بررسی اثر شربت گلوکز و شکر قهوه‏ای به عنوان سوبسترا ارزان قیمت در تولید روغن توسط گونه قارچی Mortierella alpina CBS 754. 68

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد علوم و صنایع غذایی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد آیت الله آملی، آمل، ایران

2 استادیار صنایع غذایی، دانشگاه صنعتی شاهرود، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد آیت الله آملی، آمل، ایران

چکیده

مقدمه: آراشیدونیک اسید یک اسید چرب ضروری مهم در رژیم غذایی است. قارچ رشته ای مورتیرلا آلفینا منبع مناسبی برای تولید آراشیدونیک اسید شناخته شده است. برخی از گونه‏هایی این قارچ می‌توانند بیش از 40 درصد چربی در خود ذخیره کنند که بیشتر از 40 درصد آن را آراشیدونیک اسید تشکیل می‏دهد. ‏‏‏

مواد و روش ها: در پژوهش حاضر، از منابع کربنی ارزان قیمت گلوکز مایع، شکر قهوه‏ای و نشاسته برای تولید روغن و آراشیدونیک اسید از گونه قارچی مورتیرلا آلپینا سی بی اس 68/754 استفاده شد. قند احیا به روش دی‏نیتروسالسیلیک اسید (DNS)، روغن با استفاده از دستگاه سوکسله و نوع اسید چرب با استفاده از دستگاه گاز کروماتوگرافی جرمی اندازه‏گیری شد. ‏‏‏

نتایج: منابع کربنی به جز منبع کربنی نشاسته بر اساس قند احیا‏ در سطح 70 گرم در لیتر و پودر سویا در همه نمونه‏ها ‏در سطح 10 گرم در لیتر تنظیم شد. نتایج نشان داد که میزان درصد روغن در توده زیستی به ترتیب در محیط‏های گلوکز مایع 32، نشاسته 25 و شکر قهوه‏ای 13 و درصد آراشیدونیک اسید در روغن به ترتیب در محیط‏های گلوکز مایع 37، نشاسته 33 و شکر قهوه‏ای 31 به‏دست آمد. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: اجزای اسید چرب تشکیل دهنده روغن تحت تاثیر رشد میکروارگانیسم است. افزایش رشد توده زیستی، اسیدهای چرب ساختاری روغن مانند استئاریک اسید و اولئیک اسید را افزایش داد. شرایط نامناسب محیط کشت باعث شد بازده تولید توده زیستی و روغن کاهش یابد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation of the effect of glucose syrup and brown sugar as low-cost substrate for lipid production by Mortierella alpine CBS 754.68

نویسندگان [English]

  • Saed Montazeri 1
  • Hamid Reza Samadlouie 2
  • hami kaboosi 3
1 M.Sc. of Food science and technology, Ayatollah amol branch, Islamic azad unvirsity, Amol, Iran
2 Assistant professor of Food science and technology, Shahrood university of technology, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Ayatollah amol branch, Islamic azad unvirsity, Amol, Iran
چکیده [English]

Introduction:Arachidonic acid is an important essential fatty acid in human nutrition. The filamentous fungus Mortierella alpina has been identified as a promising producer of arachidonic acid. Mortierella alpine can accumulate up to 40% (w/w) lipid, of which up to 40% can be arachidonic acid.
Materials and methods: Mortierella alpina CBS 754.68 was cultivated in low cost substrate such as glucose syrup, brown sugar and starch for lipid and arachidonic acid production. The reduced sugar, total lipids and content of ARA were determined by dinitrosalicylic acid method, soxhlet and Gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) respectively.
Results: The carbon sources were applied at 70 g/l and nitrogen source (soybean powder) at 10 g/lit. The results showed that lipid in dry biomass in glucose syrup, starch and brown sugar media were obtained 32, 25 and 13 % w/w respectively. The arachidonic acid contents of lipid in the glucose syrup, starch and brown sugar media were 41, 33 and 31 % w/w respectively.
Discussion and conclusion: Lipidfatty acid compositions areaffected by the growth of microorganism. Cell membrane fatty acids such as stearic acid and oleic acid increased substantially concomitant with increases in the amount of biomass. Biomass and oil production efficiency fell due to inappropriate brown sugar medium.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mortierella alpine
  • Arachidonic acid
  • Lipid
  • Media

مقدمه.

