جداسازّی ‏و ‏شناسایی ‏سویه‏ های ‏سودوموناس ‏تجزیه‏ کننده ‏استونیتریل از ‏آب‏ انبار ‏گنجعلی ‏خان ‏کرمان

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی ‏کارشناسی ‏ارشد ‏میکروبیولوژی، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

2 دانشیار ‏بیوشیمی، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

3 دانشیار ‏ژنتیک، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

4 استادیار ‏بیوفیزیک، ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏ایران

چکیده

مقدمه: ‏نیتریل‏ها ‏ترکیباتی ‏سمی ‏و ‏بسیار ‏خطرناک ‏برای ‏موجودات ‏زنده ‏هستند‏ ‏که ‏به‏‏طور ‏گسترده ‏توسط ‏بشر ‏تولید ‏و ‏موجب ‏آلودگی ‏محیط‏زیست ‏می‏شوند. ‏بهترین ‏روش ‏برای ‏تجزیه ‏نیتریل‏های ‏موجود ‏در ‏فاضلاب، ‏تجزیه ‏زیستی ‏است. ‏هدف ‏اصلی ‏پژوهش حاضر، ‏جداسازی ‏و ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏از ‏فاضلاب ‏شهری ‏در ‏محل ‏آب ‏انبارهای ‏کرمان ‏است. ‏‏‏‏

مواد ‏و ‏روش ‏‏ها: ‏برای ‏غنی‏سازی ‏و ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏از ‏محیط ‏کشت ‏اختصاصی ‏حاوی ‏1 ‏درصد ‏استونیتریل ‏به ‏عنوان ‏تنها ‏منبع ‏کربن ‏و ‏نیتروژن ‏استفاده ‏شد. ‏فعالیت ‏آنزیم ‏و ‏تولید ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏کشت ‏توسط ‏روش ‏فنل- هیپوکلریت ‏سنجیده ‏شد. ‏باکتری‏های ‏جدا ‏شده ‏توسط ‏آزمون‏های ‏بیوشیمیایی‏- ‏میکروبی ‏و ‏مولکولی ‏شناسایی ‏شدند. ‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف ‏کربن، ‏نیتروژن ‏و ‏اسیدیته ‏بررسی ‏و ‏مقدار ‏نیتریل ‏و ‏اسید ‏حاصل ‏توسط ‏کروماتوگرافی ‏گازی ‏تعیین ‏شد. ‏

نتایج: ‏از ‏بین ‏سه ‏جدایه ‏مولد ‏نیتریل ‏هیدرولاز ‏با ‏عنوان ‏FA11، ‏FA8، ‏AB19 ‏جدایه ‏FA8 ‏بیش‏ترین‏‏ ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏را ‏نشان ‏داد. ‏نتایج ‏آزمون‏های ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏نشان ‏داد ‏که ‏این ‏باکتری‏ها ‏به ‏جنس ‏سودوموناس ‏تعلق ‏دارند. ‏بررسی ‏مولکولی ‏ژن ‏16S rRNA‏‏ نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏FA11 ‏و ‏FA8 ‏با ‏سودوموناس ‏اوتیتیدیس ‏و ‏جدایه ‏AB19 ‏با ‏سودوموناس ‏جنیکولاتا ‏به ‏ترتیب ‏دارای ‏99 ‏و ‏100 ‏درصد ‏همولوژی ‏هستند‏. ‏بررسی ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏برتر ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏وجود ‏گلوکز ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏محیط ‏کشت ‏با ‏اسیدیته ‏خنثی ‏دارای ‏بیش‏ترین‏ ‏مقدار ‏تولید ‏آنزیم ‏است. ‏نتایج ‏کروماتوگرافی ‏گازی ‏نشان ‏داد ‏که ‏FA8 ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏انکوباسیون، ‏58 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏کرده ‏است. ‏

بحث ‏و ‏نتیجه ‏گیری: ‏نتایج ‏نشان ‏داد ‏که ‏جدایه ‏برتر ‏FA8، ‏گزینه ‏مناسبی ‏برای ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏است ‏که ‏می‏تواند ‏برای ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏از ‏پساب ‏صنایع ‏و ‏مکان ‏های ‏آلوده، استفاده شود. ‏

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of the acetonitrile-degrading Pseudomonas from the Ab-anbar-e Ganjali Khan in Kerman

نویسندگان [English]

  • Narjes Ramezanipour 1
  • Arastoo Badouei-Dalfard 2
  • Abdolhamid Namaki-Shoushtari 3
  • Zahra Karami 4
1 M.Sc. of Microbiology, Department of Biology, Faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Associate Professors of Biochemistry, Department of Biology, Faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
3 Associate Professors of Genetics, Department of Biology, Faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
4 Assistant Professors of Biophysics, Department of Biology, Faculty of sciences, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: Nitriles are toxic and hazardous compounds for all organisms which are produced enormously by human being and cause environment pollution. Biodegradation is the best method for Nitrile elimination in sewage. The aim of this study was isolation and identification of native bacteria Acetonitrile-degrading from the sewage of the city of Kerman.

Materials and methods: The enrichment and screening of Acetonitrile degrading bacteria was performed in a specific medium containing 1 % Acetonitrile as sole carbon and nitrogen source. Enzyme activity and ammonium production was determined in growth medium using a modification of the phenol/hypochlorite method. Identification of the isolates was undertaken using microbial - biochemical and molecular tests. The optimization of enzyme production was examined. The amount of nitrile and acid were also determined by gas chromatography.

Results: Among three isolated nitrile hydrolyzing producing species (FA3, FA8 and AB19), FA8 isolate showed maximum enzyme productivity. The results of characteristic tests showed that these bacteria belonged to the Pseudomonas sp. Moreover, 16S rRNA sequencing and phylogenetic analyses exhibited that FA11, FA8 and AB19 strains were similar to Pseudomonas Otitidis and Pseudomonas geniculate with 99, 100% homology, respectively. Results of medium optimization of Pseudomonas FA8 strain showed that glucose (10 gL-1) and yeast extract (5 gL-1) in neutral medium strongly supported enzyme production. Gas chromatography results showed that FA8 produced 58% acetic acid at 48 h of incubation.

Discussion and conclusion: The results demonstrated that Pseudomonas FA8 isolated bacterium is a suitable candidate for degradation of Acetonitrile. This bacterium could be used for treatment of industrial wastewater and sites that contaminated with Acetonitrile.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Nitrile
  • Screening
  • Nitrile hydrolase
  • Pseudomonas

مقدمه. ‏

نیتریل‏ها[1] ‏از ‏جمله ‏ترکیبات ‏آلی ‏با ‏گروه ‏فعال ‏سیانو ‏هستند ‏که ‏در ‏شکل‏های ‏مختلف ‏طبیعی ‏و ‏مصنوعی ‏به‏‏طور ‏رو ‏به ‏افزایشی ‏تولید ‏می‏شوند ‏(1). ‏این ‏ترکیبات ‏به ‏شکل ‏طبیعی ‏در ‏شکل‏هایی ‏از ‏سیانوگلیکوزید[2]، ‏سیانولیپید[3]، ‏ایندول ‏3-استونیتریل[4] ‏و ‏بتا-سیانو-ال–آلانین[5] ‏توسط ‏طیف ‏گسترده‏ای ‏از ‏گیاهان ‏تولید ‏می‏شوند ‏(2). ‏در ‏این ‏میان ‏سیانوگلیکوزید‏ها ‏که ‏از ‏محصولات ‏متابولیسم ‏ثانویه ‏گیاهی ‏به ‏شمار ‏می‏آیند ‏در ‏اثر ‏صدمات ‏وارده ‏بر ‏بافت ‏گیاهی ‏به ‏سرعت ‏تجزیه ‏و ‏به ‏محصولاتی ‏مانند: ‏قند، ‏ترکیبات ‏کتون[6]، ‏آلدهید[7] ‏و ‏همچنین، ‏هیدروژن ‏سیانید[8] ‏که ‏یک ‏ترکیب ‏فوق ‏العاده ‏سمی ‏است ‏تبدیل ‏می‏شوند. ‏از ‏طرف ‏دیگر ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏به‏‏طور ‏گسترده‏ ‏در ‏شکل ‏محصولات ‏مختلف ‏صنعتی ‏مانند: ‏حلال، ‏پلاستیک، ‏لاستیک‏های ‏سنتزی، ‏‏علف‏کش ‏و ‏دارو ‏تولید ‏می‏شوند ‏(3). ‏این ‏نیتریل‏ها ‏به ‏شکل ‏غیر ‏قابل ‏کنترلی ‏از ‏فاضلاب ‏صنایع ‏و ‏پساب ‏کشاورزی ‏وارد ‏محیط ‏زیست ‏شده ‏و ‏به ‏عنوان ‏یک ‏عامل ‏مهم ‏تهدید ‏برای ‏محیط ‏زیست ‏و ‏سلامت ‏موجودات ‏زنده ‏به ‏شمار ‏می‏روند ‏(4). ‏یکی ‏از ‏مهم‏ترین ‏روش‏های ‏تبدیل ‏و ‏یا ‏حذف ‏نیتریل‏ها، ‏هیدرولیز ‏شیمیایی ‏‏است ‏که ‏معمولا ‏در ‏شرایط ‏سخت ‏اسیدی ‏یا ‏بازی ‏و ‏درجه ‏حرارت ‏بالا ‏انجام می‏شود. ‏این ‏روش ‏دارای ‏معایبی ‏از ‏جمله ‏تولید ‏محصولات ‏جانبی ‏نامطلوب ‏و ‏هزینه ‏زیاد ‏است ‏(5). ‏امروزه ‏استفاده ‏از ‏روش‏های ‏زیستی ‏برای ‏تجزیه ‏آلاینده‏های ‏نیتریلی ‏مورد ‏توجه ‏قرار ‏گرفته ‏است. ‏

