جداسازی و شناسایی باکتری‏ های تجزیه کننده نفت خام از شکم‏ پا Haustrum scobina‏‏ جمع ‏آوری شده از خلیج فارس (ناحیه ساحلی بندرعباس)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر، کرمان، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر، کرمان، ایران

3 استادیار زیست شناسی دریا، دانشگاه شهید باهنر، کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: تجزیه زیستی یک جایگزین خوب نسبت به روش‏های ‏شیمیایی و فیزیکی برای پاک‏سازی مناطق آلوده به نفت است. عوامل متعددی بر تجزیه زیستی شامل: غلظت نفت خام، تولید بیوسورفکتانت، شوری و زمان انکوباسیون تاثیر می‏گذارند. هدف از پژوهش حاضر، ‏شناسایی و جداسازی باکتری‏های تجزیه کننده نفت از شکم‏پا و بررسی اثر تولید بیوسورفکتانت، غلظت‏های مختلف نفت، زمان انکوباسیون، کشت مخلوط و شوری بر تجزیه نفت توسط باکتری‏های تجزیه کننده است. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ ها: در این پژوهش، از آب و شکم‏پایان ‏خلیج فارس نمونه‏برداری شد. برای جداسازی باکترى‏هاى تجزیه کننده نفت خام از نمونه‏های جمع‏آوری شده، محیط کشت ONR7a استفاده شد. سویه‏هایی که رشد و حذف نفت بالاترى داشتند انتخاب و شناسایی شدند. تولید بیوسورفکتانت، اثر غلظت‏های مختلف نفت، زمان انکوباسیون، کشت مخلوط و شوری بر میزان تجزیه زیستی بررسی شد. ‏‏‏
نتایج: در مجموع 6 کلونی که قادر به تجزیه نفت خام بودند، جداسازی شد. 2 سویه بر اساس حذف نفت بیشتر و فعالیت امولسیون‏کنندگی بیشتر انتخاب شد. این سویه‏ها به جنس‏های VibrioوHalomonasتعلق داشتند. فعالیت امولسیون‏کنندگی و میزان تجزیه نفت برای سویه Vibrio alginolyticus به ترتیب 4/58 و 58/67 درصد و برای سویه Halomonas ps به ترتیب 6/11و 44/51 درصد بود. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت سویه‏هایی که دارای فعالیت امولسیون‏کنندگی بیشتری می‏باشند، بیوسورفکتانت بیشتری تولید کرده و قابلیت حذف نفت بالاتری دارند. میزان رشد و تجزیه نفت با طولانی شدن دوره انکوباسیون، افزایش یافته است. همچنین، مشاهده شد کشت مخلوط سویه‏های ‏VibrioوHalomonas میزان بالاتری از تجزیه را نسبت به کشت آن‏ها ‏به تنهایی دارد و با افزایش غلظت نفت از 5/2 درصد به بعد میزان رشد باکتری و تجزیه نفت کاسته شده است. بهینه رشد این سویه در 20 تا80 گرم در لیتر سدیم‏کلرید است و در غلظت‏های بالاتر نمک، میزان رشد کاهش یافته است. ‏‏‏
بحث و نتیجه‏ گیری: بررسی‏های انجام شده نشان داد که باکتری‏های موجود در خلیج فارس از تنوع زیاد با توان تجزیه نفت بالا برخوردار هستند و می‏توان از آن‏ها ‏برای‏ پاک‏سازی مناطق دریایی آلوده به نفت استفاده کرد. 

کلیدواژه‌ها


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of crude oil degrading bacteria from gastropod Haustrum scobina collected from Persian Gulf (Bandar Abbas Shoreline provenance)

نویسندگان [English]

  • Zinab Bayat 1
  • Mehdi Hassanshahian 2
  • Majid Askari 3
1 M.Sc. of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
3 Assistant Professor of Marine Biology, Shahid Bahonar University of Kerman, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction:Biodegradation is a good alternative rather than chemical and physical methods for cleaning oil contaminated areas. Several factors like crude oil concentration, biosurfactant production, salinity and incubation time affect the biodegradation.
Materials and methods: In this study, seawater sample and gastropod were collected from Persian Gulf. To isolate oil degrading bacteria from collected samples, ONR7a medium was used. The strains that had more growth and higher oil removal were selected and identified. The factors such as the effect of different concentrations of oil, incubation time, mixed cultures and salinity on the biodegradation were investigated.
Results: Six crude oil degrading bacteria were isolated. Between these bacteria 2 strains were selected based on higher oil removal. These strains belonged to the genus Vibrio and Halomonas.Strains with higher Emulsification activity produce more biosurfactant and have higher oil biodegradation. Growth and oil degradation have increment pattern by prolonging the incubation time. Mixed culture of Vibrio and Halomonas strains have higher rates of degradation rather than culturing with one of them. Increase in crudeoil concentration to 2.5% caused reduction in growth of bacteria and degradation of oil.
Discussion and conclusion: The results of this study show that crude oil degrading bacteria have high diversity in Persian Gulf. These bacteria have higher capability for oil degradation thus they can be used for remediation of oil contaminated areas.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biodegradation
  • gastropod
  • Oil degrading bacteria

مقدمه.

