تأثیر اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین خارجی بر برخی فعالیت‏های ضد قارچی سویه Pseudomonas fluorescens UTPF5 در شرایط شوری

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری کنترل زیستی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

2 استاد کنترل زیستی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران، کرج، ایران

3 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشکده پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران،کرج، ایران

4 کارشناس ارشد بیماری‌شناسی گیاهی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‏های پروبیوتیک گیاهی همچون سودومونادهای فلورسنت با سازوکار‏هایی از قبیل تولید متابولیت‏ها و آنزیم‏ها دارای سابقه طولانی در کنترل زیستی بیمارگر‏های خاکزاد هستند. یکی دیگر از نقش‏های مهم این باکتری‏ها افزایش تحمل گیاه در مقابله با تنش‏های محیطی است. اکتوئین‌ها اسمولیت‏هایی است که نقش مهمی در تحمل به تنش‏های اسمزی محیط ایفا می‏کند. ‏‏‏

مواد و روش ‏‏ها: میزان تحمل 24 سویه باکتری پروبیوتیک گیاهی به شوری و دما تعیین و تعداد 6 سویه متحمل برای انجام آزمایشات بعدی انتخاب شد. در مرحله بعد، آزمون کشت متقابل قارچ فوزاریوم سولانی و باکتری‏های رشد یافته در حضور اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین به همراه سه غلظت کلرید سدیم انجام و یک سویه از سودوموناس فلورسنس (UTPF5) انتخاب شد. در نهایت، تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و سه غلظت مختلف نمک بر جمعیت باکتری، تولید لیپاز، پروتئاز، سیانید هیدروژن، سیدروفور و بیوفیلم تعیین شد. ‏‏‏

نتایج: در غلظت 300 میلی‏مولار کلرید سدیم، باکتری رشد یافته در حضور اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین درصد بازدارندگی از رشد قارچ را نسبت به شاهد پنج برابر افزایش داد. شوری بر جمعیت باکتری در تیمارهای آب مقطر و اکتوئین، تولید سیانید‏ هیدروژن در هر سه تیمار و تشکیل بیوفیلم در تیمارهای اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین تأثیر مثبت و بر جمعیت باکتری در تیمار هیدروکسی‏اکتوئین، تولید پروتئاز و سیدروفور در هر سه تیمار و تشکیل بیوفیلم در آب مقطر تأثیر منفی داشت. از طرف دیگر اکتوئین جمعیت باکتری، تولید لیپاز و تولید سیانید هیدروژن را در هر سه غلظت کلرید سدیم، تولید سیدروفور را در غلظت 150 میلی‏مولار و تشکیل بیوفیلم را در غلظت 150 و 300 میلی‏مولار افزایش و تولید پروتئاز را در هر سه غلظت کلرید سدیم و تشکیل بیوفیلم را در محیط بدون نمک کاهش داد. هیدروکسی‏اکتوئین تأثیراتی شبیه به اکتوئین با تفاوت‏های جزیی داشت. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین با تأثیر بر تولید لیپاز، سیانید هیدروژن و تشکیل بیوفیلم موجب تعدیل کاهش کنترل زیستی ایجاد شده در اثر شوری می‏شوند. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of exogenous ectoines on some antifungal activity of Pseudomonas fluorescens UTPF5 under salt conditions

نویسندگان [English]

  • Arghavan Kamaly 1
  • Masoud Ahmadzadeh 2
  • Akram Sadeghi 3
  • Ebrahim Karimi 4
1 Ph.D student of biological control, Department of Plant Protection, Faculty of Agricultural Science and Engineering, College of Agriculture Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
2 Professor of biological control, Department of Plant Protection, Faculty of Agricultural Science and Engineering, College of Agriculture Natural Resources, University of Tehran, Karaj, Iran
3 Assistant Professor of Molecular Genetics, Microbial Biotechnology and Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran
4 M.Sc of Plant Pathology, Microbial Biotechnology and Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran
چکیده [English]

Introduction: Plant probiotic bacteria like fluorescent pseudomonads are worldly used against soil-borne pathogens through mechanisms such as production of bacterial metabolites and enzymes. These bacteria can also help plants to tolerate environmental stresses. Ectoine is a compatible solution which plays an important role in environmental osmotic stresses.

Materials and methods: Tolerance of 24 bacterial strains to salt and heat was tested and 6 tolerant strains were chosen. Then dual culture of Fusarium solani and bacteria grown in presence of ectoine and hydroxy ectoine with 3 NaCl concentrations (0, 150 and 300 mM) was done and Pseudomonas fluorescens UTPF5 was selected. Finally the effect of ectoine, hydroxyectoine and NaCl on bacterial population, lipase, protease, siderophore and hydrogen-cyanide production and biofilm formation was investigated.

Results: In 300 mM NaCl, the bacterium grown in presence of ectoines, increased the inhibition percentage 5- times more than control. NaCl had a positive effect on bacterial population in water and ectoine, hydrogen-cyanide production in all treatment and biofilm formation in ectoine and hydroxyectoine and negative effect on bacterial population in hydroxyectoine, protease and siderophore production in all treatments and biofilm formation in water. On the other hand, ectoine increased lipase and hydrogen-cyanide production and biofilm formation in 300 mM NaCl and siderophore production in 150 mM. Hydroxyectoine had similar effects with little differences.

