استفاده از مایع تخمیر UTMC 5040 Aspergillus westerdijkiae در کنترل زیستی علف هرز جودره (Hordeum spontanum)

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار‏ میکروبیولوژی، مرکز‏ پژوهشی‏ فن‏آوری‏ و‏ فرآورده‏ های‏ میکروبی، دانشگاه‏ تهران، ایران

2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، مرکز‏ پژوهشی‏ فن ‏آوری‏ و‏ فرآورده ‏های‏ میکروبی، دانشگاه‏ تهران، ایران

3 استادیار‏ میکروبیولوژی، مرکز‏ پژوهشی‏ فن‏ آوری‏ و‏ فرآورده ‏های‏ میکروبی، دانشگاه‏ تهران، ایران

چکیده

مقدمه: علف هرز جودره (Hordeum spontanum) از مهم‏ترین علف‏های هرز مزارع غلات به ویژه گندم است. هدف از انجام پژوهش حاضر، معرفی قارچ‏های بیماری‏زای گیاهی جدا شده از خاک‏های مناطق مختلف ایران برای کنترل زیستی این علف هرز است. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: ابتدا 150 نمونه قارچ جدا شده از نقاط مختلف ایران طی دو مرحله متوالی با غربال‏گری اولیه و ثانویه روی برگ آفتابگردان و جودره قرار گرفتند. به این منظور، 200 میکرولیتر از مایع تخمیر هر کدام از قارچ‏های کشت داده شده در محیط PDB روی برگ گیاهان یاد شده اسپری شد. در ادامه، توانایی جدایه‏های منتخب برای ایجاد نکروز در علف هرز جودره رشد داده شده در گلدان و نیز توانایی آن‏ها در مهار جوانه‏زنی و ریشه‏زایی علف هرز و همچنین، طیف میزبانی جدایه‏های منتخب بررسی شد. ‏‏‏

نتایج: پس از انجام غربال‏گری اولیه و ثانویه مشخص شد که جدایه Aspergillus westerdijkiae UTMC 5040 بیش‏ترین توانایی را در ایجاد نکروز در علف هرز جودره دارد. پس از اسپری 5/1 میلی‏لیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده این جدایه قارچی بر برگ‏های بالغ علف هرز جودره کشت داده شده در گلدان، و پس از گذشت 3 هفته نکروز شدیدی در گیاه مشاهده شد. بررسی توانایی جدایه منتخب برای مهار جوانه‏زدن و ریشه‏زایی علف هرز، نشان داد که پس از گذشت 10 روز قوه نامیه جودره به میزان 75 درصد و قدرت ریشه‏زایی به طور میانگین از 60 میلی‏متر به 35 میلی‏متر کاهش یافت. بررسی طیف میزبانی جدایه مورد نظر نشان داد که از بین 25 گیاه مختلف، این جدایه توانایی ایجاد علایم بیماری را در سه گیاه هرز جودره، گارس و پیچک صحرایی دارد. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏گیری: پژوهش حاضر، نخستین گزارش از کنترل زیستی علف هرز جودره توسط مایع تخمیر UTMC5040 A. westerdijkiae است و نتایج به دست آمده می‏تواند در یافتن علف‏کش‏های زیستی جدید استفاده شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Biological control of Hordeum spontanum by fermentation broth of Aspergillus westerdijkiae UTMC 5040

نویسندگان [English]

  • Javad Hamedi 1
  • Hamid Cheraghian Radi 2
  • Hamid Moghimi 3
1 Associate professor of microbiology, Microbial technology and Products research center, University of Tehran, Iran
2 M.Sc. of microbiology, Microbial technology and Products research center, University of Tehran, Iran
3 Assistant professor of microbiology, Microbial technology and Products research center, University of Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction: Hordeum spontanum is one of the most important crop weeds, especially for wheat. The aim of this study was screening of phytopathogenic fungi for biocontrol of H. spontanum.
Materials and methods: Firstly, 150 fungal isolates were obtained from different soil sources of Iran. The isolates were subjected under primary and secondary screening on the sunflower and H. spontanum leaves. In these steps, 200 µl of centrifuged fermentation broth of cultivated fungi in PDB medium was sprayed on the leaves of sunflower and H. spontanum. Also, the ability of selected isolates to induce disease and necrosis on H. spontanum leaves in pot, preventing seed germination and root growth repression were studied. Finally, the host range of selected isolate was investigated.
Results: The results of primary and secondary screening showed that Aspergilluswesterdijkiae UTMC 5040 produced the highest lesion halo on H. spontanum leaves. In pot test, treatment with 1.5 ml of fermentation broth produced huge necrosis on mature H. spontanum plant after 3 weeks. H. spontanum seed germination decreased from 90 to 25% and root emersion decreased from 60 to 35 mm 10 days after treatment by the fermentation broth. Host range study revealed that among 25 different plant strains, A.westerdijkiae UTMC 5040 caused disease on H. spontanum, Eremopyrum bonaepartis and Convolvulus arvensis leaves.
Discussion and conclusion: This study was the first report of biological control of H. spontanum with fermentation broth of A.westerdijkiae UTMC 5040. The obtained results can be useful to finding a new fungal bio-herbicide.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Hordeum spontanum
  • Phytopathogenic fungi
  • Biological control
  • Aspergillus westerdijkiae UTMC 5040

مقدمه.

