بررسی فعالیت ضد‏میکروبی عصاره متانولی گلسنگ فولجنسیا فولجنس در شرایط in vitro و in vivo

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار زیست ‏شناسی، دانشگاه ایلام، ایران

2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران

چکیده

مقدمه: مقاومت روز افزون باکتری‏ها (به ویژه استافیلوکوکوس اورئوس‏) به انواع آنتی‏بیوتیک‏ها به ویژه پنی‏سیلین و متی‏سیلین سبب شده است که دانشمندان همیشه به دنبال یافتن دارو‏های جدید باشند.

مواد و روش ‏‏ها: 600گرم فولجنسیا فولجنس از کوه‏های کان‏گنبد در استان ایلام جمع‏آوری و عصاره متانولی آن با استفاده از سوکسله تهیه شد. خواص ضد‏باکتری عصاره در شرایط in vitro به روش انتشار دیسک و میکرودایلوشن (با تعیین MIC و MBC) روی دو باکتری گرم مثبت (استافیلوکوکوس اورئوس‏ و انتروکوکوس فکالیس‏) و دو باکتری گرم منفی (سودوموناس آئروجینوزا و اشریشیا کلی) بررسی شد. برای تعیین اثرات ضد‏باکتری در شرایط
in vivo، زخمی روی سطح پشتی موش ایجاد و به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس آلوده شد. سپس، موش‏‏ها به طور تصادفی به سه گروه تقسیم شدند: کنترل، تحت درمان با پماد تترا سایکلین و تحت درمان با پماد10 درصد عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس. در نهایت، مساحت زخم در روز‏های سوم، پنجم، هفتم، نهم و یازدهم اندازه‏گیری شد.‏‏‏

نتایج: میانگین قطر هاله عدم رشد عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس بر علیه استافیلوکوکوس اورئوس‏ بین 21/11 میلی‏متر تا 01 /33 میلی‏متر بود. با توجه به اندازه سطح زخم در روز یازدهم می‏توان نتیجه گرفت که تفاوت معناداری بین گروه کنترل (63/0 سانتی‏متر مربع) و دوگروه درمان (0) وجود داشت (05/0 P value<). در حالی‏که بین گروه تحت درمان با پماد تتراسایکلین و گروه تحت درمان با پماد 10 درصد عصاره تفاوت معناداری وجود نداشت. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: با توجه به نتایج، عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس می‏تواند جایگزین آنتی‏بیوتیک‏های شیمیایی در درمان عفونت‏هایی مانند استافیلوکوکوس اورئوس‏ باشد.‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Survey of Antibacterial Effect of Methanolic Extract of Fulgensia fulgens through in Vitro and in Vivo Conditions

نویسندگان [English]

  • Tahereh Valdbeigi 1
  • Somaye Rashki 2
1 Associate Professor of Biology- Lichenology, Ilam University, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, Ilam University, Iran
چکیده [English]

Introduction: Daily increasing of bacteria resistance (specially Staphylococcus aureus) to various antibiotics in particular penicillin and methicillin has always led the scientists to look for new medicines.

Materials and methods: 600 g of Fulgensia fulgens was collected from KaneGonbad mountains in Ilam province, the methanol extract was prepared by soxhle. In vitro antimicrobial activity of the extract against two gram-positive bacteria (S. aureus and Entrococcus faecalis) and two gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa and Escherchia coli) was tested by the use of disc diffusion method and microdilution (with determination of MIC and MBC). Wound was made on the dorsal surface of therat and wound infections caused by S.aureus for determination of in vivo antibacterial effect. Than rats were randomly divided into three groups; control, treated with tetracycline ointment and treated with 10% ointment of F. fulgens extract. Finally, wound areas wear measured on days 3, 5, 7, 9 and 11.

Results: Average inhibitory zone diameter of methanolic F. fulgens extract against S. aureus ranged between 11.21 mm to 33.01 mm. According to the wound area on 11th day, it could be concluded that there was a statistically significant difference between the control group (0.63 cm2) and two treatment groups (0) (p<0.05). There was no significant difference between a group treated with tetracycline ointment and a group treated with 10% ointment of extract.

Discussion and conclusion: According to the results, the methanol extract of F. fulgens in the treatment of infections as S. aureus can be replaced by chemical antibiotics.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ointment tetracycline
  • Staphylococcus aureus
  • Methanol
  • wound
  • Rat

مقدمه.

