تعیین و مدل‏ سازی شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران

2 دانشیار فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه ارومیه، ایران

3 کارشناسی ارشد بیماری شناسی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران

4 استادیار بیوتکنولوژی غذایی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران، کرج، ایران

چکیده

مقدمه: اندو-بتا-1و4 گلوکاناز میکروبی از جمله آنزیم‌های کلیدی در تجزیه گلوکان است. در میان باکتری‌ها، گونه‏های مربوط به جنس باسیلوس یکی از منابع اصلی تولید کننده گلوکانازهای صنعتی هستند. هدف پژوهش حاضر، با توجه به تأثیر متقابل شاخص‏های محیطی بر خواص کاتالیتیکی آنزیم‏ها، بررسی توانایی تولید آنزیم بتاگلوکوناز توسط سویه بومی باسیلوس سابتیلیس  B5d ‏جدا شده از فیلوسفر باغات سیب و ‏تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آن است‏. ‏‏

مواد و روش‏‏ ها: در بررسی حاضر، پتانسیل تولید آنزیم بتاگلوکاناز از جدایه باسیلوس B5d به روش کیفی تایید شد. جدایه یاد شده‏ با روش‏های بیوشیمیایی و مولکولی شناسایی شد‏. تعیین شرایط بهینه فعالیت آنزیم بتاگلوکوناز تولیدی توسط باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ و با استفاده از طرح مرکب مرکزی انجام شد. متغیرهای مورد بررسی شامل دما ‏(‏20 تا80 درجه سانتی‏گراد‏‏) ‏٬ اسیدیته ‏(‏5/3 تا 8) و غلظت سوبسترا ‏(‏1/0 تا 1 درصد) بودند. ‏‏

نتایج: مطالعات بیوشیمیایی و مولکولی مبتنی بر ژن 16 S rDNA نشان داد که جدایه یاد شده‏ به گونه باسیلوس سابتیلیس متعلق است. بر اساس نتایج به دست آمده از طرح مرکب مرکزی، مدل درجه دوم مناسب‏ترین ‏مدل برای پیش‏بینی ‏فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز در دامنه دمایی، اسیدیته ‏و غلظت سوبسترای مورد بررسی تعیین شد. همچنین،‏ نتایج بهینه‌سازی فعالیت آنزیم نشان داد که بتاگلوکوناز تولید شده توسط سویه B5d اپتیمم فعالیت کاتالیتیکی را در دامنه ‏اسیدیته ‏5/5 تا 7و دمای 50 تا ‏65 درجه سانتی‏گراد‏‏ و غلظت بالای سوبسترا داراست. اگرچه در دماهای 80 و 20 درجه سانتی‏گراد‏ و همچنین،‏ غلظت‌های کم سوبسترا فعالیت آنزیم کاهش می‏یابد. نتایج ‏تعیین صحت مدل‌ حاصل از بهینه‏سازی به روش سطح پاسخ مطابقت خوبی را بین اعداد پیش‏بینی ‏شده توسط مدل و داده‏های واقعی نشان داد. ‏

بحث و نتیجه‏ گیری: با توجه به ویژگی‏های بهینه کاتالیتیکی، آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d قابلیت کاربرد در صنایع خوراک دام و طیور را داراست‏. ‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Determination and modeling the optimum conditions of beta glucanase Bacillus subtilis B5d activity with potential used as feed additive

نویسندگان [English]

  • Sholeh Dahpahlevan 1
  • Jalil Khara 2
  • Maryam Mousivand 3
  • Maryam Hashemi 4
1 M.Sc. of plant physiology, Urmia University, Urmia, Iran
2 Associate Professor of plant physiology, Biology Department, Urmia University, Urmia, Iran
3 M.Sc. of Plant Pathology, Microbial Biotechnology & Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran
4 Assistant Professor of Food Biotechnology, Microbial Biotechnology & Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran, Karaj, Iran
چکیده [English]

Introduction: Microbial β - 1, 4 glucanase is one of the key enzymes in glucan hydrolysis. Among bacteria, Bacillus species is a main source for industrial glucanse production. According to interaction between environmental factors on the enzymatic catalytic properties, in this study the potential of β-glucanase production by native strain B. subtilis B5d isolated from apple phyllosphere orchards and determination and modeling the optimum conditions of enzyme activity was surveyed.

Materials and methods: In this study, the potential of β-glucanase production by B. subtilis B5d was confirmed using qualitative method. The B. subtilis B5d isolate was identified through biochemical and molecular methods. Determination of optimum condition for beta glucanase activity was evaluated by response surface method and Central Composite Design. Investigated variables included temperature (20- 80 °C), pH (3.5- 8) and concentration of substrate (0.1- 1%).

Results: According to the molecular and biochemical analysis, the strain B. subtilis B5d belonges to B.subtilis species. Based on the Central Composite Design results, the quadratic model was the most suitable model for predicting β-glucanase activity in experimental temperature, pH and substrate concentration range. Furthermore, the optimization of enzyme activity showed that the β-glucanase produced by strain B5d has highest catalytic activity at pH (5.5- 7) and temperature (50- 65°C) and the high concentration of lechinan. However, the enzyme activity is reduced in 80 and 20 °C as well as low concentration of substrate. Validation test of the prediction model of optimization obtained by response surface methodology showed a good agreement between experimental and predicted data.

Discussion and conclusion: According to the optimum catalytic characteristics, the β-glucanase produced by B. subtilis B5d has a potential to be used as a feed additive.

کلیدواژه‌ها [English]

  • β-glucanase activity
  • Optimal Conditions
  • Bacillus subtilis
  • Feed

مقدمه.