هر ساله علف‏های هرز به کاهش بیش از 7/9 درصد بازده محصولات کشاورزی در سرتاسر جهان منجر می‏شوند (1). کنترل علف‏های هرز بخش قابل توجهی از فعالیت‏های لازم برای تولید محصولات کشاورزی را به خود اختصاص داده است. علف‏های هرز بازده محصولات کشاورزی را در اثر رقابت با گیاه اصلی برای آب، مواد غذایی و نور خورشید کاهش می‏دهند (2). همچنین، می‏توانند به طور مستقیم عملیات جمع‏آوری محصول را با تأخیر مواجه کرده، کیفیت محصول را کاهش داده و مواد شیمیایی زیان‏بار تولید کنند.در ایالات متحده امریکا با وجود کوشش زیاد برای مقابله با علف‏های هرز، خسارت سالانه ناشی از این عوامل مزاحم بیش از 8 میلیارد دلار تخمین زده شده است (3). علف هرز جودره با نام علمی
 Hordeumspontanum عضوی از خانواده گندمیان واز جمله مهم‏ترین علف‏های هرز در مزارع گندم است. زیست‏گاه طبیعی این گیاه یک‏ساله در مناطق آمریکای جنوبی، آفریقای جنوبی، آسیا و نیز ایران است (4). این علف هرز بیشتر در رقابت با گندم سریع‏تر جوانه زده و عامل بسیار مهمی در کاهش محصول نهایی است. در یک مطالعه انجام شده در استان فارس مشخص شده که رشد جودره می‏تواند محصول گندم را تا 83 درصد در هکتار کاهش دهد (5 و 6).

برای کنترل علف‏های هرز از روش‏های مکانیکی، شیمیایی و زیستی استفاده می‏شود (7). امروزه استفاده از علف‏کش‏های شیمیایی به عنوان روش اصلی برای مقابله با علف‏های هرز در نظر گرفته می‏شود، اما آثار مضر این علف‏کش‏ها بر سلامت انسان و حیوانات، ایجاد آلودگی‏های زیست محیطی از قبیل آلودگی خاک، آب‏های زیرزمینی و مواد غذایی، از بین بردن ارگانیسم‏های غیرهدف و افزایش مقاومت علف‏های هرز در برابر علف‏کش‏های شیمیایی، توجه دانشمندان را به استفاده از روش‏های جایگزین جلب کرده است (8 و 10). هم اکنون علف‏کش‏های زیستی به عنوان مهم‏ترین روش جایگزین برای علف‏کش‏های شیمیایی در نظر گرفته می‏شوند. از جمله ویژگی‏های مثبت این نوع از علف‏کش‏ها می‏توان به اختصاصی بودن نسبت به علف هرز هدف، ایمن بودن برای محیط زیست و کاهش توسعه مقاومت در بین علف‏های هرز اشاره کرد (11). در روش کنترل زیستی علف‏های هرز از نماتودها، حشرات، باکتری‏ها و قارچ‏ها برای مهار رشد یا از بین بردن این عوامل مزاحم استفاده می‏شود. در این میان استفاده از قارچ‏ها به عنوان مهم‏ترین عوامل بیماری‏زا در گیاهان، بیش‏ترین توجه و موفقیت را در برداشته است (12). در روش کنترل زیستی علف‏های هرز به وسیله قارچ‏ها یا از اسپور‏های قارچی مثل اسپور‏های Colletotrichumgloeosporioides و Alternariacassiو یا از فیتوتوکسین‏های تولید شده توسط آن‏ها استفاده می‏شود (13). در سال 1984 بیویک[1] و همکارانش گونه Alternariadestruensرا از گیاه بیمار Cuscutagronovii جداسازی کردند (14). در مطالعات بعدی، مشخص شد که این قارچ بیماری‏زا به میزان 92 درصد به کنترل علف هرز Cuscutagronoviiقادر است (15).

با توجه به توانمندی‏های زیاد قارچ‏ها در این زمینه و اهمیت کنترل زیستی جودره در کشت غلات و به ویژه گندم، در پژوهش حاضر، برای نخستین بار توانمندی قارچ‏های بیماری‏زای گیاهی در ایران به منظور معرفی یک عامل زیستی توانمند در کنترل زیستی گیاه هرز جودرهبررسی شد.

‏‏مواد و روش‏ها.

کشت و خالص‏سازی جدایه‏های قارچی: در پژوهش حاضر، 150 جدایه قارچی از ریزوسفر و فیلوسفر گیاهان آلوده جمع آوری شده از سراسر کشور به دست آمد. به منظور کشت و جداسازی و همچنین خالص‏سازی جدایه‏های قارچی از محیط سیب زمینی دکستروز آگار [2] استفاده شد. پلیت‏های کشت داده شده به مدت 7 تا 14 روز در دمای 28 سانتی‏گراد گرماگذاری شد. جدایه‏ها پس از کشت مجدد رویPDA داخل ارلن مایرهای حاوی 50 میلی‏لیتر از محیط کشت مایع سیب زمینی دکستروز براث [3] تلقیح شده و به مدت 6 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد روی شیکر با 180 دور در دقیقه گرمخانه گذاری شد. مایع تخمیر حاصل از رشد قارچی 15 دقیقه در 4000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی حاصل در مراحل بعدی برای سنجش روی گیاه استفاده شد (9).