امروزه یکی از عوامل مهم شکست درمان عفونت‏ها، مقاومت میکروبی به آنتی‏بیوتیک‏ها به علت استفاده بی‏رویه از داروهای ضد‏میکروبی است (1). به عبارت دیگر با تجویز آنتی‏بیوتیک در مقادیر بالا نه تنها نتیجه‏ای حاصل نمی‏شود بلکه عفونت پایدار می‏ماند. میکروب‏ها با ایجاد ژن مقاوم در برابر آنتی‏بیوتیک‏ها این مقاومت را از نسلی به نسل دیگر یا حتی از یک گونه به گونه دیگر منتقل می‏کنند. در این بین، استافیلوکوکوس اورئوس‏[1] یکی از عوامل شایع عفونت‏های بیمارستانی به ویژه عفونت‏های زخم‏ها پس از عمل جراحی است (2). با گسترش روز افزون مقاومت آنتی‏بیوتیکی و همچنین، پیدایش سویه‏های مقاوم، روز به روز تعداد آنتی‏بیوتیکی‏های در دسترس برای درمان عفونت این باکتری کاهش می‏یابد (3).این مسأله سبب شده است تا بشر همواره به فکر جایگزین کردن عوامل ضد‏میکروبی مؤثر و با عوارض جانبی کمتر به جای مواد ضد‏میکروبی با اثر کمتر و عوارض ناخواسته بیشتر باشد (4).

عفونت با مکانیسم‏های مختلف، توانایی زخم برای التیام (خود به خودی) را مختل می‏سازد. به طوری‏که تمامی مراحل التیام زخم تحت تأثیر عفونت قرار می‏گیرند. به طور کلی عفونت سبب کاهش Po2 در زخم و طولانی شدن مرحله التهابی می‏‏شود‏. همچنین، عفونت شدید (وجود بیش از 105 باکتری) موجب اختلال در کموتاکسی، مهاجرت و فاگوسیتوز گویچه‏های قرمز می‏شود. افزون بر این‏ باکتری‏ها سبب می‏شوند تا فرایند رگ‏زایی و اپی‏تلیازه شدن مختل ‏‏شود‏. در نهایت، کلاژناز مشتق از باکتری‏ها، کلاژن‏های موجود در زخم را می‏شکند و مقاومت و توان انقباضی زخم را کاهش می‏دهد (5).

استافیلوکوکوس اورئوس‏ یک باکتری بیماری‏زای گرم مثبت است که گستره وسیعی از عفونت‏های ساده پوستی تا بیماری‏های اندوکاردیت، سندرم شوک سمی و سپتی‏سمی را ایجاد می‏کند. افزون بر این،‏ این باکتری یکی از عوامل شایع عفونت های پوستی پس از عمل جراحی است (6). گونه‏های باکتریایی زیادی قادرند باعث عفونت زخم شوند اما طبق مطالعات انجام گرفته معمول‏ترین باکتری جدا شده از زخم، استافیلوکوکوس اورئوس‏ است (7). این باکتری با مکانیسم‏های متفاوتی مانع از انجام مراحل ترمیم زخم می‏شود. سویه‏های بیماری‏زای این باکتری با تولید پیگمان استافیلوگزانتین نقش مهمی در بیماری‏زایی ایفا می‏کنند (8)؛ زیرا به عنوان آنتی‏اکسیدن عمل کرده و موجب در امان ماندن باکتری در برابر رادیکال‏های آزاد اکسیژن می‏شوند. شایان ذکر است که رادیکال‏های آزاد اکسیژن توسط سیستم ایمنی میزبان برای ازبین بردن باکتری‏ها تولید می‏شوند (9). از عوامل دیگری که سبب به تأخیر افتادن ترمیم زخم می‏شود می‏توان به بیوفیلم اشاره کرد. تشکیل بیوفیلم زمانی رخ می دهد که باکتری به سطح زخم متصل شود یا تشکیل میکروکلونی دهد. سپس، در یک ماتریکس خارج سلولی فرو می‏رود و باکتری‏ها در آن رشد می کنند و بالغ می‏شوند و در این‏حال خارج شدن از میزبان سخت است (10).همچنین، این باکتری، پروتئین چسبنده خارج سلولی[2] را بیان و ترشح می‏کند. این پروتئین با اختلال در فعالیت لکوسیت‏ها و ممانعت از انجام فرآیند التهاب باعث طولانی‏تر شدن روند ترمیم زخم می‏شود (11). التهاب دومین مرحله از مراحل ترمیم زخم است. ماکروفاژها نقش مهمی در پاسخ‏های التهابی بر عهده دارند. آن‏ها فعالیت‏های کلاسیکی را با لیپوپلی‏ساکاریدها و عامل نکروز کننده آلفا انجام می‏دهند که باعث تولید اکسید نیتریک سنتتاز و اکسید نیتریک می‏شوند و فعالیت آن‏ها به التهاب منجر می‏‏شود‏ (12). یا ممکن است فعالیت‏های دیگری را توسط اینترلوکین-4 و اینترلوکین-10 انجام دهند. در این‏ شکل فعالیت آن‏ها سبب تولید L-اورنتین می‏شود که پیش‏ساز مهمی برای رشد سلول‏ها و سنتز کلاژن در بهبود زخم است. بنابراین، پروتئین چسبنده خارج سلولی با داشتن ویژگی ضد‏التهابی مسؤول طولانی‏ترشدن فرآیند ترمیم زخم آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس است (13). امروزه به علت بالا بودن میزان عوارض جانبی دارو‏های شیمیایی و همچنین، مقاوم شدن بسیاری از میکروب‏ها به این داروها توجه بسیاری به منابع گیاهی به ویژه، گلسنگ‏ها معطوف شده است.