سلولز، همی سلولز و لیگنین بخش‏های اصلی دیواره سلولی گیاهان بوده که به ترتیب 40، 33 و 23 درصد از وزن خشک گیاه را تشکیل می‏‏دهند. گلوکان یکی از اجزای اصلی سلولزها در دیواره سلولی گیاهان و دومین پلی‌ساکارید به لحاظ فراوانی پس از سلولز است. از این رو میکروارگانیسم‌های تجزیه‌کننده گلوکان در محیط‌های طبیعی بسیار زیادی مانند خاک، کمپوست ‏(‏کود)، روده حیوانات گیاه‌خوار، حشرات و بی‌مهرگان توزیع شده اند ‏(‏1). گلوکان از هموپلیمرهای خطی حاوی مونومرهای دی- گلوکز با پیوندهای بتا 1و4 گلیکوزیدی تشکیل شده است. با این حال در طبیعت بیشتر حاوی زنجیره‌های جانبی استیل، 4-O-متیل-دی گلوکورونوزیل و آرابینوفورانوزیل هستند که یک کمپلکس ناهمگن را تشکیل می‌دهند ‏(‏2). هیدرولیز کامل گلوکان نیاز به عملکرد هماهنگ آنزیم‌های گلوکونولیتیک متفاوت دارد که شامل اندوگلوکانازها، بتا-گلیکوزیداز و آنزیم‌های کمکی مانند آلفا-آرابینوفورانوزیداز، استیل گلوکان استراز و آلفا-گلوکورونیداز است. در میان این آنزیم‌ها اندو-بتا-1و4 گلوکاناز در کاتالیز و هیدرولیز زنجیره‌های بلند گلوکان به گلوکوالیگوساکاریدهای کوتاه بسیار اهمیت دارند ‏(‏3). اندو-بتا-1و4 گلوکاناز میکروبی از جمله آنزیم‌های کلیدی پاسخگو برای تجزیه گلوکان است. گلوکز محصول اصلی تجزیه گلوکان است. بیشتر گلوکانازهای صنعتی توسط قارچ‌های آسپریژیلوس[1]، تریکودرما[2]، کاندیدا آلبیکنس[3] و باکتری‌های مربوط به جنس باسیلوس تولید می‏‏شوند ‏(‏4). مشتقات محلول سلولز مانند کربوکسی‌متیل سلولز، هیدروکسی‌اتیل‌سلولز و یا سلولز تیمار شده با اسید فسفریک، سوبستراهای مناسبی برای آنزیم اندوبتا 1و 4گلوکاناز هستند. نقش اصلی آنزیم اندوگلوکاناز شکستن زنجیره سلولزی و تبدیل آن به قندهای کوچکتر همچون گلوکز و سلودکسترین است ‏(‏5). گلوکانازها بر اساس شباهت‌های توالی اسیدهای آمینه، ساختار، نوع فعالیت، ویژگی‏های سوبسترا ‏و ویژگی‌های فیزیکی- شیمیایی به ‏چند گروه ‏تقسیم می‌شوند که گروه‌های 5، 16و 17 گلیکوزیدهیدرولازها از مهم‌ترین آن‏ها هستند که از نظر ساختار مولکولی، ویژگی‌های کاتالیزوری ‏و وزن مولکولی تمایز دارند ‏(‏6). ‏

با توجه به جایگاه و اهمیت روز افزون بتاگلوکانازها در صنایع مختلف مانند رنگ‌بری خمیرکاغذ، صنایع آبمیوه، خوراک دام و طیور و صنایع غذایی، بررسی پتانسیل‏های ملی به منظور تولید این آنزیم‏ها کاملاً ضروری به نظر می‏آید. شایان ذکر است که برای رفع هر کدام از نیازهای صنعتی خاص، آنزیم باید ویژگی‏های خاصی مانند پایداری مناسب در برابر حرارت و اسیدیته، فعالیت اختصاصی بالا و مقاومت در برابر کاتیون‏های فلزی و مواد شیمیایی را دارا باشند ‏(‏7-8). به عنوان نمونه بتاگلوکانازهای ایده آل برای صنایع کاغذ، آنزیم‌های فعال در دماهای بالا و اسیدیته‏های قلیایی هستند ‏(‏9). همچنین،‏ فعالیت قابل توجه بتاگلوکاناز در غلظت‌های پایین سوبسترا نیز از جمله خواص مهم در صنایع کاغذسازی و تولید بیواتانول است ‏(‏10). ‏

جیره غذایی غنی شده با آنزیم بتاگلوکاناز از طریق افزایش قابلیت هضم فیبر، بهبود تغذیه دام و افزایش راندمان رشد ‏و همچنین،‏ افزایش تولید شیر در گاوهای شیری و دیگر نشخوار کنندگان ‏را به همراه داشته است ‏(‏11). به طور کلی اعتقاد بر این است که بتاگلوکاناز یکی از آنزیم‏های مناسب برای تکمیل علوفه دام است و برای این منظور داشتن فعالیت بهینه‌ در ‏اسیدیته 6 ‏از ویژگی‏های مناسب برای کاربرد آنزیم بتاگلوکاناز به عنوان مکمل خوراک دام می‏باشد ‏(‏10).

مطالعات گسترده‏ای در زمینه شناسایی و تعیین ویژگی‏های کاتالیتیکی آنزیم‏های بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه‏های مختلف باکتریایی با هدف یافتن آنزیم‏‏های مناسب مورد استفاده در صنایع مرتبط همچنان در حال انجام است. برای مثال در بررسی ویژگی‏های آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس[4] A4، نشان داده شد که اسیدیته ‏5 تا ‏6 برای دستیابی به بیشنه فعالیت آنزیم مورد مطالعه لازم است. همچنین، بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه یاد شده در دمای 50 درجه سانتی‏گراد‏ و ‏اسیدیته ‏6 پایداری در خور توجهی داشته است. به همین علت آنزیم یاد شده‏ به عنوان گزینه مناسبی برای کاربرد در صنعت خوراک دام معرفی شد ‏(‏12). در مطالعه دیگری مشخص شد که آنزیم بتاگلوکاناز ‏تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس LN در اسیدیته ‏6 و دمای 60 درجه سانتی‏گراد‏ بیش‏ترین فعالیت کاتالیتیکی داشته است ‏(‏13). اپتیمم دما و اسیدیته ‏فعالیت بتاگلوکاناز مقاوم به حرارت باسیلوس برویس[5] به ترتیب 65 تا ‏70 درجه سانتی‏گراد‏ و 8 تا ‏10 گزارش و به عنوان گزینه مناسب برای استفاده در ‏صنایع کاغذسازی معرفی شد ‏(‏9).