Discussion and conclusion: Ectoine and hydroxyectoine moderate the biocontrol reduction in presence of NaCl through positive effect on lipase and hydrogen-cyanide production and biofilm formation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pseudomonas fluorescens UTPF5
  • Ectoine
  • Salinity
  • Biocontrol
  • Lipase
  • Hydrogen cyanide
  • Biofilm

مقدمه

بیش از 70 سال است که روش‏های کنترل زیستی بیمارگرهای گیاهی خاکزاد توسط باکتری‏ها به عنوان یک روش جایگزین برای روش‏های کنترل شیمیایی معرفی شده‏اند (1). ریزوباکتری‏های محرک رشد گیاه[1] در کنترل دامنه وسیعی از قارچ‏های بیماری‏زای ریشه مؤثر هستند (2). این گروه از باکتری‏ها توانایی کلنیزه کردن ریشه‏های گیاه را دارند، رشد گیاه را تحریک می‏کنند و وقوع بیماری‏های گیاهی را کاهش می‏دهند. هر سویه باکتریایی که حداقل دارای دو ویژگی از سه ویژگی یاد شده باشد در گروه ریزوباکتری‏های محرک رشد گیاه قرار می‏گیرد (3). در میان باکتری‏هایی که این ویژگی را دارند چندین سویه[2] از سودوموناس فلورسنس به منظور کنترل زیستی بیمارگرهای خاکزاد استفاده شده‏اند (4- 6). ساز وکار‏های این کنترل بیشتر شامل رقابت برای مواد غذایی، تولید متابولیت‏هایی از قبیل سیدروفورها (7)، آنتی‏بیوتیک‏ها (8)، مواد فرار (مانند سیانید هیدروژن) (9) و آنزیم‏های لیز کننده خارج سلولی (10) هستند. به علاوه مشخص شده است که تشکیل بیوفیلم در باکتری‏ها رشد گیاه را تحریک و از گیاه در برابر بیمارگر‏های گیاهی محافظت می‏کند (11). نقش سیدروفور پیووردین تولید شده توسط بسیاری از گونه‏های سودوموناس در کنترل گونه‏های پیتیوم و فوزاریوم مشخص شده است (12). در شرایط "در شیشه"[3]سیانید هیدروژن تولید شده توسط کشت سودوموناس فلورسنس[4] روی محیط جامد، اثر بازدارندگی بر برخی از قارچ‏های بیماری‏زا دارد (13). یکی دیگر از نقش‏های مهم باکتری‏های پروبیوتیک گیاهی[5] افزایش تحمل گیاه برای مقابله با تنش‏های محیطی است (14). اکتوئین (تتراهیدرو-2-متیل-4- پیریمیدین کربوکسیلیک اسید) از مشتقات پیریمیدین‏ها و یک‏آمینواسید حلقوی است که به طور طبیعی توسط باکتری‏ها تولید می‌شود (15). این ماده که به عنوان یک اسمولیت نقش مهمی در تحمل به تنش‏های اسمزی محیط ایفا می‏کند، نخستین بار در باکتری نمک دوست اکتوتیورودوسپیرا هالوکلریس[6] شناسایی و پس از آن در تعداد زیادی از باکتری‏های نمک دوست دیگر یافت شد (16). این ترکیب تا کنون در باسیلوس سوبتیلیس[7]، ایشرشیا کولی[8]، پانتوئئا اگلومرانس[9]و گونه‏هایی از سودوموناس، برویباکتریوم و استرپتومایسس (17) دیده شده است. مشتق هیدروکسیله اکتوئین (هیدروکسی‏اکتوئین) نیز دارای ویژگی‏های مشابه اکتوئین است. این ترکیب در باکتری‏های گرم مثبت عمومیت بیشتری دارد (18). پژوهش حاضر با هدف بررسی تأثیر اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین خارجی بر فعالیت ضد‏ قارچی سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5) در تنش شوری و در شرایط "در شیشه"انجام شده است. فعالیت ضد قارچی این سویه در شرایط غیر شور در مطالعات قبلی بررسی شده بود (19).

 

‏‏. مواد و روش‏ها.

تهیه و نگهداری سویه‏های باکتری: تعداد 21 سویه باسیلوس سوبتیلیس، 1 سویه باسیلوس آمیلولیکوئیفشنس[10]و دو سویه سودوموناس فلورسنس ازکلکسیون باکتری‏های آنتاگونیست گروه گیاه‏پزشکی دانشگاه تهران دریافت و نگهداری شد. ویژگی‏های این باکتری‏ها در جدول 1 ثبت شده است.

 

جدول 1- ویژگی‏های 24 سویه‏ باکتریایی آنتاگونیست که در این پژوهش از آن‏ها استفاده شده است.

جنس و گونه

محل نمونه برداری

منبع

نام سویه

Bacillus subtillis

قزوین

چغندر قند

UTB10

Bacillus subtillis

کرمانشاه

چغندر قند

UTB11

Bacillus subtillis

کرمانشاه

چغندر قند

UTB12

Bacillus subtillis

کردستان

چغندر قند

UTB13

Bacillus subtillis

تهران

چغندر قند

UTB14

Bacillus subtillis

تهران

چغندر قند

UTB15

Bacillus subtillis

کرمانشاه

چغندر قند

UTB16

Bacillus subtillis

همدان

چغندر قند

UTB17

Bacillus subtillis

اصفهان

چغندر قند

UTB18

Bacillus subtillis

تهران

چغندر قند

UTB19

Bacillus subtillis

مرکزی

چغندر قند

UTB20

Bacillus subtillis

مرکزی

چغندر قند

UTB21

Bacillus subtillis

مرکزی

چغندر قند

UTB22

Bacillus subtillis

لرستان

چغندر قند

UTB23

Bacillus subtillis

فارس

چغندر قند

UTB24

Bacillus subtillis

تهران

چغندر قند

UTB25

Bacillus subtillis

قزوین

چغندر قند

UTB26

Bacillus subtillis

تهران

چغندر قند

UTB27

Bacillus subtillis

فارس

چغندر قند

UTB28

Bacillus subtillis

اصفهان

چغندر قند

UTB29

Bacillus subtillis

کرمانشاه

چغندر قند

UTB30

Bacillus amyloliquefaciens

-

-

UTB96

Pseudomonas fluorescens

کرج

پیاز

UTPF5

Pseudomonas fluorescens

مازندران

کلزا

UTPF68


. میزان تحمل سویه‏های باکتری به شوری و دما: سویه‏های باکتری در محیط کشت نوترینت آگار[11] با غلظت‏های مختلف کلرید سدیم (5، 7، 10، 11، 12 و 13 درصد) کشت و بیش‏ترین غلظت نمک قابل تحمل برای هر سویه مشخص شد. در مرحله بعد میزان رشد 24 سویه در سه دمای مختلف (10، 28 و 45 درجه سانتی‏گراد) و در حضور کلرید سدیم (برای باسیل‏ها غلظت 10درصد و برای سودوموناس‏ها غلظت 7 درصد) و غیاب آن بررسی و با هم مقایسه شد.