گلسنگ ارتباط بین قارچ و جلبک سبز و یا سیانوباکتر است. این موجودات ترکیبات شیمیایی متنوعی (مانند مشتقات پلی کتید[3]؛ دپسیدها[4] و دپسیدون‏ها[5]) دارندکه به ندرت در ارگانیسم‏های دیگر گزارش شده است. برای مثال آثار آنتی‏بیوتیکی اسنیک اسید[6] (یکی از ترکیبات مهم گلسنگ‏ها) در درمان زخم‏های موضعی و سوختگی‏ها بسیار مؤثرتر از پنی‏سیلیوم[7] است (14). همچنین، دی بنزوئیل‏اسنیک اسید[8]خواص مهار کنندگی قابل توجهی علیه استافیلوکوکوس اورئوس‏ و سودوموناس آئروجینوزا‏[9]دارد (15). از جمله ترکیبات گلسنگ که اثر درخور توجهی بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس‏ دارد می توان به الکتوسارمنتین[10]، اورنیک اسید[11]، متیل ß- ارسلینات[12]و مشتقات اسنیک اسید اشاره کرد. به طور کلی بارباتیک[13] و اسنیک اسید به عنوان ترکیبات مؤثر علیه میکروارگانیسم‏ها و همچنین، سلول‏های سرطانی و توموری شناخته شده‏اند (16). اگرچه ابتدا گلسنگ‏ها در فارماکوپه‏های سنتی با ارزش دانسته شدند ولی ارزش آن‏ها در صنعت داروسازی به علت مشکلات در کشت‏های آکسنیک[14] طراحی شده و محدودیت‏های رشد نادیده گرفته شد (17). امروزه این ارگانیسم‏ها به ویژه در کشورهای اروپا و آمریکا، با برطرف شدن مشکلات یاد شده دوباره اهمیت ویژه‏ای یافته اند. به طور کلی، در زمینه کاربرد دارویی گلسنگ‏ها در ایران و همچنین، خواص ترمیم زخم گونه مورد نظر در دنیا مطالعه مؤثری انجام نشده است. بنابراین، در پژوهش حاضر به بررسی آثار دارویی این گلسنگ بومی ایران به ویژه خواص ضد باکتریایی و ترمیم زخمی پرداخته شده است. به این امید که زمینه مناسبی برای پژوهش در این راستا در کشور فراهم شود.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

in vitro:

.جمع‏آوری و شناسایی گونه گلسنگ و تهیه عصاره: 600 گرم گلسنگ فولجنسیا فولجنس از کوه‏های کان‏گنبد در استان ایلام جمع‏آوری شد (هرباریوم دانشگاه شهید بهشتی، شماره 48). سپس، با استفاده از کلید شناسایی استاندارد و همچنین، مقایسه با نمونه‏های معتبر در هرباریوم برلین (B) و مونیخ (M) شناسایی شد (18). نمونه‏ها پس از شستشو و خشک شدن در سایه، به شکل پودر درآمدند و عصاره متانولی آن‏ها با استفاده از سوکسله تهیه شد (19).

باکتری: باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس ATCC1885، سودوموناس آئروجینوزا‏PTCC1047، انتروکوکوس فکالیس‏[15]PTCC2321 و اشریشیاکلی[16]PTCC1652 از مرکز کلکسیون باکتری ایران تهیه شد. سوسپانسیون نیم‏مک‏فارلندی
(cfu/ml 108 ×5/1) از باکتری‏ها بر روی محیط کشت مانیتول سالت آگار به شکل خطی کشت داده شد. سپس، به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور قرارگرفت (18).

تاثیر عصاره متانولی بر باکتری: برای بررسی فعالیت ضد‏میکروبی از غلظت‏های 63، 125، 250، 500 و 1000 میلی‏گرم عصاره استفاده شد. سپس، عصاره در دی‏متیل‏سولفوکساید 10 درصد حل و دیسک پیپرپلانک تهیه شده از شرکت رکین به رقت‏های تهیه شده اضافه شد. در ادامه دیسک‏ها در آون 35 درجه قرار داده شد تا خشک شوند (19). سوسپانسیون نیم‏مک‏فارلندی باکتری در محیط کشت مولر هینتون آگار به شکل چمنی کشت داده شد (20). با روش استاندارد انتشار دیسک، دیسک‏ها در فاصله 5/1 سانتی‏متر از یکدیگر در محیط کشت قرار داده شدند (21). در نهایت، محیط کشت به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور قرار گرفت. پس از 24 ساعت قطر هاله‏ها خوانده شد (22).