روش‏های حذف آلودگی‏های نفتی در آب، خاک و هوا به سه روش فیزیکی، شیمیایی و زیستی انجام می‏شود. از میان روش‏های فیزیکی می‏توان به ابزارهای جمع‏آوری کننده نظیر اسکیمر اشاره کرد. در روش شیمیایی اکسید‏کننده‏های شیمیایی به محیط افزوده می‏شوند که پرهزینه‏اند و می‏توانند به تولید مواد جانبی خطرناک‏تر ‏منجر شوند (1). روش‏های ‏زیستی نسبت به روش‏های فیزیکی و شیمیایی در حذف نفت مزایایی دارند، به طوری که امکان تجزیه زیستی درونی نفت به‏وسیله میکروارگانیسم‌ها را فراهم می‌سازند. تجزیه زیستی مشتقات نفتی در محیط‏های ‏آلوده موثرتر، قوی‌تر و از نظر اقتصادی مقرون به صرفه‌تر از روش‏های ‏فیزیکی- شیمیایی است. مکانیسم کلی تجزیه زیستی به این شکل است که میکروب‏ها و باکتری‏ها به قطرات نفتی حمله‏ور شده و پس از در بر گرفتن آن‏ها ‏(به اصطلاح خوردن قطرات)، تجزیه و هضم اجزا آغاز شده و در نهایت، آب و گاز‏های بی‏خطری چون دی‏اکسید‏کربن حاصل می‏شود (2). میکروارگانیسم از مهم‏ترین عوامل تجزیه‏کننده هیدروکربن‏های نفتی بوده و عملکرد آن‏ها ‏تحت تأثیر عوامل محیطی است. برای‏ دستیابی به کارایی بالای تجزیه زیستی، شناخت شرایط بهینه مصرف این ترکیبات توسط باکتری‏های خالص‏شده مهم است (3).

پژوهش‏های کمی به ارتباط بین موجودات پریاخته پیچیده مثل نرم‏تنان و پروکاریوت‌ها در اکوسیستم‏های ‏آلوده پرداخته‏اند. نرم‏تنان اعماق دریا به طور مستقیم از رسوبات تازه ته‏نشین شده تغذیه و زندگی می‏کنند و بنابراین، در تماس مستقیم با مواد آلوده کننده وارد شده به آب هستند و از طرفی با واسطه معلق‏خواری با باکتری‏های جمع شده در رسوبات آلوده شوند. در واقع، حجم زیادی از آب را برای تامین مواد غذایی مورد نیازشان فیلتر و اجزای محلول نفتی و ذرات حاوی هیدروکربن‏های ‏موجود در ستون آب‏های ‏آلوده به نفت را جمع‌آوری می‌کنند. همچنین، ممکن است روی باکتریوپلانکتون‌ها در ستون آب نیز تاثیر گذارند (4). شکم‏پایان ‏از جمله موجوداتی هستند که باکتری‏ها در آبشش آن‏ها ‏حضور دارند و ترکیبات کاهش یافته مانند هیدروژن سولفید را متابولیزه و کربن غیر آلی را به کربن آلی تثبیت می‏کنند که ممکن است به‏وسیله میزبان استفاده شود (5).

هدف از پژوهش حاضر، جداسازی و شناسایی باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت خام در برخی شکم‏پایان ‏خلیج فارس، بررسی تنوع جنس و گونه‌ای در باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت خام همراه با شکم‏پا و بررسی برخى عوامل محیطى بر میزان تجزیه زیستى نفت خام توسط سویه‏هاى بومى دریایی جداسازى شده از خلیج فارس است‏.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

نمونه برداری: به منظور جداسازی باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت خام، نمونه‏های آب دریا و شکم‏پا Haustrum scobina‏‏ در اسکله حقانی قشم جمع‏آوری شد (شکل 1). نمونه آب دریا از عمق 15 سانتی‏متری و شکم‏پا نیز از مناطق ساحلی که احتمال حضور نفت وجود داشت و همچنین، از عمق 10 تا 15 متری به‏وسیله غواصی جمع‏آوری، در ظروف استریل و روی یخ به آزمایشگاه منتقل و سپس، در دمای 4درجهسانتی‏گراد‏ تا انجام تحلیل‏‏های بعدی قرار داده شد (6).

 

شکل 1- Haustrum scobina‏‏

 

جداسازی و شناسایی باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت: برای جداسازی و غربال‏گری باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت از محیط کشت اختصاصی ONRبا 1درصد نفت خام استفاده شد. از نمونه‏های ‏آب به میزان 5 میلی‏لیتر و محلول شکم‏پا 5 میلی‏لیتر به داخل این محیط برای‏ غنی‏سازی اولیه تلقیح شد. پس از دو پاساژ متوالی کلونی‏ها روی محیط کشت مارین آگار خالص‏سازی ‏شدند. سویه‏های ‏باکتریایی که بیش‏ترین چگالی نوری (OD) در 600 نانومتر داشتند برای شناسایی غربال‏گری شدند. ترکیبات محیط ONR در یک لیتر به شرح زیر است: محلول اول شامل: سدیم‏کلرید (40 گرم)، سدیم سولفات (8/3 گرم)، سدیم بی کربنات (031/0 گرم)، پتاسیم کلرید (72/0 گرم)، سدیم برمید (083/0گرم)، سدیم فلورید (0026/0 گرم)، سدیم مونوفسفات (089/0 گرم)، اسید بوریک (27/0 گرم) و آمونیوم کلرید (27/0 گرم) و محلول دوم شامل کلسیم کلرید (46/1 گرم)، منیزیم کلرید (18/11 گرم)، استرانسیوم کلرید (024/0 گرم)، آهن کلرید (002/0گرم) و تریس (3/1 گرم) است. اسیدیته محلول در 6/7 تنظیم شد (7).