امروزه با پیشرفت دانش بشری و با شناخت فواید غذاهای عملگرا، توجه دانشمندان به این نوع غذاها افزایش یافته است. اسید‏های چرب ضروری یکی از این نوع غذا‏های عملگرا است که نقش بسزایی در سلامت انسان ایفا می‏کنند. از آنجا که این اسیدهای چرب در بدن انسان ساخته نمی‏شوند اهمیت وجود این ترکیبات در رژیم غذایی به شدت مورد توجه دانشمندان قرار گرفته است (1)

با توجه به اهمیت اسیدهای چرب ضروری و کم بودن منابع تولید این نوع از اسیدهای چرب به‏ویژه اسید آراشیدونیک، دانشمندان در پی آن هستند که منابع مناسبی را برای تهیه این اسید چرب ضروری فراهم سازند (2 و 3). با در نظر گرفتن اهمیت این اسید چرب در ویژگی‏های عملکردی غشای سلولی، تنظیم کننده سوخت و ساز لیپوپروتئین[1]، رئولوژی خون و فعال‌سازی پلاکت‌ها[2] تولید تجاری آن مورد توجه قرار گرفته است. با توجه به نکات یاد‏ شده، مشکل اصلی در زمینه تهیه یا تولید آراشیدونیک اسید برای استفاده تجاری آن است‏‏. منابع گیاهی از این نظر غنی نیستند و منابع دریایی به علت مشکلاتی مانند وجود آلاینده‏های زیستی و سختی استخراج روغن از بافت آن‏ها، کمتر مورد توجه قرار گرفته‏اند (4 و 5). پس از اندکی پژوهش، دانشمندان پی‏بردند که پروتزوا، جلبک و قارچ منبع مناسبی برای تولید روغن با اسیدهای چرب چند غیراشباعی هستند. از این رو، ریزاندامک‏ها ‏به عنوان منشا اسیدهای چرب چند غیراشباعی در زنجیره غذایی مورد توجه قرار گرفتند.

در بین میکروارگانیسم‏های روغنی، کپک‏‏ها ‏بیشتر مورد توجه قرار گرفته است. توانایی تولید محدوده وسیع‏‏‏تری از اسیدهای چرب، امکان استفاده از ضایعات کشاورزی برای تولید محصول و رشد در محیط‏‏‏هایی با دامنه وسیع اسیدیته، از ویژگی‏های مثبت این نوع از میکروارگانیسم‏هاست. در بین گونه‏های قارچی، گونه‏هایی ‏از قارچ رشته‏ای ‏مورتیرلابه علت کم توقع بودن و سرعت رشد بالا، عدم تولید رنگدانه و همچنین، با توجه به اینکه بیش از40 درصد چربی ذخیره کرده و بیشتر از 40 درصد این میزان را آراشیدونیک اسید تشکیل می‏‏‏دهد مورد توجه قرار گرفته است (6- 8).

از آنجا که محیط کشت برای رشد و تولید محصول توسط ریزسازواره‏ها ‏بسیار اهمیت دارد پژوهش‏های وسیعی برای بهینه‏سازی ‏‏این عوامل انجام شده است. در پژوهشی که توسط وین[3] و همکاران در سال 2001 (9) انجام شد نشان داده شد که ژن مؤثر در تولید روغن (مالیک آنزیم) در محیط کشت گلوکز میزان فعالیت آن 10 برابر محیط کشت Tween 80 است در واقع وجود گلوکز بیان ژن مالیک آنزیم را تحریک کرده که عامل اصلی تجمع روغن در این ریزسازواره است‏‏. پارک [4]و همکاران در سال 2001 (10) تاثیر منابع مختلف نیتروژنی مانند عصاره مخمر، کنجاله سویا، شربت ذرت خیسانده، پروتئین ماهی و گلوتن بر تولید آراشیدونیک اسید و ریخت‏شناسی ‏‏توده زیستی را بررسی کردند. نتایج نشان داد که منبع پروتئینی سویا و ماهی بیش‏ترین تاثیر در تولید آراشیدونیک اسید داشته است. در پژوهشی که توسط راکی[5] و همکاران در سال 2011 (11) بر روی گونه قارچی Mortierella alpina انجام شد، تأثیر عواملی مانند نوع منبع کربنی (گلوکز و گالاکتوز)، نوع منبع نیتروژنی (پپتون و عصاره مخمر) و مدت زمان تخمیر بر روی تولید آراشیدونیک اسید بررسی شد و نتایج نشان داد که گلوکز، عصاره مخمر و مدت زمان تخمیر باعث افزایش آراشیدونیک اسید می‏شود. همچنین، پژوهش‏های مشابه دیگری در سایر میکروارگانیسم‏ها ‏در بهینه‏سازی ‏‏محیط کشت در جهت افزایش میزان محصول انجام شده است (12)

با توجه به پژوهش‏های اخیر انجام شده چنین به نظر می‏رسد که از مهم‏ترین نکات مورد توجه برای تولید محصول روغنی از گونه‏های قارچی مورتیرلا آلفینا شرایط محیط کشت است‏‏. از این رو در پژوهش حاضر، از منابع کربنی پیچیده، ارزان و بومی استفاده شد تا از یک سو روند تولید محصول بررسی شود و از سوی دیگر هزینه تولید کاهش یابد. در این پژوهش، تاثیر سه نوع منبع کربنی گلوکز مایع، شکر قهوه‏ای و نشاسته در تولید روغن و آراشیدونیک اسید بررسی شد. همچنین، در این پژوهش از سویا به عنوان منبع پروتئینی استفاده شده است. در نهایت، تغییرات محیط کشت از نظر میزان قند احیا، نیتروژن، تغییرات توده زیستی، روغن و آراشیدونیک اسید در روزهای 2، 5، 7 و 11 بررسی شد.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