تعیین مقدار MIC[17] وMBC[18]: تعیین حداقل غلظت مهار‏کنندگی (MIC) طبق دستور العمل CLSI بااستفاده از پلیت‏های 96 خانه‏ای استریل و روش براث میکرودایلوشن انجام شد (23).ابتدا محیط نوترینت براث و سپس، رقت‏های تهیه شده عصاره به هر چاهک‏ اضافه شد (50 میکرولیتر). همچنین، در دو چاهک انتهایی آنتی‏بیوتیک به همراه محیط کشت به عنوان کنترل مثبت و در دو چاهک نیز فقط محیط کشت به عنوان کنترل منفی ریخته شد. سپس، به تمام چاهک‏ها سوسپانسیون میکروبی اضافه شد. در انتها، پلیت‏ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه قرار گرفت. سپس با مقایسه کدورت چاهک‏ها با چاهک‏های کنترل، میزان MIC مشخص شد (24). به این ترتیب که نخستین چاهک بدون کدورت به عنوان حداقل غلظت بازدارنده ( (MIC به شکل میلی‏گرم بر میلی‏لیتر گزارش شد. از چاهک‏هایی که رشد باکتری در آن‏ها کاملا متوقف شده بود 10 میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده شد. سپس، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد. پس از 24 ساعت غلظتی که در آن رشدی دیده نشد به عنوان MBC عصاره برای باکتری مورد نظر گزارش شد (25).

 in vivo:

باکتری: از باکتری استافیلوکوکوس اورئوسATCC1885 که از مرکز کلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های ایران تهیه شده بود استفاده شد. سوسپانسیون نیم‏مک‏فارلندی (cfu/ml 108 ×5/1) از باکتری روی محیط کشت مانیتول سالت آگار به شکل خطی کشت شد. سپس، باکتری به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در انکوباتور قرارگرفت. در نهایت، باکتری کشت شده در سرم فیزیولوژی حل شد (26).

تهیه پماد: برای تهیه پماد 10 درصد، یک گرم عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس خشک با 9 گرم پایه پماد مخلوط شد (27).

حیوانات: در این مطالعه از 15 سر موش‏ نر نژاد ویستار استفاده شد. موش‏‏ها در دمای 20 تا 24 درجه سانتی‏گراد و سیکل روشنایی و تاریکی 12:12 ساعت نگهداری شدند. تمام مراحل این پژوهش با در نظر گرفتن اصول اخلاقی حاکم بر کاربرد حیوانات آزمایشگاهی انجام شد.

ایجاد زخم: موش‏‏ها با استفاده از داروی بی‏هوشی دی‏کلرواتان بی‏هوش شدند. سپس، موهای ناحیه پشتی موش‏ با استفاده از تیغ جراحی تراشیده شد. پس از آن با استفاده از تیغ جراحی زخمی به طول 5 سانتی‏متر ایجاد شد (عمق زخم در همه گروه‏ها یکسان بود). روز جراحی روز صفر در نظر گرفته شد (شکل 1). پس از ایجاد زخم، سوآپ استریل به باکتری حل شده در سرم فیزیولوژی آغشته شد. سپس سطح زخم با سوآپ، به استافیلوکوکوس اورئوس آلوده شد (28).

موش‏‏ها پس از ایجاد زخم به طور تصادفی به سه گروه ذیل تقسیم شدند:

1) گروه کنترل (A).

2) گروه تحت درمان با پماد تتراسایکلین (B).      

3) گروه تحت درمان با پماد تهیه شده از عصاره فولجنسیا فولجنس (C).

از زخم‏ها قبل از تجویز هر دارو با دوربین دیجیتال عکس تهیه شد. برای محاسبه مساحت زخم برای بررسی مورفومتریک از نرم‏افزار تحلیل تصاویر فرآیند التیام زخم 20001.2MoticImagesاستفاده شد (29).

تحلیل آماری داده‏ها: داده‏های بدست آمده با استفاده از نرم افزار SPSS21ارزیابی شدند. برای مقایسه نتایج از آزمون واریانس یک طرفه و آزمون توکی[19] استفاده شد. نتایج به شکل میانگین ±انحراف معیار ارایه شد. اختلافات بین داده‏ها با در نظر گرفتن 05/0P value< به عنوان اختلاف معنا‏‏دار در نظر گرفته شد.


نتایج.

in Vitro: میانگین قطر هاله‏های عدم رشد حاصل از تأثیر غلظت‏های 125 تا 1000 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس بر باکتری‏های مورد مطالعه نشان داد که عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس بیش‏ترین اثر را علیه استافیلوکوکوس اورئوس‏ با قطر هاله (01/33 میلی‏متر) داشت و بر انتروکوکوس فکالیس‏ اثری نداشت (جدول 1 و شکل 2). طبق جدول 2 عصاره در غلظت 250 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اثر باکتریسدال (کشندگی) بر باکتری استافیلوکوکوس اورئوس‏ داشت و بر باکتری انتروکوکوس فکالیس‏ اثری ضدباکتریایی مشاهده نشد.

