غربال‏گری‏ لاکتوباسیل‏ های ‏بومی ایران از نظر تولید اسید لاکتیک و شناسایی سویه‏ های ‏برتر

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم و تحقیقات، اراک، ایران

2 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشگاه استاندارد، کرج، تهران، ایران

3 استادیار صنایع غذایی، پژوهشگاه استاندارد، کرج، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: لاکتوباسیل‏ ها ‏دسته‏ای ‏از باکتری‏های ‏اسیدلاکتیک هستند که محصول نهایی تخمیر آن‏ها اسیدلاکتیک است. هدف از پژوهش حاضر،‏ انتخاب لاکتوباسیل‏های ‏بومی تولید کننده اسیدلاکتیک تک ایزومره است. ‏‏‏

مواد و روش ‏‏ها: در پژوهش حاضر،‏ سویه‏های ‏بومی بر اساس‏ توانایی تولید اسیدلاکتیک غربال‏گری‏‏ شد. غربال‏گری‏‏ در دو مرحله انجام شد. مرحله اول به روش تیتراسیون و مرحله دوم به روش آنزیماتیک بود. سویه‏های ‏برتر حاصل از روش تیتراسیون برای انجام آزمون آنزیمی انتخاب شد. در نهایت، سویه‏های ‏برتر که توانایی تولید اسیدلاکتیک تک ایزومره را داشتند توسط آزمون‏های ‏بیوشیمیایی شناسایی شدند. سپس، شناسایی مولکولی سویه با استفاده از تعیین توالی 16S rRNA انجام شد. ‏‏‏

نتایج: در پژوهش حاضر،‏ توانایی 79 سویه لاکتوباسیل بومی از نظر تولید اسیدلاکتیک بررسی شد‏. بالاترین میزان تولید 8/34 و پایین‏ترین ‏میزان تولید 4/12 میلی‏گرم در گرم محاسبه شد. لاکتوباسیل‏های ‏برتر از نظر تولید اسیدلاکتیک توانایی تولید یک نوع ایزومر نوری L (+) را داشتند که بالاترین میزان L (+) اسیدلاکتیک برابر با 99/3 و پایین‏ترین ‏میزان برابر با 03/1 میلی‏گرم در گرم بود. نتایج بیوشیمیایی و مقایسه سویه‏ها‏ی برتر با اطلاعات موجود در بانک ژنومی نشان داد که آن سویه‏ها ‏لاکتوباسیلوس پاراکازئی هستند. سپس، توالی 16S rRNA چهار سویه برتر به شماره دسترسی‏های ‏KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی، مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: میزان تولید اسید لاکتیک توسط لاکتوباسیل‏های ‏بومی بسیار متفاوت مشاهده شد و مقدار تولید اسید برخی از سویه‏ها ‏نسبت به گزارش‏های ‏موجود، تولید بیش‏تری را نشان داد. لاکتوباسیل‏های ‏برتر تنها توانایی تولید ایزومر نوری L (+) اسیدلاکتیک را داشتند. نتایج پژوهش حاضر،‏ استفاده از سویه‏های ‏برتر لاکتوباسیل برای تولید اسیدلاکتیک خالص را پیشنهاد می‏کند‏. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Screening local Lactobacilli from Iran in terms of production of lactic acid and identification of superior strains

نویسندگان [English]

  • Fatemeh Soleimanifard 1
  • Maryam Ghobadi Dana 2
  • Zahra Piravivanak 3
1 M.Sc Student of Microbiology, Islamic Azad University, Arak, Iran
2 Assistant Professor of Molecular Genetic, Standard Research Institute, Karaj, Iran
3 Assistant Professorof Food Industry, Standard Research Institute, Karaj, Iran
چکیده [English]

Introduction: Lactobacilli are a group of lactic acid bacteria that their final product of fermentation is lactic acid. The objective of this research is selection of local Lactobacilli producing L (+) lactic acid.

Materials and methods: In this research the local strains were screened based on the ability to produce lactic acid. The screening was performed in two stages. The first stage was the titration method and the second stage was the enzymatic method. The superior strains obtained from titration method were selected to do enzymatic test. Finally, the superior strains in the second stage (enzymatic) which had the ability to produce L(+) lactic acid were identified by biochemical tests. Then, molecular identification of strains was performed by using 16S rRNA sequencing.

Results: In this study, the ability of 79 strains of local Lactobacilli in terms of production of lactic acid was studied. The highest and lowest rates of lactic acid production was 34.8 and 12.4 mg/g. Superior Lactobacilli in terms of production of lactic acid ability of producing had an optical isomer L(+), the highest levels of L(+) lactic acid were with 3.99 and the lowest amount equal to 1.03 mg/g. The biochemical and molecular identification of superior strains showed that strains are Lactobacillus paracasei. Then the sequences of 16S rRNA of superior strains were reported in NCBI with accession numbers KF735654، KF735655، KJ508201and KJ508202.

Discussion and conclusion: The amounts of lactic acid production by local Lactobacilli were very different and producing some of these strains on available reports showed more products. The results of this research suggest the use of superior strains of Lactobacilli for production of pure L(+) lactic acid.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Screening
  • Lactobacillus
  • Lactic acid
  • PCR

مقدمه.