با توجه به تأثیر متقابل شاخص‏های محیطی بر خواص کاتالیتیکی آنزیم‏ها هدف این مطالعه بررسی توانایی تولید آنزیم بتاگلوکوناز توسط سویه بومی باسیلوس سابتیلیس B5d ‏جدا شده از فیلوسفر باغات سیب، و ‏تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آن با مدل‌سازی تاثیرات دما، اسیدیته ‏و غلظت سوبسترا بر فعالیت آنزیم به روش سطح پاسخ است‏ تا ضمن تعیین شرایط بهینه عملکرد آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه مورد مطالعه، آثار متقابل متغیرهای محیطی بر فعالیت کاتالیتیکی آن نیز مشخص شود.

طراحی مناسب آزمایش‌ها، مهم‌تر از تجزیه و تحلیل آماری مفصل است. در نظر گرفتن مجموعه متغیرهای مهم در طراحی آماری آزمایش‌ها با استفاده از روش سطح پاسخ ‏(‏RSM)‏[6]، که برای ارزیابی اهمیت نسبی متغیرها در حالت وجود برهم‌کنش‌های پیچیده به کار می‌رود، شیوه مناسبی برای غلبه بر محدودیت بهینه‌سازی به روش یک عامل در هر زمان به شمار می‌آید. ‏

 

‏‏مواد و روش‏ها.

میکروارگانیسم و شرایط نگهداری: جدایه باکتریایی باسیلوس سابتیلیس B5d از فیلوسفر باغات سیب استان کرمان جمع آوری و با استفاده از روش سری رقت ‏و بر روی محیط کشت NBY[7] ‏(‏نوترینت براث 8 گرم بر لیتر، دی‏پتاسیم‏هیدروژن فسفات 1 گرم بر لیتر، عصاره مخمر 1 گرم بر لیتر، پتاسیم دی هیدروژن فسفات 25/0 گرم بر لیتر، گلوکز 2 گرم بر لیتر، 12/0 گرم بر لیتر، آگار 18 گرم بر لیتر) جدا و خالص‏سازی شد. سپس، جدایه باکتریایی به منظور استفاده در بخش‏های بعدی مطالعه در بانک ژن میکروبی پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی نگهداری شد به منظور فعالسازی سویه باکتریایی مورد نظر محیط کشت NBY تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏ گرمخانهگذاری شد ‏(‏14).

.ارزیابی کیفی و اندازه‌گیری فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d: برای تعیین توانایی تولید آنزیم ‏بتاگلوکاناز از محیط کشت ‏LB ‏حاوی 02/0 درصد لچینن[8] ‏(‏1,3:1,4-ß-D-Glucan) به عنوان سوبسترای آنزیم استفاده شد. ‏شایان ذکر است که لچینن مورد استفاده ‏(‏Megazyme, Lot N:70901c) از گلسنگ Cetraria islandica استخراج شده بود. باسیلوس سابتیلیس B5d به شکل نقطه‏ای روی محیط کشت یاد شده‏ تلقیح و به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏ گرمخانه‌گذاری شد ‏(‏15). ‏

مشاهده هاله زرد رنگ در حضور معرف کنگو رد به منزله مثبت بودن این آزمون تلقی شد. پس از تایید تولید آنزیم توسط جدایه یاد شده اندازه‌گیری آنزیم تولیدی با استفاده از روش دی نیتروسالیسیلیک اسید انجام شد. بدین منظور ابتدا محلول لچینن 1 درصد در بافر مورد ‏(‏فسفات یا سیترات) نظر تهیه و 100 میکرولیتر از آن ‏به مدت 5 دقیقه در دمای مورد نظر قرار داده ‌شد. برای تهیه اسیدیته‏های مختلف نیز از بافرهای سیترات و فسفات با غلظت 2/0 مولار استفاده شد. سپس، 100 میکرولیتر محلول آنزیم به سوبسترا اضافه و به مدت 30 دقیقه در دمای مورد نظر قرار داده شد‏ و در نهایت، 600 میکرولیتر از معرف دی‏نیترو سالیسیلیک اسید به نمونه‌ها اضافه و به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار داده ‌شد. در پایان و پس از رسیدن دمای نمونه به دمای محیط جذب نمونه‌ها با استفاده از دستگاه میکروپلیت ریدر[9] در طول موج 540 نانومتر خوانده ‏و ‏با استفاده از ‏منحنی استاندارد گلوکز غلظت‌ قندهای آزاد شده محاسبه ‏‌شد ‏(‏16).

استخراج DNA ژنومی: استخراج دی ان ا[10] ژنومی با استفاده از کیت ‏DNeasy Blood &Tissue Kit[11] ‏‏و با توجه به دستورالعمل مربوطه از باسیلوس B5d انجام شد. کیفیت و غلظت دی ان ا استخراج شده با استفاده از نانودراپ اسپکتوفتومتر[12] ‏و در طول موج 260 نانومتر سنجش شد.

.شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باسیلوس سابتیلیسB5d مبتنی بر 16S rDNA : با استفاده از آزمون‏های ریخت‏شناختی، ‏بیوشیمیایی ‏و فیزیولوژیکی ‏شناسایی مقدماتی باکتری باسیلوس سابتیلیس B5d انجام شد. به منظور شناسایی مولکولی و پس از استخراج دی ان ا، تکثیر ژن 16S rDNA ‏با استفاده از پرایمر Paf و Par انجام شد. واکنش PCR در حجم 50، شامل 5 میکرولیتر بافر PCR ‏(‏10x)، 3 میکرولیتر کلرید منیزیم 25 میلی‏مولار، 25/1 میکرولیتر ‏DNTPs ‏10 میلی‏مولار، 5 میکرولیتر آغازگر پیش رو[13]

5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'

5 میکرولیتر آغازگر پس رو[14]

5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'،

5/0 میکرولیتر ‏(‏حاوی 5/2 واحد) از آنزیم Taq DNA Polymerase، 1 میکرولیتر DNA الگو و 25/29 میکرولیتر آب مقطر تهیه شد. واکنش در دستگاه ترموسایکلر[15] ‏با برنامه دمایی شامل 3 دقیقه واسرشته سازی اولیه در 94 درجه سانتی‏گراد‏ و 35 چرخه به شکل 40 ثانیه در 94 درجه سانتی‏گراد‏، 40 ثانیه در54 درجه سانتی‏گراد‏، ‏1 دقیقه در72 درجه سانتی‏گراد‏ و مرحله گسترش نهایی در 72 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 10 دقیقه انجام شد. محصول PCR با استفاده از کیت PCR purification kit; Roch بازیافت و پس از تعیین توالی و انجام تحلیل‏های [16]BLAST در پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد. ‏

تولید آنزیم ‏بتاگلوکاناز: ابتدا سویه باسیلوس سابتیلیس B5d در محیط کشت NBY به شکل خطی تلقیح و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏ به مدت 24 ساعت گرمخانه‌گذاری ‌شد. سپس، یک لوپ از باکتری رشد کرده برای تهیه مایه تلقیح از محیط کشت جامد به محیط کشت نوترینت براث ‏منتقل و به مدت 18 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏ و سرعت 180 دور بر دقیقه قرار داده شد. سپس، 2 درصد مایه تلقیح آماده شده به محیط کشت تولید آنزیم ‏(‏10 گرم بر لیتر بتاگلوکان[17]، 3 گرم بر لیتر عصاره گوشت، 4 گرم بر لیترعصاره مخمر، 5/0 گرم بر لیتر کلرید کلسیم، 3/0گرم بر لیتر ‏سولفات منیزیم و 1 گرم بر لیتر دی پتاسیم هیدروژن فسفات) افزوده و به مدت 48 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 28 درجه سانتی‏گراد‏ و سرعت 180 دور بر دقیقه گرمخانه‌گذاری ‌شد (‏17). به منظور جداسازی آنزیم، محیط کشت تخمیر شده به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد‏ و با ‏سرعت 10000 دور بر دقیقه سانتریفوژ[18] ‏ و فاز روماند به عنوان منبع آنزیم خام تا زمان انجام آزمون‏های مربوطه در دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد‏ نگهداری شد‏. ‏

.تعیین شرایط بهینه عملکرد بتاگلوکاناز تولیدی باسیلوس سابتیلیس B5d: به منظور تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم تولید شده، تاثیر سه متغییر دما، اسیدیته و غلظت ‏سوبسترا به ترتیب در دامنه‏های‌ ‏(‏20 تا ‏80 درجه سانتی‏گراد‏)، ‏(‏اسیدیته 5/3 تا ‏8) و غلظت 1/0 تا ‏1 درصد لچینن بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d به روش سطح پاسخ ‏و در پنج سطح ‏(‏‏-α, -1, 0, +1, +α) بررسی شد ‏(‏جدول 1). طرح آزمایشی مرکب مرکزی سه متغیره برای بهینه‏سازی ‏شاخص‏های اسیدیته، دما و غلظت سوبسترا متشکل از 20 آزمایش، شامل 6 تکرار نقطه مرکزی برای تعیین خطای آزمایشی به کار گرفته شد ‏(‏جدول 2).

پاسخ‌های به دست آمده با استفاده از نرم افزار ‏دیزاین اکسپرت 7 [19] (‏به روش تحلیل‏ واریانس تجزیه و تحلیل شد. بر اساس نتایج تحلیل‏ آماری مدل درجه دوم مناسب‏ترین ‏مدل برای پیش‏بینی ‏فعالیت آنزیم مورد بررسی در دامنه دمایی، اسیدیته ‏و غلظت سوبسترای مورد بررسی تعیین شد. ‏

 

نتایج.

.ارزیابی کیفی توانایی تولید آنزیم ‏بتاگلوکوناز توسط باسیلوس سابتیلیس B5d: هاله شفاف تولید شده بر محیط کشت ‏غربا‏ل‏گری پس از افزودن معرف کنگو رد به قطر 5 سانتی‏متر معرف توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز توسط باسیلوس سابتیلیس ‏B5d به روش کیفی بود ‏(‏شکل 1).

 

 

شکل1- نتیجه آزمون کیفی تعیین توانایی تولید آنزیم بتاگلوکاناز توسط باسیلوس سابتیلیس ‏B5d که به صورت هاله شفاف پس از افزودن معرف کنگو رد مشاهده می‌شود

 

 

 

 

 

جدول 1- دامنه و سطوح متغیرهای آزمایشی در طرح مرکب مرکزی

متغیرها

α*-

1-

0

1+

α*+

اسیدیته

5/3

41/4

75/5

09/7

8

دما ‏(‏درجه سانتی‏گراد‏) ‏

20

16/32

50

84/67

80

غلظت سوبسترا ‏(‏درصد) ‏

1/0

28/0

55/0

82/0

1

*Alpha=1.‏68

 

