اثر شرایط محیطی بر تغییر شکل سودوموناس آئروجینوزا و ارتباط آن با مقاومت آنتی‏ بیوتیکی در بیماران دچار سوختگی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروب‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

2 دانشیار باکتری‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

3 استادیار باکتری‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

4 دانشیار میکروب‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

5 دکتری میکروب‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

6 استاد میکروب‏شناسی، دانشگاه علوم پزشکی اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: سودوموناس آئروجیوزا یک باکتری گرم منفی هوازی و از عوامل مهم عفونت‏‏های ‏بیمارستانی است‏. این باکتری در استرس‏‏های ‏محیطی مانند کمبود مواد غذایی، تغییر اسیدیته، تغییر فشار اسمزی و آنتی‏بیوتیک‏‏‏‏ها تغییر ریخت‏شناسی داده و به شکل کوکوئید در می‏آید. در شکل کوکوئید به علت‏ تغییر در پپتیدوگلیکان دیواره سلولی، لیپید‏های ‏غشا و کاهش فعالیت متابولیک باکتری نسبت به آنتی‏بیوتیک‏‏‏‏ها مقاوم می‏شود. با توجه به افزایش مرگ و میر در بیماران سوختگی و مسأله مهم مقاومت آنتی‏بیوتیکی در سودوموناس آئروجینوزا در این بیماران، برآن شدیم تا پژوهشی در مورد عوامل مؤثر بر تغییر شکل به کوکوئید که خود یک عامل مقاومت آنتی‏بیوتیکی است، انجام دهیم. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: در پژوهش حاضر، از نمونه‏‏های ‏زخم بیماران سوختگی (8 نمونه که توسط متخصص عفونی از زخم بیماران گرفته شد) و سویه استاندارد 27853 استفاده شد. نمونه‏‏‏ها توسط آزمون‏‏‏های ‏بیوشیمیایی و روش ‏PCR با پرایمر‏های ‏16SrDNA تایید شدند. سپس، نمونه‏‏‏ها در استرس‏‏های ‏قحطی مواد غذایی‏ و آنتی‏بیوتیک‏ قرار گرفتند. شکل باکتری‏‏ها هر روز توسط میکروسکوپ دیجیتال دی پی ایکس (شرکت المپیوس ژاپن) به مدت 60 روز بررسی شد. پس از القا فرم کوکوئید، زنده بودن باکتری توسط فلوسایتومتری تایید شد. ‏‏‏

نتایج: باکتری در شرایط آنتی‏بیوتیک‏ از روز پنجم و در استرس‏‏های ‏دیگر از روز 10 شروع به تغییر شکل کرد. تغییر ابتدا به شکل باسیل‏‏های ‏کشیده، سپس به شکل U و در نهایت، به شکل کوکوئید دیده شد. در نمونه با استرس ایمیپنم و مروپنم نتیجه مشابه بود و غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 2 میکروگرم در لیتر و غلظت کشندگی این دو آنتی‏بیوتیک‏ بالاتر از 4 میکروگرم در لیتر بود. نتیجه سویه استاندارد برای ایمیپنم و مروپنم مشابه با سویه‏‏های ‏بالینی بود. ‏‏‏در نمونه‏‏های ‏کلینیکی در استرس آمیکاسین غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 4 میکروگرم بر لیتر و غلظت کشندگی بیشتر از 8 بود. در نمونه استاندارد در استرس آمیکاسین غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 2 میکروگرم بر لیتر و غلظت کشندگی بیشتر از 4 بود.

بحث و نتیجه ‏گیری: تغییر شکل باکتری از باسیل به کوکوئید در نتیجه استرس‏هایی‏ که در بدن بیمار به این باکتری وارد می‏شود، می‏تواند به مقاومت این باکتری به آنتی‏بیوتیک منجر‏ شده و عواقب وخیمی را برای بیمار در بر داشته باشد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effects of environmental conditions on the morphologic change of Pseudomonas aeruginosa and its association with antibiotic resistance in burn patients

نویسندگان [English]

  • Mohsen Moghoofei 1
  • Hossein Fazeli 2
  • Farkhonde Poursina 3
  • Bahram Nasr-Esfahani 4
  • Sharareh Moghim 4
  • Hamid Vaez 5
  • Shima Hadifar 1
  • Mansour Sedighi 1
  • Hajei Ghasemian Safaie 6
1 M.Sc of Medical microbilogy, Isfahan University of Medical Sciences, Iran
2 Ass ociated Professor of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Iran
4 Associated Professor of Microbiology, Isfahan University of Medical Sciences, Iran
5 Ph.D of Microbilogy, Isfahan University of Medical Sciences, Iran
6 Professor of Microbilogy, Isfahan Univercity of Medical Sciences, Iran
چکیده [English]

