بررسی توانایی تولید بیوسورفکتانت توسط دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد شیمی و حاصلخیزی خاک، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

2 دانشیار شیمی و حاصل خیزی خاک، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

3 استادیار خاک شناسی، دانشگاه شهید چمران اهواز، ایران

چکیده

مقدمه: بیوسورفکتانت‌ها، مولکول‌های دوگانه دوست منحصر به‌ فردی هستند که کاربرد وسیعی در حذف آلودگی‌های آلی و فلزی محیط‌زیست دارند. هدف از پژوهش حاضر، بررسی و تعیین شرایط بهینه تولید بیوسورفکتانت توسط دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI است. ‏‏‏

مواد و روش ‏‏ها: در این پژوهش، اثر منبع کربن، دما و زمان گرما‏گذاری بر تولید بیوسورفکتانت بررسی شد. به‌منظور تشخیص تولید بیوسورفکتانت از روش‌های کمی و کیفی غربال‏گری، مانند همولیز آگار خون‌دار، روش پراکنش نفت، روش فروپاشی روغن، سنجش فعالیت امولسیون‏کنندگی، سنجش آب‌گریزی سلول و اندازه‌گیری کشش سطحی استفاده شد. سپس، با توجه به نتایج حاصل بهترین شرایط تولید بیوسورفکتانت توسط دو باکتری
Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI تعیین شد. ‏‏‏

نتایج: در این پژوهش، هر دو باکتری قادر به تولید بیوسورفکتانت در سطح قابل قبولی بودند. از میان چهار منبع کربن مورد بررسی گلوکز، نفت سفید، ملاس نیشکر و فنانترن به‌عنوان منبع کربن و انرژی توسط این دو باکتری استفاده شدند. باکتری Bacillus subtilis WPI بیش‏ترین کاهش کشش سطحی را در منبع کربن نفت سفید پس از 156 ساعت و در دمای 37 درجه سلسیوس نشان داد و توانست کشش سطحی را تا 3/0± 1/33 (میلی‏نیوتن بر متر) کاهش دهد. بیش‏ترین کاهش کشش سطحی توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس نیشکر حاصل شد. کشش سطحی نمونه شاهد بدون باکتری حاوی ملاس معادل 5/1± 4/50 (میلی‏نیوتن بر متر) بود که این سویه توانست پس از 156 ساعت و در دمای 37 درجه سلسیوس کشش سطحی محلول را تا 83/22 (میلی‏نیوتن بر متر) کاهش دهد. ‏‏‏

بحث و نتیجه ‏گیری: باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI قابلیت بالایی برای تولید بیوسورفکتانت و تجزیه هیدروکربن‌های نفتی و فنانترن دارند. بنابراین، می‌توان گفت این دو باکتری قابلیت استفاده در زیست پالایی و دیگر کاربردهای زیست‌محیطی و بیوتکنولوژی را دارا هستند. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation of biosurfactant production by Bacillus pumilus 1529 and Bacillus subtilis WPI

نویسندگان [English]

  • Shila Khajavi Shojaei 1
  • Abdolamir Moezzi 2
  • Naeimeh Enayatizamir 3
1 M.Sc. of Soil chemistry and fertility, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
2 Associate professor of Soil chemistry and fertility, Shahid Chamran University of Ahvaz, Ahvaz, Iran
3 Assistant professor of Soil microbiology, Shahid Chamran University, Ahvaz, Iran
چکیده [English]

Introduction: Biosurfactants are unique amphipathic molecules with extensive application in removing organic and metal contaminants. The purpose of this study was to investigate production of biosurfactant and determine optimal conditions to produce biosurfactant by Bacillus pumilus 1529 and Bacillus subtilis WPI.

Materials and methods: In this study, effect of carbon source, temperature and incubation time on biosurfactant production was evaluated. Hemolytic activity, emulsification activity, oil spreading, drop collapse, cell hydrophobicity and measurement of surface tension were used to detect biosurfactant production. Then, according to the results, the optimal conditions for biosurfactant production by and Bacillus subtilis WPI was determined.

Results: In this study, both bacteria were able to produce biosurfactant at an acceptable level. Glucose, kerosene, sugarcane molasses and phenanthrene used as a sole carbon source and energy for the mentioned bacteria. Bacillus subtilis WPI produced maximum biosurfactant in the medium containing kerosene and reduced surface tension of the medium to 33.1 mN/m after 156 hours of the cultivation at 37°C. Also, the highest surface tension reduction by Bacillus pumilus 1529 occurred in the medium containing sugarcane molasses and reduce the surface tension of culture medium after 156 hours at 37°C from 50.4 to 28.83 mN/m.

Discussion and conclusion: Bacillus pumilus 1529 and Bacillus subtilis WPI had high potential in production of biosurfactant and degradation of petroleum hydrocarbons and Phenanthrene. Therefore, it could be said that these bacteria had a great potential for applications in bioremediation and other environmental process.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bacillus
  • Biosurfactant
  • Molasses
  • Phenanthrene

مقدمه.

سورفکتانت یکی از مواد شیمیایی است که بیشتر در زندگی روزمره استفاده می‌شود. از آغاز قرن بیستم تولید طیف گسترده‌ای از سورفکتانت‏های مصنوعی از منابع نفتی به‌شدت افزایش‌یافته است اما استفاده از بیوسورفکتانت‏های طبیعی مانند صابون (نمک اسید چرب)، لسیتین (فسفولیپید) و یا ساپونین (گلیکولیپید) در صنعت و منازل قدمت بیشتری دارد. سورفکتانت شامل یک بخش آب‌گریز و یک بخش آب‌دوست است. از سورفکتانت‏ها در صنعت به‌عنوان ماده هماور[1]، مرطوب‌کننده، عامل کف‌ساز، امولسیون کننده و روان کننده استفاده می‌شود. توانایی کاهش کشش سطحی یکی از ویژگی‌های مهم سورفکتانت است (1). امروزه بیوسورفکتانت‏ها با استفاده از مواد زائد حاصل از فرآیندهای مختلف، به‌عنوان منبع کربن تولید می‌‏شود. مصرف مواد ارزان ‌قیمت تجدید‏پذیر طبیعی، پسماندهای کشاورزی و یا پساب‌های صنعتی و شهری به‌عنوان سوبستراهای جایگزین، علاوه بر کمک به عدم تجمع این مواد در طبیعت به تولید ماده‌ای با ارزش نیز کمک می‏کند (2).

آلودگی خاک به نفت یکی از مشکلات شایع زیست‌محیطی است. روش‌های پاک‌سازی خاک از نفت دشوار بوده و یا به لحاظ اقتصادی امکان‌پذیر نیست. یکی از اقتصادی‌ترین روش‌های زیست پالایی استفاده از میکروارگانیسم‌هاست که باعث ساده‌سازی و یا تخریب کامل ساختار مولکولی آلاینده‌های زیست‌محیطی می‌‏شود (1، 3 و 4).

