بررسی معدنی شدن زیستی در نهشته‏ های تراورتنی چشمه بادآب سورت، کیاسر، مازنداران

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استادیار زمین ‏شناسی، دانشگاه تهران، ایران

چکیده

مقدمه: نهشته‏ های تراورتنی حاصل تجمع کربنات کلسیم در چشمه‌های کارستی، چشمه‌های آب‏گرم، رودخانه‌های کوچک و باتلاق‌هاست. چشمه تراورتن ساز بادآب سورت در استان مازندران واقع شده و دومین اثر طبیعی ایران است. این چشمه دارای دو سرچشمه با ویژگی‏های متفاوت است و وجود رنگ‏های متنوع به علت رسوبات مختلف زیبایی منحصر به فردی به چشمه می‏دهد. تراورتن‏ها ‏مدل مناسبی برای بررسی رابطه محیط- میکروارگانیسم‏ها ‏هستند، این مطالعه تمرکز روی بررسی تاثیرگذاری میکروارگانیسم‏ها ‏در رسوب‏گذاری ‏کربنات کلسیم و جداسازی باکتری‏های دارنده پتانسیل رسوب‏گذاری ‏داشت.‏‏‏

مواد و روش ‏‏ها: برای بررسی تأثیر میکروارگانیسم‏ها بر رسوب‏گذاری ‏در این جا از روش‏های میکرسکوپی و کشت استفاده شد، از نمونه‏های سنگی تصاویر میکرسکوپی با استفاده از میکرسکوپ الکترونی و پلاریزان تهیه شد و باکتری‏ها ‏از طریق روش‏های کشت از نمونه آب جداسازی شدند. فعالیت رسوب‏گذاری ‏باکتری‏ها ‏از طریق کشت روی محیط B4 بررسی شد و تأیید رسوب‏گذاری ‏با میکرسکوپ پلاریزان انجام شد.

نتایج: تصاویر میکرسکوپ الکترونی نشان می‏دهد که میکروارگانیسم‏ها ‏در رسوب‏گذاری ‏تاثیر گذار هستند؛ به شکلی که می‏توانند به عنوان هسته اولیه عمل کنند. در نهایت، 5 سویه Bss-3، Bsw-28d، Bss-11a، Bsw-1c1 و Bsw-39b جداسازی شدند که توانایی رسوب کربنات کلسیم را داشتند. در این بین، سویه Bss-3 که شباهت 6/99 با تاکسون Labrenzia aggregate IAM 12614T را داشت. این توانایی برای نخستین بار برای این جنس گزارش شده است و در بین سویه‏ها، سویه Bsw-28d با رسوب دادن 45 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر کربنات کلسیم بهترین سویه بود.

‏‏‏بحث و نتیجه ‏گیری: میکروارگانیسم‏ها ‏در تشکیل و تکامل محیط اطرافشان اهمیت دارند؛ در نتیجه برای حفظ و احیای یک محیط باید به میکروب‏های بومی آن توجه کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Studying of Biomineralization on Badab Sourt travertine deposit spring, Kiasar, Mazandaran Province

نویسندگان [English]

  • Javad Khansha 1
  • Mohammad Ali Amozegar 2
  • Mohsen Ranjbaran 3
1 M.Sc. of Microbiology, Tehran University, Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Tehran University, Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Geology, Tehran University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Travertine results in the accumulation of calcium carbonate on karst springs, hot springs, small rivers and marshes. Badab Sourt is the travertine-maker spring that located in Mazandaran province and is the second natural place in Iran. It has two springheads with different characteristics and different colors and different sediments that give unique beauty to spring. Travertine is a good model to study the relationship between environment and microorganisms. This study centered on the influence of microorganisms on precipitation of calcium carbonate and isolation of microorganisms that have precipitation potential.

Materials and methods: Here, to assess effects of microorganisms on mineralization were used microscopic and culture methods; from stone samples, photos have gotten with SEM and polarizing microscope and from water sample bacteria were isolated. Mineralization function of bacteria was investigated with culturing them on B4 medium and mineralization potential was approved by polarizing microscope.

Results: SEM photos showed microorganisms have effect on mineralization and can act as a nucleus in beginning of crystal production. Finally, five strains Bss-3, Bsw-28d, Bss-11a, Bsw-1c1, and Bsw-39b were isolated, which have ability to precipitate calcium carbonate. In between strain Bss-3 that has 99.6% similarity with taxon Labrenzia aggregate IAM 12614T was the first report that has the ability to precipitate calcium carbonate and among the strains, strain Bsw-28d with precipitation of 45.6 mg / ml CaCO3 was the best strain.

Discussion and conclusion: Microorganisms are important in the formation and evolution of their surrounding environments, thereby native microbes must be concerned for conserving and restoring the environments.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Travertine
  • Biomineralization
  • Badab Sourt Spring
  • Isolation
  • Scanning electron microscopy

مقدمه.

واژه تراورتن برگرفته شده از واژه ایتالیایی تیورتیون[1] و نام محلی است که تراورتن به شکل رسوب بیرونی تشکیل شده‌ است (1). تراورتن حاصل تجمع کربنات کلسیم در چشمه‏های کارستی، چشمه‏های آب‏گرم، رودخانه‏های کوچک و باتلاق‌‏هاست. مهم‏ترین عامل رسوب‏گذاری در تراورتن‏ها عوامل شیمیایی مانند تبخیر، خارج شدن CO2، افت فشار و ... است و میکروارگانیسم‏ها ‏در کنار عوامل شیمیایی در رسوب‏گذاری تاثیرگذار هستند (2). سیمونز در سال 1951 تراورتن‏های چشمه‌ای که در محل خروج چشمه‏ها ‏تشکیل می‏‌شود را معرفی کرد‏، که تراورتن‌‏های چشمه بادآب سورت در کیاسر مازندران از این نوع هستند (3). در حقیقت، تراورتن نوعی سنگ رسوبی کربناته‌ است که در محل چشمه‌‏های آهک‌ ساز تشکیل می‏شود. یک چشمه کربناته معمولاً در کف حوضچه‌‏های کم ‌عمق تشکیل می‌شود و می‌توان گفت تراورتن معمولاً حاصل رسوب مواد آهکی در آب‏های روان است (3).

چشمه تراورتن‌ ساز بادآب سورت اورست در استان مازندران، شهرستان ساری و یک کیلومتری شرق روستای اورست در ارتفاع 1840 متری از سطح دریا واقع شده است (شکل 1). چشمه سورت شامل دو سرچشمه با فاصله اندک بین هم است که از لحاظ ترکیب شیمایی، رنگ و مزه از هم متفاوت هستند (جدول 1). یکی از سرچشمه‏های اصلی سرچشمه شرقی (شکل 1، الف) است که دارای آب‌دهی بیشتر است و شوری بالاتری را نشان می‏دهد و در انتهای آن لجن سیاه‌ رنگ دیده می‌شود که خاصیت درمانی دارد، درحالی‏که سرچشمه غربی (شکل 1، ج) دارای آبی ترش ‌مزه با رنگ قرمز- نارنجی است؛ رنگ قرمز آن به علت وجود ترکیبات آهن اکسیده است.