اسیدلاکتیک یک اسید آلی هیدروکسیل‏دار ‏با وزن مولکولی 08/90 گرم بر مول و ثابت تفکیک
4-10×37/1 در 25 درجه سلسیوس است که در طبیعت به طور گسترده وجود دارد و فرمول آن (2- هیدروکسی پروپیونیک اسید[1] یا 2- هیدروکسی پروپانوئیک اسید، (CH3CHOHCOOHاست(1- 3). نخستین بار در سال 1780، شیل[2] شیمیدان سوئدی از شیر ترش شده، اسیدلاکتیک را جداسازی کرد‏. او از نظر شیمیایی این اسید را باعث ترش شدن شیر دانست و پی برد که این اسید یکی از اجزای شیر است (1، 3 و 4). پاستور در سال 1857 کشف کرد که اسیدلاکتیک جزو ترکیب شیر نیست بلکه یکی از متابولیت‏های ‏تخمیری تولید شده توسط برخی از میکروارگانیسم‏هاست (4). اسیدلاکتیک دارای فعالیت نوری است و به دو شکل ایزومری L (+) و D (-) وجود دارد. اسیدلاکتیک L (+)قابل تجزیه است و می‏تواند در بدن انسان متابولیزه شود و این خاصیت به کاربرد اسیدلاکتیک در زمینه‏های ‏زیست مواد و زیست پزشکی منجر شده است (1، 3 و 5). از آنجا که بدن انسان فاقد آنزیم D لاکتات دهیدروژناز است مصرف زیاد اسیدلاکتیک L (+) موجب تجمع آن در بدن شده و برای سلامتی انسان مضر است (4- 6). تولید اسیدلاکتیک به دو شکل سنتز شیمیایی و تخمیر میکروبی انجام می‏شود. با روش سنتز شیمیایی فقط مخلوط راسمیک DL اسیدلاکتیک تولید می‏شود‏ (7 و 8). 90 درصد تولید اسیدلاکتیک در سرتاسر جهان توسط تخمیر میکروبی انجام می‏شود (8 و 9). از آنجا که برخی از باکتری‏ها ‏قادر به تولید اسیدلاکتیک به شکل تک ایزومره هستند می‏توان با استفاده از آن‏ها، اسیدلاکتیک L (+) یا D (-) خالص تولید کرد‏ (7 و 8).

لاکتوباسیلوس‏ها[3] یکی از باکتری‏های ‏مهم تولید کننده اسید لاکتیک هستند. در صنعت از لاکتوباسیل‏ها ‏برای مصارف گوناگون استفاده می‏شود. این باکتری‏ها ‏در محصولات و فرآورده‏های ‏غذایی به علت تولید اسیدلاکتیک نقش نگهدارنده را دارند. همچنین، به علت‏ ایجاد طعم‏های ‏مختلف، ترکیبات مغذی و بافت مناسب به عنوان استارتر برای انواع مختلفی از پنیر، تخمیر غذاهای گیاهی، تخمیر گوشت، در تولید شراب، آب جو و نان نقش دارند (10). جنس لاکتوباسیلوس گروه بزرگی از خانواده لاکتوباسیلاسه[4] و به سلسله فرمی‏کوت‏ها‏[5] متعلق است. این باکتری‏ها ‏دارای بیش از 100 گونه و زیرگونه هستند (10 و 11). کلونی‏‏‏های ‏لاکتوباسیلوس روی کشت آگار معمولاً کوچک به اندازه 2 تا 5 میلی‏متر با حاشیه کامل، محدب، صاف، درخشان یا کدر و بدون پیگمان است. در موارد نادر پیگمانشان مایل به زرد و یا قرمز شده و برخی گونه‏ها ‏نیز فرم کلونی‏‏‏ها‏یشان خشن است (12). شکل میکروسکوپی این باکتری‏ها ‏به شکل میله‏ای ‏شکل به اشکال متنوع باسیل‏های ‏باریک و بلند تا کوکوباسیل کوتاه است. سلول‏ها بیشتر آرایش زنجیره‏ای ‏داشته و به شکل گرم مثبت، بدون اسپور و بندرت متحرک هستند (1 و 12). این باکتری‏ها ‏بی هوازی اختیاری یا میکروآئروفیل[6] هستند. وجود 5 درصد دی‏اکسیدکربن در محیط باعث تحریک رشد آن‏ها می‏شود (12 و 13). دمای بهینه رشد آن‏ها بین 30 تا 40 درجه سلسیوس است. اسیدیته بهینه برای رشد آن‏ها در حدود 5/5 تا 8/5 است اما آن‏ها در اسیدیته کمتر از 5 نیز قادر به رشد هستند (1 و 12). این باکتری‏ها ‏از نظر نحوه تخمیر کربوهیدرات‏ها، به دو گروه تقسیم می‏شوند: 1- هموفرمانتاتیو[7] (جور تخمیر) که قند را فقط به اسیدلاکتیک تبدیل می‏کنند.
2- هتروفرمانتاتیو[8] (ناجور تخمیر) که قند را به اسیدلاکتیک، اسیداستیک، اتانول و دی اکسیدکربن تبدیل می‏کنند (1، 10 و 12). برای تولید اسیدلاکتیک خالص به روش میکروبی نیاز به سویه‏های ‏تولید کننده اسیدلاکتیک از نوع هموفرمانتاتیو است. در پژوهش حاضر،‏ توانایی 79 سویه بومی لاکتوباسیل از نظر تولید اسیدلاکتیک بررسی و سویه‏های ‏برتر تولید کننده ایزومر خالص اسیدلاکتیک L (+) شناسایی شد.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

در پژوهش حاضر،‏ از سویه‏های ‏جداسازی شده توسط دکتر مریم قبادی دانا از فرآورده‏های ‏لبنی سنتی استفاده شد که در گروه پژوهشی میکروبیولوژی پژوهشگاه استاندارد نگهداری می‏شوند. سویه‏ها ‏در محیط ام آر اس آگار[9] به شکل کشت خطی کشت داده شد. پلیت‏ها ‏به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سلسیوس در شیشه بی‏هوازی و در شرایط میکروآئروفیل گرمخانه‏گذاری شد. سپس، ویژگی‏های ریخت‏شناسی سویه با رنگ‏آمیزی گرم مشخص شد‏. برای بررسی تولید اسید سویه‏ها‏، از محیط کشت اسکیم میلک استفاده شد. این سویه‏ها ‏از نظر تولید اسیدلاکتیک در دو مرحله غربال‏گری‏‏ شدند. در مرحله اول، غربال‏گری‏ به روش تیتراسیون انجام شد و در مرحله دوم، سویه‏های ‏برتر به روش آنزیماتیک غربال‏گری‏ شدند. سپس، سویه‏های ‏برتر تولید کننده ایزومر L (+)اسیدلاکتیک با استفاده از تخمیر قندها شناسایی بیوشیمیایی شدند و در نهایت، شناسایی دقیق گونه این لاکتوباسیل‏ها ‏با استفاده از تعیین توالی 16S rRNA آن‏ها ‏انجام شد.