 

 

شکل 1- روز صفر جراحی

 

 

جدول 1- میانگین قطر هاله عدم رشد (میلی‏متر) و انحراف معیارحاصل از تاثیر عصاره فولجنسیا فولجنس بر باکتری‏های مورد بررسی

*غلظت عصاره

باکتری

125

250

500

1000

P. aeruginase

56/0±02/8

27/0±21/9

06/0±1/14

08/0±3/18

E. coli

07/0±59/7

51/0±9

02/0±46/11

12/0±22/20

E. paecalis

0±6

0±6

0±6

0±6

S. aureus

17/0±21/11

22/0±20

40/0±61/26

17/0±01/33

* میلی‏گرم بر میلی‏متر

جدول 2- مقدارMICوMBC (میلی گرم بر میلی لیتر) عصاره فولجنسیا فولجنس بر علیه باکتری‏های مورد بررسی

باکتری

MIC

MBC

S. aureus

125

250

E. paecalis

n

n

E. coli

500

500

P. aeruginase

1000

1000

:n فاقد اثر عصاره روی باکتری

 

شکل 2- اثر عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس روی  اشریشیا کلی (A) ، انتروکوکوس فکالیس (B)، استافیلوکوکوس اورئوس‏ (C) و سودوموناس آئروجینوزا .(D)

 


 in vivo: همان‏طور که در شکل 4 مشاهده می‏شود، وسعت سطح زخم در گروه کنترل در روزهای سوم تا پنجم بعد از ایجاد زخم روند افزایشی داشت. در روز‏های بعدی نیزسطح زخم به کندی کاهش یافت، به گونه‏ای که طبق مشاهدات در روز یازدهم زخم درمان نشد (شکل 3، A). نتایج کلونی‏کانت در گروه کنترل نشان داد که تا روز یازدهم باکتری همچنان در سطح زخم وجود داشت و هیچ اثری از کاهش کلونی‏ها یافت نشد (جدول 4). در گروه تحت درمان با آنتی‏بیوتیک از روز سوم تا یازدهم وسعت سطح زخم روند کاهشی چشم‏گیری داشت (شکل 4 و جدول 3). به طوری‏که زخم در روز یازدهم به طور کامل ترمیم شد (شکل 3، B). نتایج کلونی‏کانت این موضوع را تایید می‏کند به طوری که با از بین رفتن باکتری در روز یازدهم ترمیم زخم به طور کامل انجام گرفت‏ (جدول 4). همچنین، در همه روز‏های مورد مطالعه از نظر آماری اختلاف معنا‏‏داری در سطح (05/0P value<) با گروه کنترل وجود داشت. در گروه تحت درمان با پماد 10 درصد، سطح زخم از روز سوم تا یازدهم کاهش چشم‏گیری نشان داد (شکل 4 و جدول 3). به طوری که در روز یازدهم زخم بهبود یافت (شکل 3، C). همچنین، نتایج کلونی‏کانت کاهش چشم‏گیری در تعداد کلونی‏ها از روز سوم تا یازدهم نشان داد (جدول 4). به طوری‏که در روز یازدهم اثری از باکتری در سطح زخم یافت نشد و ترمیم کامل زخم شکل گرفت. همچنین، اختلاف معناداری در سطح (05/0P value <) با گروه کنترل وجود داشت. در حالی‏که بین گروه دوم (شکل 3، B) و سوم (شکل 3، C) اختلاف معناداری در سطح
(05/0P value <) مشاهده نشد. به طور کلی، رابطه مستقیمی بین تعداد کلونی‏ها و مساحت زخم وجود داشت به طوری‏که با کاهش تعداد کلونی‏ها از اندازه سطح زخم کاسته شد و با از بین رفتن کامل باکتری‏ها زخم به طور کامل بهبود یافت.

 

 

شکل 3- وضعیت بهبود زخم (از چپ به راست) در روزهای هفتم، نهم و یازدهم در گروه کنترل (A)، تحت درمان با پماد تتراسایکلین (B) و گروه تحت درمان با پماد 10 درصد عصاره فولجنسیا فولجنس (C).

جدول 3- میانگین مساحت زخم (سانتی‏متر مربع) و انحراف معیار در روزهای سوم تا یازدهم در گروه کنترل (A)، گروه تحت درمان با پماد تتراسایکلین (B) و گروه تحت درمان با پماد 10 درصد فولجنسیا فولجنس (C).