این چشمه هم اکنون فعال است و قسمت‏های قدیمی هم در حومه آن دیده می‏شود (شکل 1، ب). چشمه بادآب سورت با ایجاد شکل‏های ژئومورفولوژی منحصر به ‌فرد همراه با رنگ‏های گوناگون و به ویژه‏ رنگ‏های قرمز، یکی از جاذبه‏های زمین‌ شناختی استان مازندران محسوب می‏شود. مجموعه تراورتنی بادآب سورت هم زمان با آخرین چین‌خوردگی البرز در پلیوسن و پلیستوسن (دوران چهارم زمین‌شناسی) شکل گرفته است. این چشمه در سال 1387دومین اثر طبیعی ملی بعد از قله دماوند توسط سازمان میراث فرهنگی و گردشگری تعیین شد.

 در شکل 3 موقعیت قرارگیری و خروج سرچشمه‏های بادآب سورت و رابطه سن آن با واحدهای زیرین خود نشان داده شده است.

چشمه‏های تراورتن ساز به علت وجود فعالیت میکروارگانیسم‏ها ‏در رسوب‏گذاری ‏مدل مناسبی برای بررسی رابطه میکروب‏ها ‏و محیط است. کربنات‏های میکروبی و توده‏های میکروبی مهم‏‏ترین ‏مدل بررسی رابطه میکروب‏- محیط هستند (4). زمان آغاز حیات میکروبی ‏حدود 1/4 میلیارد سال پیش در نظر گرفته می‏شود (5) که محیط آن دارای شرایط با 150 درجه سانتی‏گراد‏، قلیایی و حاوی بی سولفید و آهن است و نخستین نشانه‏های توده‏های میکروبی ‏در حدود 5/3 میلیارد سال پیش در آفریقای جنوبی و استرالیا گزارش شده است (6). همان طور که دیده می‏شود موجودات اولیه در زیستگاه‏های پلی‏اکستریم حیات داشته‏اند (7) که گفته شده ابتدا در حباب‏هایی ‏نزدیک به سطح آب حیات شکل گرفته و سپس، تکامل جمعیت‏های میکروبی ‏و تولید فرآیند‏ها ‏و متابولیسم‏های متنوع میکروبی ‏در توده‏های میکروبی ‏شکل گرفته است. برای نمونه نخستین فتوسنتز‏کننده‏ها ‏در توده‏های میکروبی ‏وجود داشته‏اند (4).

 

شکل 1- چشمه بادآب سورت. الف) چشمه شرقی، ب) سرچشمه‏های قدیمی که در حال حاضر فعالیتی ندارند، ج) چشمه غربی

 

 

معدنی شدن به واسطه میکروب‏ها ‏در آغاز حیات میکروبی ‏وجود داشته که با رسوب یافتن کربنات کلسیم، استروماتولیت‏های لایه‏ای‏یی شکل گرفته‏اند که جمعیت‏ها ‏کلسیت را رسوب می‏داده‏ یا اینکه به دام می‏انداخته‏اند (8). به این شکل میکروارگانیسم‏هایی که در زیستگاه‏های کربناته تکامل یافته‏اند توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند، حتی یوکاریوتی مثل مرجان‏ها ‏که به شکل فعال توسط فرآیندی آنزیمی کلسیت را روی خود رسوب می‏دهند (9). این کار سبب شده نیچ‏های مناسب برای ادامه حیات ایجاد شود مثل کاری که در بیوفیلم‏ها ‏رخ می‏دهد. با تشکیل توده‏های میکروبی ‏ارگانیسم‏های مختلف در کنار هم قرار گرفته و تحمل شرایط سخت محیطی برای آنها افزایش می‏یافته در نتیجه شانس ادامه حیات افزایش می‏یافته است.

معدنی شدنی که توسط مرجان‏ها ‏انجام می‏شود فرآیند معدنی شدن زیستی نام دارد. دو فرآیند دیگر به نام معدنی شدن تحریک شونده زیستی[2] و معدنی شدن تحت تاثیر زیستی[3] وجود دارند (10) که باکتری‏ها ‏در کنار فرآیندهای فیزیکی رسوب‏گذاری ‏مثل انتشار، بخارشدن و آزادشده گاز روی رسوب‏گذاری ‏تأثیر می‏گذارند. مشخص شده است که در محیط‏های دریایی دو عامل درونی و بیرونی (11) در رسوب‏گذاری ‏تاثیرگذار هستند (12). عوامل درونی مانند برهم‏کنش‏های اکولوژیکی، تولید و مصرف مواد آلی و غیرآلی است که دو مکانیسم کلی آن یکی تولید پلی‏ساکاریدهای خارج سلولی است که در نتیجه آن میکروارگانیسم‏ها ‏به عنوان هسته اولیه هنگام آغاز رسوب‏گذاری ‏عمل می‏کنند و مکانیسم بعدی موتور قلیالیت[4] نام دارد (9) که به فعالیت‏های متابولیکی سلول‏ها ‏اشاره دارد تغییرات اسیدیته می‏تواند از 6 تا 10 باشد، با این تغییر میکرومحیط‏هایی ‏برای تولید رسوب فراهم آورده می‏شود (9). با توجه به اینکه فعالیت‏های میکروب‏ها ‏متنوع است، تاثیر آن‏ها بر رسوب‏گذاری ‏می‏تواند یا منفی باشد. برای نمونه سیانوباکترها با گرفتن کربن دی اکسید از آب، سبب تسهیل رسوب یافتن کربنات کلسیم می‏شوند در حالی که اکسیداسیون سولفید سبب اسیدی شدن محیط می‏شود که اثر منفی بر رسوب‏گذاری دارد (13). عوامل بیرونی مانند نور، مواد غذایی، فضا، هیدرودینامیک و لایه‏گذاری ‏هستند (14). همان‏طور که دیده می‏شود این دو عامل بیرونی و درونی را باید در کنار هم در نظر گرفت زیرا در محیط‏های مختلف ممکن است یک عامل اصلی در رسوب‏گذاری ‏کلسیت وجود داشته باشد.