. کشت در محیط حاوی اسمولیت‏ها و کلرید سدیم:برای تمام آزمایشاتی که در ادامه می‏آید استوک اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین یکمیلی‏‏مولار (در محیط مایع) و دو میلی‏مولار (در محیط جامد) تهیه و پس از عبور از فیلتر میلی‏پور 2/0 میکرون به محیط‏های در حال سرد شدن اضافه شد. به محیط‏های شاهد آب مقطر سترون اضافه شد. در تمام آزمایشات غلظت‏های صفر، 150 و 300 میلی‏مولار کلرید سدیم استفاده شد.

آزمون کشت متقابل: برای این آزمایش از روش کیل[12] و همکاران (20) با تغییراتی به شرح زیر استفاده شد. به این ترتیب که باکتری (از کشت 24 ساعته) به شکل نقطه‏ای روی محیط کشت پوتیتو دکستروز آگار[13] به فاصله 5/0 سانتی متر از لبه تشتک پتری کشت داده شد. به شکل همزمان قطعه‏ای از محیط کشت حاوی قارچ فوزاریوم سولانی[14] (کشت 7 روزه) نیز در وسط تشتک پتری قرار گرفت. هر تیمار در چهار تکرار انجام شد. پس از اینکه کلونی شاهد پتری را پر کرد، درصد بازدارندگی برای هر تیمار مطابق فرمول زیر محاسبه شد:

 


100×

میزان رشد قارچ درون پتری حاوی باکتری – میزان رشد قارچ درون پتری شاهد

= درصد بازدارندگی

میزان رشد قارچ درون پتری شاهد

 


. تعیین جمعیت باکتری با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری: میزان مشخصی از کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت نوترینت براث[15] به ارلن‏های حاوی محیط‏‏های تازه (حاوی غلظت‏های مختلف نمک و اسمولیت‏ها) اضافه شد. ارلن‏ها به مدت 24 ساعت داخل شیکر انکوباتور در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و 120 دور در دقیقه قرار گرفتند. سپس، یک میلی‏لیتر از محتوای هر ارلن به ویال‏های سترون منتقل و به مدت 10 دقیقه در g 8000 و در دمای چهار درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. مایع رویی خالی شد، به هر ویال یک میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی استریل اضافه، از هر تیمار 100 میکرولیتر به چاهک‏های میکروپلیت اضافه و جذب هر تیمار در طول موج 625 نانومتر با دستگاه پلیت ریدر خوانده شد.

بررسی تولید لیپاز: بر اساس روش شاد[16] و همکاران (21) محیطی شامل 10 گرم پپتون، 5 گرم کلرور سدیم، 1/0 گرم کلرور کلسیم، 15 گرم آگار در یک لیتر آب تهیه شد. 10 میلی‌لیتر تویین 80 اتوکلاو شده به محیط در حال سرد شدن (قبل از توزیع در تشتک‏پتری‌‌ها) افزوده شد. باکتری به شکل خطی کشت داده شد. پس از 48 ساعت وجود هاله رسوبی در اطراف هر یک از کلونی‏‏ها که نشان دهنده فعالیت لیپازی باکتری است، بررسی شد.

 بررسی تولید پروتئاز: به منظور بررسی توانایی تولید آنزیم پروتئاز در باکتری‏ها مطابق روش مارهوفر[17] و همکاران (22) از محیط اسکیم میلک آگار[18]حاوی 15 گرم پودر شیر، 5/0 گرم عصاره مخمر و 13/9 گرم آگار در یک لیتر آب مقطر استفاده شد. باکتری‌‌ها روی این محیط به شکل نقطه‌ای کشت شدند. تشکیل هاله بیرنگ در اطراف کلونی باکتری‌ها نشانه فعالیت پروتئازی باکتری است‏.

 بررسی تولید سیانید هیدروژن: این آزمایش از روش آلستروم و برنز[19] (23) انجام شد. بدین منظور ابتدا 100 میکرولیتر از سوسپانسیون کشت 24 ساعته هر یک از باکتری‏ها در تشتک‏های پتری حاوی محیط کشت نوترینت آگار همراه با اسید آمینه گلایسین به طور یکنواخت پخش شد. سپس، کاغذ‏های صافی آغشته به محلول معرف شامل: کربنات کلسیم دو درصد و اسید پیکریک 5/0 درصد در قسمت درب تشتک پتری قرار داده شد. تشتک‏ها توسط نوار پارافیلم کاملا درزگیری شدند تا از خروج هر گونه متابولیت فرار و گازی شکل از جمله سیانید هیدروژن جلوگیری شود. این ظروف به شکل واژگون به مدت 72 ساعت درون انکوباتور در دمای 28 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. یک تشتک پتری نیز به عنوان شاهد بدون تلقیح با باکتری در نظر گرفته شد. در صورت تولید سیانید هیدروژن کاغذ صافی آغشته به معرف از رنگ زرد اولیه به رنگ کرم (+) قهوه‌ای روشن (++) قهوه‌ای تیره (+++) و آجری (++++) تغییر رنگ پیدا می‌کند.