برای شناسایی بیوشیمیایی باکتری‏های ‏جدا شده از منابع یاد شده، از آزمایش‏های ‏اولیه زیر رنگ‏آمیزی گرم، شکل میکروسکوپی، شکل کلونی، حرکت، اکسیداز، کاتالاز، اکسایش/ تخمیر (O/F)، احیای نیترات، تولید H2S، تولید اندول و آزمون TSI استفاده شد (8).

شناسایی مولکولی:شناسایی مولکولی با تکثیر قسمتی از ژن 16S rDNA توسط پرایمرهای عمومی

Forward Primer:

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' و

Reverse Primer:

5'-TACGYTACCTTGTTACGACTT -3'

 انجام شد (7). برنامه PCR برای تکثیر ژن به این شکل بود: دمای دناتوراسیون 94 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت یک دقیقه، دمای اتصال پرایمرها 55 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت یک دقیقه و دمای تکثیر 72 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 1 دقیقه و تعداد سیکل‌ها 35 است. محصول حاصل از PCR در ژل آگاروز 1 درصد بارگذاری شد و سپس، باند bp 1400 از ژل آگاروز طبق دستورکار کیت فرمنتاژ (K0513) استخراج و برای‏ تعیین توالی فرستاده شد. نتایج حاصل از تعیین توالی در بانک‏های ‏ژنی بلاست و همولوژی آن‏ها ‏بررسی شد و نزدیکی بالاتر از 98 درصد به عنوان جنس و گونه باکتری مجهول لحاظ شد (9).

سنجش حذف نفت خام توسط باکتری‏های ‏جدا شده

روش اسپکتروفتومتری: میزان حذف نفت خام به‏وسیله حل کردن مقدار نفت باقیمانده محیط کشت در دی کلرو متان و سپس، خواندن کدورت نفت استخراج شده در مقابل شاهد (محیط کشت ONR حاوی یک درصد نفت بدون تلقیح باکتری) در طول موج 420 نانومتر تعیین شد (10).

روش گاز کروماتوگرافی[1] (GC): سویه‌ها در محیط کشت ONR حاوی 1 درصد نفت به مدت 15 روز انکوبه شدند. پس از دوره انکوباسیون به محیط کشت 50 میلی‏لیتر DCM افزوده و به قیف جداکننده برای‏ جداسازی فاز آلی از فاز آبی منتقل شد. سپس، فاز آلی که حاوی نفت حل شده در DCM بود، درون ارلن ریخته، 3 گرم سدیم سولفات برای‏ جذب آب باقی مانده به ارلن اضافه و به مدت یک شب در دمای اتاق انکوبه شد. سپس، محتویات ارلن از کاغذ واتمن شماره 1 عبور داده شد و در دمای محیط برای‏ تبخیر DCM قرار گرفت. پس از تبخیر DCM، دوباره 3 میکرولیتر DCM به یک میکرولیتر نفت باقی مانده اضافه شد و با دستگاه GC تحلیل‏‏ شد (11).

برنامه GC به این شکل بود:

ستون: varian capillary column cp- sil5cB
0.32 mm × 0.1 μm) (30 m ×
دتکتور:FID، گاز حامل: هلیم، دمای اولیه: 100 درجه سانتی‏گراد‏ برای 1 دقیقه، دمای انتقال: 300 درجه سانتی‏گراد‏، دمای تزریق: 280 درجه سانتی‏گراد‏، دمای نگهداری ستون: 70 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 2 دقیقه سپس، 290 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 7 دقیقه، دمای نهایی: 290 درجه سانتی‏گراد‏ و جریان عبوری 3 میلی‏لیتر بر دقیقه بود. پیک‏های ‏حاصل از GC با شاهد مقایسه و درصد تجزیه برای هر سویه محاسبه شد.

سنجش هیدروفوبیسیته سطح سلولی[2] (BATH): ابتدا سوسپانسیون باکتریایی در بافر تهیه شد. ترکیبات بافر به شرح زیر است (گرم بر لیتر):

22 گرم دی پتاسیم هیدروژن فسفات (K2HPO4
22 گرم پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4
26/7 گرم اوره و 2/0 گرم منیزیم سولفات (MgSO4. 7H2O).

سپس، 200 میکرولیتر هیدروکربن هگزا دکان به آن اضافه شده و پس از 2 دقیقه همزنی، 45 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شد تا فاز هیدروکربنی جدا شود. کدورت فاز آبی قبل و پس از تیمار اندازه گیری شد. نتایج به شکل جذب فاز آبی پس از تیمار نسبت به جذب اولیه سوسپانسیون باکتریایی محاسبه شد (12).