در پژوهش حاضر تلاش شد در درجه اول تنوع میکروبی ‏و رابطه بین میکروب ‏و محیط با روش‏های میکرسکوپی و کشت بررسی شود و در مرحله بعد میکروارگانیسم‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم جداسازی شوند. این میکروارگانیسم‏ها ‏کابردهای مختلفی مانند کاهش آلودگی‏های فلزی خاک و آب‏های زیرزمینی (15)، افزایش استحکام خاک (16)، کاهش حفرات ساخت‏های زمین‏شناسی (17)، حفاظت و استحکام به ساخت‏‏های سیمانی (18) و حفاظت از سنگ‏های ساختمانی (19) دارند که هر یک از نظر اقتصادی مهم هستند.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه‏ برداری: نمونه‏های سنگی برای بررسی میکرسکوپی و نمونه آب برای جداسازی باکتری‏‏‏ها ‏در مهرماه سال 1391 جمع‏آوری، به آزمایشگاه در دانشگاه تهران منتقل و در یخچال 4 درجه سانتی‏گراد‏ نگهداری شد.

.تهیه عکس‏های میکرسکوپی و رسم نقشه‏های زمین‏شناسی: از نمونه‏های سنگی ابتدا برش نازک به قطر 30 میکرون تهیه شد و با میکروسکوپ پلاریزان مدل المپیوس[5] با عدسی‏های 5/2، 4 و 10 مشاهده و بررسی شدند (20 و 21). سپس، قطعات کوچکی از آن‏ها برای تصویر برداری میکرسکوپ الکترونی تهیه شد (22 و 23). تصاویر SEM از طریق دستگاه میکروسکوپ الکترونی نگاره مدل KYKY-EM3200 تهیه شد.

موقعیت چشمه بادآب سورت در ایران و لایه‏های سنگی منطقه کیاسر (شکل 2) از روی نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر (مقیاس 20000/1) با استفاده از نرم افزار کورل درا ایکس [6]6 رسم شد و نقشه توپوگرافی و لایه‏های محدوده چشمه از طریق نرم افزارهای گوگل ارث[7]، سرفر 10[8] و کورل درا ایکس 6 و با استفاده از نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 رسم شد.

 

 

 

شکل 2- موقعیت چشمه بادآب سورت در (a) مکان چشمه در ایران و نقشه راه‏‏های دسترسی به چشمه و (b) نقشه زمین‏شناسی و موقعیت چشمه بادآب سورت نمایش داده شده است. (رسم شده با استفاده از نقشه زمین‏شناسی منطقه کیاسر با مقیاس 20000/1 و نرم افزار Corel Draw X6)

 

 

شکل 3- نقشه توپوگرافی و توالی لایه‏های تشکیل شده در محدوده چشمه بادآب سورت (رسم شده با نرم افزار Surfer 10 و Corel Draw X6)


طراحی محیط کشت و کشت باکتری‏ها:نمونه‏های آب ابتدا توسط دستگاه جذب اتمی مدل پرکین المر [9]100 برای کاتیون‏ها ‏و تیتراسیون برای آنیون‏ها ‏تحلیل شیمیایی شد(جدول 1). با توجه به نوع و مقدار نمک‏ها ‏محیط کشت متناسب با محیط طراحی شد (جدول 2). با توجه به اینکه مشخص شده استفاده از محیط کشت فقیر غذایی سبب افزایش میزان جداسازی می‏شود، در پژوهش حاضر از این نوع محیط استفاده شد. زیرا در محیط‏های طبیعی ماده غذایی به وفور دیده نمی‏شود و جمعیت‏ها ‏در محیط طبیعی در حالت متابولیسمی نیمه فعال وجود دارند (24). محتوی نمکی از تغییر میزان نمک استفاده شده در محیط هالوفیلیک نسبی[10] MH به‏دست آمد (25).

 

 

جدول 1- ویژگی‏های فیزیکی و میزان عناصر سرچشمه‏های چشمه بادآب سورت

رنگ

غلظت یون‏ها ‏(گرم بر لیتر)

دما (آب)

دما محیط)

اسیدیته

شوری

نقطه

CO32-

SO42-

Cl-

Mg2+

Ca2+

K+

Na+

Fe2+

قرمز، خاکستری، سیاه

7/0>

1/3

5/36

25/0

5/16

014/0

12

0012/0

19

24

39/7

2/56

A شرقی

قرمز

68/1>

96/0>

7/1

011/0

05/0

02/0

06/0

000023/0

18

24

15/7

42/3

Bغربی

 

 

جدول 2- محیط کشت و شرایط گرماگذاری استفاده شده برای جداسازی و خالص‏سازی ‏باکتری‏ها

محیط B2

محیط A1

 

1000

1000

آب مقطر (میلی‏لیتر)

8/0

8/0*

نوترینت براث

-

8/4

MgSO4 7H2O

-

2/3

MgCl2 6H2O

-

1

KCl

-

5/40

NaCl

-

015/0

NaHCO3

-

09/0

CaCl2 2H2O

15

15

آگار

34

**34

دما (درجه سانتی‏گراد‏)

7

5/7

 اسیدیته

* مقادیر بر حسب گرم بر لیتر

** استفاده از دمای بین 30 تا 34 درجه سانتی‏گراد‏ گستره جداسازی باکتری‏ها ‏را افزایش می‏دهد.

1 محیط طراحی شده برای سرچشمه شرقی1

2 محیط طراحی شده برای سرچشمه غربی2

پس از تلقیح، محیط‏ها ‏در دمای 34 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 6 ماه گرماگذاری شدند و جداسازی و خالص‏سازی ‏به روش کشت خطی انجام شد.

کشت سویه‏های جدا شده روی محیط B4 و تایید رسوب گذاری: برای بررسی تأثیر باکتری‏ها ‏بر رسوب‏گذاری، باکتری‏های خالص شده روی محیط کشت B4 (کلسیم استات 25/0 درصد، گلوکز 1 درصد، عصاره مخمر4/0 درصد، نمک به میزان مورد نیاز سویه‏ها ‏و آگار 5/1 درصد برای محیط جامد) کشت داده شدند (26). به محیط چند قطره از فنل رد به عنوان شناساگر اضافه شد (مقدار 0025/0 درصد حل شده در سدیم هیدروکسید 1/0 نرمال) و با توجه به اینکه مشخص شده رسوب‏گذاری ‏کربنات کلسیم در اسیدیته‏‏های بالاتر از 8 رخ می‏دهد، اسیدیته محیط روی 8 تنظیم شد (27)، سویه‏ها ‏در دمای 34 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 1 هفته تا یک ماه گرمخانه‏گذاری ‏شدند.

تأیید رسوب‏گذاری ‏کلسیت توسط میکرسکوپ پلاریزان انجام شد، بدین صورت که بلورهای کلسیت در زیر نور پلاریزه به رنگ بژ تا خاکستری دیده می‏شوند، در حالی که بلورهای نمک یا هالیت[11] به علت اینکه زاویه بلور 90 درجه دارند به اصطلاح خاموش می‏شوند یعنی تیره هستند و دیده نمی‏شوند. زاویه بلور کلسیت 120 درجه است به همین علت زیر نور پلاریزه به رنگ بژ یا خاکستری دیده می‏شوند زیرا می‏توانند نور را از خود عبور دهند (شکل 5).