دسترسی زیستی آلاینده‌های نفتی در محیط ‌زیست به علت ﺣﻼﻟﻴﺖ ناچیز این ترکیبات بسیار کم است،
از این‌رو موجب تخریب محیط‌زیست و سلامت انسان‌ها می‌شوند. بنابراین، بیوسورفکتانت‏ﻫﺎ می‌توانند به‌عنوان ﻋﺎﻣﻞ ﻣﺤﺮک برای اﻓﺰاﻳﺶ ﺗﺠﺰﻳﻪ زﻳﺴﺘﻲ اﻳﻦ ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت مؤثر باشند. بیوسورفکتانت با کاهش کشش سطح و بین‏سطحی، افزایش سطح ترکیبات نامحلول به افزایش تحرک و فراهمی زیستی هیدروکربن‌ها منجر می‌شود. در نتیجه، بیوسورفکتانت به افزایش تجزیه زیستی و حذف هیدروکربن‌ها منجر می‌‏شود. علاوه بر این، بیوسورفکتانت از طریق افزایش حلالیت و امولسیون نیز باعث افزایش تجزیه زیستی هیدروکربن‌های نفتی می‌شود (5 و 6).

جمعی از پژوهشگران آثار رامنولیپید تولیدشده توسط Pseudomonas aeruginosaدر آب‌گریزی سطح سلول و تجزیه زیستی فنانترن توسط دو باکتری گرمادوست Bacillus subtilis وPseudomonas aeruginosaو ترکیبی از هر دو سویه را بررسی کردند. در غیاب رامنولیپید ترکیب دو سویه 2/82 درصد از فنانترن را در کمتر از 30 روز حذف کرد. در حالی که افزودن رامنولیپید جذب فنانترن را به‌واسطه سورفکتانت افزایش داد (7). کالو و همکاران[2] در اسپانیا با استفاده از باکتری Bacillus pumilus تجزیه نفتالین و تولید بیوسورفکتانت را مطالعه کردند. پس از جداسازی سویه‌های باکتری، آن را در حضور 1/0 درصد (وزنی) نفت خام و نفتالین در شرایط هوازی رشد دادند. نتایج نشان داد که این باکتری ظرفیت امولسیون‏کنندگی نفت خام را داراست و ازاین‌رو می‌توان برای حذف هیدروکربن‌های نفتی به روش زیستی از آن استفاده کرد (8).

بر این اساس، پژوهش حاضر به‌منظور بررسی توانایی تولید بیوسورفکتانت و انتخاب بهترین منبع کربن برای تولید بیوسورفکتانت انجام شد.

‏‏مواد و روش‏ها.

تهیه باکتری: باکتری Bacillus pumilus 1529 به‌‏شکل لیوفیلیزه از سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران و باکتری Bacillus subtilis WPI از کلکسیون میکروبی گروه خاک‏شناسی دانشگاه شهید چمران اهواز تهیه و بر روی پلیت‏های حاوی محیط کشت آگار مغذی[3] کشت شد. باکتری Bacillus pumilus 1529 از مناطق آلوده به هیدروکربن‏های نفتی و باکتری Bacillus subtilis WPIاز پساب کارخانجات کاغذ‏سازی استان خوزستان (9) جداسازی شده بودند.

شرایط کشت و تولید بیوسورفکتانت: برای تولید بیوسورفکتانت از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت مایع مغذی[4] (چگالی نوری[5]= 1) استفاده شد. به این ‏شکل که پنج درصد از کشت شبانه باکتری به ارلن‏های حاوی محیط کشت نمک معدنی[6] (جدول 1) با اسیدیته 2/7 و منابع مختلف کربن، شامل: 2/1 درصد (وزنی/ حجمی) گلوکز، پنج درصد (وزنی/ حجمی) ملاس، دو درصد (وزنی/ حجمی) نفت سفید و 100 میلی‏گرم بر لیتر فنانترن تلقیح شد. همچنین، به تمامی محیط کشت‏ها 1/0 درصد (وزنی/ حجمی) آمونیوم سولفات به‌عنوان منبع نیتروژن اضافه شد. نمونه‌ها در دو درجه حرارت 30 و 37 درجه سلسیوس و با سرعت دورانی 180 دور در دقیقه[7] در دو دوره زمانی 48 و 156 ساعته نگهداری شدند. پس از ﮔﺬﺷﺖ دوره گرما‏گذاری، ﻣﺤﻠﻮل ﺑﺎﻗﯿﻤﺎﻧﺪه ﺑﻪ ﻣﺪت 15 دﻗﯿﻘﻪ ﺑﺎ دور 8500 ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ شد ﺗﺎ سلول‌ها و ذرات ﻣﻌﻠﻖ از آن ﺣﺬف ﺷﻮد (2). مایع رویی به‌دست‌آمده برای تولید ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ بررسی شد.

 

 

جدول 1- ترکیبات محیط کشت نمک معدنی (10)

ترکیبات

مقدار

پتاسیم دی هیدروژن فسفات

2 گرم

آمونیوم نیترات

1/0 گرم

منیزیم سولفات

1/0 گرم

سدیم کلرید

1/0 گرم

سولفات آهن 7 آبه

1/0 گرم

دی سدیم هیدروژن فسفات

4/2 گرم

کلسیم کلرید 2 آبه

013/0 گرم

سولفات روی 7 آبه

4/1 گرم

سولفات منگنز 7 آبه

2/1 گرم

سولفات مس 5 آبه

25/0 گرم

آب مقطر

1000 میلی‏لیتر

 

غربال‏گری بیوسورفکتانت

آزمایش همولیز خون: به‌منظور تعیین توانایی تولید بیوسورفکتانت ابتدا فعالیت همولیتیکی باکتری‏ها بررسی شد‏. بدین منظور تک کلونی‌های حاصل اﺯ ﻛﺸﺖ ۲۴ ﺳﺎﻋﺘﻪ دو باکتری، ﺑﺮ ﺭﻭﻱ پلیت‏های حاوی ﺁﮔﺎﺭ خون‌دار[8] (ﺩﺍﺭﺍﻱ ۵ ﺩﺭﺻﺪ (حجمی/ حجمی) ﺧﻮﻥ ﮔﻮﺳﻔﻨﺪ)، کشت شد و ﺑﻪ ﻣﺪﺕ ۴۸ ﺳﺎﻋﺖ ﺩﺭ گرمخانه در دمای ۳۷ ﺩﺭﺟﻪ سلسیوس ﻗﺮﺍﺭ ﺩﺍﺩﻩ شد. فعالیت همولیتیک با حضور منطقه شفاف اطراف کلونی‌های باکتریایی شناسایی می‏‏شود (11).

آزمون پراکنش نفت[9]: در این آزمون، 30 میلی‏لیتر آب ﻣﻘﻄﺮ درون یک ﭘﻠﯿﺖ رﯾﺨﺘﻪ، 20 میکرولیتر ﻧﻔﺖ ﺧﺎم ﺑﻪ ﻣﺮﮐﺰ ﭘﻠﯿﺖ اﺿﺎﻓﻪ و در ﭘﺎﯾﺎن، 10 میکرو لیتر از ﻫﺮ ﻧﻤﻮﻧﻪ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ ﺑﺮ ﻻﯾﻪ ﻧﻔﺘﯽ ایجادشده رﯾﺨﺘﻪ شد. چنانچه محلول رویی حاصل از سانتریفوژ حاوی بیوسورفکتانت باشد، قادر خواهد بود ﻻﯾﻪ ﻧﻔﺘﯽ را ﮐﻨﺎر ﺑﺰﻧﺪ و در ﺳﻄﺢ آب ناحیه شفافی ایجاد کند (12).