فعالیت امولسیونه کنندگی[3] (E24): باکتری‏های ‏تجزیه کننده ابتدا در محیط نوترینت براث به همراه 4 درصد نمک کشت داده شدند و پس از آن که باکتری‌ها به رشد لگاریتمی رسیدند، میزان 4 میلی‏لیتر از محیط کشت درون لوله آزمایش حاوی 6 میلی‏لیتر از نفت سفید استریل ریخته و با سرعت بالا همزنی شد. سپس، به مدت 24 ساعت به شکل ساکن در دمای محیط قرار داده شد، پس از 24 ساعت فعالیت امولسیونه‏کنندگی با فرمول 1 به دست آمد (13).

×100

ارتفاع ناحیه امولسیون شده

E24=

کل ارتفاع مایع

فرمول 1- فعالیت امولسیون کنندگی

 

آزمون هالوفیته: باکتری‏ها از نظر هالوفیل یا هالوترانت بودن و همچنین، غلظت بهینه نمک آزمایش شدند. برای این منظور کشت 48 ساعته از باکتری‏ها در محیط مارین براث تهیه و کدورت‏شان با خواندن جذب نوری (OD600=2) تعیین شد. سپس، به محیط ONR حاوی 1 تا 200 گرم در لیتر سدیم‏کلرید و بدون سدیم‏کلرید تلقیح و در انکوباتور گذاشته شد. رشد باکتری‏ها از نظر ایجاد کدورت در محیط کشت بررسی شد (14).

اثر غلظت: سویه‌های Halomonas sp. isolate BHA16 وVibrio alginolyticus isolate BHA 17 در محیط ONR حاوی غلظت‏های ‏1 تا 5/5 درصد تلقیح شدند. پس از 15 روز انکوباسیون رشد باکتری‌ها و میزان حذف نفت به شکل کیفی و تعداد باکتری‌ها به شکل CFU/gram محاسبه شد (15).

اثر زمان: سویه‌هایHalomonas sp. isolate BHA16وVibrio alginolyticus isolate BHA 17در محیط کشت ONR به همراه نفت به مدت یک ماه انکوبه شدند و سپس، میزان رشد و حذف نفت خام محاسبه شد (6). 
اثر کشت مخلوط: سویه‌های Halomonas sp. isolate BHA16 وVibrio alginolyticus isolate BHA 17به مدت 15 روز در محیط کشت ONR به همراه نفت انکوبه شدند و سپس میزان رشد و حذف نفت خام محاسبه شد (16). 

نتایج.

جداسازی باکتری‏های ‏تجزیه کننده‌ نفت خام: در پژوهش حاضر ‏6 سویه از نمونه‏های ‏شکم‏پا و آب ناحیه اسکله بهمن قشم جداسازی شد که 4 سویه مربوط به شکم‏پایان ‏است. سویه‏های ‏جداسازی شده در محیط ONR به همراه نفت به عنوان تنها منبع کربن کشت داده شدند. 2 سویه که قادر به رشد بالاتر در این محیط بودند، به عنوان سویه‏های ‏برتر تجزیه کننده نفت برای مطالعات بعدی انتخاب شدند. در جدول 1 ویژگی‏های این باکتری‌ها آمده است.

شناسایی بیوشیمیایی: برای شناسایی اولیه سویه‏ها یک‏سری آزمون‏های ‏بیوشیمیایی روی 2 سویه غربال شده، انجام شد که در جدول 2 آورده شده است.

 

 

جدول 1- ویژگی‏های باکتری‏های ‏تجزیه کننده‌ نفت خام جداسازی شده

سویه

نمونه جداسازی شده

شکل باکتری و واکنش گرم

ویژگی‏های کلونی

آزمون کیفی

OD600

HA 1-1

آب

میله‌ای بلند، گرم منفی

سفید، متوسط

+

44/0

HA 1-2

آب

کوکوباسیل، گرم منفی

سفید، درشت

+

50/0

HA 2-1

شکم پا

کوکوباسیل، گرم منفی

سفید، متوسط

+

83/0

HA 2-2

شکم پا

کوکسی، گرم منفی

سفید، ریز

+++

20/1

HA 2-3

شکم پا

میله‌ای، گرم منفی

سفید، درشت

++

37/0

HA 2-4

شکم پا

کوکسی، گرم منفی

سفید، موکوئیدی

++++

32/2

 

جدول 2- شناسایی بیوشیمیایی

نام سویه

O/F

اکسیداز

کاتالاز

حرکت

تولید H2S

تولید ایندول

احیای نیترات

آزمون TSI

HA 2-2

-/-

+

+

_

_

_

+

قلیا/ قلیا

HA 2-4

+/-

+

+

+

_

_

_

اسید/اسید

 

جدول 3- توالی به دست آمده برای سویه HA 2-2و HA 2-4

نام سویه

شناسایی سویه

شماره دستیابی

HA 2-2

Halomonas sp. isolate BHA16

LK391617

HA 2-4

Vibrio alginolyticus isolate BHA 17

LK391618

 

 


شناسایی مولکولی: شناسایی مولکولی باکتری‏های ‏قوی در تجزیه نفت خام با تکثیر قسمتی از ناحیه ژنی 16S rDNA با پرایمرهای ویژه این ژن انجام شد. سپس، محصول bp1400 حاصل از PCR از ژل استخراج، خالص‏سازی و برای‏ تعیین توالی فرستاده شد. توالی‏های ‏به دست آمده در بانک‏های ‏ژنی بلاست شد و بالاترین همولوژی (بالاتر از 98 درصد) به عنوان جنس و گونه باکتری تعیین شد. توالی به دست آمده و بالاترین همسانی پس از بلاست کردن توالی به‏دست آمده در بانک‏های ‏ژنی به همراه شماره دستیابی توالی این سویه‌ها در پایگاه EMBL در جدول 3 آمده است. درخت فیلوژنی این دو سویه به روش Neighborjoiningو به کمک نرم افزار Mega4 رسم شد. موقعیت فیلوژنی این دوسویه در شکل‏های 2 و3 آمده است.