تحلیل سویه ‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم: پس از تأیید وجود رسوب کلسیت دمای مناسب رسوب‏گذاری ‏برای یک سویه در بین دماهای 15، 20، 30 و 40 درجه سانتی‏گراد‏ به‏دست آمد. میزان کربنات کلسیم از طریق فیلتراسیون با کاغذ صافی 5/12 سانتی‏متری با اندازه حفره 42 میکرون واتمن به‏دست آمد. تفاوت وزن فیلتر قبل و پس از فیلتراسیون نشان دهنده مقدار کربنات‌کلسیم است (28) که میزان به شکل میلی‏گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد[12] و در نهایت، میزان تولید رسوب با استفاده از روش یاد شده در بالا و میزان تغییرات اسیدیته با استفاده از اسیدیته متر مدل Multi7 برای سویه‏ها ‏طی 21 روز و در دمای مناسب به‏دست آمده در آزمایش قبلی محاسبه شد (29).

شناسایی مولکولی و رسم درخت فیلوژنتیکی: برای شناسایی مولکولی جدایه‏ها، ابتدا از آن‏ها بیومس گرفته شد. استخراج DNA به روش جوشاندن انجام شد و واکنش PCR با پرایمر‏‏های عمومی 27F
(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') و 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGCTT-3') با برنامه (دناتوراسیون اولیه 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه در یک چرخه، دناتوراسیون 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 1 دقیقه در 30 چرخه، اتصال 56 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه، گسترش 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 ثانیه در 30 چرخه و گسترش نهایی به مدت 7 دقیقه در یک چرخه) انجام شد. محصول PCR برای تعیین‌ توالی از طریق شرکت ژن فن‌آوران به شرکت ماکروژن[13] تحویل داده‌ شد و توالی به‏دست آمده با استفاده از نرم افزار کرماس پرو [14]4/1 اصلاح شد. سپس، با استفاده از ابزار بلاست[15] توالی با توالی‏های ثبت شده در پایگاه‏های داده اطلاعات ژنوم NCBI و Eztaxon مقایسه و میزان شباهت آن با سویه‌های مختلف ثبت شده تعیین شد (31).

تحلیل فیلوژنتیک سویه‌های منتخب و سویه‌های مشابه آن با استفاده از نرم افزارهای Clustal X2، Bioedit و Mega6 انجام شد و شکل 6 فیلوژنتیک با استفاده از روش‌های Neighbor-joining انجام گرفت (32). بررسی میزان اعتبار شاخه‌‏ها ‏در درخت رسم شده با استفاده از الگوریتم BootstrapAnalysis و با 1000 بار نمونه‏‏گیری انجام شد (33 و 34).

 

نتایج.

مقاطع تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان بررسی شدند و سپس، تصویر SEM از نمونه‏های مناسب گرفته شد (شکل 4 تا 9).

 

 

 

شکل 4- تصاویر نمونه سنگ RS-1 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایره‏ای متحد المرکز هستند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنید‏هایی ‏به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که دیاتومه‏ها ‏به خوبی دیده می‏شوند.

 

 

شکل 5- تصاویر نمونه سنگ RS-2 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایه‏ای است ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن به رنگ قرمز و ترکیبات آلی به رنگ قهوه‏ای و سیاه دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگ که باکتری‏های باسیلی شکل به وضوح دیده می‏شود.

 

 

شکل 6- تصاویر نمونه سنگ RS-3 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) الگوی رسوبی لایه‏ای در نمونه دیده می‏شود و همچنین رسوبات آهن دار که به رنگ قرمز دیده می‏شوند، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که ترکیبات آهن دار به رنگ قرمز در کنار بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده می‏شوند و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که بلورهای کلسیت دیده شده و همچنین باکتری‏های کوکسی شکل دیده می‏شوند.

 

شکل 7- تصاویر نمونه سنگ RS-4 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه دارای الگوی رسوبی لایه‏ای بوده و روی سنگ نشانه‏هایی ‏از رسوبات ثانویه و همچنین فعالیت ارگانیسم‏ها ‏دیده می‏شود، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ، رسوبات آهن به رنگ قرمز دیده می‏شوند، زمینه سیاه رنگ به علت استفاده از چسب اپوکسی است.

 

 

شکل 8- تصاویر نمونه سنگ RS-5 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) پیزوئیدها دارای الگوی رسوبی دایره‏ای متحد المرکز هستند،
ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به شکل گنبد‏هایی ‏به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی که باکتری کوکسی شگل در نمونه دیده می‏شود.

 

 

شکل 9- تصاویر نمونه سنگ RS-6 تهیه شده از چشمه بادآب سورت، الف) نمونه الگوی رسوبی لایه‏ای داشته و روی آن رنگ‏های سیاه دیده می‏شود که به علت فعالیت ارگانیسم‏هایی ‏مثل جلبک‏ها ‏و گلسنگ‏ها ‏است، ب) تصویر تهیه شده توسط میکرسکوپ پلاریزان که بلورهای کلسیت به رنگ بژ دیده می‏شود و ج) تصویر SEM از نمونه سنگی.

146 جدایه‏ای که در مرحله جداسازی به‏دست آمده بود بر روی محیط B4 کشت داده و پس از یک ماه بررسی شدند. مشاهده شد که 5 جدایه Bss-3، Bsw-28d، Bss-11a، Bsw-1c1 و Bsw-39b توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند (شکل 10). میزان شباهت آن‏ها به نزدیک‏‏ترین ‏تاکسون در جدول 3 آورده شده است.

 

شکل 10- مشاهده بیومس میکروبی ‏با میکروسکوپ نوری (شکل الف) و میکروسکوپ پلاریزان (شکل ب)، در شکل ب مکعب‏های نمک در نور پلاریزه به رنگ تیره دیده می‏شوند. رسوب کربنات کلسیم در زیر میکروسکوپ پلاریزان به رنگ بژ و خاکستری دیده می‏شود که شکل ب نمایان است و با فلش نشان داده شده است. در مرکز آن مکعب‏های مشکی رنگ هالیت نمایان است.

 

جدول 3- ویژگی‏های سویه‏هایی ‏که توانایی رسوب کلسیت در محیط B4 را داشتنند

نام سویه

تاکسون مشابه

درصد شباهت

واکنش گرم

مورفولوژی

Bss-3

Labrenzia aggregate IAM12614T

6/99

منفی

باسیل

Bss-11a

Bacillus cohenii DSM6307T

7/99

مثبت

باسیل

Bsw-1c1

Bacillus safensis FO-036bT

9/99

مثبت

باسیل

Bsw-28d

Marinobacter flavimaris SW-145T

100

منفی

باسیل

Bsw-39b

Marinobater adhaerens HP15T

100

منفی

باسیل

 

 

 

شکل 11- درخت فیلوژنتیک مربوط به سویه مربوط به سویه‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم با استفاده از روش Neighbor-joining.