نیتریل‏هیدرولاز‏ها[9]، ‏آنزیم‏هایی ‏هستند ‏که ‏هیدرولیز ‏پیوند ‏کربن- ‏نیتروژن ‏غیر ‏پپتیدی ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏کاتالیز ‏می‏کنند. به طور ‏معمول ‏این ‏خانواده ‏بزرگ ‏آنزیمی ‏بر ‏اساس ‏تشابه ‏توالی ‏و ‏فعالیت ‏کاتالیزوری ‏به ‏13 ‏شاخه ‏تقسیم ‏می‏شوند ‏که ‏در ‏این ‏میان ‏3 ‏شاخه ‏نیتریلاز[10]، ‏نیتریل‏هیدراتاز[11] ‏و ‏آمیداز[12] ‏بسیار ‏مطرح ‏هستند. ‏هیدرولیز ‏آنزیمی ‏نیتریل‏ها ‏با ‏دو ‏مسیر ‏آنزیمی ‏متفاوت ‏انجام می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏اول ‏یک ‏نیتریلاز
(E.C.3.5.5.1) ‏هیدرولیز ‏مستقیم ‏نیتریل‏ها ‏به ‏اسیدهای ‏مربوطه ‏را ‏کاتالیز ‏می‏کند ‏(3) ‏و ‏در ‏مسیر ‏دیگر ‏نیتریل ‏هیدراتاز ‏(E.C.4.2.1.84)، ‏یک ‏نیتریل ‏را ‏به ‏آمید‏های ‏مربوطه ‏تبدیل ‏می‏کند ‏(6). ‏این ‏آنزیم ‏در ‏باکتری‏ها ‏معمولا ‏به‏‏طور ‏همزمان ‏با ‏یک ‏آمیداز ‏بیان ‏می‏شود ‏که ‏آمید ‏تولید ‏شده ‏را ‏با ‏آزادسازی ‏آمونیاک ‏به ‏یک ‏اسید ‏تبدیل ‏می‏کند. ‏

نیتریل‏هیدراتاز ‏به ‏عنوان ‏جزیی ‏از ‏مسیر ‏متابولیکی ‏تجزیه ‏نیتریل ‏در ‏میکروب‏ها ‏برای ‏نخستین ‏بار ‏در ‏تولید ‏نیکوتینآمید[13] ‏و ‏5-سیانو‏والرآمید[14] ‏شناسایی ‏شد ‏و ‏بیشتر ‏در ‏تولید ‏صنعتی ‏واسطه‏های ‏دارویی ‏و ‏کشاورزی ‏و ‏تولید ‏000/30 ‏تن ‏آکریلآمید[15] ‏در ‏سال ‏نقش ‏دارد ‏(7). ‏نیتریلاز ‏(نیتریل‏آمینو‏هیدرولاز[16]) ‏نخستین ‏آنزیم ‏متابولیزه‏کننده ‏نیتریل‏هاست ‏که ‏در ‏سال ‏1960 ‏با ‏تخلیص ‏از ‏گیاه ‏جو ‏و ‏باکتری ‏سودوموناس[17] ‏کشف ‏شد ‏(8 ‏و ‏9). ‏نخستین ‏واکنشی ‏که ‏در ‏آن ‏این ‏آنزیم ‏شناسایی ‏شد، ‏تولید ‏ایندول ‏3 ‏استیک‏اسید[18] ‏(اکسین[19]) ‏از ‏ایندول ‏‏3‏-استونیتریل ‏در ‏گیاهان ‏بود ‏(10). ‏نیتریلاز‏ها ‏آنزیم‏هایی ‏قابل ‏القا ‏با ‏یک ‏یا ‏دو ‏زیر‏ واحد ‏در ‏اندازه ‏و ‏تعداد ‏متنوع ‏هستند ‏و ‏به‏طور معمول ‏یک ‏گروه ‏سولفیدریل ‏دارند ‏که ‏برای ‏فعالیت ‏آن‏ها ‏ضروری ‏است. ‏

از ‏جمله ‏کاربردهای ‏صنعتی ‏مهم ‏نیتریلاز‏ها ‏علاوه ‏بر ‏شرکت ‏در ‏پاک‏سازی ‏زیستی ‏خاک ‏و ‏آب‏های ‏حاوی ‏ترکیبات ‏سمی ‏نیتریلی ‏می‏توان ‏به ‏مواردی ‏همچون ‏سنتز ‏کربوکسیلیک‏اسیدهای ‏مهم ‏صنعتی، ‏تولید ‏نیکوتینیک‏اسید[20] ‏(نیاسین[21]) ‏از ‏3-سیانوپیریدین[22] ‏با ‏مصارف ‏کاربردی ‏در ‏پزشکی ‏و ‏تغذیه ‏و ‏تولید ‏تجاری ‏R-‏ماندلیک‏اسید[23] ‏از ‏ماندلونیتریل[24] ‏به ‏عنوان ‏واسطه ‏و ‏عوامل ‏حل‏کننده ‏برای ‏تولید ‏بسیاری ‏از ‏محصولات ‏دارویی ‏و ‏کشاورزی ‏و. ‏. ‏. ‏اشاره کرد ‏(11). ‏فعالیت ‏تجزیه ‏نیتریل‏ها ‏به ‏ندرت ‏در ‏طبیعت ‏دیده ‏می‏شود. ‏میزان ‏کم ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏فقط ‏در ‏سه ‏خانواده ‏از ‏21 ‏خانواده ‏گیاهی ‏و ‏شمار ‏محدودی ‏از ‏جنس‏های ‏قارچی ‏مشاهده ‏شده ‏است. ‏این ‏فعالیت ‏در ‏باکتری‏ها ‏غالب‏تر ‏است. ‏برخی ‏از ‏آن‏ها ‏مانند: ‏اسینتوباکتر[25]، ‏رودوکوکوس[26]، ‏کلبسیلا[27]، ‏سودوموناس، ‏آرتروباکتر[28]، ‏کورینه‏باکتریوم[29] ‏و ‏نوکاردیا[30] ‏می‏توانند ‏از ‏نیتریل‏ها ‏به ‏عنوان ‏منابع ‏نیتروژن ‏و ‏کربن ‏استفاده ‏کنند ‏(12). ‏یکی ‏از ‏مشکلات ‏سال‏های ‏اخیر ‏شهر ‏کرمان ‏بالا ‏آمدن ‏سطح ‏آب‏های ‏زیر ‏زمینی ‏است ‏که ‏متاسفانه ‏باعث ‏آلودگی ‏شدید ‏اماکن ‏و ‏ابنیه ‏تاریخی ‏از ‏جمله ‏آب ‏انبارهای ‏قدیمی، ‏توسط ‏فاضلاب ‏شهری ‏و ‏خانگی ‏شده ‏است. ‏

در پژوهش حاضر، ‏سه ‏باکتری ‏مولد ‏نیتریل‏هیدرولاز ‏با ‏توانایی ‏تجزیه ‏استونیتریل[31] ‏از ‏آب ‏آلوده ‏آب‏انبار‏های ‏قدیمی ‏شهر ‏کرمان ‏جداسازی ‏و ‏توسط ‏روش‏های ‏بیوشیمیایی ‏و ‏مولکولی ‏شناسایی شد ‏و ‏پتانسیل ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏جدایه ‏برتر ‏سودوموناس ‏اوتیتیدیس ‏FA8[32]در ‏حضور ‏ترکیبات ‏مختلف ‏بررسی ‏و ‏بهینه‏سازی ‏شد. ‏

 