روش تیتراسیون: ابتدا از کلونی‏‏ خالص در محیط اسکیم میلک پاساژ داده و در دمای 37 درجه سلسیوس به مدت 48 ساعت گرمخانه‏گذاری شد. پس از پایان گرمخانه‏گذاری و بسته شدن محیط، یک گرم از محیط بسته شده به دقت وزن شد‏ه و به آن 10 میلی‏لیتر آب مقطر، 20 میلی‏لیتر سود 1/0 نرمال اضافه شد‏. پس از 30 دقیقه، حدود 5/0 میلی‏لیتر محلول فنل فتالئین 1درصد به عنوان اندیکاتور اضافه شد. سپس، نمونه‏ها ‏با هیدروکلریک اسید[10] 1/0 نرمال تیتر شدند. مقدار اسیدلاکتیک تولید شده توسط هر سویه بر حسب میلی‏گرم در گرم طبق فرمول محاسبه شد (هر میلی‏لیتر هیدروکسید سدیم مصرفی در تیتراسیون که به ایجاد رنگ صورتی منجر می‏شود برابر است با 1/90 میلی‏گرم اسیدلاکتیک) (14). برای اعتبار بخشی این آزمون از اسیدلاکتیک خالص تهیه شده از شرکت مرک[11] با درجه خلوص90 درص، به عنوان کنترل مثبت تیتراسیون استفاده شد. سپس، از سویه‏های ‏لاکتوباسیلی که میزان تولید اسیدلاکتیک آن‏ها ‏در رده تولید زیاد قرار داشتند سه تکرار انجام و تکرار پذیری تولید اسید توسط سویه‏ها ‏بررسی شد.

روش آنزیمی: در این روش، آنزیم اختصاصی
(L- لاکتات دهیدروژناز و D- لاکتات دهیدروژناز)، لاکتات حاصل را به پیرووات و NADH[12] تبدیل کرده و میزان تولید NADH در حضور هر آنزیم، معرف میزان نوع ایزومر نوری مربوط به آن آنزیم است (15). سویه‏ها‏یی که در مرحله اول میزان اسیدلاکتیک بیشتری تولید می‏کردند و تولید آن‏ها تکرارپذیر بود، برای غربال‏گری‏ به روش آنزیماتیک انتخاب و نوع ایزومر اسیدلاکتیک تولیدی آن‏ها ‏تعیین شد. در این روش، پس از کشت سویه‏ها ‏در محیط کشت اسکیم میلک و گرمخانه‏گذاری مطابق با روش ISO 9232 پروتئین‏زدایی شد (15). میزان L (+) و D (-) اسیدلاکتیک مایع پروتئین‏زدایی شده توسط آنزیم
D- لاکتات دهیدروژناز و L- لاکتات دهیدروژناز به‏طور جداگانه با استفاده از اسپکتروفتومتر در طول موج 340 نانومتر تعیین شد (15). برای اعتبار بخشی این آزمون نیز از اسیدلاکتیک خالص با درجه خلوص 90 درصد استفاده شد. به این شکل که 1/0 میلی‏لیتر اسید با 9/19 میلی‏لیتر آب مقطر رقیق شد‏. با آماده شدن این نمونه به همراه نمونه شاهد جذب آن‏ها، ‏قبل و پس از اضافه شدن آنزیم L و D لاکتات دهیدروژناز در طول موج 340 نانومتر خوانده و میزان غلظت L (+) و D (-) اسیدلاکتیک مطابق با فرمول‏های ‏ارایه شده در ISO 9232 محاسبه شد (15).

شناسایی بیوشیمیایی سویه‏های ‏برتر: آزمون‏های ‏تأییدی بیوشیمیایی از قبیل ذوب ژلاتین، تولید اندول از تریپتوفان، آزمایش کاتالاز و تخمیر قندها از جمله آرابینوز، سوربیتول، سلوبیوز، ملیبیوز، مانوز، مالتوز، سالیسین، رامنوز، اینوزیتول، گزیلوز، مانیتول، ریبوز، لاکتوز، گالاکتوز، فروکتوز، سوکروز، تره هالوز و گلوکز برای سویه‏های ‏برتر انجام شد (12).

شناسایی مولکولی سویه‏های ‏برتر: برای شناسایی مولکولی سویه‏های ‏برتر ابتدا DNA آن‏ها ‏استخراج شد (16). سپس، با استفاده از آغازگرهای طراحی شده برای ابتدا و انتهای 16S rRNA، واکنش زنجیره‏ای ‏پلیمراز انجام شد (17). توالی آغازگرهای مورد استفاده عبارت بودند از:

 F:5' GAGTTTGATCCTGGCTCA 3' و
 R:5' GGTTACCTTGTTACGACTT 3'و واکنش PCR برای تکثیر 16S rRNA با برنامه حرارتی زیر انجام شد: دمای دناتوره شدن اولیه 95 درجه سلسیوس و مدت زمان آن 5 دقیقه بود. سپس، 30 چرخه شامل مرحله واسرشت[13] به مدت40 ثانیه در دمای 95 درجه سلسیوس، مرحله اتصال[14] به مدت40 ثانیه در دمای 6/57 درجه سلسیوس و مرحله سنتز یاگسترش[15] به مدت40 ثانیه در دمای 72 درجه سلسیوس، سپس، مرحله گسترش نهایی به مدت 5 دقیقه در دمای 72 درجه سلسیوس انجام شد (18). محصول PCR تعیین ترادف شده و ترادف تعیین شده با اطلاعات موجود در بانک ژنومی، مرکز اطلاعات بیوتکنولوژی[16] مقایسه شد‏.