ضریب بوت استرپ 1000 و Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه استفاده شده است.

 

 

در بین این سویه‏ها، این توانایی برای نخستین بار است که برای ‏Bss-3 گزارش شده است.

درخت فیلوژنی سویه‏‏‏ها با روش نیبر جوینینگ[16] و ضریب بوت استرپ[17] 1000 رسم شد.
Ferroplasmaacidarmanusfer1 به عنوان برون گروه انتخاب شد و در شکل 11 آورده شده است.

سویه Bss-3 برای انتخاب دمای مناسب رسوب‏گذاری ‏انتخاب شد و آزمایش نشان داد که دمای مناسب 30 درجه سانتی‏گراد‏ است (شکل 12).

سپس، میزان رسوب و تغییرات اسیدیته برای 5 سویه در دمای 30 درجه سانتی‏گراد‏ در 21 روز به‏دست آورده شد (شکل 13 و 14).

 

 

 

شکل 12- میزان رسوب کربنات کلسیم در 4 دمای 15، 20، 30 و 40 درجه سانتی‏گراد‏ برای سویه Bss-3، نتایج نشان می‏دهد که مناسب‏‏ترین ‏دما 30 درجه سانتی‏گراد‏ است که برای انجام آزمایش‏های بعدی استفاده شد، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.

 

 

 

شکل 13- تغییرات اسیدیته محیط کشت 4‏‏‏‏B مایع برای سویه‏های رسوب دهنده کننده کربنات کلسیم، ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.

 

شکل 14- تغییرات رسوب کربنات کلسیم در محیط کشت B4 مایع برای سویه‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم ضریب خطا، خطاهای استاندارد در نسبت با میانگین است.

 


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

در ابتدا توالی لایه‏های سنگ‏‏‏های رسوبی منطقه بررسی شد (شکل 2)، لایه‏های سنگی مربوط به دوران سوم زمین‏شناسی، دوره کواترنری و سری پلیوستوسن و پلیوسن هستند که مربوط به 6/1 میلیون سال پیش است. بیشتر تراورتن‏‏‏ها در این دوره شکل گرفته ‏‏اند که با داده‏های قبلی مطابقت دارد (1). سپس، موقعیت مکانی و زمانی چشمه بادآب سورت مشخص شد (شکل 3). همان‏طور که مشاهده می‏شود، چشمه محدوده کوچکی دارد و سرچشمه‏های قدیمی هم در کنار آن دیده می‏شوند. زمانی که تشکیل رسوبات مانع از خارج شدن آب نشود چشمه به فعالیت خود ادامه می‏دهد و در نهایت، با مسدود شدن راه خروج آب چشمه از فعالیت می‏افتد (شکل 1، ب) در شکل‏های 2 و 3 گسل‏ها ‏و شکستگی‏هایی ‏دیده می‏شود. این نشان دهنده آن است این منطقه از نظر فعالیت تکتونیکی منطقه فعالی است به همین علت ترتیب لایه‏ها ‏در منطقه یکسان نیست (1).

سرچشمه‏‏‏ها می‏توانند از دو منشا باشند. یا از لایه‏های آهکی و دولومیتی باشند و یا از توده‏‏های تخریبی[xviii] منشا گرفته باشند. بر همین اساس ترکیب یونی متفاوت خواهد شد. سرچشمه‏‏‏هایی ‏که منشا دولومیتی و آهکی داشته باشند، غنی از کلسیم و منیزیم هستند و اسیدیته قلیایی دارند که پتانسیل رسوب کربنات کلسیم در این حالت بیشتر است. چشمه‏هایی ‏سنگ‏های میزبان آن‏ها از نوع ماسه سنگی و شیلی است، غنی از گوگرد، ذغال، آهن و سیلیس هستند و به علت وجود گوگرد اسیدی می‏شود. سرچشمه غربی این شرایط را دارد، البته اسیدی بودن می‏تواند به علت CO2 باشد که می‏تواند منشا کربناتی داشته باشد. داده‏‏‏های تحلیل یونی (جدول 1) این موضوع را تأیید می‏کند. این داده‏‏‏ها ‏نشان می‏دهد که سرچشمه شرقی از سنگ منشأ‏های آهکی، و سرچشمه غربی از سنگ میزبان شیلی سرچشمه گرفته اند. رنگ قرمز چشمه به علت وجود ترکیبات آهن است که منشا تخریبی دارد و رنگ سیاه ناشی از حضور سولفید آهن FeS است که در شرایط بی ‏‏هوازی توسط فعالیت باکتری‏هایی ‏مثل SRB‏ها ‏تولید می‏شوند. نتایج تحلیل نشان می‏دهد که هر دو سرچشمه حاوی آهن هستند که رنگ قرمز چشمه را تأیید می‏کند. در سرچشمه غربی ابتدا آهن رسوب کرده و رسوبات بعدی خاکستری رنگ دیده می‏شوند، به این علت که ترکیبات آهن زودتر رسوب می‏‏‏کنند. با توجه به اینکه فاصله کمی بین دو سرچشمه است می‏توان نتیجه گرفت که منشا آب سرچشمه‏ها ‏متفاوت بوده و اینکه لایه‏های سنگی مسیر عبوری آب‏های زیرزمینی سبب شده تا ترکیب یونی تغییر کند.

بررسی رابطه میکروب- محیط در ابتدا با روش میکرسکوپی انجام شد نتایج در شکل 4 تا 9 آمده است. الگوی رسوبی سنگ‏ها ‏به شکل لایه‏ای (RS-2,3,4) و دایره‏ای متحدالمرکز (RS-1,5) بودند که به (RS-1,5) پیزوئید گفته می‏شود. این‏ها ‏در حوضچه‏ها ‏تشکیل می‏شوند و نیاز به یک هسته اولیه برای تشکیل و گسترش دارند (2) که میکروارگانیسم‏ها ‏ممکن است این نقش را ایفا کنند. در شکل 6 (RS-3) لایه‏هایی ‏به طور هماهنگ وجود دارد که نشان دهنده تغییرات روزانه بوده است (35)، این در شکل 4 هم دیده می‏شود که این به علت فعالیت سیانوباکترهاست. آن‏ها با جذب کربن دی اکسید شرایط را برای رسوب یافتن کلسیت فراهم می‏آورند (36). همان‏طور که مشاهده می‏شود لایه‏های رسوبی می‏توانند به شکل دایره‏ای متحدالمرکز و لایه‏های روی هم باشد (شکل 4 و 6)، این نشان از شرایط تشکیل می‏دهد به این شکل که اگر به صورت لایه‏های متحدالمرکز باشد، نشان می‏دهد هسته اولیه وجود داشته و این هسته دارای حرکتی روبه جلو و عقب بوده. ولی زمانی که لایه‏ها ‏روی هم باشد و حلقه‏ای نباشد، به این معناست که سطحی برای رسوب وجود داشته و این سطح ثابت بوده است.