‏‏مواد ‏و ‏روش‏ها. ‏

مواد ‏شیمیایی: ‏تمامی ‏ترکیبات ‏محیط ‏کشت ‏غربال‏گری ‏از ‏شرکت ‏سیگما ‏آلدریچ[33] ‏و ‏مرک ‏خریداری ‏شد. ‏مواد ‏مورد ‏نیاز ‏برای ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز[34] ‏از ‏شرکت ‏سیناژن ‏و ‏سایر ‏مواد ‏شیمیایی ‏مورد ‏نیاز ‏از ‏شرکت ‏مرک[35] ‏(آلمان) ‏خریداری ‏شد. ‏همین ‏طور ‏پرایمر‏های ‏مورد ‏نیاز ‏توسط ‏شرکت ‏بیونیر‏[36] ‏(کره ‏جنوبی) ‏سنتز ‏شد. ‏حلال‏های ‏آلی ‏مورد ‏نیاز ‏نیز ‏از ‏شرکت ‏مرک ‏خریداری ‏شدند. ‏

. ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏نمونه‏برداری ‏از ‏آب‏انبار‏های ‏قدیمی ‏شهر ‏کرمان ‏که ‏سطح ‏فاضلاب ‏شهری ‏کرمان ‏بسیار ‏بالا ‏آمده ‏بود، ‏انجام ‏شد. ‏پس ‏از ‏انتقال ‏نمونه‏ها ‏در ‏شرایط ‏استریل ‏به ‏آزمایشگاه، ‏برای ‏غنی‏سازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل، ‏حجم ‏5 ‏میلی‏لیتر ‏از ‏نمونه ‏آب ‏به ‏محیط ‏کشت ‏مایع ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی ‏(MM1)‏[37] ‏(حاوی: ‏8/6 ‏گرم ‏دی ‏پتاسیم ‏هیدروژن ‏فسفات[38]، ‏2/1 ‏گرم ‏پتاسیم ‏دی ‏هیدروژن ‏فسفات[39]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏منیزیم[40]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏منگنز[41]، ‏1/0 ‏گرم ‏کلسیم ‏دی‏کلرید[42]، ‏1/0 ‏گرم ‏سولفات ‏آهن[43] ‏و ‏006/0 ‏گرم ‏سدیم ‏مولیبدات[44] ‏در ‏یک ‏لیتر ‏آب ‏مقطر ‏و ‏یک ‏درصد ‏سوبسترای ‏استونیتریل) ‏افزوده ‏شد ‏(13). ‏محیط ‏کشت ‏به‏‏وسیله  ‏کلریدریک اسید[45] ‏و ‏سدیم ‏هیدروکسید[46] ‏یک ‏مولار، ‏در ‏اسیدیته ‏7 ‏تنظیم ‏شد. ‏ارلن‏ها ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه، ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏پس ‏از ‏3 ‏کشت ‏متوالی ‏در ‏محیط ‏کشت ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی، ‏غنی‏سازی ‏میکروارگانیسم‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏انجام ‏شد. ‏برای ‏جداسازی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل ‏‏100 ‏میکرولیتر ‏از ‏کشت ‏غنی‏شده ‏به ‏محیط ‏کشت ‏جامد ‏حداقل ‏حاوی ‏5/1 ‏درصد ‏آگار[47] ‏و ‏02/0 ‏درصد ‏فنل‏رد[48] ‏به ‏عنوان ‏شناساگر ‏و ‏100 ‏میکرولیتر ‏استونیتریل، ‏تلقیح ‏شد. ‏پلیت‏ها ‏به ‏مدت ‏24 تا 72 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏پس ‏از ‏سه ‏دوره ‏کشت ‏از ‏میان ‏سه ‏جدایه ‏با ‏فعالیت ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏جدایه ‏FA8 ‏که ‏بیش‏ترین‏ ‏هاله ‏و ‏میزان ‏شدت ‏رنگ ‏در ‏محیط ‏جامد ‏و ‏مایع ‏حاوی ‏سوبسترا ‏و ‏فنل‏رد، ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏انکوباسیون ‏را ‏نشان ‏داد، ‏به ‏عنوان ‏جدایه ‏برتر ‏مولد ‏نیتریل‏هیدرولاز ‏تجزیه ‏کننده ‏استونیتریل ‏برای ‏مطالعات ‏آنزیمی ‏انتخاب ‏شد ‏(13). ‏

. ‏شناسایی ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏جدا ‏شده، ‏بر ‏اساس ‏صفات ‏ریخت‏شناسی، ‏فیزیولوژیکی، ‏بیوشیمیایی ‏و ‏مولکولی ‏انجام ‏شد. ‏ویژگی‏های ‏ریخت‏شناسی ‏هر ‏یک ‏از ‏جدایه‏ها ‏روی ‏محیط ‏کشت ‏تریپتیکال ‏سوی ‏آگار (TSA[49]) ‏(مرک، ‏آلمان) ‏بررسی ‏شد. ‏پس ‏از ‏رنگ‏آمیزی ‏گرم[50]، ‏شکل ‏باکتری‏ها ‏و ‏واکنش ‏گرم ‏آن‏ها ‏مطالعه ‏شد. ‏همچنین، ‏آزمون‏های ‏بیوشیمیایی ‏شامل: ‏فعالیت ‏کاتالازی، ‏اکسیدازی، ‏مصرف ‏گلوکز ‏از ‏مسیر ‏تخمیر ‏اسید‏های ‏مخلوط ‏(متیل‏رد‏[51]) ‏یا ‏مسیر ‏تخمیر ‏بوتاندیول ‏(وژز ‏پروسکوئر[52])‏، ‏تولید ‏پیگمان، ‏مصرف ‏سیترات، ‏احیای ‏نیترات، ‏هیدرولیز ‏اوره، ‏ژلاتین ‏و ‏کازئین، ‏انجام ‏و ‏حرکت ‏باکتری ‏مطابق ‏جداول ‏شناسایی ‏کتاب ‏سیستماتیک ‏باکتریولوژی ‏برگی[53]، ‏بررسی ‏شد ‏(14). ‏تمام ‏آزمایش‏ها ‏با ‏سه ‏بار ‏تکرار ‏انجام ‏شدند. ‏