 

 

فروپاشی روغن[10]: در این مرحله10 میکرولیتر از ﻣﺤﻠﻮل روﻳﻲ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ ﺑﻪ درون ﻫﺮ ﭼﺎﻫﻚ ﭘﻠﻴﺖ الایزا ﺣﺎوی 100 میکرولیتر ﭘﺎراﻓﻴﻦ اﺿﺎﻓﻪ ﮔﺮدﻳﺪ. در اﻳﻦ آزﻣﺎﻳﺶ از سورفکتانت ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ تویین 20 به‌عنوان ﺷﺎﻫﺪ ﻣﺜﺒﺖ و از ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ نمک معدنی همراه با منبع کربن به‌عنوان ﺷﺎﻫﺪ ﻣﻨﻔﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. در ﺻﻮرت ﺗﺸﻜﻴﻞ ﻗﻄﺮه ﻛﺮوی در ﺳﻄﺢ ﭘﺎراﻓﻴﻦ اﻣﺘﻴﺎز ﻣﻨﻔﻲ ﺑﻪ ﭼﺎﻫﻚ و در صورتی‌که ﻗﻄﺮه اضافه‌شده ﺑﻪ ﺗﻪ ﭼﺎﻫﻚ ﻣﻨﺘﻘﻞ شود یا از حالت کروی خارج شود اﻣﺘﻴﺎز ﻣﺜﺒﺖ می‌گیرد. ﻧﺘﺎﻳﺞ در زمان‌های 1، 30 و 60 دﻗﻴﻘﻪ ﻳﺎدداﺷﺖ ﺷﺪ (13).

فعالیت امولسیون کنندگی[11]: ﺑﺮای اﻧﺠﺎم اﯾﻦ آزمون، دو میلی‌لیتر از ﻫﺮ ﻧﻤﻮﻧﻪ حاصل از ﺳﺎﻧﺘﺮﯾﻔﻮژ، درون لوله‌های آزﻣﺎﯾﺶ ﺟﺪاﮔﺎﻧﻪ رﯾﺨﺘﻪ و دو میلی‌لیتر ﻧﻔﺖ ﺳﻔﯿﺪ ﻧﯿﺰ ﺑﻪ ﻫﺮﮐﺪام اﺿﺎﻓﻪ ‌شد. ﺳﭙﺲ، هر نمونه ﺑﻪ ﻣﺪت دو دﻗﯿﻘﻪ ﺗﺤﺖ ورﺗﮑﺲ ﺷﺪﯾﺪ ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺖ، پس ‌از آن نمونه‌ها ﺑﻪ ﻣﺪت 24 ﺳﺎﻋﺖ در ﻣﺤﯿﻂ به‌‏شکل ﺳﺎﮐﻦ ﻗﺮار گرفتند. پس از گذشت این زمان، ارتفاع امولسیون ﺑﺎﻗﯿﻤﺎﻧﺪه درون ﻫﺮ لوله‌آزمایش اندازه‌گیری ﺷﺪ و ﻧﺴﺒﺖ ارتفاع این امولسیون به ارتفاع کل مایع درون لوله آزمایش، به عنوان شاخص امولسیفیکاسیون برای هر نمونه گزارش شد (12).

آب‌گریزی سطح سلول: این روش از روش‌های غیرمستقیم برای غربال‏گری تولید ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ ریز موجودات است. با ‌وجود این، برای شناسایی سریع سویه‌های تولیدکننده ﺑﯿﻮﺳﻮرﻓﮑﺘﺎﻧﺖ می‌توان از این ‌روش استفاده کرد (14 و 15). این روش به میزان چسبندگی سلول به هیدروکربن‌های مختلف مایع بستگی دارد. برای اندازه‏گیری این فاکتور، از کشت باکتری در منابع مختلف کربن استفاده شد. سلول‏های باکتریایی در 7000 دور در دقیقه به مدت 4 دقیقه سانتریفوژ شده و دو بار در محلول بافر فسفات منیزیم اوره (ترکیبات (گرم در لیتر): دی پتاسیم هیدروژن فسفات: 7/19، پتاسیم دی هیدروژن فسفات: 26/7، اوره: 8/1، سولفات منیزیم 7 آبه: 2/0) شسته شد. سپس، به حالت سوسپانسیون درآمده تا چگالی نوری اولیه (A0) به یک برسد. چگالی نوری در 600 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر مدل Apel (PD- 303 UV) خوانده شد. پس ‌از آن 500 میکرولیتر هگزادکان به پنج میلی‏لیتر از سوسپانسیون سلولی اضافه و به مدت دو دقیقه با دور بالا ورتکس شد. پس از 10 دقیقه، چگالی نوری فاز آبی اندازه‌گیری شد (A1). میزان آب‌گریزی از معادله (1) محاسبه شد (16). این آزمایش در سه تکرار انجام شد.

معادله (1):  درصد آب‏گریزی

اندازه‌گیری کشش سطحی: به‌منظور اندازه‌گیری کشش سطحی پنج میلی‌لیتر از مایع به‌دست‌آمده از سانتریفوژ نمونه‌ها به لوله‌ آزمایشی که در حمام آب در درجه حرارت ثابت 28 درجه سلسیوس قرار داشت اضافه شد. کشش سطحی با اندازه‌گیری ارتفاع صعود مایع در لوله موئین و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد. در ﻫﺮ ﻣﻮرد ﺑﺮای اﻃﻤﯿﻨﺎن از درستی ﻧﺘﺎﯾﺞ، اندازه‌گیری ﮐﺸﺶ ﺳﻄﺤﯽ سه ﻣﺮﺗﺒﻪ انجام شد (17).

معادله (2):                                               

 =r شعاع لوله مویین (سانتی‏متر)، =h ارتفاع صعود مایع (سانتی‏متر)، = چگالی (گرم بر میلی‏لیتر)،
=g نیروی ثقل (980 سانتی متر بر مجذور ثانیه)،
= کشش سطحی (میلی‏نیوتن بر متر[12]) است.

رﺳﻢ ﻣﻨﺤﻨﯽ رﺷﺪ باکتری‌: به‌منظور رسم منحنی رشد، باکتری در ارلن‏های 250 میلی‌متری حاوی 100 میلی‌لیتر محیط نمک معدنی همراه با منابع مختلف کربن (ملاس نیشکر، گلوکز، نفت سفید و فنانترن) در 3 تکرار کشت داده شد. ارلن‏ها در شیکر انکوباتور در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور 150 (دور در دقیقه) به‌منظور هوادهی، گرما‏گذاری شد. چگالی ﻧﻮری باکتری‌ها در زمان‌های صفر، 12، 36، 60، 84، 108، 132 و 156 ساعت ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از دﺳﺘﮕﺎه اﺳﭙﮑﺘﺮوﻓﺘﻮﻣﺘﺮ در طول‌موج 600 ﻧﺎﻧﻮﻣﺘﺮ خوانده ﺷﺪ.