روز

گروه

سوم

پنجم

هفتم

نهم

یازدهم

A

05/0±24/1

05/0±61/1

03/0±94/0

05/0±72/0

06/0±63/0

B

02/0±62/1

03/0±42/1

02/0±61/0

03/0±02/0

0

C

01/0±96/1

02/0±92/0

03/0±34/0

05/0±07/0

0

 

جدول4- نتایج شمارش کلونی‏ها (برحسب (CFU در گروه‏های کنترل (A)، تحت درمان با پماد تتراسایکلین (B) و تحت درمان با پماد 10 درصد (C)در روز‏های دوم تا یازدهم پس از ایجاد زخم.

روزهای مورد مطالعه

گروه

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

A

*غ

غ

غ

غ

غ

275

210

165

125

105

B

غ

غ

275

210

142

76

38

15

0

0

C

غ

غ

210

130

94

63

35

15

0

0

*غیر قابل شمارش

 

 

شکل 4- نمودار روند بهبود زخم در روزهای هفتم، نهم و یازدهم گروه کنترل (A)، تحت درمان با پماد تترسایکلین (B) وگروه تحت درمان با پماد 10 درصد عصاره فولجنسیا فولجنس (C).

 

 


بحث و نتیجه ‏‏گیری.

در زمینه خواص ترمیم زخم گونه‏های گلسنگ بومی ایران و همچنین، گونه فولجنسیا فولجنس در شرایط in vivo در دنیا تا کنون مطالعه‏ای انجام نشده است. فقط فعالیت ضدباکتری این گونه در شرایط
in vitro توسط رانکوویک[xx] و همکاران در سال 2010، بررسی شده است (30). نتایج آن‏ها فاقد آثار آنتی‏باکتریال در خور توجه برای گونه مورد نظر است. در حالی که نتایج مطالعه حاضر در شرایط in vitro نشان می‏دهد که عصاره فولجنسیا فولجنس فعالیت ضدباکتری قابل توجهی علیه باکتری‏های اشریشیا کلی، سودوموناس آئروجینوزا‏ و استافیلوکوکوس اورئوس‏ داشته و در شرایط in vivo (ترمیم زخم) سبب از بین بردن باکتری استافیلوکوکوس اورئوس‏ در سطح زخم شده (هما‏ن‏طور که در مقدمه اشاره شد باکتری استافیلوکوکوس اورئوس‏ با مکانیسم‏های مختلفی سبب تاخیر در روند التیام زخم می‏‏شود‏) و در مدت زمان کمی (11 روز) زخم به طور کامل التیام می‏‏شود‏. علت این تناقض را می‏توان به این شکل توضیح داد که وجود ترکیبات ضدباکتری در بسیاری از گونه‏ها، به کلیمان و میکروکلیمان‏ها وابسته است. برای مثال
Cladiaaggregata دارای بارباتیک اسید[xxi] به عنوان متابولیت اصلی است. درحالی‏که وجود ترکیبات دیگر مانند استیک تیک[xxii]، نورستیک تیک[xxiii] و پروتوستراریک اسید[xxiv]در ریسه به محیط و شرایط اکولوژی وابسته است (7). به همین علت به نظر می رسد که گونه ایرانی دارای ترکیبات ثانویه ویژه‏ای ناشی از شرایط منحصر به فرد اکولوژیک بوده که خواص آنتی‏باکتریال و ترمیم زخمی آن را سبب می‏شود. بنابر این انجام تحلیل‏های شیمیایی (کروماتوگرافیHPLC یاGC-MASS) برای تعیین مواد موثره ریسه این گونه در مطالعات آتی پیشنهاد می‏شود.

مقایسه میانگین قطر هاله‏های عدم رشد حاصل از تأثیر غلظت‏های 63 تا 1000 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره متانولی فولجنسیا فولجنس بر روی باکتری‏ها و همچنین، مقادیر MBC و MICنشان می دهد که باکتری استافیلوکوکوس اورئوس‏ حساس‏ترین باکتری به عصاره متانولی این گلسنگ است. به علت ساختار دیواره سلولی باکتری‏های گرم مثبت و نفوذ بیشتر عصاره به دیواره سلولی، به طور کلی عصاره گلسنگ‏ها اثر بیش‏تری روی باکتری‏های گرم مثبت دارند، اما در مورد انتروکوک‏ها به ویژه انتروکوکوس فکالیس‏ مقاومت زیادی در برابر عوامل ضد میکروبی و آنتی بیوتیک‏ها دیده می‏شود و به این علت عصاره فولجنسیا اثری روی این باکتری ندارد. به همین علت در قسمت فعالیت ضد‏باکتریایی در شرایط in vivoاز استافیلوکوکوس اورئوس‏ استفاده شد و مشخص شد که این عصاره روند ترمیم زخم پوستی آلوده به این باکتری راتسریع می‏کند. این امر ممکن است به علت وجود ترکیبات شیمیایی ویژه در ریسه فولجنسیا فولجنس باشد که ویژگی ضد میکروبی دارند و همان‏طور که پیش از این اشاره شد باید تجزیه و تحلیل‏ شوند. به طور کلی وجود مشتقات فنلی (فنل و فلاونویید) در گلسنگ‏ها نشان دهنده فعالیت آنتی‏میکروبی آن‏هاست. این مواد باعث اسیدی شدن سلول باکتری، به ترتیب تخریب غشای سیتوپلاسم، غیر فعال شدن آنزیم‏ها و اختلال انتقال الکترون و فسفریلاسیون اکسیداتیو می‏شوند (31- 33).