Introduction: Pseudomonas aeruginosa is an aerobic gram-negative bacteria, which causes hospital infections. Bacteria under stress, such as lack of food, pH and osmotic pressure change and antibiotic stress transforms its morphology to coccoid form. In the bacill form due to changes in the peptidoglycan cell wall, membrane lipids and decreased metabolic activity, bacteria resistant to antibiotics. Due to an increase in mortality in burn patients and important problem of antibiotic resistance in P.aeruginosa the researcher decided to study the factors affecting on morphologic change to coccoid form.

Materials and methods: In this study P.aeruginosa strains obtained from clinical samples of burned patients (8 samples were taken from the wound by Infectious Disease Specialist) and standard strain ATCC 27853 were used. Samples were confirmed by biochemical tests and PCR by 16srDNA primer. Then bacteria were put under lack of food and antibiotic stress invitro. After that bacterial morphology was examined on different days by digital DP 72-BX 51 microscope to 60 days. After induction coccoid forms, bacterial viability was confirmed by flow cytometry.

Results: Bacteria begin to change morphology from 5 days for antibiotic stress and 10 days for other stress. Changing morphology was initially elongate bacilli, U shape and finally the coccoid form was seen.

Discussion and conclusion: Changing morphology of bacilli to coccoid bacteria that are the result of stress on the bacteria which enter the body can lead to bacterial resistance to antibiotics and have grave consequences for the patient.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pseudomonas aeruginosa
  • Coccoid form
  • Burn patients

مقدمه.

سودوموناس آئروجینوزا [1]با تولید عوامل حدت مختلف می‏تواند موجب انواع بیماری شامل باکتریمی، اندوکاردیت، عفونت دستگاه ادرار، دستگاه تنفسی، سیستم عصبی مرکزی، گوش، چشم، استخوان، مفاصل و پوست شود (1). این باکتری به عنوان سومین عامل در عفونت‏‏های ‏بیمارستانی و نخستین عامل ایجاد عفونت‏‏های ‏بیمارستانی در بخش‏‏های ‏سوختگی بیمارستان‏‏ها مطرح است‏ (2 و 3). سپتی سمی ناشی از این باکتری به عنوان یک عارضه جدی ناشی از عفونت‏‏های ‏سوختگی مطرح بوده و خطر این عارضه متناسب با درجه سوختگی افزایش می‏یابد (4 و 5). این باکتری عامل اصلی مرگ و میر در بخش سوختگی بیمارستان است‏ (6). امروزه شاهد این مسأله هستیم که با وجود اثرگذاری آنتی‏بیوتیک‏‏‏های ‏مورد استفاده در درمان این باکتری در شرایط آزمایشگاهی، همیشه نتیجه مطلوب و مشابه این شرایط روی بیمار حاصل نمی‏شود و این مسأله مربوط به شرایط فیزیولوژیک باکتری بوده و خود متأثر از شرایط محیطی است‏ (7). توانایی‏ این باکتری برای رشد در محیط‏‏های ‏با حداقل مواد غذایی‏ و داشتن مقاومت طبیعی به عوامل ضدعفونی کننده وآنتی‏بیوتیک‏‏‏ها باعث می‏شود که این باکتری از وسایل پزشکی و محیط‏‏های ‏مرطوب بیمارستان‏ها جداسازی شود (8). در طی عفونت، سودوموناس آئروجینوزا باید در برابر تغییرات محیطی از جمله تغییر در دما، اسیدیته [2]، قدرت یونی، حد واسط‏‏های ‏فعال اکسیژن و آنتی بادی مقاومت کرده و زنده بماند (9). باکتری در اثر استرس‏هایی‏ مانندکمبود موادغذایی‏، تغییراسیدیته، تغییر دما، کاهش اکسیژن، افزایش فشار اسمزی و آنتی‏بیوتیک‏‏‏ها ابتدا به شکل U و سپس، به شکل کوکوئید در می‏آید. بنابراین، باکتری به شکل‏‏های ‏باسیلی، U شکل وکوکوئید دیده می‏شود (10 و 11). درطی تبدیل به شکل کوکوئید اندازه سلول کاهش می‏یابدکه نتیجه انقباض غشای سیتوپلاسمی وکاهش در حجم فضای پری پلاسمیک است‏، همچنین، DNA (دئوکسی‏ریبو‏نوکلئیک‏اسید [3]) فشردگی پیدا می‏کند (12 و 13). مطالعات مختلف نشان داده که مجاورت باکتری با غلظت‏‏های ‏زیر حداقل غلظت مهار کننده رشد [4] آنتی‏بیوتیک‏‏‏ها بر چسبندگی، هیدروفوب سطحی سلول و تحرک باکتری اثر می‏گذارند (14 و 15). پژوهش‏ها نشان می‏دهندکه وقتی باکتری از شکل باسیل به کوکوئید تغییر شکل می‏دهد مقاومت آن‏‏ها نسبت به پراکسید هیدروژن، فشاربالای اسمزی، شوک حرارتی، مقاومت به آنتی‏بیوتیک، عوامل شیمیوتراپی و عوامل احیاکننده افزایش می‏یابد. این مقاومت می‏تواند به علت‏ تغییرات در اتصالات متقاطع دیواره سلولی و یا کاهش فعالیت‏‏های ‏متابولیک باشد (10، 16- 18). در تبدیل شکل باسیل به شکل کوکوئید ژن‏های ‏متفاوتی دخالت دارند ازجمله ژن rpoS کهعامل‏‏های ‏سیگمای متفاوتی کد می‏کند و باعث زنده ماندن سودوموناس آئروجینوزا در شرایط استرس می‏شوند (19). ژن rpoS یک پروتئین به نام عامل ‏‏سیگما (RpoS) را کد می‏کند که یک عامل‏‏ عمومی رونویسی بوده و در تنظیم ژن‏‏های ‏درگیر در فاز ایستایی‏ [5] دخالت دارد. این ژن دارای عملکرد‏‏های ‏بسیار مهمی برای باکتری از جمله: کنترل ژن‏‏های ‏‏درگیر در تحمل فشار اسمزی، کمبود مواد غذایی‏ و گرما، کنترل تولید اگزوتوکسین A، الاستاز، پیوسیانین، پروتئاز، آلژینات، تشکیل بیوفیلم و تغییر در پوشش سلولی و شکل است‏ (1، 9 و 20). با توجه به افزایش مرگ و میر در بیماران سوختگی و مسأله مهم مقاومت آنتی‏بیوتیکی در سودوموناس آئروجینوزا در این بیماران برآن شدیم تا پژوهشی در مورد عوامل مؤثر بر تغییر شکل از باسیل به کوکوئید انجام دهیم.