آماده‏سازی گیاهان: بذر گیاهان مورد استفاده در پژوهش حاضر، از موسسه علف‏های هرز ایران تهیه شد. فهرست این گیاهان در جدول 1 آورده شده است. به منظور استریل کردن بذرها قبل از کشت، در ابتدا هر بذر در محلول هیپوکلریت سدیم 1 درصد شستشو و به دنبال آن با آب مقطر دو مرحله شستشو انجام شد (16). بذرهای سترون شده به منظور جوانه زدن اولیه در محیط آب آگار کشت و به مدت 3 روز در تاریکی و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. بذرهای جوانه زده و بدون آلودگی به داخل محیط کشت MS آگار [4] انتقال یافتند و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد در زیر روشنایی مستقیم قرار داده شدند. گیاهان بالغ 4 هفته‏ای برای انجام سنجش زیستی آثار عصاره‏های قارچی استفاده شدند. به منظور رشد گیاهان مورد نظر در گلدان، خاک باغچه غنی شده با کود برگ که توسط اتوکلاو در دمای 121 درجه سانتی‏گراد به مدت 15 دقیقه استریل شده بود، به گلدان‏های پلاستیکی 15سانتی‏متر مکعب انتقال داده شد. سپس، در هر گلدان 4 عدد بذر علف هرز قرار گرفت. آبیاری به شکل روزانه انجام گرفت و در نهایت، گلدان‏ها در دمای 28 درجه سانتی‏گراد به مدت 4 تا 6 هفته قرار داده شدند.

سنجش زیستی فعالیت جدایه‏های قارچی در پلیت: در مرحله غربال‏گری اولیه، 200 میکرولیتر از مایع تخمیر به دست آمده از 150 جدایه خالص شده روی برگ، ساقه و ریشه گیاه آفتابگردان در محیط MS قرار داده شد و گیاه مورد نظر به مدت 10 روز بررسی شد. طی این مرحله از گیاه آفتابگردان تیمار شده با محیط کشت به تنهایی به عنوان نمونه شاهد منفی استفاده شد. در ادامه ارزیابی بیماری‏زایی قارچ‏های منتخب از مرحله اول بر روی علف هرز جودره به ترتیبی که در بالا برای آفتابگردان یاد شد، انجام شد. طی انجام این مرحله از گیاه گندم اسپری شده با محیط کشت تلقیح نشده به عنوان نمونه شاهد استفاده شد. هر عصاره به دست آمده روی سه گیاه مستقل و در دو آزمایش به شکل جداگانه تکرار شد (17).

سنجش فعالیت زیستی جدایه منتخب در گلدان: در این مرحله تاثیر مایع تخمیر جدایه منتخب در مهار رشد و ایجاد نکروز روی گیاهان بالغ جودره بررسی شد. برای این منظور 5/1 میلی‏لیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه منتخب روی برگ‏های گیاهان بالغ 4 هفته‏ای اسپری شد. در طول مدت انکوباسیون 12روزه، تیمار مایع تخمیر قارچ منتخب روی برگ‏ها 3 بار و هر 4 روز یکبار انجام شد. در این آزمایشاز گندم و محیط کشت تلقیح نشده به عنوان نمونه شاهد منفی استفاده شد. تغییرات گیاهان شاهد و گیاه مورد آزمایش، روزانه عکس‏برداری شد. به منظور تکرار آزمایش،عصاره قارچ منتخب روی سه گلدان مستقل و در دو آزمایش، جداگانه آلوده‏سازی شد (17).

سنجش میزان مهار قدرت جوانه‏زنی بذر گیاه هرز: به منظور بررسی مهار قدرت جوانه‏زنی بذر علف هرز توسط جدایه منتخب، 50 عدد از بذر جودره در پلیت‏های حاوی آب آگار قرار داده شد و سپس، 3 میلی‏لیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده روی سطح بذرها ریخته شد. در نهایت، پلیت‏ها در دمای 28 درجه سانتی‏گراد در تاریکی نگهداری شدند. از پلیت‏های حاوی بذر که تنها با محیط کشت تلقیح نشده تیمار شده بودند، به عنوان شاهد استفاده شد. قوه نامیه بذرها پس از گذشت 10 روز بررسی شد (9). این آزمایش برای علف هرز مورد آزمایش 3 بار و هر بار با 3 تکرار 50 تایی از بذرها تکرار و میانگین نتایج حاصل با نمونه شاهد مقایسه شد.

سنجش میزان مهار ریشه‏زایی بذر گیاه هرز: به منظور بررسی توانایی جدایه منتخب در جلوگیری از ریشه‏زایی علف هرز جودره، 50 عدد از بذرهای جوانه زده این گیاه با 3 میلی‏لیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده قارچی تیمار شدند. سپس، بذرها در تاریکی و در دمای 28 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند. پس از گذشت 10روز نتایج ثبت شد. این آزمایش برای علف هرز مورد آزمایش 3 بار و هر بار با سه تکرار 50 تایی از بذرها تکرار و میانگین نتایج حاصل با نمونه شاهد مقایسه شد.