برای طراحی درخت فیلوزنتیکی 16S rRNA با استفاده از بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی، توالی 16S rRNA مربوط به چندین باکتری لاکتوباسیل که به طور کامل تعیین توالی شده‏اند شناسایی و درخت فیلوژنتیکی توسط برنامه MEGA4 و روش UPGMA با bootstrapt 10000 رسم شد‏.

 

نتایج.

از میان 79 سویه لاکتوباسیل که به روش تیتراسیون غربال‏گری‏ شدند، 18 سویه از نظر تولید اسیدلاکتیک در دسته تولید زیاد قرار گرفتند. 8 سویه از نظر میزان تولید اسیدلاکتیک، تولید زیاد و از نظر تکرارپذیری، تولید آن‏ها ‏تکرار پذیر بودند که با روش آنزیماتیک میزان تولید L (+) و D (-) اسیدلاکتیک تولیدی آن‏ها ‏بررسی شد‏. 4 سویه که زیادترین مقدار L (+) خالص به شکل تکرارپذیر تولید کردند، شناسایی بیوشیمیایی و مولکولی شدند که هر 4 سویه، لاکتوباسیلوس پاراکازئی[17] شناسایی شدند.

میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط 79 سویه لاکتوباسیل با روش تیتراسیون بر حسب میلی‏گرم در گرم محاسبه شد. سپس، سویه‏ها بر حسب میزان تولید به 3 دسته کم، متوسط و زیاد در جدول 1 رده بندی شدند. به این ترتیب که 23 درصد سویه‏ها‏یی که بیش‏ترین تولید را داشتند در رده تولید زیاد قرار گرفتند. 62 درصد که بیش‏ترین تعداد بودند در رده متوسط قرار گرفتند. 15 درصد سویه‏ها ‏که کم‏ترین تولید را داشتند در رده تولید کم قرار گرفتند. میانگین کل مقدار تولید اسیدلاکتیک، 62/22 میلی‏گرم در گرم، بالاترین میزان تولید مربوط به سویه L175 و L89 با مقدار 8/34 و پایین‏ترین ‏میزان، 4/12 میلی‏گرم در گرم بود.

در جدول 2 نتایج میزان تولید اسیدلاکتیک سویه‏های ‏رده تولید زیاد اسیدلاکتیک بر حسب میلی‏گرم در گرم نشان داده شده است. همان‏طور که در جدول 2 مشاهده می‏شود برخی از سویه‏ها ‏از نظر تولید اسیدلاکتیک، تکرار پذیر بودند. از این سویه‏ها ‏برای انجام مرحله بعد که سنجش میزان L (+) و D (-) اسیدلاکتیک به روش آنزیمی بود، استفاده شد.

نتایج میزان L (+) و D (-) اسیدلاکتیک به روش آنزیمی در جدول 3 نشان داده شده است. با توجه به این که تعیین میزان تولید D (-) اسیدلاکتیک سویه‏ها ‏با استفاده از میزان جذب آن‏ها، ‏قبل و پس از اضافه شدن آنزیم D لاکتات دهیدروژناز در طول موج 340 نانومتر و قرار دادن میزان جذب در فرمول مربوطه محاسبه می‏شد، D (-) اسیدلاکتیک سویه‏ها ‏منفی گزارش شد. همچنین، L (+) اسیدلاکتیک سویه‏ها ‏مثبت گزارش شده است (15). بر اساس این نتایج سویه L175 بیش‏ترین L (+) اسیدلاکتیک با میزان 99/3 میلی‏گرم در گرم را در مقایسه با بقیه سویه‏ها ‏داشته است. اسیدلاکتیک خالص با درجه خلوص 90 درصد دارای هر دو ایزومر L و D است.

 

 

جدول 1- نتایج رده بندی سویه بر اساس‏ میزان تولید اسیدلاکتیک

رده بندی سویه‏ها‏

تولید اسیدلاکتیک بر حسب میلی‏گرم در گرم

تعداد فراوانی

تولید کم

16- 12

12

تولید متوسط

20- 16

49

تولید زیاد

35- 20

18

 

جدول 2- نتایج حاصل از روش تیتراسیون در سویه‏های ‏با تولید زیاد

ردیف

کد نمونه

میزان تولید اسیدلاکتیک بر حسب میلی‏گرم در گرم

1

L175

42/0±8/34

2

L132

0±30/27

3

L67

41/0±7/26

4

L25

05/1±7/26

5

L83

0±3/24

6

L26

16/1±24

7

L138

31/1±24

8

L56

84/0±7/23

9

L147

80/1±4/23

10

L108

42/0±5/22

11

L92

46/1±5/22

12

L200

84/0±9/21

13

L104

73/0±6/21

14

L84

24/2±3/21

15

L17

54/1±8/20

16

L70

62/1±1/20

17

L124

22/1±20

18

L105

90/1±20

19

کنترل مثبت

0±135

 

محاسبه غلظت D (-)اسیدلاکتیک:

 

CD (-) =  × AD (-)؛

Csb =  × Asb

CD (-) = Cs - Csb

 

CD (-):غلظت D (-) اسیدلاکتیک، بر حسب گرم در 100 گرم نمونه کشت

A D (-): اختلاف جذب نمونه میکروبی و نمونه شاهد

Csb: غلظت نمونه شاهد

Asb: اختلاف جذب نمونه شاهد و شاهد

Cs: غلظت نمونه کشت میکروبی

: مقدار گرم برداشته از نمونه کشت و نمونه شاهد

: 3/6 در طول موج 340 نانومتر (لیتر بر میلی‏مول بر سانتی متر)

سویه‏ها‏یی که ایزومر L (+) اسیدلاکتیک تولید کرد‏ند همه میله‏ای ‏گرم مثبت، بدون اسپور، بدون حرکت، کاتالاز منفی و اندول منفی بوده و قادر به ذوب ژلاتین نبودند. شناسایی سویه‏ها ‏بر اساس تخمیر هجده کربوهیدرات انجام شد که نتایج آن و نتایج رشد در دمای 15 و 42 درجه سلسیوس در جدول 4 ارایه شده است.