 

شکل 2- درخت فیلوژنی جنس Halomonas به روش Neighborjoiningو به کمک نرم افزار Mega4

 

 

شکل 3- درخت فیلوژنی جنس Vibrio به روش Neighborjoining و به کمک نرم افزار Mega4


حذف نفت خام توسط سویه‌ها.

روش اسپکتروفتومتری: هر دوسویه بر روی غلظت یک درصد نفت خام رشد داده شدند. پس از 15 روز میزان حذف نفت خام به‏وسیله سویه‏ها به روش اسپکتروفتومتری سنجش شد. به‏طوری که سویه Halomonassp. isolateBHA16، 02/58 درصد و سویه VibrioalginolyticusisolateBHA17، 50 درصد نفت را تجزیه کردند.

روش کروماتوگرافی: سویه‌ها به مدت 15 روز در محیط کشت ONR حاوی یک درصد نفت خام انکوبه شدند. پس از استخراج نفت باقیمانده با دی کلرومتان، درصد تجزیه نفت توسط هر سویه با استفاده از تحلیل‏‏ گاز کروماتوگرافی از نفت باقی مانده در محیط کشت برای هر سویه انجام شد. ستونGC به کار رفته با دکتور FID بود. حلال به کار رفته دی‏کلرومتان و دمای نگهداری ستون برای 17 دقیقه است. گاز حامل هلیم و جریان عبوری 3 میلی‏لیتر بر دقیقه بود. در شکل‏های ‏زیر نتایج حاصل از گاز کروماتوگرافی به همراه طیف مربوط به هر سویه آمده است. همان‏طور که در شکل‏های 5 و 6 دیده می‏شود، طیف‏های کروماتوگرافی سویه‏ها نسبت به شاهد (شکل 4) کمتر شده که نشان دهنده تجزیه و حذف ترکیبات نفتی است. درصد تجزیه نفت خام توسط هر یک از سویه‏ها با محاسبه سطح زیر منحنی طیف‏های ‏گاز کروماتوگرافی حاصل شده از هر سویه با کسر نمودن پیک حلال به‏دست آمد. نتایج نشان داد که سویه‏های Halomonassp. isolate BHA16و Vibrio alginolyticus isolate BHA 17 توانستند به ترتیب 44/51 و 58/67 درصد، نفت موجود در محیط کشت را تجزیه کنند.

 

 

شکل 4- طیف گاز کروماتوگرافی شاهد (نفت خام بدون تلقیح باکتری)

 

شکل 5- طیف گاز کروماتوگرافی سویه Halomonas sp. isolate BHA16

 

شکل 6- طیف گاز کروماتوگرافی سویه Vibrio alginolyticus isolate BHA 17

 


فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و هیدروفوبیسیته سطح سلولی (BATH): فعالیت امولسیون کنندگی (E24) و هیدروفوبیسیته سطح سلولی (BATH) بررسی شد. نتایج به دست آمده از این دو آزمایش برای سویه Halomonassp. isolate BHA16، 6/11 و 10 درصد و برای سویه Vibrio alginolyticus isolate BHA 17، 4/58 و 5/16 درصد است.

آزمون هالوفیلیته: رشد کیفی سویه‏های باکتریایی در غلظت‏های 0 تا 200 گرم در لیتر سدیم‏کلرید در محیط کشت ONRدر جدول 4 آورده شده است. بر اساس اطلاعات جدول این دو سویه هالوفیل (به سویه‏هایی گفته می‏شود که در محیط‏های حاوی حداقل 2 درصد سدیم‏کلرید قادر به رشد باشند) بوده و بهینه رشد آن‏ها ‏در 20 تا80 گرم در لیتر سدیم‏کلرید است و در غلظت‏های بالاتر نمک، میزان رشد کاهش یافته است.

میزان رشد و حذف نفت توسط سویه‌ها در غلظت‏های ‏مختلف نفت: رشد باکتری‌ها و میزان حذف نفت در غلظت‏های ‏1 تا 5/5 درصد نفت به شکل کیفی محاسبه شد. جدول 5 نشان دهنده نتایج حاصل از رشد باکتری در OD600، جدول 6 نشان دهنده نتایج حاصل از میزان حذف نفت است و در جدول 7 تعداد باکتری‌ها به شکل CFU/gram آمده است. هر دو سویه‌ در غلظت 5/2 در صد نفت خام بهترین رشد را داشته و با افزایش غلظت‏های ‏بیشتر رشدشان کمتر شده به طوری‏که کم‏ترین میزان حذف نفت خام در غلظت 5/5 درصد است.