بدیهی است که با توجه به نتایج مثبت حاصل از این مطالعه در درمان عفونت‏های استافیلوکوکوسی و همچنین، عوارض جانبی کمتر عصاره فولجنسیا فولجنس نسبت به آنتی‏بیوتیک‏های شیمیایی، نیاز به مطالعات گسترده‏تری در مورد کاربرد اثرات دارویی این گونه روی حیوانات بیشتر و در مرحله بعدی انسان است. در آخر نیز پیشنهاد می‏شود که فعالیت ضد‏باکتری عصاره بر علیه سایر باکتری‏ها منجمله اشریشیا کلی در شرایط in vivo مطالعه و بررسی شود.

تشکر و قدردانی

از پروفسور هری سیپمن[xxv] (مسئول هرباریوم گلسنگ برلین، آلمان) برای آماده کردن زمینه یازده ماه مطالعه در هرباریوم گلسنگ برلین و همچنین، داگمار تریبل[xxvi] (مسئول هرباریوم گلسنگ مونیخ، آلمان) برای همکاری در شناسایی نمونه‏ها تشکر و قدردانی می‏شود.



[1]- Staphylococcus aureus

[2]- Eap

[3]- Polyketides

[4]- Depside

[5]- Depsidon

[6]- Usnic acid

[7]- Penicillium

[8]- Dibenzoyl usnic acid

[9]- Pseudomona aeroginosa

[10]- Alectosarmetin

[11]- Uronic acid

[12]- Methyl- β orsellinate

[13]- Barbatic acid

[14]- Axenic cultures

[15]- Entrococcus faecalis

[16]- Escherchia coli

[17]- Minimum inhibitory concentration

[18]- Minimum bactericidal concentration

[19]- Tukey

[xx]- Rankovič

[xxi]- Barbatic acid

[xxii]- Stictic acid

[xxiii]- Norstictic acid

[xxiv]- Protocetraric acid

[xxv]- Harrie Sipman

[xxvi]- Dagmar Triebel

(1)               Schito GC. The importance of the development of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Clinical Microbiology and Infection 2006; 12 (1): 3- 8.

(2)               Ehling-Schulz M., Fricker M., Scherer S. Bacillus cereus, the causative agent of an emetic type of food-borne illness. Molecular Nutrition and Food Research 2004; 48 (7): 479- 87.

(3)               Granslo H., Gammelsrud KW., Fredheim EA., Flaegstad T., Klingenberg C. Coagulase- negative staphylococci-biofilm and antibiotic resistance. Tidsskrift for praktisk Medicin, Organ for Den norske lægeforening 2008; 128 (23): 2746- 9.

(4)               Fabricant DS., Farnsworth NR. The value of plants used in traditional medicine for drug discovery. Environmental Health Perspectives 2001; 109 (1): 69- 75.

(5)               Lee CK., Hansen SL. Management of acute wounds. Surgical Clinics of North America 2009; 89 (3): 659- 76.

(6)               Bode LG., Kluytmans JA., Wertheim HF., Bogaers D., Vandenbroucke-Grauls CM., et al. Preventing surgical-site infections in nasal carriers of Staphylococcus aureus. The New England Journal of Medicine 2010; 362 (1): 9- 17.

(7)               Lilani SP., Jangale N., Chowdhary A., Daver GB. Surgical site infection in clean and clean-contaminated cases. Indian Journal of Medical Microbiology 2005; 23(4): 249- 52.

(8)               Zhu J., Lu C., Standland M. Single mutation on the surface of Staphylococcus aureus Sortase A can disrupt its dimerization. Biochemistry 2008; 47 (6): 1667- 74.

(9)               Clauditz A., Resch A., Wieland KP., Peschel A., Götz F. Staphyloxanthin plays a role in the fitness of Staphylococcus aureus and its ability to cope with oxidative stress. Infection and Immunity 2006; 74 (8): 4950-3.

(10)           Schierle CF., De la Garza M., Mustoe TA., Galiano RD. Staphylococcal biofilms impair wound healing by delaying reepithelialization in a murine cutaneous wound model. Wound repair and regeneration 2009; 17 (3): 354- 9.

(11)           Hussain M., Becker K., von Eiff C., Peters G., Herrmann M. Analogs of Eap protein are conserved and prevalent in clinical Staphylococcus aureus isolates. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 2001; 8 (6): 1271 -6.

(12)           Greenhalgh DG. Wound healing and diabetes mellitus. Clinics in Plastic Surgery 2003; 30 (1): 37- 45.