. اندازه‏گیری میزان تولید سیدروفور به روش اسپکتروفوتومتری: این آزمون بر اساس روش کاستاندا[20] و همکاران (24) انجام گرفت. مقدار 100 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتری‏ها در محیط مایع سوکسینات به ارلن‏های 100میلی‏‏لیتری حاوی 20میلی‏‏لیتر محیط کشت تازه سوکسینات منتقل شد. این محیط‏ها به مدت 40 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و 120 دور در دقیقه روی شیکر نگهداری شد. سلول‏های باکتری با سانتریفیوژ کردن در g10000 به مدت 10 دقیقه رسوب داده شد. پس از حذف رسوب باکتری میزان جذب مایع رویی در طول موج 400 نانومتر و با استفاده از دستگاه پلیت ریدر خوانده شد. داده‏های به دست آمده با استفاده از فرمول زیر به مول در لیتر تبدیل شد.

 

A = میزان جذب e = ضریب جذب مولی
B = قطر کوت C = غلظت ماده

 

. مقایسه میزان تشکیل بیوفیلم با استفاده از روش. میکروتیترپلیت: این آزمون بر اساس روش میکروتیتر‏پلیت (25) با تغییراتی به شرح زیر انجام شد.

کشت 24 ساعته باکتری در محیط کشت نوترینت براث در دمای 30 درجه سانتی‏گراد تهیه شد. سپس، یک میلی‏لیتر از این محیط کشت به 10 میلی‏لیتر از محیط سترون اضافه و کدورت آن از طریق خواندن جذب نوری سوسپانسیون بین 09/0 تا 1/0 در طول موج 625 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر تنظیم شد. این سوسپانسیون حاوی حدود 106 کلونی باکتری در هر میلی‏لیتر است. سپس، از این سوسپانسیون 250 میکرولیتر به هر چاهک میکروپلیت انتقال داده شد. در این صورت در هر چاهک نزدیک به 105 ×5/2 واحد تشکیل دهنده کلونی‏[21] باکتری موجود است. چاهک‏های شاهد تنها حاوی محیط سترون بودند. سطح پلیت‏ها پوشیده شد و انکوباسیون به مدت 24 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد انجام شد. پس از گذشت 24 ساعت، محلول مواد غذایی و سوسپانسیون میکروبی از چاهک‏ها خارج شد و هر چاهک سه مرتبه توسط 300 میکرولیتر سرم فیزیولوژیک استریل شسته شد. همچنین، پلیت‏ها به منظور حذف سلول‏های غیر‏متصل[22] در حین شستن به شدت تکان داده شدند. سپس، باکتری‏های متصل به دیواره و کف چاهک‏، با 250 میکرولیتر اتانول 96 درصد تثبیت شدند. پس از 15 دقیقه، محتویات چاهک‏ها تخلیه و پلیت‏ها هوا خشک شدند. پلیت‏ها به مدت پنج دقیقه با 200 میکرولیتر رنگ کریستال ویوله دو درصد رنگ‏آمیزی شدند. پس از گذشت این مدت زمان، رنگ‏های اضافی از طریق قرار دادن پلیت‏ها در مسیر جریان آب لوله شهری شسته و در دمای آزمایشگاه هوا خشک شدند. پس از خشک شدن پلیت‏ها، تشکیل بیوفیلم‏ به شکل حلقه‏های ارغوانی رنگی درون چاهک‏ها قابل مشاهده است. در نهایت، 200 میکرولیتر استیک‏اسید 33 درصد به هر چاهک اضافه و جذب نوری[23] رنگ کریستال ویوله‏ موجود در حلال رنگ‏بر در طول موج 492 نانومتر توسط دستگاه پلیت ریدر خوانده شد.

محاسبات آماری: تمام آزمایشات به شکل فاکتوریل و در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار انجام شد. تجزیه واریانس و مقایسه میانگین صفات به روش حداقل تفاوت معنا‏‏‏دار (05/0P value< ) با استفاده از نرم افزار SAS انجام گرفت. در مواردی که روش
ال اس دی[24] قادر به جداسازی میانگین‏ها نبود همچون، مواردی که تعداد میانگین‏ها کم یا نامتعادل بود از روش چند دامنه‏ای دانکن در سطح آماری 05/0 استفاده شد. نرمال بودن پراکنش داده‏ها قبل از تحلیل آماری با نرم‏افزار MINITAB آزمایش شد.

 

. نتایج

. میزان تحمل سویه‏های باکتری به شوری و دما: نتایج این پژوهش نشان داد که تمام سویه‏های آزمایش‏شده تحمل خوبی به شوری داشتند و علاوه بر دمای بهینه 28 درجه سانتی‏گراد در دماهای 10 و 45 درجه سانتی‏گراد نیز قادر به رشد بودند (جدول 2). 6 سویه برای انجام آزمایشات بعدی انتخاب شد. سویه‏های UTB16، UTB27، UTB96 و UTPF68 قادر به تحمل غلظت بیش از 10 درصد کلرید سدیم بودند و همچنین رشد آن‌ها در دمای 10 و 45 درجه سانتی‏گراد در حضور نمک بیشتر از سایر سویه‏ها بود. رشد سویه UTPF5 بر خلاف بقیه سویه‏ها در دمای 10 درجه سانتی‏گراد بیشتر از دمای 45 درجه سانتی‏گراد بود. میزان تحمل به نمک و رشد در دماهای کم و زیاد در سویه UTB14 نسبت به سایر سویه‏ها کمتر بود.