مواد: در پژوهش حاضر، قارچ مورتیرلا آلپینا از مجموعه میکروبی کشور هلند[6] خریداری شد. نمونه قارچ مورتیرلا آلپینا خریداری شده به شکل میسلیوم در لوله آزمایش آگار شیب‌دار[7] بود که روی محیط کشت مالت آگار در بشقابک[8] و لوله آزمایش آگار شیب‌دار در درجه حرارت 22 درجه سانتی‏گراد ‏‏و مدت زمان 7 روز کشت داده شد و تا انجام آزمون، نمونه‏ها ‏در یخچال 4 درجه سانتی‏گراد ‏‏نگه‏داری شد. همچنین، مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش از شرکت مرک آلمان خریداری شد.

 مایه تلقیح و کشت‌های اصلی: از سوسپانسیون میسلیومی برای تلقیح کشت‌های تولید محصول استفاده ‌شد. برای تهیه سوسپانسیون میسلیومی، 100 میلی‏لیتر ‏‏محیط کشت شامل گلوکز تک آبه[9] (30 گرم درلیتر) و عصاره مخمر (10 گرم در لیتر) در یک ارلن 500 میلی‏لیتری تهیه و در درجه حرارت 121 درجه سانتی‏گراد ‏‏به مدت 15 دقیقه سترون شد. سپس، میکروارگانیسم تلقیح شده و در درجه حرارت 26 درجه سانتی‏گراد ‏‏به مدت 72 ساعت و 170 دور بر دقیقه[10] گرمخانه‌گذاری شد. 3 تا 10درصد از کشت‌های توسعه تلقیح به‌عنوان مایه تلقیح به محیط کشت تولید محصول افزوده شد (13). در محیط کشت تولید محصول از منابع کربنی شربت گلوکز، شکر قهوه‏ای و نشاسته و منبع پروتئینی سویا استفاده شد. شکر قهوه‏ای با استفاده از سولفوریک‏اسید تبدیل به قند احیا‏ شد که میزان قند احیای آن به 17 درصد افزایش یافت. همچنین، میزان پروتئین شکر قهوه‏ای به روش استاندارد اندازه‏گیری شد و یک درصد به‏دست آمد (14). به میزان 5 درصد نشاسته در محیط کشت مصرف شده و از آنجا که نشاسته قند پلی‏ساکاریدی است که توسط این گونه قارچی قابلیت مصرف ندارد، در روزهای 2، 4 و 7 تخمیر، میزان 120 واحد بر میلی لیتر آنزیم آلفا آمیلاز به محیط کشت اضافه شد. با توجه به پژوهش‏های انجام شده توسط زو[11] و همکاران، قند احیا‏ به جز محیط کشت نشاسته در سطح 70 گرم در لیتر و میزان سویا به عنوان منبع پروتئینی در همه محیط کشت‏های در سطح 10 گرم در لیتر تنظیم شد. همچنین، دما (21 درجه سانتی‏گراد)، اسیدیته 6 و دور همزن (185 دور در دقیقه) بود.

اندازه‌گیری وزن خشک توده زیستی: برای جداسازی توده زیستی از کاغذ صافی واتمن شماره 41، بر قیف بوخنر مجهز به پمپ خلا استفاده شد. سپس، برای اندازه‌گیری وزن خشک سلولی[12] روی شیشه‌های ساعت قرار داده و به مدت 2 ساعت در آون با درجه حرارت 105 درجه سانتی‏گراد ‏‏خشک ‌شدند (15).

 استخراج روغن: برای استخراج روغن، توده زیستی خشک شده در هاون چینی خرد شد. روغن پودر به دست آمده با حلال نرمال هگزان در دستگاه سوکسله شیشه‏ای Isolab آلمان که با گرم کن مدل EV16 ساخت شرکت Gerhardt آلمان استخراج شد (15).

 اندازه گیری اسیدهای چرب: برای تعیین و اندازه‌گیری اسیدهای چرب، با توجه به عدم فراریت اسیدهای چرب باید مشتق‌های متیل استر آن‏ها را تهیه کرد. پس از متیلاسیون نمونه‏های روغن، 5/0 میکرولیتر نمونه به دستگاه گاز کرماتوگرافی جرمی
 (qoa-Gcsystem78)، ستون HP-5MS (کاپیلاری، طول 30 متر، قطر 25/0 میلی‏متر و قطر فاز ساکن 25/0 میکرومتر) و دتکتور[13] مدل Agilent Technology 5975C تزریق شد. گاز استفاده شده هلیوم به خلوص 999/99 درصد با شدت جریان 1 میلی‏متر در دقیقه استفاده شد. دمای آون از 50 درجه سانتی‏گراد ‏‏به مدت 10 دقیقه با شیب 5 درجه سانتی‏گراد ‏‏در دقیقه به 250 درجه سانتی‏گراد ‏‏افزایش یافت و به مدت 10 دقیقه در این دما باقی ماند (16).