جدول 2- طرح مرکب مرکزی بر اساس مقادیر واقعی به‌ همراه پاسخ تجربی

فعالیت بتاگلوکاناز سویه

 ‏(‏U/L) B5d

X3: غلظت سوبسترا ‏(‏درصد) ‏

X2: دما(‏درجه سانتی‏گراد‏) ‏

X1: اسیدیته

تیمار

46/145

1/0

50

75/5

1

20/767

1

50

75/5

2

20/575

55/0

50

75/5

3

53/597

55/0

50

75/5

4

30/169

28/0

84/67

09/7

5

83/477

82/0

84/67

09/7

6

66/175

55/0

80

75/5

7

40/670

55/0

50

75/5

8

53/435

82/0

16/32

09/7

9

6/622

55/0

50

75/5

10

63/563

55/0

50

75/5

11

16/110

28/0

84/67

41/4

12

03/341

82/0

84/67

41/4

13

60/142

55/0

50

5/3

14

93/425

82/0

16/32

41/4

15

73/146

28/0

16/32

09/7

16

03/244

55/0

20

75/5

17

96/403

55/0

50

8

18

23/283

28/0

16/32

41/4

19

86/538

55/0

50

75/5

20

 


شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی باسیلوس سابتیلیس B5d مبتنی بر 16S rDNA : بررسی ویژگی‏های ریخت‏شناسی نشان داد که جدایه یاد شده‏ گرم مثبت، میله‏ای شکل، دارای اندوسپور با موقعیت مرکزی و هوازی اجباری است‏. همچنین،‏ تکثیر ژن 16SrDNA، تعیین توالی و مقایسه با توالی‏های موجود در پایگاه NCBI متعلق بودن جدایه مورد بررسی به گونه باسیلوس سابتیلیس را مشخص و با کد شناساییKF856736 در بانک ژن پایگاه اطلاعاتی NCBI ثبت شد.

 

.تعیین ویژگی‌های کاتالیتیکی بهینه بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیسB5d ‏به روش سطح پاسخ: به منظور تعیین شرایط بهینه کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس ‏B5d، از روش سطح پاسخ سه متغییره شامل اسیدیته، دما ‏و غلظت سوبسترای لچینن استفاده شد. بر اساس نتایج به دست آمده از طرح مرکب مرکزی مدل درجه دوم مناسب‌ترین مدل برای پیش‏بینی فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس ‏B5d در دامنه دمایی، اسیدیته ‏و غلظت سوبسترای ‏تعریف شده بود. بر اساس نتایج تحلیل‏ واریانس مدل ذیل متغیر پاسخ را به شکل قابل قبولی پیش‌بینی می‌کند: ‏(‏معادله 1) ‏

که در آن X1 و ‏X2 و X3 به ترتیب نمایانگر متغیرهای مستقل اسیدیته ‏و دما وغلظت سوبسترا و Y نشان دهنده متغیر پاسخ است. نتایج تجزیه و تحلیل واریانس نشان می‌دهد که مدل‌ برازش داده شده در سطح 99 درصد معنا‌دار است ‏(‏P value<0.0001).
بر اساس نتایج تجزیه و تحلیل واریانس، ضریب تعیین ‏(‏R2) فعالیت آنزیم خام 9485/0 برآورد شده است؛ به این معنا که مدل‌ آماری می‌تواند 85/94 درصد تغییرات پاسخ را توضیح دهد. ‏ضرایب مثبت یا منفی آثار خطی ‏X1)، X2، (X3 و ‏درجه دوم ‏‏X12)، X22، X32‏( هر کدام از متغیرها و برهمکنش متقابل آن‏ها )‏‏X1 X2، X2 X3، (X1X3به ترتیب نشانگر اثر افزایش‌دهنده و یا کاهنده متغیر پاسخ است. ‏

همان‏گونه که در معادله ‏1 قابل مشاهده است اثر خطی هر سه متغیر مورد بررسی بر فعالیت آنزیم مثبت بوده است. اگرچه ضرایب بزرگ‏تر متغیرهای اسیدیته ‏و غلظت سوبسترا نسبت به متغیر دما حاکی از نقش بیشتر این دو متغیر در تنظیم فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏B5d است. نتایج تحلیل‏ واریانس نیز گویای معنا‏دار نبودن اثر خطی دما بر مقدار پاسخ است ‏(‏جدول 3).

 

 

 (معادله 1)

Y= -5062.95676+1347.29473X1+70.44105X2+1483.48085X3+3.69588X1X2+169.26472X2X3+6.13058X1X3-136.02952X12-0.97183X22-1420.56035X32

 

جدول 3- تجزیه و تحلیل واریانس ‏(‏ANOVA) سطح پاسخ مدل درجه دوم برای فعالیت آنزیم‌ بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏B5d

P آماره Prob > F

F آماره

میانگین مربعات

درجه آزادی

مجموع مربعات

منابع تغییرات

< 0001/0

46/20

63/84745

9

7/762710

مدل

0583/0

57/4

54/18913

1

54/18913

X1

2243/0

68/1

851/6949

1

851/6949

X2

< 0001/0

75/71

3/297187

1

3/297187

X3

1065/0

15/3

67/13027

1

67/13027

X1X2

2471/0

51/1

942/6258

1

942/6258

X1X3

5665/0

35/0

299/1455

1

299/1455

X2X3

< 0001/0

37/44

2/183787

1

2/183787

X21

< 0001/0

70/63

7/263834

1

7/263834

X22

0173/0

11/8

25/33579

1

25/33579

X23

   

012/4142

10

12/41420

Residual

1437/0

77/2

09/6088

5

45/30440

Lack of Fit

   

94/2195

5

67/10979

Pure Error

     

19

8/804130

Cor Total

 

 

با وجود مثبت بودن ضریب اثر متقابل دو متغیر دما و اسیدیته (‏معادله 1)، افزایش همزمان این دو متغیر تأثیر معنا‏داری بر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز مورد بررسی نداشته است ‏(‏P value>0.05). بر اساس نمودار سه بعدی اثر متقابل دو متغیر دما و اسیدیته، حداقل فعالیت آنزیمی در دماهای 80 و 20 درجه سانتی‏گراد‏ و ‏کم‏ترین ‏اسیدیته ‏مورد بررسی در این مطالعه ثبت شده است. در حالی که در دامنه دمایی 36 تا 65 درجه سانتی‏گراد‏ و اسیدیته‏های 8/4 تا4/7 افزایش فعالیت آنزیمی مشاهده شد. جمله درجه دوم دو متغیر دما و اسیدیته ‏منفی و بیانگر آن است که افزایش بیش از حد هر کدام از این دو متغیر سبب کاهش فعالیت آنزیمی می‏شود ‏(‏شکل 2).