 

 

جدول 4- رشد کیفی سویه‏ها در غلظت‏های صفر تا 200 گرم در لیتر سدیم‏کلرید

سویه

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

BHA16

_

++

++++

+++

+++

++

++

++

+

+

+

BHA17

_

++++

++++

+++

+++

++

++

++

+

+

+

 

جدول 5- اثر غلظت‏های ‏مختلف نفت خام بر رشد باکتری (OD600)

غلظت نفت

سویه باکتری

1 درصد

5/2 درصد

4 درصد

5/5 درصد

Halomonas sp. isolate BHA16

30/1

86/1

16/0

08/0

Vibrio alginolyticus isolate BHA 17

58/0

73/0

24/0

18/0

جدول 6- اثر غلظت‏های ‏مختلف نفت خام بر میزان حذف نفت خام

غلظت نفت

سویه باکتری

1 درصد

5/2 درصد

4 درصد

5/5 درصد

Halomonas sp. isolate BHA16

08/76

95/86

4/3

03/0

Vibrio alginolyticus isolate BHA 17

23/81

32/87

37/21

03/2

 

جدول 7- اثر غلظت‏های ‏مختلف نفت خام بر تعداد باکتری‌ها

غلظت نفت

سویه باکتری

1 درصد

5/2 درصد

4 درصد

5/5 درصد

Halomonas sp. isolate BHA16

107×83/3

107×17/2

107×23/3

105×5/5

Vibrio alginolyticus isolate BHA 17

107×7

107×9

104×3

104×2

 


اثر زمان: میزان رشد، CFU/gram و حذف نفت خام توسط سویه در مدت یک ماه انکوباسیون محاسبه شد. نتایج میزان رشد (OD)، درصد تجزیه و CFU/gram برای سویه Halomonas sp. isolate BHA16، به ترتیب 43/1، 11/79، 107×04/9 و برای سویه Vibrio alginolyticus isolate BHA 17، 48/2، 64/73، 107×87/8 مشاهده شد. با توجه به نتایج به دست آمده میزان رشد و حذف نفت خام با افزایش زمان ماند بیشتر شده است.

اثر کشت مخلوط: میزان رشد، CFU/gram و حذف نفت خام در کشت مخلوطی از سویه‏ها محاسبه شد. به‏طوری که میزان رشد (OD)، درصد تجزیه و CFU/gram مخلوط دو سویه به ترتیب 1/81، 68 و 106×72/2 است. بنا بر نتایج به دست آمده میزان رشد و تجزیه در مخلوط سویه‏ها در مقایسه با هر کدام از سویه‏ ها به تنهایی بیشتر شده است.

 
بحث و نتیجه‏‏گیری.

مطالعات بسیاری روی جداسازی باکتری‏های ‏تجزیه کننده نفت از محیط‏های ‏گوناگون شامل: خشکی و دریایی انجام شده است.

کواریتی[4] و همکاران تعدادی باکتری گرم مثبت تجزیه کننده آلکان از آب‏های ‏آلوده به هیدروکربن مدیترانه جداسازی کردند و بر این باور بودند که باکتری‌ها باید مکانیسم معینی برای به دست آوردن و استفاده از این سوبسترای هیدروکربنی داشته باشند (17). همچنین، گزارشاتی از جداسازی سویه‌هایی از باکتری متعلق به جنس‏های Pseudomonas، Moraxella، Marinobacter‏،Flavobacterium،Cycloclasticus، Sphingomonas وVibrioاز آب‏های ‏دریایی داده شده است (18). حسن شاهیان[5] و همکاران نیز، 28 سویه باکتریایی و دو سویه مخمری تجزیه کننده نفت از محیط‏های ‏دریایی ایران شامل خلیج فارس و دریای خزر شرح دادند (7).

 

در پژوهش ‏حاضر، 6 سویه تجزیه کننده نفت از نمونه‏های ‏شکم‏پا و آب ناحیه اسکله حقانی بندر عباس جداسازی شد که در نهایت، با سنجش‏های غربال‏گری 2 سویه باکتریایی انتخاب شد و پس از شناسایی مولکولی مشخص شد که مربوط به جنس Halomonas وVibrioاست.

در این پژوهش، ‏برخی از شرایطی که روی تجزیه نفت تاثیر گذار هستند، بررسی شد. در پژوهش‏های بسیاری به اثر هر یک از این شرایط پرداخته شده است.

حسن شاهیان و همکاران اثر غلظت‏های ‏1 تا 4 درصد نفت را بر روی میزان تجزیه بررسی کردند. بر اساس مطالعه انجام شده ایشان بهترین میزان تجزیه نفت در غلظت 1 درصد نفت انجام می‏شود و غلظت بالای هیدروکربن‏ها باعث پراکنده نشدن نفت در آب، مهار تجزیه زیستی با محدودیت اکسیژن یا نیتروژن و ایجاد اثرات سمی ناشی از هیدروکربن‏های ‏فرار می‌شود (7).

فوزی[vi] و آدوت[vii] گزارش کردند که آلودگی در رسوبات ساحل دریا با غلظت بالاتر از آستانه نفت، به علت محدودیت اکسیژن و مواد غذایی، مانع از تجزیه زیستی نفت می‌شود (19).

در این پژوهش، اثر غلظت‏های ‏1، 5/2، 4 و 5/5 درصد نفت بر میزان رشد و حذف نفت توسط سویه‌ها بررسی شد. که هر دو سویه بیش‏ترین میزان رشد و تجزیه نفت را در غلظت 5/2 درصد داشته و با افزایش غلظت نفت از 5/2 درصد به بعد، میزان رشد باکتری و تجزیه نفت کاسته شده است.