 اندازه‏گیری قند احیا به روش DNS[14]: نمونه محیط کشت درروزهای 2، 4، 7 و 11 تخمیر برداشت شده، توده زیستی از محیط کشت با سانتریفوژ کردن در 8000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه، از محیط کشت جدا شده و میزان قند محیط کشت به روش DNS اندازه‏گیری شد (17). این طرح به شکل مشاهده‏ای انجام شد و همه آزمایش‏ها در سه تکرار اندازه گیری شد.

 

نتایج.

.بررسی میزان تغییرات وزنی توده زیستی در حین فرآیند تخمیر: روند رشد توده زیستی در اثر مواد مغذی محیط کشت و مرحله رشد میکروارگانیسم است (9، 18، 11 و 12). همان‏طور که در شکل 1 مشاهده می‏‏شود، بیشتر میزان توده زیستی در روز هفتم در محیط کشت شکر قهوه‏ای و کم‏ترین میزان توده زیستی در محیط کشت نشاسته به‏دست آمد. با توجه به پژوهش‏های انجام شده (18) پروتئین تأثیر زیادی در افزایش توده زیستی دارد و با در نظر گرفتن این نکته که شکر قهوه‏ای دارای 1 درصد پروتئین بوده و در عین حال از پروتئین سویا نیز استفاده شده است، احتمالا مخلوط این دو نوع پروتئین اثر زیادی در رشد داشته و رشد ریزسازواره را تقویت کرده است. نشاسته جزو پلی ساکارید‏هاست که این ریزسازواره توانایی شکستن این ترکیب را نداشته از این رو از آنزیم آلفا آمیلاز به منظور تولید قند احیا استفاده شد. رشد کم ریزسازواره در این محیط در اثر کم بودن منبع کربنی با قابلیت جذب بالاست‏‏. در محیط کشت شربت گلوکز همواره یک روند افزایش توده زیستی مشاهده شد و بیش‏ترین افزایش مربوط به روز هفتم تا یازدهم تخمیر است‏‏ (شکل 1).

 

 

شکل 1- تغییرات میزان توده زیستی در محیط کشت شکر قهوه ای، شربت گلوکز و نشاسته

نمودارها دارای خطای معیار (SE[15]) در سه تکرار هستند.

 


مصرف گلوکز در حین فرایند تخمیر: گلوکز به عنوان منبع کربنی از دو لحاظ دارای اهمیت است. اول این‏که، به عنوان منبع انرژی به منظور فعالیت حیاتی میکروارگانیسم ضروری است و دوم، به منظور تبدیل به محصول که در اینجا روغن می‏باشد، ضروری است (8). همان‏طور که در شکل 2 مشاهده می‏‏شود در محیط کشت محتوی شکر قهوه‏ای و نشاسته، میزان زیادی از قند احیا‏ مصرف نشده باقی مانده است. از آنجا که مصرف شکر قهوه‏ای به منظور تنظیم منبع قند احیا در سطح 70 گرم در لیتر، بالاست،‏‏ فشار اسمزی محیط کشت افزایش زیادی یافته، در نتیجه توانایی قارچ برای مصرف حداکثری قند احیا‏ کاهش می‏‏یابد و مقادیر زیادی از قند احیا‏ در محیط کشت بدون استفاده باقی می‏‏ماند. نتایج به‏دست آمده مشابه پژوهش پاپانیکولو [16]و همکاران (19) است‏‏. در محیط کشت شربت گلوکز قند احیا‏ نیز در سطح 70 گرم در لیتر تنظیم شد. روند مصرف قند احیا‏ در روزهای انتهایی تخمیر بالا و همواره کاهش گلوکز با افزایش تجمع روغن همراه بود. نتایج به‏دست آمده مشابه نتایج به‏دست آمده در پژوهش صمدلوئی[17] و همکاران در سال 2012 (20) است‏‏. در محیط کشت گلوکز مایع، مصرف قند احیا گاهی تند و گاهی کند است. از روز 5 به 7 مصرف قند احیا کند است و در بقیه روزها، مصرف سوبسترا زیاد است. میزان نشاسته مصرفی در سطح 5 درصد تنظیم، افزودن آنزیم باعث ایجاد قند احیا‏ در محیط کشت و توسط ریزسازواره مصرف شد. از این رو مصرف گلوکز همواره یک روند ثابتی تا روز 7 تخمیر داشت.

 

 

شکل 2- تغییرات میزان قند احیا در محیط کشت شکر قهوه‏ای، شربت گلوکز و نشاسته. نمودارها دارای خطای معیار (SE) در سه تکرار هستند.