در شکل 4 و تصویر پلاریزان (RS-1) رسوبات گنبدی (هرمی) شکل کربنات کلسیم دیده می‏شود، که به رنگ بژ دیده می‏شود. هرچه این‏ها ‏شفاف‏تر باشند نشان می‏دهد جنس رسوبات و سیمان شباهت بیشتری به هم داشته‏اند. رسوبات کلسیت را می‏توان در شکل 8 و 9 (RS-5 و RS-6) نیز مشاهده کرد. در تصویر پلاریزان شکل 7 ((RS-4 بلورهای کلسیت در کنار رسوبات دیگر دیده می‏شود این رسوبات با رنگ‏های مختلف نیلی، قرمز دیده می‏شود، رسوبات قرمز رنگ به علت وجود آهن در ترکیبات آن‏هاست.

در تصویر پلاریزان شکل 5 و 6 (RS-2 و RS-3) دایره‏های قرمز رنگ دیده می‏شود، این‏ها ‏رسوبات آهن هستند. البته نواحی قهوه‏ای رنگ می‏تواند به علت وجود ترکیبات آلی (سیانوباکترها و جلبک ها) باشد. در مقاطع نازک میکروسکوپی در نور پلاریزان دایره‏های سیاه رنگ هم دیده می‏شود که این به علت حضور کاربراندوم است. این پودر زمان ساییدن لایه نازک سنگ استفاده می‏شود. در لام ممکن است فضا‏های خالی به رنگ سیاه دیده شود (RS-3,4، شکل 6 و 7) که این به علت استفاده از چسب است، به طور معمول برخی از سنگ‏های کربناته جنس سستی دارند که برای جدا نشدن و از هم پاشیده نشدن بافت سنگ با چسب اپوکسی اشباع می‏‏‏شوند. قطر لایه‏ها ‏کمتر از 2 میلی‏متر است (RS-1، شکل 4) که نشان از سرعت بالای رسوب‏گذاری ‏در این چشمه است.

در شکل 7 (RS-4) دیده می‏شود که لایه‏های تشکیل شده دارای رسوبات آهن هستند که می‏تواند به علت وجود باکتری‏های اکسیدکننده آهن باشد. عکس SEM نیز وجود باکتری‏های کروی را تایید می‏کند (20).

در بررسی تاثیر‏گذاری ‏میکروارگانیسم‏‏ها در رسوب‏گذاری ‏با توجه به عکس‏های گرفته شده از میکرسکوپ الکترونی، باکتری‏‏‏ها ‏و دیاتومه‏‏‏ها در بلورهای کلسیت مشاهده می‏شوند، این نشان می‏دهد که میکروارگانیسم‏ها ‏می‏توانند به عنوان هسته اولیه تشکیل بلور عمل کنند و با تولید پلی‏ساکاریدهای خارج سلولی سبب پیشرفت بلور شوند که در مطالعات دیگر نیز گزارش شده است (22).

در پژوهش حاضر، در بررسی با استفاده از کشت میکروبی ‏روی تأثیر باکتری‏های هتروتروف در رسوب‏گذاری ‏کلسیت، مشخص شد که 5 سویه Bss-3، Bsw-28d و Bsw-39b، Bss-11a و Bsw-1c1 توانایی رسوب کربنات کلسیم را دارند. این 5 سویه بیش‏ترین شباهت را به تاکسون‏‏هایLabrenzia aggregate IAM 12614T، Marinobacter flavimaris SW-145T، MarinobateradhaerensHP15T، BacilluscoheniiDSM6307T و BacillussafensisFO-036bT داشتند. در مطالعات پیشین مشخص شده که باکتری‏های Bacillus، Shewanella، Pseudomonas و Micrococcus در رسوب‏گذاری ‏تاثیر دارند (37) (38) ولی در مورد سویه Bss-3، نخستین بار است که این توانایی برای آن گزارش شده است. ویژگی‏های ریخت‏شناختی و درخت فیلوژنی سویه‏های رسوب دهنده کربنات کلسیم در جدول 3 و شکل 11 نشان می‏دهد که سویه‏های جداشده، همگی شکل باسیلی داشته و 3 سویه گرم منفی بوده‏اند.

پس از تایید وجود رسوب کربنات کلسیم (شکل 10) ابتدا دمای مناسب تولید رسوب برای سویه Bss-3 به‏دست آمد که دمای 30 درجه بود (شکل 11)، میزان تولید بلور در دمای پایین کم است که این را می‏توان به واکنش‏های رشد ربط داد. بیش‏ترین میزان تولید بین دماهای 20 و 30 درجه است که اشاره به دمای مناسب رشد دارد و اینکه دمای آب و چشمه هم بین 18 تا 25 درجه سانتی‏گراد‏ بود که تایید کننده دمای مناسب رشد است.

 سپس، میزان تولید رسوب و تغییرات اسیدیته توسط سویه‏ها ‏در دمای 30 درجه محاسبه شد. با توجه به داده‏‏های به‏دست آمده مشاهده شد که در همان هفته اول به بالاترین میزان تولید کلسیت می‏رسد و پس از آن میزان آن کم می‏شود که این می‏تواند با متابولیسم سلول ربط داشته باشد به همین علت باید تغییرات سلول‏های زنده و دارای فعالیت با این داده‏‏‏ها همراه شود.