 

 

جدول 2- میزان رشد 24 سویه باکتری در 3 دمای مختلف و در حضور نمک و عدم حضور آن و بیش‏ترین میزان نمک قابل تحمل برای هر سویه

رشد در حضور یا عدم حضور نمک در دماهای مختلف

میزان تحمل نمک (درصد)

نام سویه

45 درجه سانتی‏گراد

28 درجه سانتی‏گراد

10 درجه سانتی‏گراد

+کلرید سدیم

-کلرید سدیم

+کلرید سدیم

-کلرید سدیم

+کلرید سدیم

-کلرید سدیم

2

3

2

3

0

2

13

UTB10

0

2

0

3

0

3

5

UTB 11

0

3

0

3

0

2

5

UTB 12

1

3

2

3

0

2

13

UTB 13

0

3

0

3

0

3

5

UTB 14

2

3

2

3

0

2

13

UTB 15

2

3

2

3

1

2

13

UTB16

2

3

2

3

0

2

13

UTB 17

0

3

0

3

0

2

5

UTB 18

0

3

0

3

0

2

5

UTB 19

2

3

2

3

0

2

13

UTB 20

0

2

0

3

0

2

5

UTB 21

2

3

2

3

0

2

13

UTB 22

0

2

0

3

0

2

5

UTB 23

2

3

2

3

0

2

13

UTB 24

0

2

0

3

0

2

5

UTB 25

2

3

2

3

0

2

13

UTB 26

2

3

2

3

1

2

13

UTB 27

0

2

0

3

0

2

5

UTB 28

0

2

0

3

0

2

5

UTB 29

0

3

0

3

0

2

5

UTB 30

2

3

2

3

0

2

11

UTB 96

0

1

0

3

0

2

5

UTPF5

2

3

2

3

1

2

12

UTPF68

اعداد صفر، 1، 2 و 3 به ترتیب نشان‏دهنده عدم رشد، رشد کم، رشد متوسط و رشد زیاد باکتری هستند.

جدول 3- درصد بازدارندگی از رشد فوزاریوم سولانیتوسط 5 سویه باکتری در سه غلظت نمک و در حضور آب مقطر، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین

 

بازدارندگی از رشد (درصد)

 

نام سویه

 (300 میلی‏‏مولار) کلرید سدیم

 (150 میلی‏‏مولار) کلرید سدیم

 (صفر میلی‏‏مولار) کلرید سدیم

هیدروکسی اکتوئین

اکتوئین

آب مقطر

هیدروکسی اکتوئین

اکتوئین

آب مقطر

هیدروکسی اکتوئین

اکتوئین

آب مقطر

3/34

30

6/28

3/34

4/31

7/35

4/31

7/25

4/31

UTB16

85/42

1/37

1/37

3/34

6/38

85/42

85/42

40

85/42

UTB27

40

40

3/34

85/42

7/35

40

7/35

85/42

40

UTB96

85/22

6/28

7/5

85/42

85/42

40

7/45

85/42

85/42

UTPF5

0

0

0

0

0

0

6/28

3/14

6/28

UTPF68

0

0

0

0

0

0

0

0

0

UTB14

 


. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر درصد بازدارندگی: همان‏طور که در جدول 3 مشاهده می‏شود، سویه UTPF5 که در محیط کشت حاوی اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین رشد یافته بود، در غلظت 150 و 300 میلی‏مولار کلرید سدیم درمقایسه با شاهد (باکتری رشد یافته در محیط حاوی آب مقطر) ویژگی بازدارندگی بیشتری بر رشد قارچ فوزاریوم سولانیداشت به گونه‏ای که در غلظت 300 میلی‏مولار کلرید سدیم درصد بازدارندگی تیمار اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین (به ترتیب 6/28 و 85/22) 5 برابر تیمار شاهد (7/5) بود. با توجه به این نتیجه، سویه UTPF5 برای انجام آزمون‏های بعدی انتخاب شد.

. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر جمعیت باکتری با استفاده از روش اسپکتروفوتومتری: همان‏طور که در شکل 1 دیده می‏شود اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و دو غلظت 150 و 300 میلی‏مولار کلرید سدیمتأثیر مثبت معنا‏‏‏داری بر جمعیت باکتری داشتند. تأثیر مثبت شوری در حضور اکتوئین افزایش یافت. در صورتی‏که در حضور هیدروکسی اکتوئین عکس این مطلب صادق بود و تیمار توام شوری و هیدروکسی‏اکتوئین تأثیر منفی بر جمعیت باکتری داشت.

 

 

شکل 1- تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر جمعیت سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

 

 

. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید لیپاز: در غلظت صفر میلی‏مولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین میزان تولید لیپاز را در مقایسه با شاهد (آب مقطر) به طور معنا‏‏‏داری افزایش دادند و این افزایش در مورد هیدروکسی‏اکتوئین بیشتر بود. در غلظت 150 و 300 میلی‏مولار کلرید سدیمنیز اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین باعث افزایش تولید لیپاز شدند (شکل 2).

تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید پروتئاز: به طور کلی شوری تأثیر منفی بر تولید پروتئاز در هر سه تیمار آب مقطر، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین داشت و همان‏طور که در شکل مشهود است اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین در هر سه غلظت میزان تولید پروتئاز را نسبت به شاهد کاهش دادند (شکل 3).

. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید سیانید هیدروژن: تأثیر 300 میلی‏مولار کلرید سدیم بر تولید سیانید هیدروژن در هر سه تیمار اسمولیت مثبت بود. اکتوئین در هر سه غلظت نمک میزان تولید سیانید هیدروژن را افزایش داد. در حالی‏که افزودن هیدروکسی‏اکتوئین به محیط کشت حاوی نمک و یا بدون نمک تأثیری بر تولید سیانید هیدروژن نداشت (جدول 4).

جدول 4- تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید سیانید هیدروژن در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

مواد حل شونده سازگار

غلظت نمک طعام (میلی‏مولار)

هیدروکسی‏اکتوئین

اکتوئین

آب مقطر

+

++

+

0

+

++

+

150

++

+++

++

300

تولید سیانید هیدروژن: تولید اندک: +، تولید متوسط: ++،
تولید زیاد: +++

 

شکل 2- تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید لیپاز در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

.

شکل 3- تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید پروتئاز در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

 

. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید سیدروفور: شوری تأثیر منفی در خور توجه و معنا‏‏‏داری بر تولید سیدروفور در هر سه تیمار اسمولیت داشت. در غلظت 150 میلی‏مولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین میزان تولید سیدروفور را نسبت به شاهد به طور معنا‏‏‏داری افزایش دادند و این افزایش در مورد هیدروکسی‏اکتوئین بیشتر بود (شکل 4).