 

نتایج.

آزمایش همولیز خون: در این روش، 48 ساعت پس از کشت باکتری‏ها در پلیت‏های حاوی آگار خون‌دار هاله‌ای از نوع بتا در اطراف کلونی باکتری
Bacillus pumilus 1529 مشاهده شد (شکل 1). قطر هاله‌ ایجادشده پس از دو روز گرما‏گذاری به دو سانتی‌متر رسید. نتیجه فعالیت همولیتیکی باکتری
Bacillus subtilis WPI منفی بود و هیچ هاله‌ای در اطراف کلونی‌های این باکتری ایجاد نشد.

 

 

شکل 1- فعالیت همولیتیکی باکتری Bacillus pumilus 1529

 

آزمون پراکنش نفت: در این روش، نفت اضافه‌شده در سطح آب مقطر لایه‌ای به قطر 10 سانتی‌متر تشکیل داد که با افزودن محلول حاصل از سانتریفوژ هر دو باکتری در منابع مختلف کربن به‌‏شکل جداگانه، ناحیه شفافی در سطح لایه نفتی ایجاد شد. این پدیده نشان‌دهنده حضور ترکیبات دوگانه دوست بیوسورفکتانت در محیط کشت باکتری
Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI در چهار منبع کربن است؛ اما با توجه به ایجاد نواحی شفاف با قطر بیشتر در برخی از نمونه‌ها مشخص شد فعالیت بیوسورفکتانت تولیدشده در برخی منابع کربن بیشتر است (جدول 2).

فروپاشی روغن: مشاهدات نشان داد شاهد منفی (آب مقطر) در لایه پارافینی موجود در چاهک پلیت سقوط نکرده و مانند یک ‌مهره در سطح پارافین قرار گرفت. درحالی‌که شاهد مثبت (تویین 20 درصد) در مدت‌زمان یک دقیقه فروریخت و به ته چاهک منتقل شد. این حالت به‌طور مشابه، برای محلول‌های حاوی متابولیت‏های هر دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIدر هر چهار منبع کربن مشاهده شد. از سوی دیگر در نمونه‏های شاهد حاوی منابع کربن هیچ‌گونه سقوط و یا تغییر حالت در سطح پارافین مایع مشاهده نشد. نتایج این آزمون در جدول 2 آورده شده است.

فعالیت امولسیون کنندگی: آزمون (EI24) برای تمامی نمونه‌ها انجام شد. امولسیون‌های ایجاد شده به‌وسیله باکتریBacillus pumilus 1529در دو منبع کربن ملاس و گلوکز به ترتیب با 1± 2/42 و
9/1± 7/33 درصد پایدارتر از سایر منابع کربن به نظر می‌رسیدند. نتایج نشان داد باکتری
Bacillus subtilis WPIتوانایی تشکیل امولسیون پایدار را ندارد و امولسیون‌های تشکیل‌شده به‌وسیله این باکتری چند ساعت پس از تشکیل از بین رفتند (جدول 2).

 

جدول 2- نتایج تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI

48 ساعت،
37 درجه سانتی‏گراد

156 ساعت،
 37 درجه سانتی‏گراد

48 ساعت،

30 درجه سانتی‏گراد

156 ساعت،

30 درجه سانتی‏گراد

زمان و دمای آزمایش

 باکتری

منبع کربن

B. 1529

B. subtilis

B. 1529

B. subtilis

B. 1529

B. subtilis

B. 1529

B. subtilis

شاهد

++

+

++

+

++

+

++

+

-

گلوکز

پراکنش نفت*

++

++

++

++

++

++

++

++

-

نفت سفید

++

++

+++

++

+

++

+++

++

-

ملاس

++

+

++

++

+

+

++

++

-

فنانترن

+

+

+

+

+

+

+

+

-

گلوکز

فروپاشی نفت**

+

+

+

+

+

+

+

+

-

نفت سفید

+

+

+

+

+

+

+

+

-

ملاس

+

+

+

+

+

+

+

+

-

فنانترن

2/0± 11

2/1± 8/3

9/1± 7/33

1/2± 6/5

6/2± 1/7

1/1± 8/5

9/1± 19

8/0± 6/3

0

گلوکز

EI24(درصد)

6/0± 5/5

2/1± 4/4

2/1± 1/9

8/1± 10

7/0± 4/4

1/2± 6/4

4/0± 11

9/1± 8/5

0

نفت سفید

5/0± 18

5/2± 5/10

1± 2/42

3/2± 12

1± 13

7/1± 3/9

1/1± 1/20

3/2± 2/10

0

ملاس

9/1± 7/5

1± 6/4

6/0± 13

7/1± 11/11

6/0± 5

3/2± 1/7

7/0± 4/9

5/1± 7/13

0

فنانترن

*+ نواحی با قطر کمتر از 1 سانتی‏متر، ++ نواحی با قطر 3-1 سانتی‏متر، +++ نواحی با قطر بیش‌تر از 3 سانتی‏متر،

** + نواحی فروریخته با قطر کمتر از 6/0 سانتی‏متر، ++ نواحی فروریخته با قطر 1-7/0 سانتی‏متر، +++ نواحی فروریخته با قطر بیش‌تر از 1/0 سانتی‏متر

 

جدول 3- اثر منبع کربن بر آب‌گریزی Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI پس از 156 ساعت

درصد آب‌گریزی

باکتری

گلوکز

ملاس

نفت سفید

فنانترن

1/3±2/31

2/1±5/60

8/1±3/68

8/0±7/55

Bacillus pumilus 1529

6/1±9/16

9/0±4/38

1/2±3/51

6/1±3/21

Bacillus subtilis WPI

 


آب‌گریزی سطح سلول: برای بررسی بیشتر تأثیر منبع کربن استفاده ‌شده، آب‌گریزی سطح سلول هر دو باکتری اندازه گیری شد. نتایج این آزمون نشان داد آب‌گریزی سطح سلول با توجه به نوع منبع کربن موجود در محیط کشت تغییر می‌کند. در هر دو باکتری بالاترین میزان آب‌گریزی مربوط به منبع کربن نفت و کم‏ترین آب‌گریزی مربوط به گلوکز است (جدول 3).