بررسی طیف میزبانی جدایه منتخب: به منظور بررسی طیف اثر جدایه منتخب، بیماری‏زایی آن برای 25 گونه گیاهی متعلق به 9 خانواده مختلف بررسی شد (18). در این مرحله 1 میلی‏لیتر از مایع تخمیر سانتریفوژ شده از جدایه منتخب در محیط PDB روی برگ‏های گیاهان مورد نظر تیمار شد. در ادامه، گیاهان تیمار شده در دمای 28 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 روز نگهداری شدند. از گیاهان تیمار شده با آب مقطر به عنوان نمونه‏های شاهد منفی استفاده شد. گیاهان بر اساس میزان آسیب وارد شده به سه دسته ایمن (بدون نکروز قابل مشاهده)، مقاوم (با لکه نکروزی دارای قطر کمتر از1 میلی‏متر) و یا حساس (دارای لکه نکروزی بزرگتر از 2 میلی‏متر) تقسیم بندی شدند(18). این آزمایش برای هر کدام از 25 گونه‏ گیاهی، جداگانه و به شکل 3 تکرار انجام شد.

.شناسایی ریخت‏شناسی و مولکولی جدایه منتخب: شناسایی ریخت‏شناسی جدایه منتخب از طریق تهیه کشت روی لام و رنگ آمیزی با لاکتوفنول کاتن بلو و مشاهده میکروسکوپی و سپس، روش مولکولی انجام شد. برای این منظور جدایه منتخب در محیطPDB به مدت 48 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. میسلیوم‏های قارچ با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا و پس از شستشو با سرم فیزیولوژی در هاون ریخته و به شکل فیزیکی با روش کوبیدن زیست توده منجمد شده با ازت مایع سلول‏ها شکسته شده و DNA آن با روش استخراج با روش فنل- کلروفرم جداسازی شد (19). PCR با پرایمرهای ITS1 و ITS4 (ITS1: 5´TCC GTA GGT GAA CCT GCG G´3وITS4:5´TCCTCCGCT TAT TGA TAT GC´3) انجام شد (20). ویال PCR حاوی 25 میکرولیتر از اجزای واکنش، شامل 5/3 میکرولیتر آب مقطر استریل، 1 میکرولیتر از هر کدام از پرایمرهای رفت و برگشت، 2 میکرولیتر DNA نمونه با غلظت 30 نانوگرم در میکرولیتر، 5 میکرولیتر بافر PCR و 5/12 میکرولیتر آنزیم TaqDNApolymerasemastermix، شرکت آمپلیکون [5] بود. تکثیر قطعه مورد نظر در شرایط زیر انجام شد: 5 دقیقه واسرشتی ابتدایی در 96 درجه سانتی‏گراد، 30 چرخه PCR شامل واسرشتی اولیه 45 ثانیه‏ای در دمای 96 درجه سانتی‏گراد، 30 ثانیه در دمای 50 درجه سانتی‏گراد برای اتصال پرایمر و پلیمریزاسیون برای 5/1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏گراد. پلیمریزاسیون نهایی در 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه انجام شد. محصول به دست آمده پس از خالص‏سازی از روی ژل، برای تعیین توالی استفاده شد. به منظور توالی‏یابی، باند مورد نظر از ژل با کمک کیت استخراج از ژل ساخت شرکت ژن آل-کره جنوبی [6] استخراج و به شرکت ماکروژن-کره جنوبی ارسال شد. تعیین ترادف بر اساس روش تغییر یافته سنگر انجام شد و نتایج تعیین ترادف در بانک ژن و از طریق هم‏ردیفی توالی ارزیابی شد.

تحلیل آماری نتایج: داده‏های به دست آمده با نرم‏افزار SPSS نسخه 20 تجزیه و تحلیل شد. آزمون نرمال سنجی برای آزمایش‏های پتانسیل جوانه‏زنی، ریشه‏زایی و میزان آسیب وارد شده به برگ‏ها پس از اسپری کردن مایع تخمیر با استفاده از آزمون شاپیرو- ویلک [7] انجام شد. همچنین، معنادار بودن این داده‏ها به کمک آزمون تی [8] ارزیابی شد.

 

نتایج.

.غربال‏گری جدایه‏ها بر اساس سنجش سمیت بر آفتابگردان و جودره: با توجه به حساسیت بالای گیاه آفتابگردان به متابولیت‏های ضد گیاهی تولید شده توسط میکروارگانیسم‏ها (17)، به منظور غربال‏گری اولیه جدایه‏ها از این گیاه استفاده شد. براساس نتایج به دست آمده پس از گذشت 10 روز مشخص شد که از میان 150 جدایه مورد آزمایش، 30 جدایه توانایی ایجاد نکروز و مرگ در برگ‏های گیاه آفتابگردان را دارند (شکل 1). ایجاد نکروز و کلروز، رشد قارچ در سطح گیاه، مهار رشد برگ و از بین رفتن ساقه و ریشه معیارهای انتخاب جدایه‏های مثبت در این مرحله بود.

 

 

 

شکل 1- سنجش زیستی جدایه‏های قارچی روی گیاه آفتابگردان.

راست: گیاه تیمار شده با 1 میلی‏لیتر مایع تخمیر به دست آمده از جدایه HC99، چپ: گیاه شاهد تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB

 

شکل 2- سنجش زیستی جدایه‏های قارچی بر روی برگ‏های جودره

A: برگ گیاه جودره تیمار شده با عصاره تخمیر سانتریفوژ شده جدایه HC99،B: برگ گیاه جودره تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB و C: برگ‏های گندم تیمار شده با مایع تخمیر حاصل از HC99) (P value<0.05.