شناسایی دقیق‏تر سویه‏های ‏برتر تولید کننده ایزومر L (+) اسیدلاکتیک به روش مولکولی با تکثیر ژن 16S rRNA سویه‏های ‏برتر با استفاده از واکنش زنجیره‏ای ‏پلی‏مراز انجام شد. ژن 16S rRNA سویه‏های ‏برتر با شماره‏های ‏KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 در بانک ژنومی، مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی ثبت شد‏. هر 4 سویه برتر لاکتوباسیلوس پاراکازئی شناسایی شدند.

ترسیم درخت فیلوژنتیکی: بر اساس 16S rRNA، ارتباط فیلوژنتیکی سویه‏های ‏برتر با شماره‏های ‏KJ508201 (L25)، KJ508202 (L132)، KF735654 (L175) و KF735655 (L67) با هم و با دیگر سویه‏های ‏لاکتوباسیل موجود در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی، بررسی و تعیین شد. فهرست سویه‏های ‏لاکتوباسیل موجود در درخت فیلوژنی به ترتیب شکل 1 آمده است.

 

جدول 3- نتایج حاصل از روش آنزیمی در سویه‏های ‏با تولید زیاد و تکرارپذیر

ردیف

کد نمونه

میزان L (+) اسیدلاکتیک تولید شده بر حسب میلی‏گرم در گرم

میزان D (-) اسیدلاکتیک تولید شده بر حسب میلی‏گرم در گرم

1

L175

99/3

357/1-

2

L132

062/1

707/3-

3

L67

035/1

274/4-

4

L25

03/1

168/5-

5

L83

127/0

062/6-

6

L26

029/0

044/4-

7

L138

024/0

169/6-

8

L56

020/0

046/6-

9

کنترل مثبت

55/20

12/23

 

 

 

جدول 4 - نتایج تخمیر کربوهیدرات‏ها ‏ی سویه‏های ‏برتر

 

 

1) >gi|635200826|gb|KJ508201. 1| Lactobacillus paracasei strain L25

2) >gi|1843427|dbj|D86517. 1| Lactobacillus casei

3) >gi|635200827|gb|KJ508202. 1| Lactobacillus paracasei strain 132

4) >gi|574960707|gb|KF735654. 1| Lactobacillus paracasei strain 175

5) >gi|574960708|gb|KF735655. 1| Lactobacillus paracasei strain 67

6) >gi|191636824:c1991488-1989908 Lactobacillus casei BL23

7) >gi|1843426|dbj|D86516. 1| Lactobacillus zeae 

8) >gi|385826720:c2565329-2563756 Lactobacillus rhamnosus GG

9) >gi|175005|gb|M58829. 1|LBARR16SAA Lactobacillus sake 
10) >gi|501145339:c1879865-1878295 Lactobacillus plantarum subsp. plantarum P-8

11) >gi|22027048|dbj|E10216. 1| Lactobacillus brevis L63

12) >gi|283483492|emb|FN185731. 1| Lactobacillus paucivorans type strain TMW 1. 1424T
13) >gi|175006|gb|M58830. 1|LBARR16SAB Lactobacillus sanfrancisco 

14) >gi|501673812:627796-629363 Lactobacillus fermentum F-6

15) >gi|184152655:c1414412-1412879 Lactobacillus reuteri JCM 1112
16) >gi|388037|gb|L23507. 1|LBARGDAAAA Lactobacillus reuteri 
17) >gi|385824947:c1872967-1871317 Lactobacillus johnsonii DPC 6026
18) >gi|560151351:c1580334-1578755 Lactobacillus johnsonii N6. 2

19) >gi|385816611:c1594383-1592809 Lactobacillus amylovorus GRL1118

20) >gi|175029|gb|M58823. 1|LBARR16SU Lactobacillus lactis 
 

شکل 1- تصویر درخت فیلوژنتیکی بر مبنای 16S rRNA بین سویه‏های برتر با شماره‏های ‏KJ508201 (L25)، KJ508202 (L132)، KF735654 (L175) و KF735655 (L67) با دیگر سویه‏های ‏لاکتوباسیل موجود در پایگاه اطلاعاتی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

اسیدلاکتیک در صنایع غذایی، شیمیایی، نساجی و پزشکی کاربردهای زیادی دارد. برای نمونه، در صنایع غذایی از اسیدلاکتیک به عنوان عوامل اسیدی کننده، طعم دهنده و نگهدارنده استفاده می‏شود (4 و 19). از اسیدلاکتیک در صنایع پزشکی برای تهیه پلاستیک‏های ‏زیست تجزیه‏پذیر از جمله پلی لاکتیک اسیدها[xviii] و کوپلیمرهای‏پلی لاکتیک‏اسید استفاده می‏شود که در موارد بالینی و ساخت ابزارآلات پزشکی نظیر نخ بخیه کاربرد دارند. ایزومرهای خالص L (+) و D (-) اسیدلاکتیک ارزش بیشتری نسبت به فرم راسمیک DL داشته زیرا هر ایزومر کاربرد صنعتی ویژه خود را دارند (7). در فرآیند تولید اسیدلاکتیک، گزارش‏های ‏متعددی درباره باکتری‏های ‏تولید کننده اسیدلاکتیک از جمله لاکتوباسیل‏ها ‏وجود دارد. در صنایع تخمیری از سویه‏های ‏میکروبی هموفرمانتاتیو (جور تخمیر) برای تولید اسیدلاکتیک استفاده شده که با ساز و کار بالایی توانایی تولید L (+) اسید لاکتیک خالص را دارند(3). بنابراین، انتخاب و شناسایی سویه‏ها‏یی که ایزومر L (+) اسیدلاکتیک را به شکل خالص تولید می‏کنند از نظر اقتصادی مهم است.