‏بر اساس نتایج تحلیل‏ واریانس اثر خطی متغیر غلظت سوبسترا مثبت و معنا‌دار بود (‏‏P value<0.05). اگرچه بر اساس مدل پیشنهادی ‏(‏معادله 1) ضریب اثر متقابل دو متغیر غلظت سوبسترا و ‏اسیدیته بر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d نیز مثبت بود ولی تأثیر معنا‌داری بر تغییرات پاسخ نشان نداد
‏(‏‏P value>0.05)، بدین معنا که افزایش همزمان این دو متغیر تأثیر مهمی بر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏ندارد ‏(‏جدول3). نمودار سه بعدی تأثیر متقابل ‏متغیرهای غلظت سوبسترا و ‏اسیدیته ‏کم‏ترین فعالیت بتاگلوکاناز مورد مطالعه را ‏در اسیدیته ‏‏(‏5/3) و کم‏ترین غلظت سوبسترا (‏1/0 درصد) نشان می‏دهد. حداکثر فعالیت آنزیمی در دامنه اسیدیته ‏9/4 تا 3/7 و غلظت‏های ‏4/0 تا 1 درصد سوبسترا مشاهده شد. جملات ‏درجه دوم ‏هر دو متغییر نیز منفی و نشانگر تأثیر کاهنده افزایش بیش از حد این دو متغیر بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏است ‏(‏شکل 3). ‏

 

شکل 2- نمودار سه بعدی اثر متقابل دما و اسیدیته بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در نقطه مرکزی غلظت سوبسترا

 

 

شکل 3- نمودار سه بعدی اثر متقابل ‏اسیدیته و غلظت سوبسترا بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏B5dدر نقطه مرکزی دما

 

همان‏گونه که در شکل 4 مشاهده می‏شود افزایش همزمان دما و غلظت سوبسترا نیز در دامنه مورد ارزیابی به افزایش فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏B5d منجر شد اگرچه افزایش یاد شده از نظر آماری معنادار نبود ‏(‏P value>0.05). کم‏ترین فعالیت آنزیمی نیز در دماهای 20 و 80 درجه سانتی‏گراد‏ و کم‏ترین غلظت لچینن مشاهده شد. در حالی که بیشینه فعالیت آنزیمی در دامنه دمایی 37 تا 65 درجه سانتی‏گراد‏ و غلظت‏های 4/0 تا 1 درصد سوبسترا ثبت شد. ‏

 

شکل 4- نمودار سه بعدی اثر متقابل دما و غلظت سوبسترا بر فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏در نقطه مرکزی ‏اسیدیته

 

از آن‏جا که دما، اسیدیته ‏وغلظت سوبسترا از عوامل تأثیرگذار بر فعالیت آنزیمی به‏شمار می‏آیند و با در نظر گرفتن این موضوع که شرایط خاصی از عوامل یاد شده مطلوب کاربردهای مختلف آنزیم بتاگلوکاناز در صنایع است، بر همین اساس جدول ‏4 چند نمونه از شرایط بهینه عملکرد آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس سابتیلیس B5d ‏را در شرایط خاصی از متغیرهای مورد بررسی نشان می‏دهد. بیشینه فعالیت آنزیمی بر اساس مدل پیش‏بینی شده توسط نرم‏افزار ‏(‏U/L 1723) در دمای 33/51 درجه سانتی‏گراد‏، اسیدیته ‏27/6 و غلظت 1 درصد لچینن حاصل می‏شود. بهینه‏سازی فعالیت آنزیم مورد بررسی در بیشینه دما هدف بعدی بود که بر این اساس مدل دمای 07/65 درجه سانتی‏گراد‏، اسیدیته ‏46/6 و غلظت سوبسترای 1 درصد را به عنوان شرایط بهینه ‏برای دستیابی به حداکثر فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز ‏(‏‏U/L 1544) پیش‏بینی کرد. بر اساس نتایج حاصل از بهینه‏سازی فعالیت کاتالیتیکی در شرایط مختلف محیطی، آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏قابلیت کاربرد در خوراک دام و طیور به عنوان افزودنی دارد.

 

 

جدول 4- فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در شرایط مختلف محیطی بر اساس مدل پیش‏بینی شده

حالت

هدف

دما ‏(‏درجه سانتی‏گراد‏) ‏

اسیدیته

غلظت لچینن

 (‏‏درصد) ‏

فعالیت بتاگلوکاناز ‏(‏U/L) ‏

فعالیت بتاگلوکاناز

بیشینه

33/51

27/6

1

1723

فعالیت بتاگلوکاناز

دما

بیشینه

بیشینه

07/65

46/6

1

1544

فعالیت بتاگلوکاناز

دما

اسیدیته

بیشینه

بیشینه

کمینه

55/61

10/5

96/0

1391

فعالیت بتاگلوکاناز

اسیدیته

بیشینه

بیشینه

5/53

41/7

1

1551

فعالیت بتاگلوکاناز

غلظت لچینن

بیشینه

کمینه

79/48

88/5

43/0

1269

 

 

 

 

 

 

 