 

 

در غربال‏گری ثانویه 30 جدایه منتخب در مرحله قبل که در کوتاه‏ترین زمان بیش‏ترین آثار تخریبی را روی آفتابگردان به همراه داشتند، به منظور بررسی اثر روی گیاه جودره آزمایش شدند. از بین 30 جدایه یاد شده 6 جدایه توانایی در خور توجهی در ایجاد علایم بیماری در علف هرز مورد آزمایش داشتند، که از بین آن‏ها جدایه HC99 به علت داشتن بیش‏ترین اثر سمی در کم‏ترین زمان نسبت به سایر جدایه‏ها انتخاب و برای انجام آزمایش‏های بعدی استفاده شد (شکل 2).

شناسایی ریخت‏شناسی و مولکولی جدایه HC99: برای شناسایی جدایه‌های قارچی، ویژگی‌های ریخت‏شناسی آن‌ها از قبیل شکل میسلیوم، آرایش اسپورها، آرایش و رنگ کلونی و پیگمان‏های تولیدی از طریق رنگ آمیزی با لاکتوفنل کاتن بلو و تهیه اسلاید کالچر و نیز با توجه به کلیدهای شناسایی ریخت‏شناسی مرجع بررسی شد (21). در جدول 1 ویژگی‏های میکروسکوپی و ماکروسکوپی جدایه HC99 مشاهده می‏شود. ساختار کنیدی‏های گرد در انتهای کلوملای مربوط به جنس Aspergillus مشاهده می‏شود. PCR با استفاده از پرایمرهای ITS انجام شده یک باند حدود 700 جفت بازی ایجاد کرد که در شکل 3 مشاهده می‏شود. توالی تعیین ترادف شده برای جدایه مورد نظر با شماره دسترسی [9] 1773510 در بانک ژنی NCBI ثبت شد‏. نتیجه حاصل از تعیین ترادف این باند مشخص کرد که جدایه HC99 به میزان 100 درصد با گونه Aspergilluswesterdijkiae خویشاوندی دارد.

 

 

شکل 3- تصویر ژل الکتروفورز آگارز 1درصد حاصل از PCR منطقه ITS درA. Westerdijkae UTMC 5040

 

 

جدول 1- ویژگی‏های میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلونی‏های جدایه A. westerdijkiae UTMC5040

میسلیوم هوایی

رنگ اسپور

رنگ کلونی‏ها

شکل کلونی

تصویر انتهای میسلیوم هوایی جدایه HC99

تصویر جدایه HC99 در محیط کشت PDA

سفید رنگ

زرد روشن

زردرنگ با حاشیه سفید

بزرگ، حاشیه‏دار، چروکیده، پودری

   

 

 

رنگ و چروکیدگی کلونی‏ها از جمله ویژگی‏های‏ متمایز کننده سویه یاد شده از سایر گونه‏های این جنس از قبیل Aspergillusniger و Aspergillusfumigatus است. جدایه مورد نظر با شماره UTMC5040 در کلکسیون میکروارگانیسم‏های دانشگاه تهران نگهداری شد‏.

.سنجش زیستی فعالیت مایع تخمیر جدایه UTMC5040. A. westerdijkiae در کشت گلدانی جودره: عصاره قارچ A.westerdijkiaeUTMC5040 روی برگ‏های گیاهان بالغ 6 تا 8 هفته‏ای تیمار شد. تیمار زیستی گیاهان با عصاره در 3 مرحله و هر 4 روز یک‏بار انجام گرفت. نتایج به دست آمده از سنجش زیستی عصاره روی گیاه در شکل 4 مشاهده می‏شود. بر اساس نتایج به دست آمده، نکروز و بافت مردگی برگ‏ها پس از 3 هفته در گیاهان تیمار شده با عصاره تخمیر قارچی به طور کامل مشاهده شد (شکل 4). در این مرحله از گیاه گندم به عنوان شاهد استفاده شد که بر اساس نتایج ارایه شده در شکل 4، مایع تخمیرقارچتأثیری روی گیاه شاهد پس از 21 روز نداشت.

 

 

 

شکل 4- سنجش زیستی آثار نکروزی مایع تخمیر UTMC5040 A. westerdijkiae در گیاهان بالغ

A: علف هرز جودره تیمار شده با عصاره تخمیر سانتریفوژ شده UTMC5040 A. westerdijkiae، B: علف هرز جودره تیمار شده با عصاره محیط کشت PDB و C: گیاه گندم تیمار شده با مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae(P value<0.05)


.ارزیابی توان مایع تخمیر قارچی در جلوگیری از جوانه زدن علف هرز جودره: در این آزمایش در هر تکرار 50 عدد از بذر علف هرز با مایع تخمیر قارچی تیمار شد و نتایج پس از گذشت 10 روز ثبت شد‏. نتایج به دست آمده نشان داده که قوه نامیه بذرها بدون هیچگونه تیمار 90 درصد بود. در ادامه قوه نامیه بذرهای تیمار شده با محیط کشت تلقیح نشده به عنوان شاهد و بذرهای تیمار شده با مایع تخمیر قارچی اندازه‏گیری شد. نتایج به دست آمده نشان داد که مایع تخمیر
 A. westerdijkiaeUTMC5040 می‏تواند جوانه زدن علف هرز جودره را به میزان 75 درصد در مقایسه با نمونه‏های شاهد کاهش دهد (شکل 5).

 

 

شکل 5- A: درصد جوانه‏زنی بذرهای علف هرز جودره اسپری شده با عصاره محیط کشت تلقیح نشده و B: درصد جوانه‏زنی بذرهای علف هرز جودره اسپری شده با مایع تخمیر
 A. westerdijkiae UTMC 5040(P value<0.05).

