J., Vuković S., Šimpraga M., Frece J., Matošić S. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology 2003; 94 (6): 981- 7.

(21)           Abedi D., Feizizadeh., Jafarian Dehkordi A. In vitro anti- bacterial and anti- adherence effects of Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus on Escherichia coli. Research in Pharmaceutical Sciences 2013; 8 (‏4): 260- 8.

(22)           Ingrassia I., Leplingard A., Darfeuille- Michaud A. Lactobacillus casei DN- 114 001 inhibits the ability of adherent- invasive Escherichia coli isolated from Crohn's disease patients to adhere to and to invade intestinal epithelial cells. Applied and Environmental Microbiology 2005; 71 (6): 2880- 8.