(13)           Athanasios NA., Economopoulou M., Orlova VV., Sobke A., Schneider D., et al. The extracellular adherence protein (Eap) of Staphylococcus aureus inhibits wound healing by interfering with host defense and repair mechanisms. Blood 2006; 107 (7): 2720- 7.

(14)           Madamombe IT., Afolayan AJ. Evaluation of the antimicrobial activity of extracts from South African Usnea barbata. Pharmaceutical Biology 2003; 41 (3): 199- 202.

(15)           Melgarejo M., Sterner O., Castro JV., Mollinedo P.More investigations in potent activity and relationship structure of the lichen antibiotic (+) -usnic acid its derivate dibenzoylusnic acid.Revista Boliviana de Quimica 2008; 25 (1): 24- 9.

(16)           Martins MCB., Gonçalves de Lima MJ., Silva FP., Azevedo-Ximenes E., Henrique da Silva N., et al. Cladia aggregata (lichen) from Brazilian northeast: chemical characterization and antimicrobial activity. Brazilian Archives of Biology and Technology 2010; 53 (1): 115- 22.

(17)           Kosanić M., Ranković B. Screening of antimicrobial activity of some lichen species in vitro. Kragujevac Journal of Science 2010; 32: 65- 72.

(18)           Valadbeigi T. Collection and Identification lichens Zirab area [Dissertation]. Tehran: Shahid Beheshti Univ.; 2004.

(19)           Manojlovic NT., Solujic S., Sukdolak S. Antimicrobial activity of an extract and anthraquinones from Caloplaca schaereri. The Lichenologist 2002; 34 (1): 83- 5.

(20)           Karagoz A., Dogruoz N., Zeybek Z., Aslan A. Antibacterial activity of some lichen extracts. Journal of Medicinal Plants Research 2009; 3 (12): 1034- 9.

(21)           Kirmizigül S., Koz Ö., Anil H., Icli S. Isolation and structure elucidation of novel natural products from Turkish Lichens. Turkish Journal of Chemistry 2003; 27 (4): 493- 500.

(22)           Ranković B., Kosanić M. Antimicrobial activities of different extract of Lecanora atra Lecanora muralis, Parmelia saxatilis, Parmelia sulcata and Parmeliopsis ambigua. Pakistan Journal of Botany 2012; 44 (1): 429- 33.

(23)           Candan M., Yýlmaz M., Tay T., Erdem M., Türk AÖ. Antimicrobial activity of extracts of the Lichen Parmelia sulcata and its Salazinic acid constituent. Zeitschrift für Naturforschung A 2007 (7-8); 62: 619- 21.

(24)           Choi MJ., Yohannes SB., Lee SJ., Damte D., Ahsanur Reza MD., et al. The in vitro antibacterial activity of enrofloxacin-trimethoprim combination against five bacterial species. The Pakistan Veterinary Journal 2012; 32 (3): 363- 6.

(25)           Rahman M., Kuhn I., Rahman M., Olsson-Liljequist B., Mollby R. Evaluation of a scanner-assisted colorimetric MIC method for susceptibility testing of gram-negative fermentative bacteria. Applied and Environmental Microbiology 2004; 70 (4): 2398- 403.

(26)           Androw JM. BSAC standardized disc susceptibility testing method. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2001; 7 (5): 48-57.

(27)           Radika S. Development of treated bandage using lichen extract for wound healing. International Journal of Latest Research in Science and Technology 2013; 2 (2): 163- 6.

(28)           Gupta N., Jain UK. Investigation of wound healing activity of methanolic extract of stem bark of Mimusops elengi Linn. African Journal of Traditional, Complementary and Alternative medicines 2011; 8 (2): 98- 103.

(29)           Edwards R., Harding KG. Bacteria and wound healing. Current opinion Infectious Diseases 2004; 17 (2): 91- 6.

(30)           Rankovič B., Rankovic D., Maric D. Antioxidant and antimicrobial activity of some lichen species. Microbiology 2010; 79 (6): 809-15.

(31)           Conover MA., Mierzwa R., King A., Loebenberg D., Bishop W., et al. Usnic acid amide a phytotoxin and antifungal agent from Cercosporidum henningsii. Phytochemistry 1992; 31 (9): 2999- 3001.

 

(32)           Randhir R., Lin YT., Shetty K. Stimulation of phenolics, antioxidant and antimicrobial activities in dark germinated mung bean sprouts in response to peptide and phytochemical elicitors. Process Biochemistry 2004; 39 (5): 637- 46.

(33)           Vattem DA., Lin YT., Labbe RG., Shetty K. Phenolic antioxidant mobilization in cranberry pomaceby solid-state bioprocessing using foodgrade fungus Lentinus edodesand effectonantimicrobial activity against select food borne pathogens. Innovative Food Science and Emerging Technologies 2004; 5 (1): 81- 91.