 

ارزیابی توان مایع تخمیر قارچی در مهار ریشه‏زایی علف هرز جودره: در این آزمایش در هر تکرار 50 عدد از بذر علف هرز تیمار شد. پس از گذشت 10روز از زمان اسپری مایع تخمیر قارچی روی بذرها، نتایج ثبت شد‏. نتایج به دست آمده نشان داد که اندازه ریشه گیاه جودره به طور میانگین از 60 میلی‏متر در نمونه‏های شاهد به 35 میلی‏متر در نمونه‏های تیمار شده کاهش یافت. نتایج به دست آمده نشان داد که مایع تخمیر
A. westerdijkiaeUTMC5040 می‏تواند ریشه‏زایی علف هرز جودره را تا بیش از 45 درصد در مقایسه با نمونه‏های شاهد کاهش دهد(شکل 6).

 

 

شکل 6- A: میزان ریشه‏زایی بذرهای جوانه زده جودره اسپری شده با عصاره محیط کشت تلقیح نشده و B: میزان ریشه‏زایی بذرهای جوانه زده جودره اسپری شده با مایع تخمیرA. westerdijkiae UTMC 5040(P value<0.05) .

 

بررسی طیف میزبانی UTMC5040 westerdijkiae A. :به منظور ارزیابی دامنه میزبانی، سنجش زیستی مایع تخمیر جدایه A. westerdijkiae UTMC5040روی گیاهان زراعی و گیاهان هرز مختلف بررسی شد. جدول 2 فهرست گیاهان هرز و جدول 3 فهرست گیاهان زراعی مورد استفاده در این آزمایش را نشان می‏دهد. در انتخاب این گیاهان خویشاوندی دور و نزدیک به جودره و همچنین، میزان انتشار و گسترش علف‏های هرز مورد توجه قرار گرفته است.

جدول 2- پاسخ علف‏های هرز مختلف در برابر تیمار با 1 میلی‏لیتر مایع تخمیر سانتریفوژ شده جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae.گیاهان براساس میزان آسیب وارد شده به سه دسته ایمن (بدون نکروز قابل مشاهده)، مقاوم (با لکه نکروزی دارای قطر کمتر از 1 میلی‏متر) و یا حساس (دارای لکه نکروزی بزرگتر از 2 میلی‏متر) تقسیم‏بندی شدند (18) (P value<0.05).

نام علمی

نام فارسی

شدت بیماری

Amaranthus retroflexus

تاج خروس ایستاده

ایمن

Amaranthus blitoides

تاج خروس خوابیده

ایمن

Brassica cf deflexa

کلم وحشی

ایمن

Chenopodium album

سلمه تره

ایمن

Convolvulus arvensis

پیچک صحرایی

حساس

Cuscuta sp.

سس

ایمن

Trifolium sp.

شبدر

ایمن

Echinochloa crusgali

سوروف

ایمن

Eremopyrum bonaepartis

گارس

حساس

Hordeum murinum

جوموشک

مقاوم

Hordeum spontanum

جودره

حساس

Lolium sp.

چچم

مقاوم

Sorghum halepense

قیاق

ایمن

Rumex sp

ترشک

ایمن

 

بر اساس نتایج ارایه شده در جدول 2 و 3، آثار نکروزی ناشی از عصاره قارچ منتخب در 4 گونه گیاهی از 24 گونه گیاهی مورد آزمایش مشاهده شد. همچنین، در نمونه‏های شاهد هیچگونه اثر نکروزی دیده نشد. علاوه بر جودره که بیش‏ترین علایم نکروزی در آن مشاهده شد، در 2 گیاه هرز گارس [x] و علف هرز پیچک صحرایی [xi] آثار نکروزی ایجاد شد. شایان ذکر است جودره و گارس به هم نزدیک بوده و در خانوده پواسه [xii]قرار می‏گیرند. همچنین، در سایر اعضای متعلق به خانواده پواسه، آثار نکروزی کم و بدون از بین بردن گیاه در جوموشک، چچم و ذرت دیده شد. از میان گیاهان زراعی آثار نکروزی تنها در گیاه کدو [xiii] مشاهده شد.

جدول 3- پاسخ گیاهان زراعی مختلف در برابر تیمار با 1 میلی‏متر مایع تخمیر جدایه UTMC 5040A. westerdijkiae

(P value<0.05)

شدت بیماری

نام معمول

نام علمی

ایمن

تره

Alliumampeloprasum

ایمن

ترب

Raphnus sativus

ایمن

هندوانه

Citrullus vulgaris

حساس

کدو

Cucurbita moschata

ایمن

لوبیا

Phaseolus vulgaris

ایمن

نخود فرنگی

Pisum sativum

ایمن

عدس

Lens culinaris

ایمن

برنج

Oryza sativa

ایمن

گندم

Triticum sp.

مقاوم

ذرت

Zea mays

 

بحث و نتیجه ‏‏گیری.

علف هرز جودره یکی از علف‏های هرز رایج و مخرب در مزارع گندم است که هر ساله خسارات در خور توجهی را به مزارع وارد می‏کند (6). امروزه به منظور مقابله با این گیاه از علف‏کش‏های شیمیایی استفاده می‏شود. سولفوسولفورون [xiv] با نام تجاری آپیروس و مت سولفورون متیل به همراه سولفوسولفورون [xv] با نام تجاری توتال مهم‏ترین علف‏کش‏های شیمیایی مورد استفاده برای کنترل جودره هستند (22). ماندگاری بالای این ترکیبات در خاک و همچنین، سمیت ناشی از آن از جمله معایب استفاده از این علف کش‏های شیمیایی است (23).