برای انتخاب سویه‏های ‏برتر باید از روش‏های ‏اندازه‏گیری میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه‏ها ‏استفاده شود. روش‏های زیادی برای این منظور وجود دارد که می‏توان به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا[xix]، کروماتوگرافی گازی[xx]، کلریمتری[xxi]، کیت آنزیمی و تیتراسیون اشاره کرد (20). ایشولا و تیو[xxii] در سال 2012 میزان اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه‏های ‏لاکتوباسیل را با روش تیتراسیون بررسی کرد‏ند (21). ترونتل[xxiii] و همکارانش در سال 2011 میزان ایزومرهای L و D اسیدلاکتیک را به روش آنزیمی بررسی کرد‏ند (22). پانسار[xxiv] و همکارانش در سال 2010 میزان اسیدلاکتیک تولید شده را به روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا بررسی کرد‏ند (23). در این پژوهش،‏ به علت‏ زیاد بودن تعداد سویه‏های ‏مورد غربال‏گری‏ و هزینه زیاد روش‏های ‏کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا و کروماتوگرافی گازی از روش کم هزینه تیتراسیون و برای افزایش دقت از روش آنزیمی به عنوان مکمل روش تیتراسیون استفاده شد.

در پژوهش حاضر‏، توانایی لاکتوباسیل‏ها ‏در تولید اسید لاکتیک بسیار متفاوت مشاهده شد. به این شکل که میانگین کل تیتراسیون سویه‏ها‏، 62/22 میلی‏گرم در گرم محاسبه شد و پایین‏ترین ‏میزان تولید در حدود 4/12 و بالاترین میزان 8/34 میلی‏گرم در گرم بود. پانسار و همکارانش در سال 2010 در کشور ایرلند میزان اسیدلاکتیک تولید شده در سویه لاکتوباسیلوس کازئی[xxv] را به میزان 48/33 میلی‏گرم بر گرم گزارش کردند (23). ودنر[xxvi] و همکارانش در سال 2009 در کشور رومانی میزان اسیدلاکتیک تولید شده در سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی 168[xxvii] را به میزان 97/45 میلی‏گرم بر گرم گزارش کردند (24). میردامادی[xxviii] و همکارانش میزان اسیدلاکتیک سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس رامنوسوس[xxix] را به ترتیب 87/59 و 96/58 میلی‏گرم بر گرم گزارش کردند (25). ایشولا و تیو در سال 2012 در کشور نیجریه میزان اسیدلاکتیک سویه لاکتوباسیلوس پلانتاروم[xxx] LPF2به میزان 96/1 میلی‏گرم بر گرم و سویه لاکتوباسیلوس فرمنتوم[xxxi] LFN7 به میزان 91/1 میلی‏گرم بر گرم را گزارش کردند (21). میزان تولید اسیدلاکتیک در سویه‏های ‏مورد بررسی نسبت به مقدار اسیدلاکتیک تولید شده سویه لاکتوباسیلوس کازئی در مطالعه پانسار و همکارانش بیشتر است اما نسبت به مقدار اسیدلاکتیک تولید شده سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی، در مطالعه ودنر و همکارانش کمتر است. در این پژوهش،‏ در مرحله دوم غربال‏گری‏ نتایج حاصل از روش آنزیمی نشان داد که هیچ کدام از سویه‏ها ‏ی برتر توانایی تولید ایزومر D (-) اسیدلاکتیک را نداشتند. اما 4 سویه برتر ایزومر L (+) اسیدلاکتیک را تولید کردند. پس از بررسی با روش آنزیمی، پایین‏ترین ‏میزان L (+) اسیدلاکتیک مربوط به سویه L25 با میزان 03/1 میلی‏گرم در گرم و بالاترین مربوط به سویه L175 با میزان 99/3 میلی‏گرم در گرم بود. ترونتل و همکارانش در سال 2011 در کشور کرواتی میزان ایزومرهای L و D اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس آمیلووروس[xxxii] (DSM 20531) را به ترتیب به میزان 008/0±563/0و 017/0±437/0 میلی‏گرم بر گرم گزارش کردند (22). پانسار و همکارانش در سال 2010 در کشور ایرلند تولید L (+) اسیدلاکتیک توسط لاکتوباسیلوس کازئی را 73/33 میلی‏گرم بر گرم گزارش کرد‏ند (23). مون[xxxiii] و همکارانش در سال 2012 در کشور کره، L (+) اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس پاراکازئی زیرگونه پاراکازئی را به میزان 6/91 میلی‏گرم بر گرم گزارش کردند (26). میردامادی و همکارانش در سال 1386، میزان L (+) اسیدلاکتیک دو سویه، لاکتوباسیلوس کازئی PTCC1608 و لاکتوباسیلوس رامنوسوس PTCC1637 به ترتیب 95 و 40/81 میلی‏گرم بر گرم گزارش کرد‏ند (25). سرمست قفهرخی[xxxiv] و همکارانش در سال 1391، L (+) اسیدلاکتیک لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس را 8/6 میلی‏گرم بر گرم گزارش کرد‏ند (27). میزان تولید L (+) اسیدلاکتیک در سویه‏های ‏لاکتوباسیل مورد بررسی نسبت به مقدار L (+) اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه لاکتوباسیلوس آمیلووروس، ترونتل و همکارانش بیشتر است اما نسبت به مقدار L (+) اسیدلاکتیک تولید شده توسط سویه لاکتوباسیلوس پاراکازئی زیرگونه پاراکازئی، در مطالعه مون و همکارانش و سویه لاکتوباسیلوس کازئی، در مطالعه پانسار و همکارانش کمتر است.