.اثر منبع کربن بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: تأثیر منابع کربن مختلف در تولید بیوسورفکتانت نشان داد هر دو سویه قادر به کاهش قابل‌قبول کشش سطحی در چهار منبع کربن هستند. همان‏طور که در جدول 4 در میان منابع کربن مورداستفاده بیش‏ترین کاهش کشش سطحی و در نتیجه، تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری
Bacillus subtilis WPIمنبع کربن نفت سفید ایجاد شد و این باکتری توانست کشش سطحی را تا 3/0± 1/33 (میلی‏نیوتن بر متر) کاهش دهد. پس از منبع کربن نفت سفید، بیش‏ترین کاهش کشش سطحی به‌وسیله باکتری Bacillus subtilis WPIدر محیط کشت حاوی فنانترن و گلوکز به ترتیب با کشش سطحی 1/0± 31/32 (میلی‏نیوتن بر متر) و 5/0± 81/35 (میلی‏نیوتن بر متر) ایجاد شد. همچنین، بیش‏ترین کاهش کشش سطحی به‏وسیله باکتریBacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس نیشکر رخ داد. کشش سطحی نمونه شاهد بدون باکتری حاوی ملاس معادل 5/1± 4/50 (میلی‏نیوتن بر متر) بود که این سویه توانست پس از 156 ساعت کشش سطحی محلول را تا 83/22 (میلی‏نیوتن بر متر) کاهش دهد. پس از ملاس بیش‏ترین کاهش کشش سطحی در محیط حاوی نفت سفید و فنانترن ایجاد شد. همان‌طور که در شکل 2 مشاهده می‌شود در بین چهار منبع کربن استفاده شده، باکتری
Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی گلوکز رشد بیشتری نسبت به سایر منابع کربن دارد. همچنین، باکتری Bacillus subtilis WPIبالاترین رشد را در بین منابع کربن در محیط حاوی ملاس نیشکر نشان داد.

. اثر دمای گرما‏گذاری بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: نتایج این بررسی نشان داد رشد باکتری‌ها در دمای 37 درجه سلسیوس بسیار بیشتر و سریع‏تر از دمای 30 درجه سلسیوس بوده و با افزایش دما کاهش کشش سطحی نیز افزایش‌یافته است. رشد باکتری در چهار منبع کربن در دمای 37 درجه سلسیوس در شکل 2 آورده شده است. افزایش دما از 30 درجه سلسیوس به 37 درجه سلسیوس به کاهش کشش سطحی در تمامی منابع کربن منجر شد که می‌توان گفت افزایش دما به افزایش میزان تولید بیوسورفکتانت منجر شد (شکل 3). بیش‏ترین میزان کاهش کشش سطحی در اثر افزایش دما در دوره زمانی 156 ساعته توسط باکتری Bacillus subtilis WPIو در منبع نفت سفید ایجاد شد.

 

 

جدول 4-کشش سطحی باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPI

باکتری

زمان و دمای گرما‏گذاری

کشش سطحی (میلی‏نیوتن بر متر)

فنانترن

ملاس نیشکر

نفت سفید

گلوکز

Bacillus pumilus 1529

48 ساعت- 37 درجه سانتی‏گراد

9/0± 51/38

1/2± 36/34

1/2± 65/42

8/1± 13/40

156 ساعت- 37 درجه سانتی‏گراد

1/1± 83/22

9/0± 87/29

4/1± 07/36

5/1 ± 07/38

48 ساعت- 30 درجه سانتی‏گراد

7/1± 61/46

5/1± 74/39

8/1± 29/48

8/2± 26/49

156 ساعت- 30 درجه سانتی‏گراد

3/1± 28/33

8/2± 91/28

3/2± 43/40

8/2± 02/47

Bacillus subtilis WPI

48 ساعت- 37 درجه سانتی‏گراد

5/0± 81/35

7/0± 41/49

5/0± 6/36

3/0± 09/47

156 ساعت- 37 درجه سانتی گراد

1/0± 96/37

4/0± 23/41

3/0± 1/33

1/0± 32/39

48 ساعت- 30 درجه سانتی گراد

8/0± 75/36

3/0± 82/47

4/0± 65/33

2/0± 89/45

156 ساعت- 30 درجه سانتی گراد

2/0± 58/37

2/0± 32/46

1/0± 31/32

3/0± 08/45

شاهد (بدون تلقیح باکتری)

 

3/1± 6/56

5/1± 4/50

8/0± 6/63

7/1±12/56

 


 

 

شکل 2- نمودار تغییرات رشد در منابع مختلف کربن در دمایºC37

. الف) باکتری Bacillus pumilus 1529، ب) باکتریBacillus subtilis WPI

 


. اثر زمان گرما‏گذاری بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت: به‌منظور بررسی اثر زمان بر تولید بیوسورفکتانت، آزمایش‌ها در دو زمان 48 و 156 ساعت انجام شد. همان‏طور که در شکل 2 نشان داده‌شده است بیش‏ترین میزان رشد در هر دو باکتری بیشتر بین 36 تا 60 ساعت رخ‌ داده است. رشد باکتری‌ها در این زمان در فاز نمایی قرار دارد و پس ‌از آن رشد هر دو باکتری کاهش‌یافته و به ‌تدریج وارد فاز سکون می‌‏شود. بیش‏ترین میزان کاهش کشش سطحی محیط نیز پس از 156 ساعت که رشد در فاز سکون قرار دارد، مشاهده شد. به‌طوری‌که کشش سطحی در هر دو باکتری در دوره زمانی 156 ساعت 5 تا 14 (میلی‏نیوتن بر متر) نسبت به دوره 48 ساعته کاهش نشان داده است (شکل 3).


 

 

 

شکل 3- تغییرات کشش سطحی در دو دوره‌ی زمانی 48 و 156ساعت در چهار منبع کربن در دمای 37 درجه سلسیوس.

 الف) باکتری Bacillus pumilus 1529 ، ب) باکتری Bacillus subtilis WPI

 


بحث و نتیجه‏‏گیری.

در سال‌های اخیر با توجه به ‌کاربرد‌های فراوان بیوسورفکتانت در صنایع مختلف، تولید بیوسورفکتانت در پژوهش‌های فراوانی بررسی شده است. پژوهشگران از روش‌های مختلفی برای بهبود تولید بیوسورفکتانت استفاده کرده‌اند که از میان این روش‌ها بهینه‌سازی تولید بیوسورفکتانت ارزان‌تر و آسان‌تر از سایر روش‌هاست.

در پژوهش حاضر، قابلیت تولید ﺗﺮﻛﻴﺒﺎت ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺘﻲ به‌وسیله دو ﺑﺎﻛﺘﺮی Bacillus pumilus 1529 و
 Bacillus subtilis WPIدر دو دوره زﻣﺎﻧﻲ (48 و 156 ساعت) و ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﻣﺼﺮف گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن به‌عنوان ﺗﻨﻬﺎ ﻣﻨﺒﻊ ﻛﺮﺑﻦ و اﻧﺮژی در دو دمای متفاوت ﺷﻨﺎﺳﺎﻳﻲ ﺷﺪ.