 

شکل 4- تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تولید سیدروفور در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

 

 

شکل 5- تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تشکیل بیوفیلم در سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5)

 

. تأثیر اکتوئین، هیدروکسی‏اکتوئین و شوری بر تشکیل بیوفیلم: تاثیر نمک، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین بر تشکیل بیوفیلم منفی بود، اما اثر متقابل اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین و شوری باعث افزایش معنا‏‏‏دار تشکیل بیوفیلم شد. بدین ترتیب که در غلظت صفر میلی‏مولار کلرید سدیم اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین باعث کاهش میزان تشکیل بیوفیلم نسبت به شاهد شدند، اما در غلظت‏های 150 و 300 میلی‏مولار کلرید سدیم، اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین تشکیل بیوفیلم را در مقایسه با شاهد به طور معنا‏‏‏داری افزایش دادند (شکل 5).

. بحث و نتیجه‏‏گیری

توانایی رشد سودوموناس‏ها (26 و 27) و باسیلوس‌ها (28 و 29) در غلظت‌های زیاد نمک گزارش شده است. مطابق نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر توانایی تحمل نمک به شکل رشد در محیط کشت حاوی 13 و 12 درصد نمک به ترتیب برای باسیلوس‌ها و سودوموناس‌ها دیده شد. اگرچه توانایی بازدارندگی قارچ بیمارگر فوزاریوم در میان باکتری‌های بررسی شده در این پژوهش دیده شد، اما تأثیر منفی نمک بر ویژگی بازدارندگی باکتری‌های مورد مطالعه یکسان نبود. دامنه این تأثیر منفی از 9 تا 100 درصد متغیر بود. تأثیر منفی نمک بر توانایی بازدارندگی در میان باسیلوس‌ها و سودوموناس‌هایی با میزان متفاوتی از تحمل به نمک دیده می‌شود. در مطالعات انجام شده بر روی توانایی بازدارندگی سودوموناس‌ها در شرایط شور و غیرشور این تنوع دیده شده است (30). اگرچه توانایی رشد باکتری‌های مورد مطالعه در غلظت‌های افزایشی نمک کاهش یافت اما غلظت‌های کمتر نمک (150 تا 300 میلی‏مولار) موجب افزایش جمعیت باکتری شد. مطابق نتایج نشان داده شده در شکل 1 تأثیر نمک بر رشد سویه سودوموناس فلورسنس (UTPF5) مثبت بود. تأثیر متفاوت نمک بر رشد باکتری‌های متحمل به نمک در جنس استرپتومایسس نیز گزارش شده است (17). توانایی بازدارندگی این سویه در حضور نمک 87 درصد کاهش یافت، در صورتی‏که رشد باکتری در حضور همین مقدار نمک به میزان 10 درصد افزایش یافت. اگرچه افزایش توانایی بازدارندگی در حضور نمک در سودوموناس‌ها (30) و استرپتومایسس‌ها (31) گزارش شده است، اما به نظر می‌رسد ساز و کار تأثیر نمک بر بازدارندگی و رشد جمعیت باکتری متفاوت است‏. گزارش‏های اندکی مبنی بر پتانسیل تولید متابولیت‏های ضد میکروبی در باکتری‏های محرک رشد در تنش شوری وجود دارد. مطابق گزارش خاره[xxv] و همکاران (26)، بازدارندگی از رشد ماکروفومینا فازئولینا[xxvi] توسط سویه‏ای از سودوموناس فلورسنس در شرایط شوری (400 میلی‏‏مولار کلرید سدیم) گویای توانایی این سویه برای بقا و تولید متابولیت‏های بازدارنده در چنین شرایطی است. پژوهش حاضر برای نخستین بار به بررسی ارتباط میان اکتوئین و مشتق هیدروکسیله آن (هیدروکسی‏اکتوئین) با میزان بازدارندگی از رشد قارچ توسط باکتری در شرایط تنش شوری می‏پردازد. بر اساس نتایج به دست آمده از این پژوهش، اکتوئین و هیدروکسی اکتوئین اگرچه خود به تنهایی موجب افزایش کنترل زیستی نمی‏شوند، اما در صورت اعمال شوری (غلظت 300 میلی‏مولار) که خود کاهش دهنده کنترل زیستی است، این کاهش را تعدیل می‏کنند. ممکن است علت این تعدیل، تأثیر اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین بر یکی از ساز و کار‏های کنترل زیستی در شرایط تنش شوری باشد. در پژوهشی که توسط کریمی[xxvii] و همکاران (31) انجام شد، شوری تأثیر مثبت بر ویژگی کنترل زیستی دو جدایه استرپتومایسس متحمل به نمک داشت. یکی از این دو جدایه تولیدکننده اکتوئین بود (17). نتایج نشان می‏دهند که شوری تأثیر چندانی بر تولید لیپاز در تیمار شاهد ندارد. اما اثر مثبت تیمار اکتوئین و هیدروکسی بر تولید لیپاز را کاهش می‏دهد. اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین صرف نظر از شوری موجب افزایش میزان لیپاز می‏شوند و همین افزایش می‏تواند علت افزایش ویژگی بازدارندگی باکتری رشدیافته در حضور اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین در مقایسه با آب مقطر باشد. در مورد پروتئاز شوری باعث کاهش تولید پروتئاز در هر سه تیمار می‏شود و می‏تواند یکی از علت‏های کاهش بازدارندگی باشد. اکتوئین در هر سه غلظت شوری موجب کاهش تولید پروتئاز نسبت به شاهد شدند و بنابراین، تولید پروتئاز ساز و کاری نیست که از طریق آن اکتوئین بازدارندگی را در شرایط شوری تعدیل می‌کند. در پژوهش حاضر، شوری 300 میلی‏مولار باعث افزایش تولید سیانید هیدروژن در هر سه تیمار شد. دشوال و کومار[xxviii] (32) گزارش کردند که گونه‏های مختلف سودوموناس در غلظت‏های صفر تا یک درصد کلرید سدیم سیانید هیدروژن را به میزان بهینه تولید می‏کنند اما با افزایش غلظت کلرید سدیم از 25/1 به 25/2 درصد زمان تولید این متابولیت از 24 ساعت به 48 ساعت می‏رسد. اکتوئین به همراه نمک (300 میلی‏‏مولار) بیش‏ترین تأثیر مثبت را بر تولید سیانید هیدروژن می‏گذارد. بنابراین، تولید سیانید هیدروژن هم می‏تواند یکی از علت‏های افزایش ویژگی بازدارندگی باکتری رشد یافته در حضور اکتوئین در مقایسه با آب مقطر باشد. شوری باعث کاهش شدید و ناگهانی سیدروفور در هر سه تیمار اسمولیت شد. دشوال و کومار (32) نیز گزارش کردند که در گونه‏های مختلف سودوموناس تولید سیدروفور در غلظت‏های بیشتر از یک درصد کلرید سدیم به تأخیر می‏افتد. در پژوهشی که توسط تانک و ساراف[xxix] (33) انجام شد، تولید سیدروفور توسط گونه‏هایی از سودوموناس حتی در حضور 6 درصد کلرید سدیم انجام شد، اما زمان تولید سیدروفور از 30 ساعت به 72 ساعت افزایش یافت که می‏تواند توسط تأثیر کلرید سدیم بر رشد جدایه‏ها توجیه شود. مطابق گزارش خاره و همکاران (26)، با افزایش غلظت کلرید سدیم (از صفر تا 500 میلی‏مولار) کاهش رشد باکتری به کاهش تدریجی غلظت سیدروفور تولید‏شده توسط سویه UTPF5 منجر شد. اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین اگر چه این کاهش را در غلظت 150 میلی‏مولار نمک تعدیل می‌کنند، اما توانایی تعدیل آن را در غلظت 300 میلی‏مولار ندارند. اگرچه شوری تشکیل بیوفیلم توسط باکتری را کاهش داد، اما تیمار اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین همراه با نمک موجب افزایش تشکیل بیوفیلم شد. بنابراین، ممکن است یکی دیگر از علت‏های تعدیل ویژگی بازدارندگی باکتری رشدیافته در حضور اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین در مقایسه با آب مقطر در غلظت 300 میلی‏مولار تأثیر مثبت این دو اسمولیت بر تشکیل بیوفیلم باشد. به طور کلی، می‏توان نتیجه گرفت که اکتوئین و هیدروکسی‏اکتوئین احتمالا با تأثیر بر تولید لیپاز، سیانید هیدروژن و تشکیل بیوفیلم موجب تعدیل کاهش کنترل زیستی ایجاد‏شده در اثر شوری می‏شوند. انتقال ژن‌های سنتزکننده اکتوئین به باکتری‌هایی که توانایی بازدارندگی خوبی در شرایط غیر‏شور دارند و یا استفاده از آنتاگونیست‏هایی که تولیدکننده اکتوئین نیز هستند ممکن است آثار منفی ناشی از تنش شوری یا حتی سایر تنش‏های محیطی بر ویژگی‏های بازدارندگی را کاهش دهد.