.شناسایی ‏مولکولی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏به ‏منظور ‏شناسایی ‏مولکولی، ‏ابتدا ‏باکتری‏ها ‏روی ‏محیط ‏نوترینت ‏آگار[54] ‏کشت ‏چمنی ‏داده ‏و ‏به ‏مدت ‏24 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شدند. ‏باکتری‏های ‏رشد ‏یافته ‏به ‏کمک ‏لوپ ‏از ‏سطح ‏محیط ‏کشت ‏جمع‏آوری ‏و ‏سوسپانسیونی ‏از ‏آن‏ها ‏در ‏آب ‏مقطر ‏استریل ‏تهیه ‏شد. ‏با ‏سانتریفیوژ[55] ‏سوسپانسیون ‏حاصل ‏در ‏دمای ‏4 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏به ‏مدت ‏10 ‏دقیقه ‏و ‏در ‏دور ‏g8000 ‏رسوب ‏باکتری ‏به ‏دست ‏آمد. ‏جداسازی ‏DNA ‏ژنومی ‏با ‏استفاده ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏سیناژن ‏انجام ‏شد. ‏به ‏منظور ‏تخمین ‏کیفیت ‏و ‏کمیت ‏DNA ‏ژنومی ‏استخراج ‏شده، ‏جذب ‏محلول ‏رقیق ‏شده ‏DNA ‏(با ‏رقت ‏100) ‏در ‏طول ‏موج‏های ‏260 ‏و ‏280 ‏نانومتر ‏اندازه‏گیری ‏شد. ‏با ‏استفاده ‏از ‏رابطه ‏Conc.DNA (µg/ml)= 50.d.A260 و ‏نسبت ‏A260/A280 ‏به ‏ترتیب ‏غلظت ‏DNA ‏و ‏میزان ‏خلوص ‏آن ‏تخمین ‏زده ‏شد. ‏پرایمر‏ها ‏مطابق ‏با ‏پرایمر‏های ‏عمومی ‏برای ‏تکثیر ‏ژن ‏16S rRNA‏ ‏به ‏شکل ‏زیر ‏با ‏استفاده ‏از ‏نرم‏‏افزار ‏Gene runner ‏طراحی ‏شدند ‏(15). ‏پرایمر ‏Forward: 5'-AGTTTGATCCTGGCTCCAG-3' ‏با Tm= 53.7درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏پرایمر
5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'Reverse: ‏با ‏Tm= 53.4 ºC‏واکنشزنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏مطابق ‏با ‏برنامه ‏ذیل ‏انجام ‏شد. ‏دمای ‏اولیه ‏برای ‏جداشدن ‏دو ‏رشته ‏DNA، ‏94 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏به ‏مدت ‏5 ‏دقیقه ‏بود. ‏باز ‏شدن ‏دو ‏رشته ‏در ‏دمای ‏94 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏45 ‏ثانیه، ‏اتصال ‏پرایمرها ‏در ‏دمای ‏54 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏45 ‏ثانیه، ‏طویل ‏شدن ‏رشته ‏هدف ‏در ‏72 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏90 ‏ثانیه ‏و ‏مرحله ‏طویل ‏شدن ‏نهایی ‏در ‏دمای ‏72 ‏درجه ‏به ‏مدت ‏8 ‏دقیقه. ‏محصول ‏واکنشزنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏پس ‏از ‏الکتروفورز ‏ژل ‏آگاروز[56] ‏یک ‏درصد ‏با ‏استفاده ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏خالص‏سازی ‏شد. ‏سپس، ‏توالی ‏DNA ‏با ‏استفاده ‏از ‏توالی‏یاب ‏DNA ‏توسط ‏شرکت ‏بیونیر ‏(کره ‏جنوبی) ‏تعیین ‏شد. ‏شباهت ‏توالی ‏نوکلئوتید‏های ‏ژن
16S rRNAجدایه‏های ‏تجزیه‏کننده ‏به ‏کمک ‏نرم‏افزار ‏BLAST ‏با ‏توالی‏های ‏ثبت ‏شده ‏در ‏پایگاه ‏اطلاعاتی ‏ژنوم ‏بانک ‏ژنی[57] ‏مقایسه ‏شد ‏(16). ‏به ‏این ‏ترتیب ‏نزدیک‏ترین ‏جدایه‏ها ‏با ‏ترادف ‏16S rRNA‏ ‏جدایه‏های ‏FA11، ‏FA8 ‏و ‏AB19 ‏تعیین ‏شد. ‏همچنین، ‏توالی‏های ‏به ‏دست ‏آمده ‏در ‏این ‏پژوهش ‏در ‏بانک ‏ژنی ‏مرکز ‏ملی ‏بیوتکنولوژی[58] ‏ثبت ‏و ‏شماره ‏دستیابی[59] ژنی ‏مربوطه ‏دریافت ‏شد. ‏درخت ‏فیلوژنی ‏توالی ‏جدایه‏ها ‏با ‏توالی ‏حاصل ‏از ‏جستجو ‏در ‏پایگاه ‏اطلاعاتی ‏بانک ‏ژنی ‏به ‏کمک ‏نرم‏افزار ‏مگا ‏4[60] ‏با ‏روش‏ ‏neighbour joining ‏رسم ‏شد ‏(17). ‏

سنجش ‏فعالیت ‏آنزیمی: ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏جدایه ‏برتر ‏FA8 ‏بر ‏اساس ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏با ‏استفاده ‏از ‏روش ‏فنل- ‏هیپوکلریت[61] ‏سنجیده ‏شد ‏(18). ‏به ‏100 ‏میکرولیتر ‏محلول ‏رویی ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏باکتری، ‏100 ‏میکرولیتر ‏استونیتریل ‏25 ‏میلی‏مولار ‏و ‏200 ‏میکرولیتر ‏بافر ‏فسفات ‏50 ‏میلی‏مولار ‏با ‏اسیدیته ‏7 ‏اضافه ‏شد. ‏مخلوط ‏حاصل ‏به ‏مدت ‏30 ‏دقیقه ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏گرماگذاری ‏شد. ‏پس ‏از ‏آن، ‏مقادیر ‏400 ‏میکرولیتر ‏محلول A ‏(فنل[62] ‏59/0 ‏مولار ‏و ‏سدیم‏نیتروپروساید[63] ‏1 ‏میلی‏مولار) ‏و ‏400 ‏میکرولیتر ‏محلولB ‏(سدیم‏هیپوکلریت[64] ‏11/0 ‏مولار ‏و ‏سدیم ‏هیدروکسید ‏2 ‏مولار) ‏به ‏آن ‏اضافه ‏شد ‏(18). ‏پس ‏از ‏پدیدار ‏شدن ‏رنگ ‏آبی ‏مقدار ‏جذب ‏نمونه‏ها ‏در ‏طول ‏موج ‏600 ‏نانومتر ‏توسط ‏دستگاه ‏اسپکتروفتومتر[65] ‏خوانده ‏شد. ‏پس ‏از ‏رسوب ‏دادن ‏باکتری‏ها ‏علاوه ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏محیط ‏کشت ‏فاقد ‏باکتری، ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏عصاره ‏باکتری ‏لیز ‏شده ‏نیز ‏سنجش شد. ‏در ‏تمامی ‏واکنش‏ها ‏از ‏محلول ‏شاهدی ‏که ‏در ‏آن ‏آنزیم ‏پس ‏از ‏انکوباسیون ‏مخلوط ‏واکنش ‏به ‏آن ‏اضافه ‏شده ‏بود ‏استفاده ‏شد. ‏از ‏این ‏رو، ‏یک ‏واحد ‏فعالیت ‏آنزیم ‏عبارت ‏است ‏از ‏مقدار ‏آنزیمی ‏که ‏قادر ‏است ‏1 ‏میکرو‏مول ‏آمونیاک ‏به ‏ازای ‏1 ‏دقیقه ‏در ‏شرایط ‏استاندارد ‏واکنش ‏آزاد ‏کند. ‏آزمایشات ‏3 ‏بار ‏تکرار ‏و ‏منحنی ‏استاندارد ‏توسط ‏آمونیوم ‏کلراید[66] ‏رسم ‏شد ‏(11 ‏و ‏13). ‏

.‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف: ‏برای ‏بهینه‏سازی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم، ‏جدایه ‏FA8 ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏در ‏محیط ‏تولید ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی ‏حاوی ‏استونیتریل ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏(گلوکز[67]، ‏مالتوز[68]، ‏فروکتوز[69] ‏و ‏نشاسته[70])، ‏منابع ‏مختلف ‏نیتروژن ‏(پپتون[71]، ‏عصاره ‏مخمر[72]) ‏و ‏اسیدیته‏های ‏مختلف ‏(5، ‏6، ‏7 و ‏8) ‏انکوبه ‏شد. ‏از ‏محیط ‏تولید ‏بدون ‏منابع ‏به ‏عنوان ‏شاهد ‏سنجش ‏استفاده ‏شد. ‏سنجش ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏بر ‏اساس ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏طبق ‏روش ‏فنل- ‏هیپوکلریت ‏در ‏زمان‏های ‏24 ‏و ‏48 ‏ساعت ‏انجام ‏شد ‏و ‏میزان ‏جذب ‏در ‏طول ‏موج ‏600 ‏نانومتر ‏نیز ‏اندازه‏گیری ‏شد ‏(19). ‏

. ‏بررسی ‏مقدار ‏استیک‏‏اسید ‏تولیدی ‏توسط ‏جدایه ‏FA8: ‏ابتدا ‏جدایه ‏FA8 ‏درون ‏ارلن‏های ‏محیط ‏غنی‏سازی ‏حاوی ‏(گلوکز ‏10 ‏گرم، ‏عصاره ‏مخمر ‏5 ‏گرم، ‏پتاسیم ‏دی ‏هیدروژن ‏فسفات ‏2 ‏گرم، ‏سدیم ‏کلرید ‏1 ‏گرم، ‏سولفات ‏منیزیم ‏2/0 ‏گرم ‏در ‏یک ‏لیتر ‏آب ‏مقطر) ‏و ‏20 ‏میلی‏مولار ‏استونیتریل، ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏و ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏گرماگذاری ‏شد. ‏پس ‏از ‏آن ‏سلول‏های ‏باکتری ‏توسط ‏سانتریفیوژ ‏برداشته ‏و ‏سوسپانسیونی ‏از ‏آن‏ها ‏در ‏بافر ‏فسفات ‏100 ‏میلی‏مولار، ‏اسیدیته ‏5/7 ‏تهیه ‏شد. ‏در ‏مخلوط ‏واکنش، ‏به ‏20 ‏میلی‏گرم ‏رسوب ‏باکتریایی، ‏استونیتریل ‏20 ‏میلی‏مولار ‏و ‏بافر ‏فسفات ‏100 ‏میلی‏مولار ‏با ‏اسیدیته ‏5/6 ‏اضافه ‏شد ‏و ‏به ‏مدت ‏48 ‏ساعت ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏با ‏160 ‏دور ‏در ‏دقیقه ‏گرما‏گذاری ‏شد. ‏100 ‏میکرولیتر ‏نمونه ‏در ‏فواصل ‏معین ‏از ‏مخلوط ‏واکنش ‏برداشته ‏و ‏سپس، ‏سانتریفیوژ ‏شد. ‏سنجش ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏طبق ‏روش یاد شده ‏سنجیده ‏شد. ‏تحلیل ‏مقدار ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏شده ‏از ‏فعالیت ‏نیتریل‏هیدرولازی ‏FA8 ‏با ‏تزریق ‏5 ‏میکرولیتر ‏محلول ‏رویی ‏حاصل ‏از ‏واکنش ‏مربوطه ‏در ‏بافر ‏فسفات ‏حاوی ‏استونیتریل، ‏به ‏دستگاه ‏کروماتوگرافی ‏گازی[73] ‏‏دارای ‏ستون ‏موئینه[74] ‏FFAP ‏‏و ‏شناساگر ‏یونیزاسیون ‏شعله‏ایFID[75] ‏در ‏محدوده ‏دمایی ‏150 ‏تا ‏220 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏انجام ‏شد. ‏گاز ‏نیتروژن ‏به ‏عنوان ‏گاز ‏حامل[76] ‏در ‏دستگاه ‏استفاده ‏شد ‏(20). ‏