در ﭘﮋوﻫﺶ ﺣﺎﺿﺮ ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻫﻤﻮﻟﻴﺘﻴﻚ باکتری‌ها به‌عنوان نخستین ﺷﺎﻫﺪ ﻛﻴﻔﻲ ﺑﺮای ﺗﻮﻟﻴﺪ بیوسورفکتانت در ﻧﻈﺮ ﮔﺮﻓﺘﻪ ﺷﺪ. مانرات و ﻫﻤﻜﺎران[xiii] ﻧﻴﺰ از اﻳﻦ روش ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﺳﻂ باکتری‌های جداسازی شده‌ ﺧﻮد اﺳﺘﻔﺎده ﻛﺮدﻧﺪ (13). ﻓﻌﺎﻟﻴﺖ ﻫﻤﻮﻟﻴﺘﻴﻚ بیوسورفکتانت‏ها، نخستین ﺑﺎر ﺗﻮﺳﻂ برن هایمر و اویقاد[xiv] در ﺳﺎل 1970 ﺑﺮای ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ تولیدشده ﺗﻮﺳﻂ Bacillus subtilisﮔﺰارش ﺷﺪ (18). مصطفی پور و احمدی[xv] با استفاده از گونه‏ای از باکتری Bacillus cereus دارای فعالیت همولیتیکی کشش سطحی محیط حاوی نفت خام را به کمتر از 40 میلی‏نیوتن بر متر کاهش دادند (19). اﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ﻧﺒﻮدن اﻳﻦ روش، ازجمله محدودیت‌های آن ﻣﺤﺴﻮب می‌شود، زﻳﺮا ﻣﻤﻜﻦ اﺳﺖ ﻫﺎﻟﻪ ﺷﻔﺎف اﻃﺮاف ﻛﻠﻮﻧﻲ درنتیجه ﺣﻀﻮر آنزیم‌های ﻟﻴﺘﻴﻚ تولیدشده ﺗﻮﺳﻂ باکتری به وجود آﻣﺪه ﺑﺎﺷﺪ. همچنان که در ﻧﺘﺎﻳﺞ اﻳﻦ ﻣﻄﺎﻟﻌﻪ باکتری Bacillus subtilis WPIﻫﻤﻮﻟﻴﺰ منفی ﺑﻮده، اما توانایی تولید بیوسورفکتانت آن در غربال‏گری اولیه مثبت ارزیابی شد. ﻋﺪم ﻫﻤﻮﻟﻴﺰ سلول‌های ﻗﺮﻣﺰ ﺧﻮن ﻧﻴﺰ می‌تواند ﻧﺎﺷﻲ از ﻣﺤﺪودﻳﺖ انتشار ﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ در ﻣﺤﻴﻂ ﺣﺎوی آﮔﺎر ﺑﺎﺷﺪ. به همین منظور در ادامه، ﺗﻮاﻧﺎﻳﻲ ﺗﻮﻟﻴﺪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﺳﻂ این دو باکتری ﺑﺎ روش دقیق‌تر و ﻛﻤﻲ بررسی شد. نتایج آزمون فروپاشی روغن و پراکنش نفت در مورد هر دو باکتری مثبت بود و مؤید تولید بیوسورفکتانت است. نتایج حاصل نشان داد بیش‏ترین میزان پراکنش و فروپاشی در دمای 37 درجه سلسیوس و پس از 156 ساعت گرما‏گذاری حاصل می‌‏شود. روش پراکنش نفت و فروپاشی روغن روش سریع و آسان برای تشخیص بیوسورفکتانت است که بدون نیاز به تجهیزات و تنها با حجم کوچکی از نمونه انجام می‌شود. این روش نسبت به مقادیر کم بیوسورفکتانت نیز واکنش نشان می‌دهد. یوسف و همکاران[xvi] گزارش دادند که پراکنش نفت روش قابل‌اعتمادی برای تشخیص بیوسورفکتانت تولیدشده به‌وسیله ریز موجودات است (20).

نتایج به‌دست‌آمده در این مطالعه نشان می‌دهد، بیش‏ترین شاخص امولسیونی در باکتری
Bacillus pumilus 1529 و در دو منبع کربن ملاس و گلوکز ایجادشده است. فعالیت امولسیونی باکتری Bacillus subtilis WPI در هر چهار منبع کربن پایین بود که با نتایج برخی از پژوهش‌‏های قبلی هم سو است (2، 21 و 22). باقری و همکاران[xvii] با بررسی ارتباط بین فعالیت امولسیون‏کنندگی و کشش سطحی 16 سویه باکتریایی اعلام داشتند تشابهی بین روند داده‌های حاصل از کشش سطحی و شاخص امولسیون‏کنندگی وجود ندارد. از طرفی در این پژوهش مشاهده شد میزان امولسیون‏کنندگی نمونه‌ها در هگزان نرمال و نفت خام کاملاً متفاوت است و میزان امولسیون‏کنندگی به ماده امولسیون شونده نیز بستگی دارد (2). برای اطمینان بیش‌تر از تولید بیوسورفکتانت و تعیین شرایط بهینه برای تولید آن کشش سطحی نمونه‌ها نیز اندازه‌گیری شد.

در پژوهش حاضر، پتانسیل باکتری
Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIبرای استفاده از گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی از طریق اندازه‌گیری رشد و تولید بیوسورفکتانت بررسی شد. کمیت و کیفیت تولید بیوسورفکتانت تولیدشده توسط میکروارگانیسم‏ها تحت تأثیر ماهیت منبع کربن است (23). پسماندهای حاصل از صنایع و کشاورزی پتانسیل بالایی برای تولید بیوسورفکتانت دارند. در این مطالعه، باکتری Bacillus subtilis WPIبیش‏ترین کاهش کشش سطحی را در محیط حاوی نفت سفید نشان داد و توانست به میزان 5/30 (میلی‏نیوتن بر متر) کشش سطحی محیط را نسبت به نمونه شاهد کاهش دهد. الایه و همکاران[xviii] با بررسی فعالیت بیوسورفکتانتی در سویه‌های تجزیه‌کننده هیدروکربن دریافتند تولید بیوسورفکتانت در باکتری‏ای از گونه Pseudomonas در محیط کشت حاوی نفت سفید بسیار بیشتر از محیط حاوی گلوکز به‌عنوان تنها منبع کربن و انرژی است (24). بیش‏ترین کاهش کشش سطحی و درنتیجه تولید بیوسورفکتانت توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس نیشکر رخ داد. ماکار و همکاران[xix] توسط دو سویه Bacillus و با استفاده از منبع کربن ملاس در شرایط ترموفیلیک بیوسورفکتانت لیپوپپتیدی تولید کردند. استفاده از ملاس توسط دو گونه از باکتری Bacillus Subtilis برای تولید بیوسورفکتانت و رشد در دمای 45 درجه سلسیوس به تولید بیوسورفکتانت و کاهش کشش سطحی محیط کشت تا 29 و 31 دین بر سانتی‌متر[xx] منجر شد (25). نتایج حاصل از این آزمایش نشان داد هر دو باکتری توانایی رشد و استفاده از چهار منبع کربن (گلوکز، ملاس، نفت سفید و فنانترن) را دارا هستند. رشد بالای باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی گلوکز و باکتری Bacillus pumilus 1529 در محیط حاوی ملاس احتمالاً به علت سهولت دسترسی ملاس و گلوکز به علت حلالیت بیش‌تر و میزان بالای قند موجود در ملاس و قابلیت استفاده آن توسط باکتری نسبت به نفت و فنانترن بوده است. استفاده از ملاس به‌عنوان منبع کربن ارزان‌قیمت برای تولید بیوسورفکتانت در پژوهش‏های پیشین نیز بر کارایی و کاهش قابل‌توجه کشش سطحی تأکید دارد (25- 28). تولوا و همکاران[xxi] توانستند با استفاده از سویه Pseudomonas putida 21 BN بیوسورفکتانت رامنولیپید تولید کنند. تولید بیوسورفکتانت بر بستر محلول مانند گلوکز و بسترهای کم محلول مانند هگزادکان به‌عنوان تنها منبع کربن انجام شد (29).