[1]- Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR)

[2]- Strain

[3]- In vitro

[4]- Pseudomonas fluorescens

[5]- Plant probiotic bacteria

[6]- Ectothiorhodospira halochloris

[7]- Bacillus subtilis

[8]- Escherichia coli

[9]- Pantoea agglomerans

[10]- Bacillus amyloliquefaciens

[11]- Nutrient Agar (NA)

[12]- Keel

[13]- Potato Dextrose Agar (PDA)

[14]- Fusarium solani

[15]- Nutrient Broth (NB)

[16]- Shad

[17]- Maurhofer

[18]- Skim Milk Agar (SMA)

[19]- Alstrom and Burnz

[20]- Castaneda

[21]- cfu

[22]- Planktonic

[23]- OD

[24]- LSD

[xxv]- Khare

[xxvi]- Macrophomina phaseolina

[xxvii]- Karimi

[xxviii]- Deshwal and Kumar

[xxix]- Tank and Saraf

 

 

(1)               Weller DM., Raaijmakers JM., McSpadden- Gardener BB., Thomashow LS. Microbial populations responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annals Review of Phytopathology 2002; 40: 309- 48.

(2)                Beneduzi A., Ambrosini A., Passaglia LMP. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): Their potential as antagonists and biocontrol agents. Genetics and Molecular Biology 2012; 35 (4): 1044- 51.

(3)                Haas D., Defago G. Biological control of soil-borne pathogens by fluorescent pseudomonads. Nature Reviews Microbiology 2005; 3 (4): 307-9.

(4)                O’Sullivan DJ., O’Gara F. Traits of fluorescent Pseudomonas spp. involved in suppression of plant root pathogens. Microbiology and Molecular Biology Review 1992; 56 (4): 662- 76.

(5)               Glick BR. The enhancement of plant-growth by free living bacteria. Canadian Journal of Microbiology 1995; 41 (2): 109- 17.

(6)               Vidhysaekaran P., Muthamilan M. Evaluation of a powder formulation of Pseudomonas fluorescens Pf1 for control of rice sheath blight. Biocontrol Science and Technology 1999; 9 (1): 67- 74.

(7)                Kloepper JW., Leong J., Teintze M., Schroth MN. Pseudomonas siderophores: a mechanism explaining disease-suppressive soils. Current Microbiology 1980; 4 (5): 317- 20.

(8)               Thomashow LS., Weller DM. Role of antibiotics and siderophores in biocontrol of take-all disease of wheat. Plant Soil 1990; 129 (1): 93- 99.