 

.بررسی تغییرات روغن در حین فرآیند تخمیر: محصول اصلی قارچ مورتیرلا روغن است. در واقع میکروارگانیسم منبع کربنی را به روغن تبدیل می‏کند و در شرایط کاهش مواد مغذی از روغن به عنوان منبع انرژی استفاده می‏کند (21). در محیط کشت شربت گلوکز تجمع روغن به میزان در خور توجهی بالاتر از بقیه محیط‏های کشت است.‏‏ این افزایش از روز دوم به پنجم و روز هفتم به یازدهم بسیار بالاست‏‏. در این شرایط، مصرف قند احیا‏ نیز به میزان زیادی افزایش یافته که نشان دهنده تبدیل گلوکز محیط کشت به روغن ذخیره ای توسط ریزسازواره است‏‏. روند افزایش روغن در محیط کشت نشاسته نشان می‏‏دهد که بیش‏ترین افزایش روغن از روز هفتم به یازدهم است‏‏. در محیط کشت شکر قهوه‏ای روند تجمع روغن متفاوت از سایر محیط‏های کشت بود به طوری‏که روغن از روز دوم به هفتم افزایش و سپس، کاهشی پیدا کرد (شکل 3).

 

 

شکل 3- تغییرات میزان روغن در محیط کشت شکر قهوه‏ای، شربت گلوکز و نشاسته. نمودارها دارای خطای معیار (SE) در سه تکرار هستند.

 

.بررسی تغییرات پروتئین در حین فرآیند تخمیر: پروتئین از ترکیبات کلیدی و مهم در تولید و رشد ریزسازواره است‏‏. از آنجا که همواره روند تولید توده زیستی تحت تأثیر میزان پروتئین است،‏‏ چنین تحلیل می‏‏شود که در هر سه محیط، از روز صفر تا دوم تمام منابع نیتروژنی توسط سلول مصرف شده و به میزان زیادی توده زیستی افزایش می‏‏یابد. در ادامه، گاهی افزایش پروتئین در محیط کشت دیده شده که ناشی از تولید آنزیم‏های خارج سلولی توسط ریزسازواره بوده که به منظور تجزیه ترکیبات پیچیده محیط کشت تولید شده است. نتایج به‏دست آمده مشابه نتایج زان[18] و همکاران در سال 2013 (22) است. در محیط کشت نشاسته بیش‏ترین افزایش میزان پروتئین دیده شده که نشان دهنده اثر آنزیم افزوده شده درمحیط کشت است‏‏ (شکل 4).

 

 

شکل 4- تغییرات میزان پروتئین در محیط کشت شکر قهوه‏ای، شربت گلوکز و نشاسته. نمودارها دارای خطای معیار (SE) در سه تکرار هستند.

 

 

بررسی میزان تولید آراشیدونیک: همان‏طور که در شکل 5 و 6 دیده می‏‏شود اسیدهای چرب تشکیل دهنده روغن مورتیرلا آلفینا بسیار متنوع هستند‏‏ و از 1 کربنه شروع شده و تا 27 کربنه ادامه دارند. اسیدهای چرب غالب روغن، اولئیک و آراشیدونیک اسید است‏‏. همچنین، تنوع اسیدهای چرب بلند زنجیره بسیار زیاد است. همان‏طور که در شکل 5 و 6 مشاهده می‏‏شود اسیدهای چرب تشکیل دهنده روغن هم زوج کربنه و هم فرد کربنه هستند. از آنجا که بیشتر طویل‏سازی ‏‏به شکل دو کربنه است‏‏، سوبسترا آنزیم‏های طویل‏ساز زوج کربنه‏ها ‏14 کربنه و فرد کربن‏ها ‏15 کربنه است‏‏ (23). همان‏طور که نتایج نشان می‏‏دهد آنزیم‏های غیر اشباع‏ساز بیشتر بر زوج کربنه‏ها ‏موثر بوده است و اسیدهای چرب فرد کربنه به شکل غالب، اشباع هستند. اسیدهای چرب طویل بالای 22 کربنه در محیط کشت شکر قهوه‏ای وجود دارد (شکل 6). از آنجا که مطابق شکل 3، در این محیط کشت در اواخر فرآیند تخمیر، روغن کاهش یافته است، افزایش اسیدهای چرب بلند زنجیره را در این نوع روغن می‏‏توان ناشی از تجزیه روغن دانست. بنابراین، چنین تحلیل می‏‏شود که با تجزیه روغن فعالیت آنزیم‏های طویل‏ساز که باعث شده طول زنجیره اسید چرب به بالای 20 کربنه افزایش یابد، فعال شود. پروفایل اسیدهای چرب نشان می‏‏دهد که بهترین محیط کشت برای تولید آراشیدونیک اسید محیط کشت شربت گلوکز (37 درصد آراشیدونیک اسید در روغن) است‏‏. کم‏ترین میزان اسید چرب آراشیدونیک اسید محیط کشت کربنه شکر قهوه‏ای بود که به 31 درصد آراشیدونیک اسید در روغن کاهش یافته است. با توجه به این نکته که روغن در اواخر فرآیند تخمیر کاهش یافته، نتایج این پژوهش نشان داد که با کاهش میزان روغن اسید چرب آراشیدونیک اسید به سایر اسیدهای چرب بلند زنجیره تبدیل شده است.