 نتایج به دست آمده در پژوهش حاضر نشان داد که مایع تخمیر جدایه A. westerdijkiae UTMC5040 آثار نکروزی بالایی را در جودره ایجاد کرده و توانمندی زیادی برای کنترل این گیاه دارد (شکل 2 و 4). نتایج آزمون گلدانی نشان داد که در شرایط کنترل شده، عصاره سانتریفوژ شده مایع تخمیر این قارچ بیماری‏زایی در خور توجهی برای علف هرز جودره ایجاد می‏کند. نتایج همچنین نشان داده که این جدایه به خوبی قدرت جوانه‏زنی این علف هرز را مهار می‏کند. اطلاعاتی که از آزمایش طیف میزبانی حاصل شد نشان می‏دهد که جدایه A. westerdijkiae UTMC5040 در سطح خانواده دارای طیف اثر اختصاصی است و می‏تواند به عنوان یک عامل زیستی توانمند در کنترل جودره استفاده شود.

از جمله عواملی که کنترل زیستی علف‏های هرز به وسیله اسپورهای قارچی را با مشکل مواجه می‏کند، نیاز اسپورهای قارچی به رطوبت بالا برای تندش است. بیشتر اسپورها برای تندش به رطوبت نزدیک به حالت اشباع نیاز دارند (24). ولی این مقدار رطوبتی در بسیاری از مواقع به ویژه در مزارع غلات مثل گندم قابل تأمین نیست. از جمله راه‏های جایگزین برای کنترل زیستی علف‏های هرز، استفاده از متابولیت‏های قارچی است. اعضای جنس Aspergillus توانمندی بسیار زیادی در تولید متابولیت‏های زیستی دارند. از 200 گونه مختلف این جنس تاکنون بیش از 500 متابولیت کشف شده است. این در حالی است که عدد در مورد مخمرها با بیش از 1500 گونه شناخته شده مخمر و بیش از 30 هزار گونه بازیدیومیست، به ترتیب حدود 50 و 300 متابولیت کشف شده است (25). به تازگی نیز کاظم‏زاده [xvi] و همکاران نیز از مایع تخمیر A. awamori به منظور کنترل زیستی بیماری شانکر مرکبات ایجاد شده توسط Xanthomonascitri استفاده کرده‏اند (29). بر اساس بررسی‏های انجام شده پژوهش حاضر، نخستین گزارش از توانمندی‏های متابولیت‏های زیستی جنس Aspergillus در کنترل علف‏های هرز است. ولی با توجه به ایجاد حساسیت اسپورهای برخی از گونه‏های جنس Aspergillus مانند A. nigerو نیز امکان تولید آفلاتوکسین توسط این گونه‏ها (26 و 27)، استفاده مستقیم از سویه‏ها در مزرعه، فقط پس از اطمینان از حذف این موارد میسر است. البته می‏توان این متابولیت‏ها را در فرمانتور تولید، استخراج و برای اهداف کنترل زیستی استفاده کرد. ولی در این کار باید هزینه حاصل از کشت انبوه قارچ در فرمانتور، استخراج و خالص‏سازی محصول را در نظر گرفت (25 و 26)، به نحوی که از نظر اقتصادی محصول قابل رقابت با سموم شیمیایی باشد. راه حل دیگر خاموش کردن ژن‏های مضر در سویه مولد و استفاده مستقیم از آن در مزرعه است. A. westerdijkiaeبه دست آمده در پژوهش حاضر، قادر به تولید متابولیت‏های زیستی زیادی از قبیل پنی‏سیلینیک اسید، 4- هیدروکسی‏میلین، زانتومگنین، ویومیلین، ویوزانتین، سیرکامداتین (A- G)، آسپرولوگزین‏ها و آسپرگامید‏هاست(28). اما تاکنون گزارشی مبنی بر فعالیت علف کشی در جنس Aspergillus و استفاده از آن ارایه نشده است. نتایج پژوهش حاضر می‏تواند در معرفی این قارچ و متابولیت‏های تولیدی توسط آن به عنوان یک عامل زیستی کنترل کننده علف هرز جودره استفاده شود.



[1]- Bewick 

[2]- Potato Dextrose Agar

[3]- Potato Dextrose Broth

[4]- Murashinge and Skoog Agar

[5]- Amplicon

[6]- Gene all, South Korea

[7]- Shapiro- wilk test

[8]- T-test

[9]- Accession Number

[x]- Eremopyrum bonaepartis

[xi]- Convolvulus arvensis

[xii]- Poaceae

[xiii]- Cucurbita moschata

[xiv]- Sulfosulfuron

[xv]- Metsulfuron methyl + Sulfosulfuron

[xvi]- Kazemzadeh

(1)               Li Y., Sun Z., Zhuang X., Xu L., Chen S., Li M. Research progress on microbial herbicides. Crop Protection 2003; 22 (4): 247- 52.

(2)               Zimdahl R. Weed-Crop competition. 2nd. ed. UK: Blackwell publishing Ltd Oxford; 2004.