در پژوهش حاضر،‏ نتایج تخمیر کربوهیدرات‏ها ‏در سویه‏های ‏برتر نشان داد که سویه‏های ‏لاکتوباسیل، هموفرمانتاتیو هستند. با مقایسه نتایج شناسایی بیوشیمیایی این سویه‏ها ‏با جدول تخمیر قندها در کتاب برجی، نشان داده شد که نتایج تخمیر قندها اندکی متفاوت با نتایج گزارش شده در کتاب برجی است. برای مثال، لاکتوباسیلوس پاراکازئی توانایی تخمیر قندهای سلوبیوز، مانیتول، سوربیتول و ریبوز را نداشت در حالی که 4 سویه برتر قادر به تخمیر این قندها هستند و این سویه‏ها ‏شبیه به لاکتوباسیل‏های ‏دیگر در کتاب برجی[xxxv] بودند. همچنین، لاکتوباسیلوس پاراکازئی بر اساس تولید گاز از گلوکز جزو هتروفرمانتاتیوهای اختیاری است. در حالی که این 4 سویه لاکتوباسیل طی شرایط آزمایش، ویژگی هموفرمانتاتیو را بروز دادند که با اختیاری بودن هتروفرمانتاتیو پاراکازئی قابل توجیه است. تانوک[xxxvi] در سال 1999 بیان کرد‏ که شناسایی لاکتوباسیل‏های ‏جدا شده توسط روش‏های ‏فنوتیپی مشکل بوده و تعیین خواص این باکتری‏ها ‏فراتر از آزمون‏های ‏تخمیری است (28). بنابراین، می‏توان این گونه نتیجه گرفت که روش‏های ‏بیوشیمیایی دارای معایبی است. از آن جمله این معایب می‏توان به وقت‏گیر بودن آزمون‏های ‏بیوشیمیایی، عدم تمیز کامل بین سوش‏های ‏مختلف یک گونه، قابلیت تکرارپذیری پایین و قدرت فرق گذاشتن کم بین سویه‏ها ‏اشاره کرد‏. در منابع توصیه شده که از روش‏های ‏ژنتیکی همراه با آزمون‏های ‏فنوتیپی برای تایید تشخیص سویه‏های ‏جدا شده استفاده شود (13). به تازگی ژن‏های r RNAبه عنوان روشی قوی برای تشخیص و تحلیل فیلوژنی لاکتوباسیلوس‏ها ‏پذیرفته شده‏اند که در این روش با استفاده از پرایمرهای طراحی شده ژن‏های 16S rDNA یا 23S rDNA برای تعیین و تشخیص گونه‏های ‏لاکتوباسیلوس‏ها ‏از واکنش زنجیره‏ای ‏پلیمراز استفاده می‏شود (29). بنابراین، شناسایی مولکولی و شباهت توالی 16S rRNA باکتری‏ها ‏نقش تعیین کننده‏ای ‏دارد. پس از تعیین توالی 16S rRNA و مقایسه توالی آن با توالی 16S rRNA دیگر لاکتوباسیل‏های ‏گزارش شده در بانک ژنی، نشان داده شد که این سویه‏ها ‏از نظر مولکولی لاکتوباسیلوس پاراکازئی شناسایی شدند. همچنین، بر اساس درخت فیلوژنتیکی 4 سویه برتر با شماره‏های ‏KF735654، KF735655، KJ508201 و KJ508202 با هم شباهت زیادی داشتند و 16S rRNA سویه لاکتوباسیلوس کازئی (gi 1843427) موجود در بانک ژنومی مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی شباهت زیادی به لاکتوباسیلوس پاراکازئی (KJ508201) داشت. با توجه به این‏که سویه L175 از لرستان، سویه L67 از کردستان، سویه L132 از ایلام و سویه L25 از کرمانشاه نمونه‏برداری شده بودند، از نظر تولید اسیدلاکتیک نسبت به بقیه سویه‏ها ‏برتری داشتند و فنوتیپ یکسانی را از این نظر نشان می‏دادند که همگی لاکتوباسیلوس پاراکازئی بودند. در پایان پیشنهاد می‏شود سویه‏های ‏تولید کننده اسیدلاکتیک به شکل تک ایزومره L (+) پس از بهینه‏سازی تولید به صنایع معرفی شوند.

 

تشکر و قدردانی

از کارکنان پژوهشکده صنایع غذایی کشاورزی پژوهشگاه استاندارد که در پژوهش حاضر‏ نگارندگان را یاری دادند، تشکر وقدردانی می‏شود.



[1]- 2-hydroxypropionic acid

[2]- Scheele

[3]- Lactobacillus

[4]- Lactobacillace

[5]- Firmicutes

[6]- Microaerophile

[7]- Homofermentative

[8]- Heterofermentative

[9]- MRS agar

[10]- HCl

[11]- Merck

[12]- Nicotinamide adenine dinuclotide hydrogen

[13]- Denatyring

[14]- Annealing

[15]- Elongation

[16]- National Center for Biotechnology Information (NCBI)

[17]- Lactobacillus paracasei

[xviii]- Polylactic acid (PLA)

[xix]- High-performance liquid chromatography (HPLC)

[xx]- Gas chromatography (GC)

[xxi]- Colorimetric

[xxii]- Ishola and Tayo

[xxiii] - Trontel

[xxiv]- Pansar

[xxv] -Lactobacillus casei

[xxvi] -Vodnar

[xxvii] - Lactobacillus paracasei 168

[xxviii] -Mirdamadi

[xxix]- Lactobacillus ramnosus

[xxx] -Lactobacillus plantarum LPF2

[xxxi] -Lactobacillus fermentum LFN7

[xxxii] - Lactobacillus amilovorus

[xxxiii] - Moon

[xxxiv] - Sarmast Ghahfarokhi

[xxxv] - Bergey 's

[xxxvi] - Tannock

(1)               Gunduz M. Latic acid production by Lactobacillus casei NRRL B-441 immobilized in chitosan stabilized Ca-Alginate beads. Izmir, Turkey: Institute of Technology; 2005.