 

 

 

 

شکل 5- پروفایل اسیدهای چرب تشکیل دهنده روغن مورتیرلا آلفینا

 

 

شکل 6- پروفایل اسیدهای چرب بالای 20 کربنه تشکیل دهنده روغن مورتیرلا آلفینا

 


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

در محیط کشت شکر قهوه‏ای از روز صفر تا دوم میزان توده زیستی افزایش یافته در حالی که تجمع روغن اندک بود. در این شرایط، با مصرف مقادیر زیادی از قند احیا‏ 40 گرم در لیتر و پروتئین 6 گرم در لیتر، 2/1 درصد محیط کشت توده زیستی و 5/2 درصد توده زیستی روغن تولید شده است. با توجه به مصرف بسیار بالای سوبسترا و محصول کم تولیدی، چنین تحلیل می‏شود که به علت بالا بودن فشار اسمزی در روزهای اولیه تخمیر به میزان زیادی از سوبسترا صرف تولید انرژی برای سازگاری ریزسازواره شده است. از روز دوم تا پنجم میزان پروتئین محیط کشت اندکی افزایش یافته که نشان دهنده تولید آنزیم‏های خارج سلولی برای تجزیه ترکیبات کمپلکس محیط کشت است‏‏. در این دوره زمانی 6/0 درصد توده زیستی و 5/10 درصد از وزن خشک توده زیستی روغن تولید شده و در واقع 6 گرم در لیتر محصول به ازای مصرف 3 گرم در لیتر قند احیا‏ تولید شده است. از این رو چنین تحلیل می‏‏شود که سوبسترای لازم برای تولید محصول از سایر منابع قندی پیچیده محیط کشت تامین شده است. این منابع می‏‏تواند ترکیبات قندی سویا و قندهای غیر احیا‏ شکر قهوه‏ای باشد. از روز 5 تا 7 دوباره پروتئین خارج سلولی کاهش یافته که نشان دهنده مصرف این پروتئین توسط سلول است.‏‏ در این شرایط تجمع روغن 1/0 درصد توده زیستی افزایش یافته در حالی که تولید توده زیستی تا 2/2 درصد محیط کشت افزایش یافته است. با در نظر گرفتن این‏که 22 گرم در لیتر توده زیستی و روغن تولید و از آنجا که 5/2 گرم در لیتر سوبسترا مصرف شده چنین تحلیل می‏‏شود که سلول همچنان در حال تجزیه ترکیبات پیچیده محیط کشت بوده و ترکیبات ناشی از این تجزیه را صرف افزایش وزن خشک کرده است. روند افزایش توده زیستی و تولید روغن در محیط کشت شکر قهوه‏ای کاملا متفاوت با سایر منابع قندی با قابلیت جذب و مصرف بالاست‏‏ که می‏‏تواند ناشی از فشار بالای اسمزی محیط کشت اولیه و همچنین، درصد بالای قندهای غیر احیا‏ (80 درصد شکر قهوه ای) باشد. در این محیط کشت با وجود مقادیر زیادی از قند احیا‏، روغن ذخیره‏ای توسط ریزسازواره مصرف شده که با توجه به تحقیقات هودس ورث[xix] و همکاران در سال 1988 (24) می‏‏تواند ناشی از فعالیت آنزیم ایزوسیترات لیاز باشد. این آنزیم بیشتر در محیط‏های کشت که منبع کربنی روغن است و یا در شرایطی که گلوکز در محیط کشت تخلیه شده، فعال می‏‏شود. با توجه به نتایج به‏دست آمده در این پژوهش، احتمالا فشار بالای اسمزی در روزهای اولیه تخمیر نیز می‏تواند این آنزیم را تحریک کرده و در شرایطی که قند احیا‏ در محیط کشت وجود داشته و می‏تواند توسط میکروارگانیسم مصرف شود، احتمالا در اثر فعالیت این آنزیم، روغن ذخیره ای توسط سلول مصرف می‏شود.

در محیط کشت شربت گلوکز تا روز 2 به میزان 2/2 درصد محیط کشت توده زیستی و 4/8 درصد وزن خشک توده زیستی روغن تولید شد. در این شرایط کاهش کم گلوکز، به میزان 10 گرم در لیتر، و مصرف پروتئین بسیار بالا بوده و تمامی منبع پروتئینی مصرف شد. از روز دوم تا پنجم میزان تولید روغن تقریبا 2 برابر و توده زیستی به کندی افزایش یافته است در این شرایط گلوکز به میزان زیادی مصرف شده و پروتئین محیط کشت به میزان اندکی افزایش یافته که نشان دهنده تولید آنزیم‏های خارج سلولی است‏‏. نتایج نشان داد که میزان توده زیستی 5/0 درصد افزایش یافته و حدود 8 درصد روغن توده زیستی افزایش یافته است. نتایج به‏دست آمده مشابه نتایج راتلج[xx] در سال 1997 (25) است‏‏. ایشان گزارش کردند در شرایطی که پروتئین در محیط کشت تخلیه شود تولید روغن تحریک می‏شود.