 

نتایج. ‏

.غربال‏گری ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏آب‏انبار‏های ‏نمونه‏برداری ‏شده ‏در ‏قسمت ‏مرکزی ‏شهر ‏کرمان ‏و ‏در ‏مجموعه ‏گنجعلی‏خان ‏واقع ‏شده ‏است. ‏پس ‏از ‏بررسی ‏اولیه ‏توانایی ‏جدایه‏ها ‏در ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏جدایه ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏ایجاد ‏بیش‏ترین‏ ‏شدت ‏رنگ ‏صورتی ‏در ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏فنل‏رد ‏برای ‏ادامه ‏مطالعات ‏انتخاب ‏شد ‏(شکل 1). ‏

. ‏شناسایی ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل: ‏برای ‏شناسایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریلFA8، ‏FA11 ‏و ‏AB19 ‏رنگ‏آمیزی ‏گرم ‏انجام ‏و ‏ویژگی‏های ‏میکروبیولوژیکی، ‏فیزیولوژیکی ‏و ‏بیوشیمیایی ‏جدایه‏ها، ‏بررسی ‏شد ‏(جدول 1). ‏

 

شکل 1- ‏تغییر ‏رنگ ‏محیط ‏مایع ‏حاوی ‏فنل‏رد ‏و ‏استونیتریل ‏از ‏زرد ‏به ‏شکلی ‏توسط ‏جدایه ‏FA8. ‏لوله ‏1 ‏(محیط ‏پایه)، ‏لوله ‏‏2 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏فنل‏رد)، ‏لوله ‏‏3 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد)، ‏لوله ‏‏4 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد ‏+ ‏باکتری ‏فاقد ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏نیتریل ‏هیدرولاز) و ‏لوله ‏‏5 ‏(محیط ‏پایه ‏+ ‏سوبسترا ‏+ ‏فنل‏رد ‏+ ‏جدایه ‏FA8). ‏


 

جدول 1- ‏نتایج ‏میکروبیولوژیکی، ‏فیزیولوژیکی ‏و ‏بیوشیمیایی ‏باکتری‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل

آزمون

FA11

FA8

AB19

آزمون

FA11

FA8

AB19

شکل ‏باکتری

کوکوباسیل

کوکوباسیل

کوکوباسیل

هیدرولیز ‏کازئین

+

+

+

واکنش ‏گرم

-

-

-

گاز

-

-

-

ویژگی‏های ‏کلونی

متوسط ‏مقعر ‏سفید

متوسط ‏مقعر ‏سفید

کوچک ‏محدب ‏زرد

اندول

-

-

-

اوره‏آز

-

-

+

سولفید ‏هیدروژن

-

-

-

اسپور

-

-

-

متیل‏رد

-

-

-

پیگمان

-

-

-

وژز ‏پروسکوئر

-

-

-

احیا ‏نیترات

+

+

-

مصرف ‏نشاسته

-

-

-

حرکت

+

+

+

هیدرولیز ‏ژلاتین

+

+

+

تریپل ‏شوگر ‏آیرون

قلیا/ قلیا

قلیا/ قلیا

قلیا/ قلیا

مصرف ‏سیترات

+

+

+

فعالیت ‏کاتالازی

+

+

+

مصرف ‏گلوکز

+

+

+

فعالیت ‏اکسیدازی

+

+

+

رشد ‏در ‏4 درصد ‏نمک

+

+

+

 


. ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏با ‏استفاده ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏ژن
16s rRNA: ‏شناسایی ‏جدایه‏ها ‏با ‏استفاده ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏ژن ‏16s rRNA ‏انجام ‏شد. ‏برای ‏تهیه ‏DNA ‏ژنومی ‏باکتری ‏از ‏کیت ‏استخراج ‏DNA ‏سیناژن ‏استفاده ‏شد ‏و ‏DNA ‏تکثیر ‏یافته ‏با ‏استفاده ‏از ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏توسط ‏کیت ‏تخلیص ‏DNA ‏از ‏شرکت ‏سیناژن ‏تخلیص ‏شد ‏و ‏سپس، ‏برای ‏تعیین ‏توالی ‏به ‏شرکت ‏بیونیر ‏(کره ‏جنوبی) ‏ارسال ‏شد. ‏

پس ‏از ‏تعیین ‏توالی ‏محصول ‏واکنش ‏زنجیره‏ای ‏پلیمراز ‏سه ‏جدایه ‏و ‏مقایسه ‏با ‏سایر ‏ژن‏های ‏16s rRNA، ‏درخت ‏فیلوژنتیکی ‏برای ‏آن‏ها ‏رسم ‏شد ‏(شکل 2). ‏رسم ‏درخت ‏فیلوژنتیک ‏با ‏استفاده ‏از ‏نرم‏افزار ‏مگا ‏4 ‏انجام ‏شد. ‏نتایج به دست آمده ‏از ‏تطبیق ‏توالی ‏و ‏درخت ‏فیلوژنتیکی ‏نشان ‏دادند ‏که ‏جدایه‏های ‏FA11 ‏و ‏FA8 ‏به ‏گونه ‏سودوموناس ‏اوتیدیس ‏و ‏جدایه ‏AB19 ‏نیز ‏به ‏گونه ‏سودوموناس ‏جنیکولاتا[77] ‏با ‏میزان ‏شباهت ‏نوکلئوتیدی ‏99 ‏و ‏100 ‏درصد ‏به ‏ترتیب ‏نزدیک ‏هستند. ‏توالی ‏نوکلئوتیدی ‏جدایه‌های ‏FA11، ‏FA8 ‏و ‏AB19به ‏ترتیب ‏با ‏شماره ‏دسترسی KM229752.1، KM229748.1 و KM229753.1 ‏در ‏بانک ‏ژن ‏ثبت ‏شد. ‏


 

 

شکل 2- ‏درخت ‏فیلوژنی ‏جدایه‏های ‏تجزیه‏کننده ‏استونیتریل، ‏سودوموناس ‏FA8، ‏سودوموناس ‏FA11 ‏و ‏سودوموناس ‏AB19 ‏جداشده ‏از ‏آب‏انبار. ‏اعداد ‏یاد ‏شده ‏در ‏محل ‏انشعاب ‏نشانگر ‏درصد ‏نمونه‏گیری ‏bootstrape ‏از ‏1000 ‏نمونه ‏است. ‏لیزینی ‏باسیلوس ‏اسفاریکوس ‏نیز ‏به عنوان ‏outgroup ‏در ‏نظر ‏گرفته ‏شد. ‏

 

 


. ‏بررسی ‏میزان ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏در ‏طی ‏زمان: ‏مقایسه ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏پس ‏از ‏72 ‏ساعت ‏در ‏حضور ‏و ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏در ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏جدول 2 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏در ‏حالت ‏سنجش ‏با ‏سوبسترا ‏علاوه ‏بر ‏میزان ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل، ‏فعالیت ‏نیتریل‏هیدرولازی ‏نیز ‏سنجیده ‏می‏شود. ‏این ‏در ‏حالی‏ ‏است ‏که ‏در ‏حالت ‏بدون ‏سوبسترا ‏فقط ‏میزان ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏سنجیده ‏می‏شود. ‏این ‏موضوع ‏در ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏سودوموناس ‏FA8 ‏کاملا ‏صدق ‏می‏کند. ‏. ‏بررسی ‏شرایط ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏حضور ‏منابع ‏مختلف: ‏ اثر‏منابع ‏مختلف ‏کربن: ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏به ‏میزان ‏10 ‏گرم ‏بر ‏لیتر ‏(گلوکز، ‏فروکتوز، ‏مالتوز ‏و ‏نشاسته)، ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏جدول 3 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏دادند ‏که ‏مالتوز ‏در ‏مقایسه ‏با ‏شاهد ‏باعث ‏کاهش ‏تولید ‏آنزیم ‏شده ‏است. ‏در ‏مقابل ‏گلوکز، ‏نشاسته ‏و ‏تا ‏حدودی ‏فروکتوز ‏موجب ‏افزایش ‏تولید ‏آنزیم ‏شده ‏است. ‏در ‏بین ‏منابع ‏مورد ‏بررسی ‏گلوکز ‏اثر در خور ‏توجهی ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏دارد. ‏

اثر ‏منابع ‏نیتروژن: ‏اثر ‏منابع ‏نیتروژن ‏عصاره ‏مخمر ‏و ‏پپتون ‏(5 ‏گرم ‏بر ‏لیتر)، ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏درجدول ‏4 ‏نشان ‏داده ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏دادند ‏که ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏مقایسه ‏با ‏کنترل ‏و ‏پپتون ‏اثر در خور ‏توجهی ‏بر ‏تولید ‏آنزیم ‏دارد. ‏

اثر ‏اسیدیته ‏بر ‏تولید ‏آنزیم: ‏بررسی ‏تاثیر ‏اسیدیته ‏بر ‏روی ‏تولید ‏آنزیم ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏انتخاب ‏اسیدیته‏های ‏های ‏مختلف ‏5 ‏تا ‏8 ‏در ‏محیط ‏کشت ‏انجام ‏شد ‏(جدول ‏5). ‏نتایج ‏پس ‏از ‏48 ‏ساعت ‏رشد ‏باکتری ‏در ‏دمای ‏30 ‏درجه ‏سانتی‏گراد ‏نشان ‏داد ‏که ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏در ‏محدوده ‏6 ‏تا ‏7 ‏افزایش ‏و ‏سپس، ‏به ‏آرامی ‏در ‏اسیدیته ‏8 ‏دچار ‏کاهش ‏شده ‏است. ‏اسیدیته ‏بهینه برای ‏تولید ‏آنزیم ‏7 ‏است، ‏به ‏این ‏ترتیب ‏قبل ‏از ‏انجام ‏استریلیزاسیون ‏محیط، ‏اسیدیته ‏آن ‏بین ‏6 تا 7 ‏تنظیم ‏شد. ‏

 

جدول 2- ‏مقایسه ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏پس ‏از ‏72 ‏ساعت ‏در ‏حضور ‏و ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏در ‏جدایه ‏FA8

72

0

زمان ‏(ساعت) ‏

2/0± ‏365/0

2/0 ‏± ‏125/0

عدم ‏حضور ‏سوبسترا

2/0± ‏515/0

2/0 ‏± ‏135/0

در ‏حضور ‏سوبسترا

 

جدول 3- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏کربن ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر

تولید ‏آمونیاک ‏(درصد) ‏

منبع ‏کربن

610/0± ‏3/0

100

کنترل

678/1 ‏± ‏3/0

443

گلوکز

217/1 ‏± ‏3/0

137

فروکتوز

910/0 ‏± ‏3/0

93

مالتوز

504/1 ‏± ‏3/0

387

نشاسته

 

جدول 4- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏نیتروژن ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر

تولید ‏آمونیاک ‏(درصد) ‏

منبع ‏نیتروژن

215/1 ‏± ‏2/0

100

کنترل

428/1 ‏2/0±

118

پپتون

921/1 ‏2/0±

427

عصاره ‏مخمر

 

جدول 5- ‏اثر ‏منابع ‏مختلف ‏اسیدیته ‏بر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏سودوموناس ‏FA8

جذب ‏600 ‏نانومتر

تولید ‏آمونیاک ‏(درصد)‏

اسیدیته

774/0 ‏± ‏03/0

62

5

933/0 ‏± ‏03/0

74

6

953/0 ‏± ‏03/0

100

7

141/1 ‏± ‏03/0

65

8

.بررسی ‏میزان ‏استونیتریل ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏با ‏کروماتوگرافی ‏گازی: ‏کروماتوگرافی ‏گازیبه‏‏طور ‏مستدل ‏از ‏دقیق‏ترین ‏و ‏حساس‏ترین ‏روش‏های ‏کروماتوگرافی ‏است. ‏با ‏این ‏روش ‏می‏توان ‏اجزای ‏موجود ‏در ‏یک ‏مخلوط ‏را ‏از ‏نظر ‏کیفی ‏و ‏کمی، ‏البته ‏با ‏در ‏دست ‏داشتن ‏شاهد ‏جداسازی کرد ‏(21). ‏در ‏یک ‏کروماتوگرام[78] ‏حاصل ‏از ‏جداسازی، ‏به‏طور معمول ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏به ‏دست ‏آمده ‏که ‏به ‏شکل ‏درصد ‏نشان ‏داده ‏می‏شود ‏که ‏مقدار ‏ماده ‏موجود ‏در ‏مخلوط ‏را ‏نشان ‏می‏دهد. ‏به‏‏طور ‏کلی ‏تجزیه ‏ترکیبات ‏نیتریل ‏توسط ‏دو ‏مسیر ‏آنزیمی ‏انجام می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏اول، ‏آنزیم ‏نیتریلاز ‏به ‏شکل ‏مستقیم ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏به ‏اسید‏های ‏مربوطه ‏تبدیل ‏می‏کند ‏و ‏مقدار ‏زیادی ‏آمونیاک ‏نیز ‏به ‏عنوان ‏محصول ‏اصلی ‏تولید ‏می‏شود. ‏در ‏مسیر ‏دوم، ‏آنزیم ‏نیتریل ‏هیدراتاز ‏با ‏همکاری ‏آنزیم ‏آمیداز، ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏را ‏با ‏تولید ‏حد واسط ‏آمید ‏مربوطه ‏به ‏اسید ‏تبدیل ‏می‏کند. ‏

کروماتوگرام ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏فعالیت ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏شکل 3 ‏نشان ‏داده ‏شده ‏است. ‏در ‏‏پژوهش حاضر، ‏محلول ‏رویی ‏حاصل ‏از ‏واکنش ‏تغییر ‏شکل ‏زیستی ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏حضور ‏سوبسترای ‏استونیتریل ‏در ‏زمان‏های ‏16، ‏30 ‏و ‏48 ‏ساعت ‏تحلیل شد ‏و ‏کروماتوگرام ‏به ‏دست ‏آمده ‏با ‏نمونه‏های ‏استاندارد ‏استونیتریل، ‏استامید[79] ‏و ‏استیک‏‏اسید[80] ‏مقایسه ‏شد. ‏نتایج ‏نشان ‏داد ‏که ‏سودوموناس ‏FA8 ‏دارای ‏توانایی ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏موجود ‏در ‏محیط ‏کشت ‏به ‏استیک‏‏اسید ‏است. ‏البته ‏این ‏نکته شایان ‏توجه ‏است ‏که ‏مقداری ‏از ‏محصول ‏تولیدی، ‏پس ‏از ‏یک ‏بازه ‏زمانی ‏و ‏به ‏علت ‏کمبود ‏منابع ‏انرژی ‏در ‏محیط ‏توسط ‏باکتری ‏مصرف ‏می‏شود. ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏استونیتریل ‏در ‏زمان ‏69/3 ‏دقیقه ‏پس ‏از ‏تزریق، ‏نشان‏دهنده ‏مصرف ‏تدریجی ‏این ‏ماده ‏در ‏طی ‏زمان ‏انکوباسیون ‏و ‏از ‏طرفی ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏استیک‏‏اسید ‏در ‏زمان ‏39/5، ‏تولید ‏این ‏محصول ‏را ‏به ‏شکل ‏تدریجی ‏نشان ‏می‏دهد. ‏به‏‏طور ‏کلی، ‏در ‏طی ‏یک ‏تحلیل ‏فعالیت ‏آنزیمی، ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏سوبسترا ‏و ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏محصول ‏تولیدی ‏در ‏مقایسه ‏با ‏زمان ‏خروج ‏مواد ‏استاندارد ‏تزریق ‏شده، ‏از ‏روند ‏درست ‏تجزیه ‏خبر ‏می‏دهد ‏که ‏این ‏امر ‏در ‏مورد ‏سودوموناس ‏FA8 ‏طبق ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏در ‏16 ‏ساعت ‏اولیه ‏سنجش ‏به ‏دست ‏آمده ‏است ‏و ‏تا ‏زمان ‏48 ‏ساعت ‏ادامه ‏دارد. ‏سودوموناس ‏FA8 ‏در ‏زمان ‏16 ‏ساعت ‏اولیه، ‏به ‏میزان ‏5 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏از ‏تجزیه ‏7 ‏درصد ‏استونیتریل ‏تولید ‏کرده ‏است ‏که ‏در ‏زمان ‏30 ‏ساعت ‏این ‏مقدار ‏به ‏16 ‏درصد ‏محصول ‏از ‏73 ‏درصد ‏سوبسترا ‏رسیده ‏است. ‏در ‏پایان، ‏بررسی ‏فعالیت ‏آنزیم ‏و ‏تولید ‏محصول ‏تنها ‏23 ‏درصد ‏استونیتریل ‏باقی ‏مانده ‏است ‏و ‏باکتری ‏توانسته ‏است ‏با ‏تجزیه ‏77 ‏درصد ‏استونیتریل، ‏58 ‏درصد ‏استیک‏‏اسید ‏تولید ‏کند ‏که ‏به ‏نوبه ‏خود ‏عدد در خور ‏توجهی ‏است ‏و ‏توانایی ‏بالقوه ‏باکتری ‏در ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏را ‏نشان ‏می‏دهد ‏(شکل ‏3). ‏بنابراین، ‏باکتری ‏در ‏بازه‏ ‏زمانی ‏30 تا 48 ساعت ‏بیش‏ترین‏ ‏فعالیت ‏تغییر ‏شکل ‏زیستی ‏استونیتریل ‏را داشته است. ‏