یوسال[viii] و تورکمان[ix] مدت زمان انکوباسیون را مطالعه کردند. آن‏ها ‏دریافتند که هر چه زمان ماند افزایش یابد، جمعیت میکروبی سیستم بیشتر خواهد شد که این امر به افزایش سنتز آنزیم و کارایی سیستم منجر می‌شود. همچنین، سبب می‌شود میکروب‌ها فرصت بیشتری برای‏ تلقیح و عادت کردن به آلایندگی پیدا کرده و بتوانند درصد بیشتری از ترکیبات را تخریب کنند (20). در این پژوهش، ‏هر دو سویه‌ انتخاب شده به مدت یک ماه در انکوباتور قرار گرفتند و مشاهده شد میزان رشد و تجزیه نفت با طولانی شدن دوره انکوباسیون، افزایش یافته است. 

افزودن میکروارگانیسم به شکل خالص و مخلوط موضوع بسیاری از مقالات بوده است. ستیشکومار[x] و همکاران روی سویه‏های ‏باکتریایی از جنسPseudomonas و Bacillus پژوهش‏هایی انجام دادند. آن‏ها ‏بر این باور بودند که میزان تجزیه نفت در حضور کشت میکروبی مخلوط بیشتر از کشت منفرد است. به طوری که در کشت مخلوط میزان تجزیه 77 درصد و در کشت خالص سویه باکتریایی از جنس Pseudomonas 45 درصد و Bacillus 64 درصد گزارش شده بود (16). طبق نتایج حاصل از این پژوهش ‏در کشت میکروبی منفرد، تجزیه هیدروکربن‌ها به شکل ناقص، در حالی که در کشت میکروبی مخلوط تجزیه به شکل کامل انجام می‏گیرد و درصد تجزیه افزایش می‌یابد. در واقع هنگامی که تجزیه مخلوطی از مواد آلاینده مورد نظر باشد نیز استفاده از مخلوط چند میکروارگانیسم مؤثر است زیرا ممکن است هر یک از اعضای مخلوط در تجزیه یکی یا برخی از مواد آلاینده بیشترین کارایی را داشته باشند.

لدی[xi] و کول ول[xii] گزارش دادند که جمعیت‏های ‏میکروبی مخلوط با ظرفیت کل آنزیمی گسترده می‌توانند هیدروکربن‏های ‏پیچیده را تجزیه کنند. جمعیت میکروبی مخلوط شامل شماری از میکروارگانیسم‏هاست که آنزیم‏های ‏تجزیه کننده برای قسمت‏های ‏مختلف مسیرهای تجزیه ترکیبات آروماتیک را سنتز می‌کنند و با به کار بردن راه‏های ‏متابولیک شانس تجزیه‌ کامل‌تر بیشتر می‌شود (21).

نتایج حاصل از پژوهش حاضر ‏با نتایج مطالعات دیگر مطابقت دارد. به طوری که کشت مخلوط سویه‌ها میزان بالاتری از تجزیه را نسبت به کشت آن‏ها ‏به تنهایی دارد. 
پروتی[xiii] و کامترا[xiv] سویه‏های باکتریایی تولید کننده بیوسورفکتانت را از طریق سنجش هیدروفوبیسیته سطح سلولی غربال‏گری کردند. آن‏ها ‏یک رابطه مستقیم بین هیدروفوبیسیته سطح سلولی و تولید بیوسورفکتانت مشاهده کردند، به طوری‏که هر چه یک باکتری سطح هیدروفوبی بیشتری داشته باشد، قابلیت تولید بیوسورفکتانت بیشتری دارد. بیوسورفکتانت تولید شده کشش سطحی بین فاز آلی و فاز آبی را کم کرده در نتیجه موجب ایجاد امولسیون هیدروکربنی در آب می‏شود. این امر دستیابی باکتری‏ها به هیدروکربن‏های نفتی را افزایش داده و موجب بالاتر رفتن تجزیه زیستی می‏شود (22 و 23). 
در پژوهش حاضر، باکتری‏های تجزیه کننده نفت همزیست با شکم‏پا و محیط پیرامون آن جداسازی شد. ضمن شناسایی این باکتری‏ها، تراکم وتنوع باکتری‏ها در نمونه‏های شکم‏پا و محیط اطراف و قابلیت تجزیه نفت توسط آن‏ها بررسی شد. نتایج به دست آمده نشان داد که باکتری‏های موجود در خلیج فارس از تنوع زیاد با توان تجزیه نفت بالا برخوردار هستند و می‏توان از آن‏ها ‏برای‏ پاک‏سازی مناطق دریایی آلوده به نفت استفاده کرد. البته باید در نظر داشت که غلظت نفت موجود در مناطق آلوده نفتی بر میزان تجزیه‏کنندگی نفت به‏وسیله این باکتری‏ها تاثیر مستقیم دارد. در مناطق آلوده، کاهش غلظت نفت با روش‏های فیزیکی می‏تواند زمینه را برای تجزیه زیستی نفت فراهم سازد. بر این اساس می‏توان از این گونه‏ها برای حذف آلودگی‏های نفتی استفاده کرد. 