با توجه به متفاوت بودن دو محیط کشت از نظر میزان قندهای غیر احیا‏ و ترکیبات تشکیل دهنده محیط کشت، مشاهده می‏‏شود که الگوی رشد و تولید روغن در این دو محیط کاملا با هم متفاوت است. در محیط کشت شکر قهوه‏ای و گلوکز مایع از روزهای دوم به پنجم مصرف قند احیا‏ بالا سپس، از روز پنجم به هفتم کاهش می‏‏یابد. در روزهای اولیه تخمیر در شرایط محیط کشت شربت گلوکز میزان تولید روغن و توده زیستی بالاست در حالی‏که در محیط کشت شکر قهوه‏ای، تولید توده زیستی و تولید روغن بسیار پایین است. با توجه به نتایج چنین تحلیل می‏‏شود که در محیط کشت شکر قهوه‏ای، بالا بودن فشار اسمزی باعث شده میزان زیادی از سوبسترا، صرف تولید انرژی برای ایجاد مقاومت در سلول نسبت به شرایط بد محیط کشت شود. در حالی‏که در محیط کشت شربت گلوکز شرایط برای رشد میکروارگانیسم مناسب است. مصرف قند احیا‏ در محیط کشت شکر قهوه‏ای بسیار بالاتر از محیط کشت شربت گلوکز است که می‏‏تواند ناشی از اهمیت گلوکز در تأمین انرژی برای سلول باشد. در محیط کشت شکر قهوه‏ای از روز دوم به بعد روند کاهش گلوکز کند شده است در حالی‏که در محیط کشت شربت گلوکز گاهی این روند تند و گاهی کند شده و در شرایطی که مصرف گلوکز بالاست تولید روغن نیز افزایش یافت.

نتایج به‏دست آمده از تحلیل اسیدهای چرب نشان می‏‏دهد در شرایطی که منبع کربنی نشاسته بود و از آنزیم آلفا آمیلاز به عنوان عامل ایجاد کنند ه قند احیا‏ استفاده شد، تولید لینولئیک اسید به میزان زیادی افزایش یافته که کمابیش 6 برابر محیط کشت شربت گلوکز بود و این اسید چرب در روغن تولیدی از منبع کربنی شکر قهوه‏ای تولید نشده است. وارد[xxi] در سال 2005 (26) گزارش کرد که استئاریک و اولئیک‏اسید از اسیدهای چرب غالب دیواره سلولی ریزسازواره‏هاست. با توجه به نتایج پژوهش ایشان، چنین تحلیل می‏‏شود که بالا بودن این دو اسید چرب در روغن که از محیط کشت شکر قهوه‏ای به‏دست آمده و بالاتر بودن میزان توده زیستی این محیط کشت نسبت به بقیه تیمارها این فرضیه را تقویت کرده که رشد ریزسازواره نقش زیادی در پروفایل اسیدهای چرب روغن دارد. این دو اسید چرب در محیط کشت نشاسته به میزان در خور توجهی پایین است‏‏.

با توجه به نتایج به‏دست آمده چنین تحلیل می‏‏شود که محیط‏های کشت ارزان قیمتی مانند شربت گلوکز و شکر قهوه‏ای می‏‏تواند به عنوان منابع کربنی بالقوه در تولید روغن از گونه مورتیرلا آلفینا باشد. با در نظر گرفتن میزان آراشیدونیک اسید تولید شده در محیط‏های کشت پیچیده بررسی شده در پژوهش حاضر، منبع کربنی شربت گلوکز می‏‏تواند محیط کشت مناسبی برای تولید روغن با میزان زیادی آراشیدونیک اسید در نظر گرفته شود. با توجه به اهمیت تولید روغن از گونه قارچی مورتیرلا آلفینا چنین پیشنهاد می‏‏شود که منابع کربنی پیچیده دیگری که به عنوان ضایعات در صنایع وابسته به مواد غذایی سالیانه به میزان زیادی هدر می‏رود، در فرآیند تخمیر تبدیل به روغن با ارزش این گونه قارچی شود.



[1]- Lipoprotein

[2]- Placket

[3]- Wynn

[4]- Park

[5]- Rocky

[6]- Centraalbureau voor Schimmelcultures

[7]- Slant agar

[8]- Petri dish

[9]- Glucose monohydrate

[10]- Revolution per minute (rpm)

[11]- Zhu

[12]- Dry cell weight (DCW)

[13]- Mass Selective Detector (MSD)

[14]- Dinitrosalicylic acid

[15]- Standard error

[16]- Papanikolaou

[17]- Samadlouie

[18]- Zhan

[xix]- Holdsworth

[xx]- Ratledge

[xxi]- Ward

 

(1)               Innis SM. Essential fatty acids in growth and development. Progress in Lipid Research 1991; 30 (1): 39- 103

(2)               Seyberth H W., Kuhl PG. The role of eicosanoids in paediatrics. European Journal of Pediatrics 1988: 147 (4): 341- 49.

(3)               Certik M., Shimizu S. Biosynthesis and regulation of microbial polyunsaturated fatty acid production. Journal of Bioscience and Bioengineering 1999: 87 (1): 1- 14.