نمودار تطابق ‏(‏شکل 5) همبستگی قابل قبولی میان مقادیر واقعی و پیش‌بینی شده فعالیت بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏را نشان می‌دهد. تجمع نقاط پیرامون خط شیب‌دار، نمایانگر اختلاف قابل قبول میان مقادیر تجربی و پیش‌بینی شده در دامنه عملیاتی متغیرهاست. ‏

برای بررسی بسندگی مدل‌ها نیز، نمودار توزیع باقیمانده‌ پاسخ‌های پیش‌بینی شده رسم شده است ‏(‏شکل6 ). با توجه به توزیع باقیمانده‌ها در دو سوی محور عرضی می‌توان اظهار داشت که مدل‌ برازش شده، فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏B5d را با استفاده از پاسخ سطح به طور مناسبی توصیف می‌کند. ‏

به منظور تعیین صحت مدل‌های حاصل از بهینه‌سازی به روش سطح پاسخ، فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d در دماهای (‏50، ‏60 و70 درجه سانتی‏گراد‏)، اسیدیته (‏5/4، ‏5/5 و 6) و غلظت سوبسترای ‏(‏6/0، 7/0 و 8/0 درصد) ارزیابی شد. نتایج مطابقت خوبی را بین اعداد پیش‏بینی ‏شده توسط مدل و داده‏های واقعی نشان داد که این موضوع درستی مدل به دست آمده را تایید می‏کند ‏(‏جدول 5). ‏

 

 

 

شکل 5- نمودار قیاس همبستگی داده‌های تجربی و پیش‌بینی شده فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d

 

 

شکل 6-نمودار توزیع باقیمانده مقادیر پیش‌بینی شده مدل

 

جدول 5- تعیین صحت مدل درجه دوم پیش‏بینی فعالیت کاتالیتیکی آنزیم بتاگلوکاناز باسیلوس سابتیلیس B5d ‏در شرایط ارزیابی شده

تیمار

دما

(‏درجه سانتی‏گراد‏) ‏

اسیدیته

غلظت سوبسترا ‏(‏درصد) ‏

فعالیت پیش‏بینی ‏شده بتا گلوکاناز

(‏U/L) ‏

فعالیت واقعی بتا گلوکاناز ‏(‏U/L) ‏

1

50

6

8/0

50/699

73/748

2

60

5/5

7/0

88/576

45/594

3

70

5/4

6/0

72/348

53/366

 


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

در پژوهش حاضر، تعیین ویژگی‏های بهینه فعالیت آنزیم بتاگلوکاناز سویه باسیلوس سابتیلیس B5d ‏به روش سطح پاسخ انجام و بهترین شرایط فعالیت آنزیم‏ منتخب مشخص شد. منظور از بهینه‏سازی به روش سطح پاسخ، یافتن نقاط مطلوب در فضای طراحی است.
بر اساس هدف هر فرآیند نقاط مطلوب ممکن است نقاطی باشند که کم‏ترین و یا بیش‏ترین مقدار پاسخ را داشته باشند و یا دامنه‏ای از متغیرهای مورد بررسی که پاسخ مشابهی را باعث شوند. با توجه به نتایج به‏دست آمده بتاگلوکاناز تولید شده توسط سویه B5d بیش‏ترین فعالیت کاتالیتیکی را در اسیدیته ‏برابر 27/6، ‏دمای 51 درجه سانتی‏گراد‏ ‏و غلظت 1 درصد لچینن داراست.
در حالی‏که اسیدیته ‏قلیایی به کاهش قابل توجه فعالیت آنزیم در دامنه دمایی و شرایط مورد بررسی منجر شد. دماهای 80 و 20 درجه سانتی‏گراد‏ و کاهش غلظت‌ سوبسترا نیز فعالیت آنزیم ‏را نشان دادند.

در مطالعه‏ای، پژوهشگران پس از بررسی ویژگی‏های آنزیم اندو بتا 1و 3-1 و4 گلوکاناز باسیلوس سابتیلیس 168، اپتیمم دمای 40 تا ‏60 ‏درجه ‏سانتی‏گراد‏ و ‏اسیدیته ‏5 تا ‏7 ‏را به عنوان شرایط بهینه عملکرد آنزیم مورد مطالعه گزارش کردند. بیشینه فعالیت بتاگلوکانازی آنزیم یاد شده‏ در دمای 50 درجه سانتی‏گراد‏ و ‏اسیدیته 6 ثبت شد ‏(‏2). در پژوهش دیگری به منظور بررسی ویژگی‏های عملکردی آنزیم بتاگلوکاناز تولید شده توسط باسیلوس لچنی‏فورمیس[xx] EGW039
‏(‏CGMCC 0635)، دمای 40 درجه سانتی‏گراد‏ و ‏اسیدیته ‏6/5 به عنوان شرایط مطلوب دستیابی به بهینه فعالیت آنزیمی تعیین شد ‏(‏18). دما و اسیدیته بهینه فعالیت کاتالیتیکی آنزیم بتا 1و3- 1و4 گلوکاناز باسیلوس سابتیلیس ‏GN156 ‏نیز به ترتیب ‏65 درجه‌ سانتی‏گراد‏ و 7 ‏گزارش شده است ‏(‏19). ‏

بررسی ویژگی‏های بهینه فعالیت کاتالیتیکی آنزیم‏ها در تعیین حوزه مناسب کاربرد صنعتی آن‏ها اهمیت ویژه‏ای دارد (20). با توجه به دامنه دمایی و اسیدیته بهینه، آنزیم مورد بررسی قابلیت استفاده در صنعت خوراک دام و طیور را دارد. اگرچه بهینه‏سازی محیط و شرایط کشت به منظور افزایش بهره‏وری و کاهش هزینه تولید ضروری به نظر می‏آید.