بررسی اثر دما بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت نشان داد کشش سطحی در محیط کشت هر دو باکتری در دمای 37 درجه سلسیوس کاهش بیشتری می‏یابد. درواقع تولید بیوسورفکتانت کاملاً به دمای گرما‏گذاری وابسته است. باقری و همکاران نشان دادند با افزایش دما گرما‏گذاری میزان بیوسورفکتانت تولیدی توسط سویه Pseudomonas aeruginosaافزایش می‌یابد (2).

بررسی اثر زمان بر رشد باکتری و تولید بیوسورفکتانت توسط دو باکتری نشان داد بیش‏ترین میزان تولید بیوسورفکتانت پس از 156 ساعت از دوره گرماگذاری حاصل می‌‏شود و اینطور به نظر می‌رسد ﻛﻪ ﺑﻴﻮﺳﻮرﻓﻜﺘﺎﻧﺖ ﺗﻮﻟﻴﺪی ﺗﻮﺳﻂ اﻳﻦ دو باکتری ﺟﺰو ﻣﺘﺎﺑﻮﻟﻴﺖ‏ﻫﺎی ثانویه ﺑﺎﻛﺘﺮی است. ایلوری و همکاران[xxii] گزارش دادند بیش‏ترین میزان رشد و تولید بیوسورفکتانت گلیکولیپیدی توسط گونه
Aeromonasدر محیط کشت حاوی نفت پس از 8 روز ایجاد شد (30). تولید بیوسورفکتانت در فاز سکون و استراحت در گونه‏های Pseudomonas،
Candida apicolaوRhodococcus erythropolis گزارش‌شده است (31- 35).

بررسی آب‌گریزی سطح سلول باکتری‌ها در مطالعه حاضر نشان داد بیش‏ترین میزان آبگریزی سطح سلول توسط باکتری Bacillus pumilus 1529 در دو منبع کربن ملاس و نفت سفید مشاهده شد. نتایج این آزمون نشان داد باکتری Bacillus pumilus 1529 آب‏گریزی بیشتری نسبت به باکتری Bacillus subtilis WPI در هر چهار منبع کربن دارد. آب‏گریزی بالای هر دو باکتری در دو منبع نفت و ملاس نتایج حاصل از کشش سطحی را تائید کرده و مؤید تولید بیوسورفکتانت است. بالا بودن آبگریزی سلول به باکتری اجازه می‌دهد تا به‌طور مستقیم با قطره نفت یا هیدروکربن‌های جامد تماس پیدا کنند (36). به گفته ژانگ و میلر[xxiii]، جاذبه متقابل بین بیوسورفکتانت و سلول‌های میکروبی می‌تواند به افزایش آب‌گریزی سلول منجر شود، در نتیجه سلول‌ها تماس بهتری با بستر آب‌گریز داشته و در نهایت، تجزیه زیستی بالاتری به دست می‌آید (37).

در پژوهش حاضر پتانسیل تولید بیوسورفکتانت دو باکتری Bacillus pumilus 1529 و Bacillus subtilis WPIبا چندین روشبررسی شد. هر دو سویه با وجود درصد فعالیت امولسیونی کم در دو یا سه آزمون دیگر نتایج مثبت نشان دادند. هر دو باکتری قادر به رشد در چهار منبع کربن (گلوکز، ملاس نیشکر، نفت سفید و فنانترن) بوده و کشش سطحی را به میزان قابل قبولی کاهش دادند. نتایج حاصل از آبگریزی سطح سلول تا حدودی نتایج حاصل از کشش سطحی و تولید بیوسورفکتانت را تائید کرد. بررسی اثر زمان و دما نشان داد بیش‏ترین کاهش کشش سطحی در هر دو باکتری در دمای 37 درجه سلسیوس و پس از 156 ساعت از زمان گرما‏گذاری حاصل می‌شود. به علت کاهش قابل‌توجه کشش سطحی در محیط حاوی نفت و فنانترن توسط این دو باکتری می‌توان برای پالایش مکان‏های آلوده به هیدروکربن‌های نفتی از این سویه‌ها استفاده شود. با‌ وجود این، برای اطمینان از میزان تجزیه هیدروکربن‌های نفتی و رسیدن به شرایط بهینه رشد نیاز به انجام پژوهش‏های بیشتری است. همچنین به علت دشواری در تشخیص تولید بیوسورفکتانت مختلف با استفاده از یک روش پیشنهاد می‌‏شود از روش‌های مختلف برای شناسایی سویه‌های تولیدکننده بیوسورفکتانت استفاده ‏شود.



[1]- FlocculationAgent

[2]- Calvo et al.

[3]- Nutrient Agar

[4]- Nutrient Broth

[5]- Optical Density

[6]- Mineral Salt Medium

[7]- rpm

[8]- Blood Agar plate

[9]- Oil spreading

[10]- Drop Collapse

[11]- EI24

[12]- mN/m

[xiii]- Maneerat et al.

[xiv]- Bernheimer and Avigad

[xv]- Mostafapour Rami and Ahmady-Asbchin

[xvi]- Youssef et al.

[xvii]- Bagheri et al.

[xviii]- Ellaiah et al.

[xix]- Makkar et al.

[xx]- dyne/cm

[xxi]- Tuleva et al.

[xxii]- Ilori et al.

[xxiii]- Zhang and Miller 

(1)               Mulligan CN., Gibbs BF. Types, production and applications of biosurfactants. Proceedings of the National Academy of Sciences 2004; 70 (1): 31- 55.

(2)               Lotfabad TB., Shourian M., Roostaazad R., Najafabadi AR., Adelzadeh MR., Noghabi KA. An efficient biosurfactant- producing bacterium Pseudomonas aeruginosa MR01, isolated from oil excavation areas in south of Iran. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2009; 69 (2): 183- 93.

(3)               Das K., Mukherjee AK. Differential utilization of pyrene as the sole source of carbon by Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa strains: role of biosurfactants in enhancing bioavailability. Journal of Applied Microbiology 2007; 102 (1): 195- 203.

(4)               Singh A., Van Hamme JD., Ward OP. Surfactants in microbiology and biotechnology: part2. Application aspects. Biotechnology Advances 2007; 25 (1): 99- 121.

(5)               Nguyen TT., Youssef NH., McInerney MJ., Sabatini DA. Rhamnolipid biosurfactant mixtures for environmental remediation. water research 2008; 42 (6- 7): 1735- 43.

(6)               Nievas ML., Commendatore MG., Estevas JL., Bucalá V. Biodegradation pattern of hydrocarbons from a fuel oil- type complex residue by an emulsifier- producing microbial consortium. Journal of Hazardous Materials 2008; 154 (1- 3): 96- 104.