داده‏های تغییرات اسیدیته (شکل 13) نشان می‏دهد که در نسبت با اسیدیته اولیه تغییرات متفاوت بوده است (اسیدیته قبل از اتوکلاو روی 8 تنظیم شد که پس از اتوکلاو روی 4/7 برای نمک 3 درصد و 6/7 برای نمک 5 درصد مشاهده شد). سویه Bss-3 پس از یک هفته اسیدیته را روی 8 برده و این افزایش تا اسیدیته حدود 4/8 ادامه پیدا می‏کند. در صورتی که دو سویه Bsw-28d و Bsw-39b، اسیدیته محیط‏شان قلیایی‏تر شده و حتی اسیدیته 9 هم برای روز 21 مشاهده شد. این در حالی است که اسیدیته محیط دو سویه Bsw-1c1 و Bss-11a به سمت اسیدی شدن حرکت کرده و تا حدود 5/5 برای سویه Bsw-1c1 مشاهده و گزارش شد، این نتایج با داده‏های زامارنو[xix] مطابقت دارد. در این مطالعه تغییرات اسیدیته هم افزایش و هم کاهش را نشان می‏دهد ولی میزان تغییرات کمتر از داده‏های این پژوهش است (29). با توجه به اینکه رسوب کلسیت با تغییرات اسیدیته که توسط متابولیسم باکتریایی انجام می‏شود ربط دارد (9)، می‏توان نتیجه گرفت که سه سویه Bss-3، Bsw-28d و Bsw-39b با تغییر اسیدیته سبب رسوب کلسیت می‏شوند، ولی دو سویه Bss-11a و Bsw-1c1 از راه دیگری سبب رسوب کلسیت می‏شوند. با توجه به اینکه پس از 21 روز سلول‏ها ‏وارد فاز سکون و مرگ می‏شوند احتمالا این تغییرات متابولیکی سلول‏ها ‏سبب کاهش میزان رسوب کلسیت می‏شوند به طوری که اندازه بلورهای کلسیت را تغییر می‏دهند (29). در مطالعه زامارنو در تمام سویه‏ها ‏مقدار سلول‏های فعال از روز اول تا هفته اول افزایش یافته بود و سپس، تا هفته سوم کاهش را نشان می‏داد (29).

نمودار تغییرات رسوب کربنات کلسیم در طول 21 روز (شکل 14) نشان می‏دهد که دو سویه Bss-11a و Bsw-1c1 مقدار کمی تولید می‏کنند که این می‏تواند به علت اسیدی شدن محیط باشد. دو سویه Bsw-28d و Bsw-39b بیش‏ترین میزان رسوب را داشته، 6/45 و 5/37 میلی‏گرم که این مقادیر در همان هفته اول بوده و در روزهای بعد میزان رسوب کاهش می‏یابد. سویه Bss-3 بیش‏ترین میزان رسوب را در هفته دوم داشته، 6/29 میلی‏گرم که باز هم در هفته آخر این میزان کاهش می‏یابد. این داده‏‏ها در ابتدا نشان می‏‏دهد که میزان تولید رسوب رابطه مستقیم با فعالیت متابولیکی سلول‏ها ‏ دارد زیرا سلول‏ها ‏با گذشت زمان از فاز لگاریتمی رشد خارج شده و وارد فاز سکون و مرگ می‏شوند. البته اسیدیته محیط باز هم افزایش می‏‏یابد که این نشان دهنده تمام شدن ماده غذایی و استفاده سلول‏ها ‏از ذخیره‏های پروتئینی است که این سبب افزایش اسیدیته شده ولی سبب کاهش رسوب می‏شود که علت آن نامشخص است. البته این داده‏‏ها برای تایید بیشتر باید با آزمایش‏‏های دیگر مانند تحلیل XRD و SEM تایید و میزان تغییرات سلول‏‏های دارای فعالیت (سلول‏‏های زنده) و تغییرات فاز رشد انجام شود. همچنین، آزمایش می‏تواند در کشت ثابت و مداوم مقایسه شود.

داده‏های ‏به‏دست آمده از پژوهش نشان می‏دهد محیط و میکروب‏ها ‏در کنار هم تکامل می‏یابند. محیط و میکروارگانیسم‏ها ‏از ابتدای حیات در کنار هم بوده‏اند و سبب تکامل یکدیگر شده‏اند و برای ثبات و ماندگاری هر دو باید در کنار هم وجود داشته باشند. بنابراین، برای حفظ زیستگاه‏های طبیعی باید این نکته را در نظر داشته باشیم. با افزایش فعالیت‏های بشری و دست ورزی زیستگاه‏ها ‏که سبب تغییر شرایط محیطی زیستگاه‏ها ‏و متعاقب آن تغییر جامعه میکروبی ‏می‏شود در آینده نه چندان دور میکروارگانیسم‏های سازگاریافته با محیط از بین رفته و میکروارگانیسم‏های دیگر جایگزین می‏شوند که این حفاظت زیستگاه را به خطر می‏اندازد. البته حیات انسان هم وابستگی شدیدی به حیات اکوسیستم اطراف دارد. در انتها باید بیان کرد که باکتری‏های رسوب دهنده کلسیت کاربردهای بیوتکنولوژیک زیادی دارند (15- 19) و از آن‏ها می‏توان در احیای محیط‏های کربناته از فعالیت افتاده استفاده کرد (22).

تشکر و قدردانی

نگارندگان از همکاران خود در آزمایشگاه دانشگاه تهران و مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران بخش میکروبی ‏تشکر و قدردانی می‏کنند.

 



[1]- Tivertion

[2]- Biologically-induced mineralization

[3]- Biologically-influenced mineralization

[4]- Alkanity engine

[5]- Olympus

[6]-Corel Draw X6

[7]- Google earth

[8]- Surfer 10

[9]- Perkin Elmer 100

[10]- Moderate halophilic medium

[11]- Halite (NaCl)

[12]- در مقاله‏های بررسی شده واحد اندازه‏گیری کلسیت به شکل میلی‏گرم بود که به علت نامشخص بودن در این پژوهش از واحد میلی‏گرم بر میلی‏لیتر استفاده شد. به علت مناسب نبودن روش ممکن است در محاسبه کلسیت اشتباهی رخ دهد که اجتناب‏تاپذیر است، البته این روش بیشتر برای مقایسه کربنات کلسیم در بین سویه‏هاست و ضریب خطا برای همه محاسبه می‏شود.

[13]- Macrogene

[14]- Chromas Pro 1.4

[15]- BLAST

[16]- Neighbor-joining

[17]- Boot Strap

[xviii]- Shale

[xix]- ZamarreŇo

(1)               Pentecost A. Travertine. Netherlands: Springer; 2005.

(2)               lak R., Mohammadi A., RAhimi E. Introducing Travertine Sourt Spring, kiasar, Mazandaran as a geopark. First national conference: Applied research on water resource of Iran; Kermanshah 2011.

(3)               Fouke BW. Depositional Facies and Aqueous- Solid Geochemistry of Travertine- Depositing Hot Springs (Angel Terrace, Mammoth Hot Springs, Yellowstone National Park, USA): Reply. Journal of Sedimentary Research 2001; 71 (3): 497- 500.

(4)               Riding R. Microbial carbonates: the geological record of calcified bacterial–algal mats and biofilms. Sedimentology 2000; 47 (s1): 179- 214.

(5)               Russell MJ., Hall A. The emergence of life from iron monosulphide bubbles at a submarine hydrothermal redox and pH front. Journal of the Geological Society 1997; 154 (3): 377- 402.

(6)               Westall F., de Wit MJ., Dann J., van der Gaast S., de Ronde CE., Gerneke D. Early Archean fossil bacteria and biofilms in hydrothermally- influenced sediments from the Barberton greenstone belt, South Africa. Precambrian Research 2001; 106 (1): 93- 116.