(4)               Dyal SD., Narine SS. Implications for the use of Mortierella fungi in the industrial production of essential fatty acids. Food Research International 2005: 38 (4): 445- 67.

(5)               Yuan C., Wang J., Shang Y., Gong G., Yao J., Yu Z. Production of arachidonic acid by Mortierella alpina I49-N18. Food Technology and Biotechnology 2002: 40 (4): 311- 15.

(6)               Ratledge C. Fatty acid biosynthesis in microorganisms being used for single cell oil production. Biochemistry. 2004: 86: 807- 15.

(7)               Jang HD., Lin YY., Yang S S. Effect of culture media and conditions on polyunsaturated fatty acids production by Mortierella alpina. Bioresource Technology 2005: 96 (15): 1633- 44.

(8)               Zhu M., Yu LJ., Li W., Zhou PP., Li CY. Optimization of arachidonic acid production by fed-batch culture of Mortierella alpina based on dynamic analysis. Enzyme and Microbial Technology. 2006: 38 (6): 735- 40.

(9)               Wynn JP., Hamid AA., Li Y., Ratledge C. Biochemical events leading to the diversion of carbon into storage lipids in the oleaginous fungi Mucor circinelloides and Mortierella alpina. Microbiology 2001: 147 (10): 2857- 64.

(10)           Park EY., Koike Y., Cai HJ., Higashiyama K., Fujikawa S. Morphological diversity of Mortierella alpina: effect of consumed carbon to nitrogen ratio in flask culture. Biotechnology and Bioprocess Engineering 2001: 6 (3): 161- 6.

(11)           Rocky-Salimi K., Hamidi-Esfahani Z., Abbasi., S. Statistical optimization of arachidonic acid production by Mortierella alpina CBS 754. 68 in submerged fermentation. Iranian Journal of Biotechnology 2011: 9: 12- 15.

(12)           Aminzade S., Farrokhi N. Product optimization, purification and characterization of a novel polygalacturonase produced by Macrophomina phaseolina. Biological Journal of Microorganism 2013: 1 (4): 21- 34

(13)           Jang HD., Lin YY., Yang SS. Effect of culture medium and condition on polyunsaturated fatty acid production by Mortierella alpine. Bioresource Technology 2005: 96 (15): 1633- 44.

(14)           Lowry OH., Rosebrough N J., Farr AL., Randall R J. Protein measurement with the folin–phenol reagents. Journal of Biological Chemistry 1951: 193 (1): 265- 75.

(15)           Folch J., Lees M., Stanley GHS. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry 1957: 226 (1): 497- 509.

(16)           Metcalfe LD., Schmitz AA., Pelka J R. Rapid preparation of fatty acid esters from lipids for gas chromatographic analysis. Analytical Chemistry 1996: 38 (3): 514- 15.

(17)           Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 1959: 31 (3): 426- 8.

(18)           Wynn JP., Ratledge C. Evidence that the rate-limiting step for the biosynthesis of arachidonic acid in Mortierella alpina is at the level of the 18:3 to 20:3 elongase. Microbiology 2000:146 (9): 2325- 31.

(19)           Papanikolaou S.,Sarantou S., Komaitis M., Aggelis G. Repression of reserve lipid turnover in Cunninghamella echinulata and Mortierella isabellina cultivated in multiple-limited media. Journal of Applied Microbiology 2004: 97 (4): 867- 75.

(20)           Samadlouie H R., Hamidi- Esfahani Z., Alavi SM., Soltani-Najafabadi M., Sahari MA., Abbasi S. Statistical approach to optimization of fermentative production of oil and arachidonic acid from Mortierella alpine CBS 754. 68. African journal of microbiology research 2012: 6 (7): 1559- 67.

(21)           Hou CT., Production of arachidonic acid and dihomo-gama-linolenic acid from glycerol by oil-producing filamentous fungi, Mortierella in ARS Culture Collection. Journal of Industrial Microbiology 2008: 35 (6): 501- 6.

(22)           Zhan J., Lin H., Shen Q., Zhou Q., Zhao Y. Potential utilization of waste sweetpotato vines hydrolysate as a new source for single cell oils production by Trichosporon fermentans. Bioresource Technology 2013 (4): 135:622- 9

(23)           Leonarda A E., Pereiraa S L., Sprecherb H., Huang Y S. Elongation of long-chain fatty acids. Progress in Lipid Research 2004: 43 (1): 36- 54.

(24)           Holdsworth J E., Veenhuis M., Ratledge C. Enzyme activities in oleaginous yeasts accumulating and utilizing exogenous or endogenous lipids. Journal of General Microbiology 1988: 134 (11): 2907- 15.

(25)           Ratledge C. Biotechnology. In: Rehm HJ., Reed G., Puhler A., Stadler P., editors. Microbial lipids. 2nd ed. Weinheim, Germany: VCH; 1997. p 133- 97.

(26)           Ward OP., Singh A. Omega-3/6 fatty acid: alternative sources of production. Process Biochemistry 2005: 40 (12): 3627- 52.