(7)               Zhao Z., Selvam A., Wong JW. Effects of rhamnolipids on cell surface hydrophobicity of PAH degrading bacteria and the biodegradation of phenanthrene. Bioresource Technology 2011; 102 (5): 3999- 4007.

(8)               Calvo C., Toledo FL., González- López J. Surfactant activity of a naphthalene degrading Bacillus pumilus strain isolated from oil sludge. Applied Microbiology and Biotechnology 2004; 109 (3): 255- 62.

(9)               Sheikhi F., Roayaei Ardakani M., Enayatizamir N., Rodriguez- Couto S. The Determination of Assay for Laccase of Bacillus subtilis WPI with Two Classes of Chemical Compounds as Substrates. Indian Journal of Microbiology.  2012; 52 (4): 701- 7.

(10)           Mukred AM., Hamid AA., Hamzah A., Yusoff WMW. Development of Three Bacteria Consortium for the Bioremediation of Crude Petroleum- oil in Contaminated Water. Journal of Biological Sciences2008; 8 (4): 73- 9.

(11)           Ghayyomi Jazeh M., Forghani F., Oh DH. Biosurfactan Production by Bacillus sp. Isolated from Petroleum Contaminated Soils of Sirri Island. American Journal of Applied Sciences 2012; 9 (1): 1- 6.

(12)           Chandankere R., Yao J., Choi MMF., Masakorala K., Yu C. An Efficient Biosurfactant- Producing and Crude- Oil Emulsifying Bacterium Bacillus Methylotrophicus USTBa Isolated from Petroleum Reservoir. Biochemical Engineering Journal 2013; 74 (1): 46- 53.

(13)           Maneerat S., Phetrong K. Isolation of biosurfactant- producing marine bacteria and characteristics of selected biosurfactant. Songklanakarin Journal of Science and Technology 2007; 29 (3): 781- 91.

(14)           Nakar D., Gutnick DL. Involvement of a protein tyrosine kinase in production of the polymeric bioemulsifier emulsan from the oil- degrading strain Acinetobacter lwoffii RAG- 1. Journal of Bacteriology 2003; 185 (3): 1001- 9.

(15)           Whitfield C., Roberts IS. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Molecular Microbiology 1999; 31 (5): 1307- 19.

(16)           Rosenberg M., Gutnick D., Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbons: A simple method for measuring cell- surface hydrophobicity. FEMS Microbiology Letterst 1980; 9 (1): 29- 33.

(17)           Viramontes- Ramos S., Portillo- Ruiz MC., Ballinas- Casarrubias ML., Torres- Muñoz JV., Rivera- Chavira BE., Nevárez- Moorillón GV. selection of biosurfactant/bioemulsifier production bactria from hydrocarbon contaminated soil. Brazilian Journal of Microbiology 2010; 41 (3): 668- 75.

(18)           Bernheimer AW., Avigad LS. Nature and properties of a cytolytic agent produced by Bacillus subtilis. General Microbiology 1970; 61 (3): 361- 9.

(19)           Mostafapour- Rami MJ., Ahmady- Asbchin S. Isolation and identification of biosurfactant- producing strains from the genus Pseudomonas aeruginosa and antibacterial effects of biosurfactant production in vitro. Biological Journal of Microorganism 2013; 2 (6): 41- 58.

(20)           Youssef NH., Duncan KE., Nagle DP., Savage KN., Knapp RM., McInerney MJ. Comparison of methods to detect biosurfactant production by diverse microorganisms. Journal of Microbiological Methods 2004; 56 (3): 339- 47.

(21)           Hamed S., Smii L., Ghram A., Maaroufi A. Screening of potential biosurfactant- producing bacteria isolated from seawater biofilm. African Journal of Biotechnology 2012; 11 (77): 14153- 8.

(22)           Pereira JFB., Gudina EJ., Costa R. Optimization and characterization of biosurfactant production by Bacillus subtilis isolates towards microbial enhanced oil recovery applications. Fuel 2013; 111 (1): 259- 68.

(23)           Raza ZA., Khan MS., Khalid ZM. Evaluation of distant carbon sources in biosurfactant production by a gamma ray- induced Pseudomonas putida mutant. Process Biochemistry 2007; 42 (4): 686- 92.

(24)           Ellaiah P., Prabhakar T., Sreekanth M., Taleb AT., Raju PB., Saisha V. Production of glycolipids containing biosurfactant by Pseudomonas species. Indian Journal of Experimental Biology 2002; 40 (9): 1083- 6.

(25)           Makkar RS., Cameotra SS. Biosurfactant by a thermophilic Bacillus subtilis strain. J Industrial Microbiology & Biotechnology 1997; 18 (1): 37- 42.

(26)           Aparnaa A., Srinikethana G., Smithab H. Production and characterization of biosurfactant produced by a novel Pseudomonas sp 2B. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2012; 95 (1): 23- 9.

(27)            Joshi S., Bharucha Ch., Jha S. Biosurfactant production using molasses and whey under thermophilic conditions. Bioresource Technology 2008; 99 (1): 195- 9.

(28)           Onbasli D., Aslim B. Biosurfactant production in sugar beet molasses by some Pseudomonas sp. Journal of Environmental Biology 2009; 30 (1): 161- 3.

(29)           Tuleva BK., Ivanov GR., Christova NE. Biosurfactant production by a new Pseudomonas putida strain. Zeitschrift für Naturforschung B 2002; 57 (3- 4): 356- 60.

(30)           Ilori MO., Amobi CJ., Odocha AC. Factors affecting biosurfactant production by oil degrading Aeromonas sp. isolated from a tropical environment. Chemosphere 2005; 61 (7): 985- 92.

(31)           Hommel RK., Huse K. Regulation of sophorose lipid production by Candida (Torulopsis) apicola. Biotechnology Letters 1993; 15 (8): 853- 8.

(32)           Margaritis A., Kennedy K., Zajic JE. Application of an air lift fermenter in the production of biosurfactants. Developments in industrial microbiology 1980; 21 (1): 285- 94.

(33)           Reiling HE., Wyass UT., Guerra- Santos LH., Hirt R., Kappeli O., Fiechter A. Pilot plant production of rhamnolipid biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa. Applied and Environmental Microbiology 1986; 51 (5): 985- 9.

(34)           Syldatk C., Lang S., Matulovic U., Wagner FZ. Production of four interfacial active rhamnolipids from n- alkanes or glycerol by resting cells of Pseudomonas sp. DSM 2874. Zeitschrift für Naturforschung B 1985; 40 (1): 61- 67.

(35)           Syldatk C., Wagner F. Production of biosurfactants. In N. Kosaric., W. L. Cairns., and N. C. C. Gray (ed.), Biosurfactant biotechnology 1987; 25 (1): 89- 120.

(36)           Franzetti A., Gandolfi I., Bestetti G., Smyth TJ., Banat IM. Production and applications of trehalose lipid biosurfactants. European Journal of Lipid Science and Technology 2010; 112 (6): 617- 27.

(37)           Zhang Y., Miller RM. Effect of a Pseudomonas rhamnolipides biosurfactant on cell hydrophobicity and biodegradation of octadecane. Applied and Environmental Microbiology 1994; 60 (1): 2101- 6.