 

 

 

 

 

شکل 3- ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏و ‏تولید ‏استیک‏‏اسید ‏توسط ‏سویه ‏سودوموناس ‏FA8. ‏الف) ‏استونیتریل ‏استاندارد ‏در ‏زمان ‏خروج ‏69/3 ‏دقیقه. ‏ب) ‏استیک‏‏اسید ‏استاندارد ‏در ‏زمان ‏خروج ‏39/5 ‏دقیقه. ‏پ) ‏نمونه ‏16 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏92 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏5 ‏درصد. ‏ج) ‏نمونه ‏30 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏27 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏16 ‏درصد. ‏د) ‏نمونه ‏48 ‏ساعت، ‏استونیتریل ‏23 ‏درصد ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏58 ‏درصد. ‏


بحث ‏و ‏نتیجه‏‏گیری. ‏

در ‏این ‏پژوهش ‏از ‏میان ‏سه ‏جدایه، ‏سودوموناس ‏FA8 ‏با ‏ایجاد ‏بیش‏ترین‏ ‏قطر ‏هاله ‏و ‏شدت ‏رنگ ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏به ‏آمونیاک ‏و ‏استیک‏‏اسید ‏در ‏محیط ‏حداقل ‏نمک‏های ‏معدنی، ‏جداسازی ‏و ‏شناسایی ‏شد. ‏آمونیاک ‏محصول ‏اصلی ‏تجزیه ‏ترکیبات ‏نیتریلی ‏است. ‏اگر ‏باکتری ‏قادر ‏به ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏باشد ‏با ‏تبدیل ‏آن ‏به ‏استیک‏اسید ‏و ‏آمونیاک، ‏باعث ‏تجمع ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏و ‏قلیایی ‏شدن ‏اسیدیته ‏و ‏تغییر ‏رنگ ‏معرف ‏فنل ‏رد ‏از ‏زرد ‏به ‏صورتی ‏می‏شود ‏(13). ‏مقدار ‏آمونیاک ‏تولیدی ‏حاصل ‏از ‏فعالیت ‏آنزیم ‏جدایه ‏در ‏این ‏پژوهش ‏بر ‏اساس ‏روش ‏فنل- هیپوکلریت ‏و ‏دستگاه ‏اسپکتروفتومتر ‏بررسی ‏شد. ‏این ‏مطلب ‏واضح ‏است ‏که ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏آغاز ‏تجمع ‏آمونیاک ‏در ‏محیط ‏کشت ‏است. ‏آمونیاک ‏اضافی ‏در ‏محیط، ‏‏به ‏افزایش ‏اسیدیته ‏محیط ‏از ‏مقدار ‏اولیه ‏آن ‏منجر می‏شود. ‏ناگشوار[lxxxi] ‏و ‏همکاران ‏از ‏تغییر ‏میزان ‏اسیدیته ‏محیط ‏در ‏اثر ‏تجزیه ‏استونیتریل ‏در ‏60 ‏ساعت ‏اول، ‏از ‏مقدار ‏7 ‏به ‏2/9 ‏اشاره کردند ‏(13). ‏این ‏مورد ‏در ‏مورد ‏جدایهFA8 ‏در ‏48 ‏ساعت ‏اولیه‏ ‏رشد ‏از ‏مقدار ‏7 ‏به ‏28/9 ‏به‏دست ‏آمده ‏است. ‏افزایش ‏میزان ‏جذب ‏که ‏در ‏زمان ‏استفاده ‏از ‏سوبسترا ‏در ‏زمان ‏72 ‏ساعت ‏سنجش ‏مشاهده ‏می‏شود، ‏نشانگر ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏علاوه ‏بر ‏تولید ‏آمونیاک ‏است ‏که ‏در ‏حالت ‏عدم ‏حضور ‏سوبسترا ‏دیده ‏نمی‏شود. ‏

بیش‏ترین‏ ‏فعالیت ‏نیتریل ‏هیدرولازی ‏جدایه، ‏در ‏محیط ‏خنثی ‏حاوی ‏گلوکز ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏کربن ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏نیتروژن ‏است. ‏اسیدیته ‏خنثی ‏به ‏عنوان ‏مناسب‏ترین ‏اسیدیته ‏برای ‏تولید ‏آنزیم ‏در ‏بیشتر ‏باکتری‏ها ‏گزارش ‏شده ‏است ‏(22). ‏دانگ[lxxxii] ‏و ‏همکاران ‏گزارش ‏کردند ‏که ‏عصاره ‏مخمر ‏و ‏پپتون ‏از ‏جمله ‏منابع ‏نیتروژن ‏مناسب ‏در ‏جهت ‏افزایش ‏تولید ‏فعالیت ‏آنزیم ‏باکتری ‏رودوکوکوس ‏اریتروپولیس[lxxxiii]ZJB-0910 هستند ‏(23). ‏ناگشوار ‏و ‏همکاران ‏نیز ‏گزارش ‏کردند ‏که ‏مناسب‏ترین ‏تولید ‏آنزیم ‏آلکالیژنز ‏فکالیس ‏MTCC10757[lxxxiv]، ‏در ‏زمان ‏استفاده ‏از ‏گلوکز ‏به ‏عنوان ‏منبع ‏کربن ‏است ‏(19). ‏کروماتوگرافی ‏گازییکی ‏از ‏روش‏های ‏فیزیکی برای ‏جداسازی ‏و ‏خالص‏سازی ‏مواد ‏فرار ‏است. ‏استونیتریل ‏و ‏محصولات ‏حاصل ‏از ‏تجزیه ‏آن ‏از ‏جمله ‏مواد ‏فرار ‏محسوب ‏می‏شوند ‏که ‏سنجش ‏دقیق ‏مقدار ‏مصرفی ‏و ‏تولیدی ‏آن‏ها ‏به ‏کمک ‏روش ‏کروماتوگرافی ‏بسیار ‏توصیه ‏می‏شود (21). ‏در ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏از ‏تحلیل، ‏کاهش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏سوبسترا ‏و ‏افزایش ‏مساحت ‏زیر ‏منحنی ‏در ‏مورد ‏محصول ‏تولیدی ‏در ‏مقایسه ‏با ‏زمان ‏خروج ‏مواد ‏استاندارد ‏تزریق ‏شده، ‏از ‏روند ‏درست ‏تجزیه ‏خبر ‏‏می‏دهد ‏که ‏این ‏امر ‏در ‏مورد ‏جدایه ‏FA8 ‏طبق ‏نتایج ‏به ‏دست ‏‏آمده ‏در ‏طی ‏48 ‏ساعت ‏سنجش ‏به ‏دست ‏آمده ‏است. ‏نتایج ‏به ‏دست ‏آمده ‏از ‏کروماتوگرام ‏حاصل ‏نشان ‏می‏دهد ‏که ‏این ‏جدایه ‏بیش‏ترین‏ ‏درصد ‏تولید ‏استیک‏‏اسید ‏(58 درصد) ‏را ‏با ‏تجزیه ‏77 ‏درصد ‏استونیتریل ‏در ‏زمان ‏30 ‏تا ‏48 ‏انکوباسیون ‏را ‏نشان ‏می‏دهد ‏که ‏به ‏نوبه ‏خود ‏عدد ‏در خور ‏توجهی ‏است ‏و ‏نشان‏دهنده ‏افزایش ‏فعالیت ‏آنزیمی ‏در ‏این ‏بازه ‏است. ‏

استفاده ‏باکتری ‏سودوموناس ‏FA8 ‏از ‏مواد ‏ارزان ‏و ‏قابل ‏دسترس ‏همچون ‏گلوکز ‏و ‏عصاره ‏مخمر ‏در ‏محیط ‏و ‏تولید ‏آنزیم ‏با ‏فعالیت ‏بالا ‏از ‏جمله ‏ویژگی‏هایی ‏است ‏که ‏این ‏جدایه ‏را ‏در ‏مباحث ‏بیوتکنولوژی ‏شایان ‏توجه ‏می‏سازد. ‏با ‏توجه ‏به ‏ویژگی‏های ‏باکتری ‏و ‏پتانسیل ‏بالای ‏آن ‏در ‏تولید ‏آنزیم، ‏این ‏باکتری ‏می‏تواند ‏ضمن ‏پاک‏سازی ‏آلاینده‏های ‏زیست‏محیطی ‏در ‏تولید ‏زیستی ‏ترکیبات ‏با‏ ‏ارزش ‏دارویی ‏و ‏صنعتی ‏نیز ‏استفاده ‏شود. ‏

تشکر ‏و ‏قدردانی

از ‏معاونت ‏پژوهشی ‏دانشگاه ‏شهید ‏باهنر ‏کرمان، ‏تشکر و قدردانی می‏شود.