(2)               John RP., Anisha GS., Nampoothiri KM., Pandey A. Direct Lactic acid fermentation: Focus on simultaneous saccharification and lactic acid production. Biotechnology Advances 2008; 27: 145- 52.

(3)               Rashid R. Optimization and Modeling of lactic acid production from pineapple waste. Malaysia: University Technology; 2008.

(4)               Wee YJ., Kim JN., Ryu HW. Biotechnological production of lactic acid and its recent application. Food Technology Biotechnology 2006; 44 (2): 163- 72.

(5)               Reddy G., Altaf MD., Naveena BJ., Venkateshwar M., Kumar EV. Amylolytic bacteria lactic acid fermentation-A review. Biotechnology Advances 2007; 26: 22- 34.

(6)               Buyukkileci AO. L (+) Lactic acid production from whey by Lactobacillus casei NRRL B-441. Turkey: Izmir Institute of Technology; 2000.

(7)               Abdel-Rahman MA., Tashiro Y., Sonomoto K. Lactic acid production from Lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits. Journal of  Biotechnology 2011; 156: 286- 301.

(8)               Kadam SR., Patil SS., Bastawde KB., Khire JM., Gokhale DV. Strain improvement of Lactobacillus delbrueckii NCIM 2365 for lactic acid production. Process Biochemistry 2006; 41: 120- 26

(9)               Hetenyi K., Nemeth A., Sevella B. Role of pH-regulation in lactic acid fermentation: Second steps in a process improvement. Chemical Engineering and processing 2011; 50: 293- 9.

(10)           Giraffa G., Chanishvili N., Widyastuti Y. Improtance of Lactobacilli in food and feed biotechnology. Research in Microbiology 2010; 161: 480- 7.

(11)           Canchaya C., Claesson MJ., Fitzgerald GF., Sinderen DV., Otoole PW. Diversity of the genus Lactobacillus revealed by comparative genomics of five species. Departement of Microbiology and Alimentary Pharmabiotic center 2006; 152: 3185- 96.

(12)           Hammes WP., Hertel CH. Genus Lactobacillus. In: Whitman WB., Vos pD., Garrity GM., Jones D., Krieg NR., Ludwig W., et al.editors. Bergey s manual of systematic Bacteriology. 2nd ed. New York: University of Georgia; 2009: 465- 511.

(13)           Singh S., Goswami P., Singh R., Heller KJ. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: A review. LWT-Food Science and Technology 2009; 42: 448- 57.

(14)           The United States Pharmacopeial convention. The national formulary. Washington: Board of trustees; 2000.

(15)           International Standard No. 9232- Yogurt-Identification of characteristic microorganisms Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus and Sterptococcus thermophilus 2003.

(16)           International Standard No. 21571- Foodstuffs-Method of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products nucleic acid extraction 2005.

(17)           Ghobadi Dana M. Isolation and molecular identification of naturally occurring Lactobacilli from some Iranian local yoghurt and analysis of their properties by proteomics [Dissertation]. Tehran: National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology; 2010.

(18)           Ghobadi Dana M., Yakhchali B., Salmanian AH., Rastgarjazi Jazii F. High level acetaldehyde production by an indigenous Lactobacillus strain obtained from traditional dairy products of Iran. African Journal of Microbiology Research 2011; 5 (25): 4398- 405.

(19)           Michelson T., Kask K., Jogi E., Talpsep E., Suitso I., Nurk A. L (+) -Lactic acid producer Bacillus coagulans SIM-7 DSM 14043 and its comparison with Lactobacillus delbrueckii ssp. Lactis DSM 20073. Enzyme and Microbial Technology 2006; 39: 861-7.

(20)           Sanchez-Machado DI., Lopez-Cervantes J., Martinez-Cruz O. Quantification of organic acids in fermented shrimp waste by HPLC. Food Technology and Biotechnology 2008; 46 (4): 456- 60.

(21)           Ishola RO., Tayo BC. Screening of lactic acid bacteria isolated from fermented food for Bio-molecules production. Technical Report 2012; 15 (4): 205- 17.

(22)           Trontel A., Batusic A., Gusic I., Slavica A., Santek B., Novak S. Production of D-and L-Lactic acid by mono-and mired cultures of Lactobacillus sp. Food Technology and Biotechnology 2011; 49 (1): 75- 82.

(23)           Panesar P., Kennedy J., Knill CJ., Kosseva M. Production of L (+) Lactic acid using Lactobacillus casei from whey. Brazilian Archives of Biology and Technology 2010; 53 (1): 219- 26.

(24)           Vodnar DC., Venus J., Schneider R., Socaciu c. Lactic acid production by Lactobacillus paracasei 163 in discontinuous fermentation using lucerne green juice as nutrient substitute. Chemistry of Engineering and Technology 2010; 33 (3): 468- 74.

(25)           Mirdamadi S., Rajabi A., Aziz Mohseni F., Moomem B. Lactic acid production by Lactobacillus various strains. Iranian Journal of Nutrition Sciences and Food Technology 2007; 2 (3): 57- 64.

(26)           Moon SK., Wee YJ., Choi GW. A novel lactic acid bacterium for the production of high purity L-Lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei CHB2121. Journal of Bioscience and Bioengineering 2012; 114 (2): 155- 9.

(27)           Sarmast Ghahfarokhi E., Mobini Dehkordi M., Beheshtimaal K. Isolation and evalution of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (3): 41- 52.

(28)           Jayalalitha V., Balasundaram B., Dhanalakshmi B. Molecular identification of Lactobacilli in milk. National Seminar on Current Perspectives in Biological Siences 2013; 12 (7): 56- 8.

(29)           Kwon HS., Yang EH., Yeon SW., Kang BH., Kim TY. Rapid identification of probiotic Lactobacillus species by multiplex PCR using species-specific primers based on the region extending from 16S rRNA through 23S rRNA. FEMS Microbiology Letters 2004; 239: 267- 75.