(3)               Pimentel D., McLaughlin L., Zepp A., Lakitan B., Kraus T., Kleinman P., et al. Environmental and economic impacts of reducing U.S. agricultural pesticide use. In: Pimentel D., editor. Handbook of Pest Management in Agriculture. 2nd. ed. Florida, CN: CRC Press, Boca Raton; 1991. 679- 720.

(4)               Blattner F. Progress in phylogenetic analysis and a new infrageneric classification of the barley genus Hordeum (Poaceae: Triticeae). Breeding Science 2009; 69 (5): 471- 80.

(5)               Baghestani M., Saiedipor H., Minbashi M., Lashkari A. Integrated management of H.spontanuem in wheat fields.1st. ed. Tehran: Agricaltural ecology; 2009.

(6)               Ellis R., Nevo E., Beiles A. Milling energy polymorphism in Hordeum spontaneum Koch in Israel and its potential utilization in breeding for malting quality. Plant Breeding 1993; 111 (6): 78- 81.

(7)               Kennedy G., Sutton T. Emerging Technologies for Integrated Pest Management: Concepts., Research and Implementation. 1st. ed. Minnesota: The American phytopathological society; 2000.

(8)               Watson AK. The classical approach with plantpathogens. In: TeBeest DO, editor. Microbial Control ofWeeds. 1st. ed. New York, CN: Chapman and Hall;1991. 3- 23.

(9)               Charudattan R., Dinoor A. Biological control of weedsusing plant pathogens: accomplishments andlimitations. Crop Protection 2000; 19 (4- 9): 691- 5.

(10)           Charudattan R. Ecological, practical, and politicalinputs into selection of weed targets: what makes agood biological control target. Biological Control 2005; 35 (5):183- 96.

(11)            Saxena S., Pandey A. Microbial metabolites as eco-friendly agrochemicals for the next millennium. Application of Microbial Biotechnology 2001; 55 (9): 395- 403.

(12)           Holm L., Pancho J., Holm E., Pancho J., Herberger J. The worst world weeds: Distribution and biology. 1st. ed. Honolulu: University of Hawaii press; 1977.

(13)           Hoagland R., Boyette C., Weaver M., Abbas H. Bioherbicides: research and risks. Toxin Review 2007; 26 (7): 313- 42

(14)            Bewick T., Binning L., Stevenson W. Discovery of two fungal pathogens of swamp dodder (Cuscuta gronovii Willd). Weed Science Society 1986; 3 (5): 26- 7.

(15)           Bewick TA., Binning LK., Stevenson WR., Stewart J. A mycoherbicide for control of swamp dodder (Cuscuta gronovii Willd.). In: Weber H., Forstreuter W., editor. Parasitic flowering plants. 2nd. ed. Marburg, CN: Federal and Republic; 1987. 93- 104.

(16)           Sauer D., Burroughs R. Disinfection of seed surfaces with sodium hypochlorite. Phytopathology 1986; 76 (5): 745- 9.

(17)           Hamedi J., Papiran R., Moghimi H., Mohammadipanah F. Screening of phytotoxic activity and nlp genes from rhizosphere actinomycetes. Annals of Microbiology 2014; 3 (9): 1- 6.

(18)           Wapshere A. A strategy for evaluating the safety of organisms for biological weed control. Annals Application of Biology 1974; 77 (3): 201- 11.

(19)           Sambrook J., David W., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual. 3rd. ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.

(20)           Hassanshahian M., Emtiazi G., Cappello S., Isolation and characterization of crude-oil- degrading bacteria from the Persian Gulf and the Caspian Sea. Marine. Pollution. Bulletin 2012; 64 (1); 7- 12.

(21)           Watanabe T. Pictorial Atlas of Soil and Seed Fungi: Morphologies of Cultured Fungi and Key to Species. 3rd. ed. NewYork: Taylor and Francis; 2011.

(22)           Zand A., Baghestani M., Bitarafan M., Shimi P. Iranian rigistrated herbicides guideline. 1st. ed. Mashhad: Jahad daneshgahi; 2007.

(23)           Moyer J., Hamman W. Factors affecting the toxicity of MON 37500 residues to following crops. Weed Technology 2001; 15 (2):  42- 7.

(24)           Amsellem Z., Cohen B., Gressel J. Engineering hypervirulencein a mycoherbicidal fungus for efficient weed control. Natural Biotechnology 2002; 20 (4): 1035- 9.

(25)           Jůzlová P., Martínková L., Křen V. Secondary metabolites of the fungus Monascus: A review. Journal of Industrial Microbiology. 1996; 16 (3): 163- 70.

(26)           Schuster E., Dunn-Coleman N., Frisvad J., Van Dijck P. On the safety of Aspergillus niger a review. Applied Microbiology and Biotechnology 2001; 59 (4): 2650- 2.

(27)           Abarca M., Bragulat M., Castellá G., Cabañes F. Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger. Applied Environmental Microbiology1994; 60 (7): 2650- 2.

(28)           Frisvad JC., Frank JM., Houbraken JAMP, Angelina F.A. Kuijpers AFA, Samson RA. New ochratoxin A producing of Aspergillus section Circumduction. Studies in Mycology 2004; 50 (6): 23- 43.

(29)           Kazemzadeh S., Farrokhi N., Aminzadeh S., Alavi SM., Mamarabadi M., Gudarzi T. Biocontrol of Causative Agent of Citrus Canker Disease Using Antimicrobial Substances Produced by Aspergillus awamori K-03. Biological Journal of Microorganism 2014; 3 (11): 91- 8.