[1]- Gas Chromatography

[2]- Bacterial Adhesion To Hydrocarbon

[3]- Emulsification Activity

[4]- Quatrini

[5]- Hassanshahian

[vi]- Fusey

[vii]- Oudot

[viii]- Uysal

[ix]- Turkman

[x]- Sathishkumar

[xi]- Leady

[xii]- Colwell

[xiii]- Pruthi

[xiv]- Cameotra

(1) Alemagi D. The oil industry along the Atlantic coast of Cameroon: assessing impacts and possible solutions. Resources Policy 2007; 32 (3): 135- 45. 
(2)  Hassanshahian M., Zeynalipour MS., Hosseinzadeh Musa F. Isolation and characterization of crude oil degrading bacteria from the Persian Gulf (Khorramshahr provenance). Marine Pollution Bulletin 2014; 82: 39- 44. 
(3)  Atlas RM. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. Microbiology Review 1981; 45: 180- 209. 
(4) Cavallo RA., Acquaviva MI., Stabili L. Culturable heterotrophic bacteria in sea water and Mytilus galloprovincialis from a Mediterranean area (Northern Ionian Sea- Italy). Environmental Monitoring and Assessment 2009; 149: 465- 75. 
(5)  Bayat Z., Hassanshahian M., Askeri Hesni M. Enrichment and isolation of crude oil degrading bacteria from some mussels collected from the Persian Gulf. Marine Pollution Bulletin 2015; 101 (1): 85- 91. 
(6) Hasanshahian M., Emtiazi G. Investigation of alkane biodegradation using the microtiter plate method and correlation between biofilm formation, biosurfactant production and crude oil biodegradation. International Biodegrad 2008; 62: 170- 8. 

(7)Hassanshahian M., Emtiazi G., Cappello S. Isolation and characterization of crude- oil- degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Marine Pollution Bulletin 2012; 64: 7- 12.

(8)               Holt SG., Kriey NR., Sneath PHA., Staley JT., Williams ST. Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology. 4th ed. New York: Williams and Wilkins; 1996.

(9)               Yakimov MM., Timmis KN., Golyshin PN. Obligate oil- degrading marine bacteria. Current Opinion in Biotechnology 2007; 18 (3): 257- 66.

(10)           Rahman KSM., Thahira- Rahman J., Lakshmanaperumalsamy P., Banat IM. Towards efficient crude oil degradation by a mixed bacterial consortium. Bioresour Technology 2004; 85: 257- 61.

(11)           Bayat Z., Hassanshahian M., Askeri Hesni M. Study the symbiotic crude oil-degrading bacteria in the mussel Mactra stultorum collected from the Persian Gulf. Marine Pollution Bulletin 2016; 105 (1): 120- 4.

(12)           Pruthi V., Cameotra SS. Rapid identification of biosurfactant- producing bacterial strains using a cell surface hydrophobicity technique. Biotechnology Techonology 1997; 11: 671- 4.

(13)           Batista SB., Mounteer A., Amorim FR., Totola MR. Isolation and characterization of biosurfactant bioemulsifier- producing bacteria frompetroleum contaminated sites. Bioresour Technology 2006; 97: 868- 75.

(14)           Ebrahimipour Gh., Aminian M., Abolhasani Soorki A. Isolation of a Petroleum- degrading Halo Tolerant Bacterium and Study the Effects of Environmental Factors in Biodegrading for Environmental Protection. Environmental Sciences 2005; 8: 65- 74.

(15)           Khan Kh., Naeem M., Asif M. Extraction and Characterization of Oil Degrading Bacteria. Journal of Applied Sciences 2006; 6 (10): 2302- 6.

(16)           Sathishkumar M., Binupriya A., Baik SH., Yun RE. Biodegradation of Crude Oil by Individual Bacterial Strains and a Mixed Bacterial Consortium Isolated from Hydrocarbon Contaminated Areas. Clean 2008; 36 (1): 92- 6.

(17)           Quatrini P., Scaglione G., De Pasquale C., Riela S., Puglia AM. Isolation of Gram- positive n- alkane degraders from a hydrocarbon- contaminated Mediterranean shoreline. Applied Environmental Microbiology 2008; 104 (1): 251- 9.

(18)           Kasai Y., Kishira H., Harayama Sh. Released in a Marine Environment Degradation of Aromatic Hydrocarbons Cycloclasticus Play a Primary Role in the Bacteria Belonging to the Genus. Applied and Environmental Microbiology 2002; 68 (11): 5625- 33.

(19)           Fusey P., Oudot J. Relative influence of physical removal and biodegradation in the depuration of petroleum- contaminated seashore sediments. Marine Pollution Bulletin 1984; 15: 136- 41.

(20)           Uysal A., Turkman A. Biodegradation of 4- Cp In an Activated Sludge Reactor: Effect Of Biosurfactant And The Sludge Age. Journal of Hazardous Material 2007; 21: 71- 6.

(21)           Leahy JG., Colwell RR. Microbial Degradation of Hydrocarbons in the Environment. Applied Environmental Microbiology 1990; 54: 305- 15.

(22)           Pruthi V., Cameotra SS. Rapid identification of biosurfactant- producing bacterial strains using a cell surface hydrophobicity technique. Biotechnology Techonology 1997; 11: 671- 4.

(23)           Hassanshahian M., Emtiazi G. Isolation, and molecular detection of Alcanivorax dieselolei in the Persian Gulf and the study of biodegradation ability for remediation of oil pollution. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (1): 1- 4.