(9)                Keel C., Voisard C., Berling CH., Kahr G., Défago G. Iron sufficiency, a prerequisite for the suppression of tobacco black root-rot by Pseudomonas fluorescens strain CHA0 under gnotobiotic conditions. Phytopathology 1989; 79 (5): 584- 9.

(10)           Nielsen MN., Sorensen J. Chitinolytic activity of Pseudomonas fluorescens isolates from barley and sugar beet rhizosphere. FEMS Microbiology Ecology 1999; 30 (3): 217- 27.

(11)           Bogino PC., Oliva Mde L., Sorroche FG., Giordano W. The role of bacterial biofilms and surface components in plant-bacterial associations. International Journal of Molecular Science 2013; 14 (8): 15838- 59.

(12)            Whipps JM. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. Journal of Exprimental Botany 2001; 52 (1): 487- 511.

(13)           Blumer C., Haas D. Mechanism, regulation, and ecological role of bacterial cyanide biosynthesis. Archives of Microbiology 2000; 173 (3): 170- 77.

(14)            Ahmadzadeh M. Biological control of plant diseases: plant probiotic bacteria. First edition. Tehran: University of Tehran Press; 2012.

(15)            Khmelenina VN., Mustakhimov II., Reshetnikov AS., Kalyuzhnaya MG., Trotsenko A. Genetic and biochemical aspects of ectoine biosynthesis in moderately halophilic and halotolerant methylotrophic bacteria. American Journal of Agricultural and Biological Sciences 2010; 4 (5): 446- 58.

(16)           Galinski EA., Pfeiffer HP., Truper HG. 1, 4, 5, 6- Tetrahydro- 2- methyl- 4- pyrimidinecarboxylicacid, a novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic bacteria of the genus Ectothiorhodospira. European Journal of Biochemistry 1985; 149 (1): 135- 9.

(17)           Sadeghi A., Soltani BM., Khayam nekouie M., Salehi Jouzani G., Hadavand Mirzaei H., Sadeghizadeh M. Diversity of the ectoines biosynthesis genes in the salt tolerant Streptomyces and evidence for inductive effect of ectoines on their accumulation. Microbiological research 2014; 169 (9- 10): 699- 708.

(18)            Pastor JM., Salvador M., Argandona M., Bernal V., Reina- Bueno M., Csonka LN., et al. Ectoines in cell stress protection: uses and biotechnological production. Biotechnology Advances 2010; 28 (6):782- 801.

(19)           Afsharmanesh H., Ahmadzadesh M., Javan Nikkah M., Behboudi K. Characterization of the antagonistic activity of a new indigenous strain of pseudomonas fluorescens isolated from onion rhizosphere. Journal of Plant Pathology 2010; 92 (1): 187- 94.

(20)           Keel C., Weller DM., Natsch A., D´efago G., Cook RJ., Thomashow LS. Conservation of the 2, 4-diacetylphloroglucinol biosynthesis locus among fluorescent Pseudomonas strains from diverse geographic locations. Applied and Environmental Microbiology 1996; 62 (2): 552- 63.

(21)           Schaad NW., Jonse JB., Chun W. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. 3rd edition. USA: APS Press; 2001.

(22)           Maurhofer M., Keel C., Defago G. Infuence of plant species on disease suppression by Pseudomonas fluorescens strain CHA0 with enhanced production. Plant Pathology 1995; 44 (1): 40- 50.

(23)           Alstrom S., Burns RG. Cyanide production by rhizobacteria as a possible mechanism of plant growth inhibition. Biology and Fertility of Soils 1989; 7 (3): 232- 8.

(24)           Castaneda GC., Munoz TJJ., Videa JRP. A spectrophotometric method to determine the siderophore production by strains of fluorescent Pseudomonas in the presence of copper and iron. Journal of Microchemical 2005; 81 (1): 35- 40.

(25)           Fletcher M. The effects of culture concentration and age, time, and temperature on bacterial attachment to polystyrene. Canadian Jornal of Microbiology 1977; 23 (1): 1- 6.

(26)           Khare E., Singh S., Maheshwari D K., Arora NK. Suppression of charcoal rot of chickpea by fluorescent Pseudomonas under saline stress condition. Current Microbiology 2011; 62 (5): 1548- 53.

(27)           Tewari S., Arora NK. Multifunctional exopolysaccharides from Pseudomonas aeruginosa PF23 involved in plant growth stimulation, biocontrol and stress amelioration in sunflower under saline conditions. Current Microbiology 2014; 69 (4): 484- 94.

(28)           Principe A., Alvarez F., Castro MG., Zachi L., Fischer SE., Mori GB., et al. Biocontrol and PGPR features in native strains isolated from saline soils of srgentina. Current Microbiology 2007; 55 (4): 314- 22.

(29)           Kumar GP., MH Ahmad SK., Desai S., Amalraj ELD., Rasul A. In vitro Screening for abiotic stress tolerance in potent biocontrol and plant growth promoting strains of Pseudomonas and Bacillus spp. International Journal of Bacteriology 2014: 1- 6.

(30)           Rangarajan S., Saleena LM., Vasudevan P., Nair S. Biological suppression of rice diseases by Pseudomonas spp. under saline soil conditions. Plant and Soil 2003; 251 (1): 73- 82.

(31)           Karimi E., Sadeghi A., Abbaszade-Dehaji P., Dalvand Y., Omidvari M., Kakuei-Nezhad M. Biocontrol activity of salt tolerant Streptomyces isolates against phytopathogens causing root rot of sugar beet. Biocontrol Science and Technology 2012; 22 (3): 333- 49.

(32)           Deshwal VK., Kumar P. Effect of salinity on growth and PGPR activity of Pseudomonads. Journal of Academia and Industrial Research 2013; 2 (6): 353- 56.

(33)           Tank N., Saraf M. Salinity-resistant plant growth promoting rhizobacteria ameliorates sodium chloride stress on tomato plants. Journal of Plant Interaction 2010; 5 (1): 51- 8.