[1]- Aspergillus

[2]- Trichoderma

[3]- Candida albicas

[4]- Bacillus subtilis

[5]- Bacillus brevis

[6]- Response Surface Methodology

[7]- Nutrient Broth Yeast Extract

[8]- Lichenan

[9]- Tecan, pro M200, Switzerland

[10]- DNA

[11]- QIAGEN. Cat. No. 69504

[12]- Spectrophotometr (Thermo Scientific 2000C)

[13]- Forward

[14]- Revese

[15]- Bio-Rad, Canada

[16]- Basic Local Alignment Search Tool

[17]- Brewer spent grain

[18]- Tommy, Japan

[19]- Stat-Ease Inc. Minneapolis, MN, USA ( Design Expert 7.0.0)

[xx]- Bacillus licheniformis 

(1)               Klemm D., Heublein B., Fink H P., Bohn A. Cellulose: fascinating biopolymer and sustainable raw material. Angewandte. Chemie International Edition. 2005; 44 (22): 3358- 93.

(2)                    FurtadoG P., RibeiroL F., SantosC R., TonoliC C., de SouzaA R., OliveiraR R., et al. Biochemical and structural characterization of a β-1,3-1,4-glucanase from Bacillus subtilis 168. Process Biochemistry 2011; 46 (5): 1202- 06.

(3)               Aggarwal R., Purwar S., Kharbikar L., Gupta S.Induction of a wheat β-1,3-Glucanase gene during the defense response to Bipolaris sorokiniana. Acta Phytopathologica Entomologica Hungarica. 2011; 46 (1): 39- 47.

(4)               Vuong T V., Wilson D B.Glycoside hydrolases: Catalytic base/ nuclephile diversity. Biotechnology & Bioengineering 2010; 107 (2): 195- 205.

(5)               Xia L., Shen X.Production and immobilization of cellobiase from Aspergillus niger ZU-07. Process Biochemistry 2004; 39 (11): 1363- 7.

(6)               Song J.,Nam K., Sun Y U.,Kang M., Kim C H., Kwon S K.,et al.Molecular andbiochemical characterization of a novel arthropod endo-β-1,3-glucanase from the Antarctic springtail, Cryptopygus antarcticus horizontally acquired from bacteria. Comparative Biochemistry & Physiology.Part B 2010; 155 (4): 403- 12.

(7)               Beshay U., Enshasy H E., Ismail I., Moawad H., Wojciechowska E., Ghany S A.β-glucanase production from genetically modified recombinant Esherichia coli: Effect of growth substrates and development of a culture Murmedium in shake flasks and stirred tank bioreactor. Process Biochemistry 2003; 39 (3): 307- 13.

(8)               Rajoka M I.Influence of various fermentation variables on exo-glucanase production in Cellulomonas flavigena.Electronic Journal of Biotechnology 2004; 7 (3): 256- 63.

(9)               Louw M E., Reid S H., Watson T J.Characterization, cloning and sequencing of a thermostable endo- (1,3-1,4)β- glucanase- encoding gene from an alkalophilic Bacillusbrevis. Applied Microbiology & Biotechnology 1993; 38 (4): 507- 13.

(10)           Kuhad R C., Gupta R., Singh A.Microbial Cellulases and Their Industrial Applications. Enzyme Research 2011; 1- 10.

(11)           Bedford M R., Partidge G G., Enzyme in Farm Animal Nutrition, 2nd edition Marlborough: CABI Publishing; 2001.

(12)           IbrahimA M., Abdel-Aziz A A., Mahrous H.,Abdulraouf U M.Cloning and sequencing of cellulose- encoding gene (cel2)fromlocally isolated Bacillus sp.strain A4.Journal of Biotechnology.2009; 6 (1-2): 75- 88.

(13)           Aftab S., Aftab M N., Haq I., Javad M M., Zafar A.,Iqbal I.Cloning and expression of endo-1,4-B-Glucanase gene from Bacilluslicheniformis ATCC14580 into Escherichiacoli BL21 (DE3). African Journal of Biotechnoogyl 2012; 11 (12): 2846- 54.

(14)           Lindemann J., Arny DC., Upper CD.Epiphytic populations of Pseudomonas syringae pv.Syringae on snap bean and non host plants and the incidence of bacterial brown spot disease in relation to cropping patterns. Phytopathology 1998. 74 (11): 1329- 33.

(15)           Walter J., Mangold M.,Tannock G W.Construction, Analysis, and Glucanase Screening of a Bacterial Artificial Chromosome Library from the Large-Bowel Microbiota of Mice. Applied Environmental Microbiology 2005; 71 (5): 2347- 54.

(16)           Bailey M., Biely P., Poutanen K.Interlaboratory testing of methods for assay of xylanase activity. Journal of Biotechnology 1992; 23 (3): 257- 70.

(17)           Hashemi M., Shojaosadati SA., Razavi SH., Mousavi SM.The potential of brewer’s spent grain to improve the production of α-amylase by Bacillus sp.KR-8104 in submerged fermentation system. New Biotechnology  2011; 28 (2): 165- 72.

(18)           Teng D., WangJ., Fan Y., Yang Y., TianZ., Luo J., et al.Cloning of β-1,3-1,4-glucanase gene from Bacillus licheniformis EGW039 (CGMCC 0635)and its expression in Escherichia coli BL21 (DE3). Applied Microbiology & Biotechnology 2006; 72 (4): 705- 712.

(19)           Apiraksakorn J., Buwjoom T., Nitisinprasert S.Characterization of Grass Degrading Bacteria Active on β-1,3-1,4-D-glucans from Bacillus subtilis GN156 PotentialUse for Grass Silage-Making.Kasetsart Journal (Nat.Sci.) 2006; 40 (1): 136- 47.

(20)           Naghavi N S., Naderi S, Shahanipoor K, Zia M A., Rastegari Esfahani A A. Optimization of exopectinase activity of the fungus Monilia isolated from tangerine in submerged fermentation. Biological Journal of Microorganisms 2012; 1 (1): 23- 30.