[1]- Nitriles

[2]- Cyanoglycoside

[3]- Cyanolipid

[4]- Indole-3-acetonitrile

[5]- β-cyano-L-alanine

[6]- Ketone

[7]- Aldehydes

[8]- HCN

[9]- Nitrile hydrolases

[10]- Nitrilase

[11]- Nitrile hydratase

[12]- Amidase

[13]- Nicotinamide

[14]- 5-cyanovaleramide

[15]- Acrylamide

[16]- Nitrile aminohydrolase

[17]- Pseudomonas

[18]- Indole-3-acetic acid

[19]- Auxin

[20]- Nicotinic acid

[21]- Niacin

[22]- 3-cyanopyridine

[23]- R- (-) -mandelic acid

[24]- Mandelonitrile

[25]- Acinetobacter

[26]- Rhodococcus

[27]- Klebsiella

[28]- Arthrobacter

[29]- Corynebacterium

[30]- Nocardia

[31]- Acetonitrile

[32]- Pseudomonas otitidis FA8

[33]- Sigma Aldrich

[34]- The polymerase chain reaction

[35]- Merck

[36]- Bioneer

[37]- Mineral Salts Medium

[38]- K2HPO4

[39]- KH2PO4

[40]- MgSO4

[41]- MnSO4

[42]- CaCl2

[43]- FeSO4

[44]- Na2MoO4

[45]- HCl

[46]- NaOH

[47]- Agar

[48]- Phenol red

[49]- Triptical Soy Agar

[50]- Gram straining

[51]- Methyl Red

[52]- Voges-Proskauer

[53]- Bergey's Manual of Systematic Bacteriology

[54]- Nutrient agar

[55]- Centrifuge

[56]- Agarose

[57]- Gene Bank

[58]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov (NCBI)

[59]- Accession Number

[60]- MEGA4

[61]- Phenol/hypochlorite

[62]- Phenol

[63]- Sodium nitroprosside

[64]- Sodium hypochlorite

[65]- Spectrophotometer

[66]- Ammonium chloride

[67]- Glucose

[68]- Maltose

[69]- Fructose

[70]- Starch

[71]- Peptone

[72]- Yeast extract

[73]- Gas Chromatography (Agilent, Santa Clara, N6890 CA)

[74]- Capillary (FFAP (30 m, 0.25 mm,0.33 ml))

[75]- Flame Ionization Detector

[76]- Carrier Gas

[77]- Pseudomonas geniculate

[78]- Chromatogram

[79]- Acetamide

[80]- Acetic acid

[lxxxi]- Nageshwar

[lxxxii]- Dong

[lxxxiii]- Rhodococcus erythropolis ZJB-0910

[lxxxiv]- Alcaligenes faecalis MTCC 10757

 

(1)               Knowles CJ., Bunch AW. Microbial cyanide metabolism. Advanced microbialphysiology. London: Academic Press; 1986.

(2)               Vennesland B., Conn EE., Knowles CJ., westley J., Wissing F. Biosynthesis of cyanogenic glycosides. London: Academic Press; 1981.

(3)               Banergee A., SharmaR., Banerjee UC. The nitrile degrading enzymes: current status and future prospects. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 2002; 60 (1- 2): 33- 44.

(4)               He YC., Xu JH., Su JH., Zhou L. Bioproduction of glycolic acid from glycolonitrile with a new bacterial isolate of Alcaligenes sp. ECU0401. Journal of Applied Biochemistry and Biotechnology 2010; 37 (7): 741- 50.

(5)               Vogel AL. Quantitative inorganic analysis including elementary instrumental analysis. 3rd ed. London: Lowe and Bryodne Ltd; 1969.

(6)               Bestwick L., Gronning L., James D., Bones A., Rossiter J. Purification and characterization of a nitrilase from Brassicanapus. Plant Physiology 1993; 89 (43): 611- 18.

(7)               Geronimo MJ., Antoine AD. Metabolism of acetonitrile and propionitrile by Nocardia rhodochrous LL100- 21. Journal of Applied and Environmental Microbiology 1976; 31 (6): 900- 06.

(8)               O’Reilly C., Turner PD. The nitrilase family of CN hydrolysing enzymes a comparative study. Journal of Applied Microbiology. 2003; 95 (6): 1161- 1174.

(9)               Thimann KV., Mahadevan S. Nitrilase; Occurrence, preparation and general properties of the enzyme. Archives of Biochemistry and Biophysics 1964; 105 (1): 133- 41.

(10)           Hook RH., Robinson WG. Ricinine nitrilase II. Purification and properties. Journal of Biological Chemistry 1964; 239 (12): 4263- 7.

(11)           Collins P., Knowles C. The utilization of nitriles and amides by Nocardia rhodochrous. Journal of General Microbiology 1983; 129 (1): 248- 54.

(12)           Bhalla TC., Kumar H. Nocardia globerula NHB-2: a versatile nitrile-degrading organism. Canadian Journal of Microbiology 2005; 51 (8):705- 08.

(13)           Santoshkumar M., Anand S., Nayak O., Anjaneya B. A plate method for screening of bacteria capable of degrading aliphatic nitriles. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2010; 37 (3): 111- 15.

(14)           Leavesley HB., Li L., Prabhakaran K., Borowitz JL., Isom GE. Interaction of cyanide and nitric oxide with cytochrome oxidase: implications for acute cyanide toxicity. Toxicological Sciences 2008; 101 (1): 101- 11.

(15)           Badoei- Dalfard A., Amiri-Bahrami M., Riahi-Madvar A., Karami Z., Ebrahimi M A. Isolation, identification and characterization of organic solvent tolerant protease from Bacillus sp. DAF-01. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (2): 37- 48.

(16)           Kim OS., Cho YJ., Lee K., Yoon SH., Kim M., Na H., et al. Introducing EzTaxon-e: a prokaryotic 16S rRNA gene sequence database with phylotypes that represent uncultured species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2012; 62 (3): 716- 21.

(17)           Edwards U., Rogall T., Blocker H., Emde M., Bottger EC. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. Nucleic Acids Research 1989; 17 (19): 7843- 53.

(18)           Fawcett J K., Scott JE. A rapid and precise method for the determination of urea. Journal of Clinical Pathology 1960; 13 (2): 156- 9.

(19)           Nageshwar YVD., Sheelu G., Shambhu RR., Muluka H., Nooreen M., Malik MS., et al. Optimization of nitrilase production from Alcaligenes faecali MTCC 10757 (IICT-A3): effect of inducers on substrate specificity. Journal of Bioprocess and Biosystems Engineering 2011; 34 (5): 515- 23.

(20)           Jin LQ., Li YF., Liu ZQ., Zheng YG., Shen YC. Characterization of a newly isolated strain Rhodococcus erythropolis ZJB-09149 transforming 2-chloro-3-cyanopyridine to 2- chloronicotinic acid. Journal of New Biotechnology 2011; 28 (6): 610- 615.

(21)           Skoog DA., Holler JA., Nieman TA. Principles of Instrumental Analysis. 5th ed. London: Sanders College; 1999.

(22)           Robinson WG., Hook RH. Ricinine nitrilase. I. Reaction product and substrate specificity. Journal of Biology and Chemistry 1964; 239 (1): 4257- 62.

(23)           Dong HP., Liu ZQ., Zheng YG., Shen YC. Medium optimization for nitrilase production by newly isolated Rhodococcus erythropolis ZJB-0910 using statistical designs. Journal of Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 25 (3): 351- 8.