(7)               Allwood AC., Grotzinger JP., Knoll AH., Burch IW., Anderson MS., Coleman ML., et al. Controls on development and diversity of Early Archean stromatolites. Proceedings of the National Academy of Sciences 2009; 106 (24): 9548- 55.

(8)               Semikhatov M., Gebelein C., Cloud P., Awramik S., Benmore W. Stromatolite morphogenesis- progress and problems. Canadian Journal of Earth Sciences 1979; 16 (5): 992- 1015.

(9)               Dupraz C., Reid RP., Braissant O., Decho AW., Norman RS., Visscher PT. Processes of carbonate precipitation in modern microbial mats. Earth- Science Reviews 2009; 96 (3): 141- 62.

(10)           Weiner S., Dove PM. An overview of biomineralization processes and the problem of the vital effect. Reviews in Mineralogy and Geochemistry 2003; 54 (1): 1- 29.

(11)           Nealson KH. Sediment bacteria: who's there, what are they doing, and what's new? Annual Review of Earth and Planetary Sciences 1997; 25 (1): 403- 34.

(12)           Andres MS., Pamela Reid R. Growth morphologies of modern marine stromatolites: a case study from Highborne Cay, Bahamas. Sedimentary Geology 2006; 185 (3): 319- 28.

(13)           Konhauser K., Riding R. Bacterial biomineralization. Fundamentals of geobiology Blackwell Publ 2012: 105- 30.

(14)           14.       Reid P., Dupraz C., Visscher P., Sumner D. Microbial processes forming marine stromatolites. In: Fossil and Recent Biofilms. Netherlands: Springer; 2003. p. 103- 18.

(15)           Warren LA., Maurice PA., Parmar N., Ferris FG. Microbially mediated calcium carbonate precipitation: implications for interpreting calcite precipitation and for solid- phase capture of inorganic contaminants. Geomicrobiology Journal 2001; 18 (1): 93- 115.

(16)           DeJong JT., Fritzges MB., Nüsslein K. Microbially induced cementation to control sand response to undrained shear. Journal of Geotechnical and Geoenvironmental Engineering 2006; 132 (11): 1381- 92.

(17)           Gollapudi U., Knutson C., Bang S., Islam M. A new method for controlling leaching through permeable channels. Chemosphere 1995; 30 (4): 695- 705.

(18)           De Muynck W., Debrouwer D., De Belie N., Verstraete W. Bacterial carbonate precipitation improves the durability of cementitious materials. Cement and concrete Research 2008; 38 (7): 1005- 14.

(19)           Le Metayer- Levrel G., Castanier S., Orial G., Loubiere J- F., Perthuisot J- P. Applications of bacterial carbonatogenesis to the protection and regeneration of limestones in buildings and historic patrimony. Sedimentary geology 1999; 126 (1): 25- 34.

(20)           Takashima C., Kano A., Naganuma T., Tazaki K. Laminated iron texture by iron- oxidizing bacteria in a calcite travertine. Geomicrobiology Journal 2008; 25 (3- 4): 193- 202.

(21)           Wright DT., Oren A. Nonphotosynthetic bacteria and the formation of carbonates and evaporites through time. Geomicrobiology Journal 2005; 22 (1- 2): 27- 53.

(22)           Rodriguez- Navarro C., Jroundi F., Schiro M., Ruiz- Agudo E., González- Muñoz MT. Influence of substrate mineralogy on bacterial mineralization of calcium carbonate: implications for stone conservation. Applied and environmental microbiology 2012; 78 (11): 4017- 29.

(23)           Cacchio P., Contento R., Ercole C., Cappuccio G., Martinez MP., Lepidi A. Involvement of microorganisms in the formation of carbonate speleothems in the Cervo Cave (L'Aquila- Italy). Geomicrobiology Journal 2004; 21 (8): 497- 509.

(24)           Sangwan P., Kovac S., Davis KE., Sait M., Janssen PH. Detection and cultivation of soil Verrucomicrobia. Applied and environmental microbiology 2005; 71 (12): 8402- 10.

(25)           Mehrshad M., Amoozegar MA., Yakhchali B. Diversity of aerobic heterotrophic moderately halophilic and halotolerant bacteria from western coastal line of Urmia Lake with culture-dependent and culture-independent methods [Dissertation]. Iran: University of Tehran; 2011.

(26)           Boquet E., Boronat A., Ramos-Cormenzana A. Production of calcite (calcium carbonate) crystals by soil bacteria is a general phenomenon. Nature 1973; 246: 527- 9.

(27)           Marvasi M., Visscher PT., Perito B., Mastromei G., Casillas‐Martínez L. Physiological requirements for carbonate precipitation during biofilm development of Bacillus subtilis etfA mutant. FEMS microbiology ecology 2010; 71 (3): 341- 50.

(28)           Zamarreño DV., Inkpen R., May E. Carbonate crystals precipitated by freshwater bacteria and their use as a limestone consolidant. Applied and environmental microbiology 2009; 75 (18): 5981- 90.

(29)           ZamarreŇo DV., May E., Inkpen R. Influence of environmental temperature on biocalcification by non- sporing freshwater bacteria. Geomicrobiology Journal 2009; 26 (4): 298- 309.

(30)           Spencer JF., de Spencer ALR. Public health microbiology: methods and protocols. New York: Springer; 2004.

(31)           Chun J., Lee J- H., Jung Y., Kim M., Kim S., Kim BK., et al. EzTaxon: a web- based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2007; 57 (10): 2259- 61.

(32)           Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in bioinformatics 2004; 5 (2): 150- 63.

(33)           Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap. Evolution 1985; 39 (4): 783- 91.

(34)           Mehrshad M., Amoozegar M A., Yakhchali B., Shahzedeh Fazeli A. Biodiversity of moderately halophilic and halotolerant bacteria in the western coastal line of Urmia lake. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (2): 49- 70.

(35)           Pentecost A. Formation of laminate travertines at Bagno Vignone, Italy. Geomicrobiology Journal 1994; 12 (4): 239- 51.

(36)           Pentecost A., Bayari S., Yesertener C. Phototrophic microorganisms of the Pamukkale travertine, Turkey: their distribution and influence on travertine deposition. Geomicrobiology Journal1997; 14 (4): 269- 83.

(37)           Bundeleva IA., Shirokova LS., Bénézeth P., Pokrovsky OS., Kompantseva EI., Balor S. Calcium carbonate precipitation by anoxygenic phototrophic bacteria. Chemical Geology 2012; 291: 116- 31.

(38)           López- García P., Kazmierczak J., Benzerara K., Kempe S., Guyot F., Moreira D. Bacterial diversity and carbonate precipitation in the giant microbialites from the highly alkaline Lake Van, Turkey. Extremophiles 2005; 9 (4): 263- 74.