‏‏مواد و روش‏ها.

سویه‏‏‏های ‏‏باکتری و شرایط کشت: در پژوهش حاضر،‏‏ از ایزوله‏‏‏های ‏‏سودوموناس آئروجینوزا به دست آمده از بیماران سوختگی بیمارستان امام موسی کاظم (ع) اصفهان و سویه استاندارد 27853 تهیه شده از انستیتو پاستور ایران استفاده شد. سویه‏‏‏ها روی محیط سیتریمید آگار [6] کشت داده شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه باکتری‏‏های ‏رشد یافته با رنگ آمیزی گرم و آزمایش‏‏های ‏بیوشمیایی‏ مانند اکسیداز، اکسیداتیو فرمنتاتیو [7] و رشد در 42 درجه و با پرایمر‏های ‏16SrDNAتایید شدند.

آنتی بیوگرام: در پژوهش حاضر،‏‏ از آنتی‏بیوتیک‏‏‏های ‏ایمیپنم، مروپنم و آمیکاسین استفاده شد.

حداقل غلظت مهار کننده رشد [8] : میزان حداقل غلظت مهاری برای آنتی‏بیوتیک‏‏‏های ‏آمیکاسین و مروپنم به روش آزمون E‏انجام شد. نمونه‏ها باکدورتنیم مک فارلند تهیه و -+ محیط مولر هینتون آگار پخش شد. روی هر پلیت کشت داده شده یک نوار آزمون E‏ قرار داده شد. نتایج پس از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه ثبت شد‏‏.

PCR و پرایمر مورد استفاده: روش واکنش PCR (زنجیره ای پلیمراز [9]) برای تایید سویه‏‏های ‏جداسازی شده در سطح گونه به عنوان سودوموناس آئروجینوزا انجام شد. پرایمر مورد استفاده مربوط به قسمت بین ژن‏های ‏16SrRNA و 23SrRNA بوده و توالی پرایمر به شکل زیر است‏ (21):

PA1 TCC AAA CAA TCG TCG AAA GC

PA2 CCG AAA ATT CGC GCT TGA AC

ناحیه‏ای که این پرایمر تکثیر می‏کند شامل 181 جفت باز است‏. از سویه سودوموناس آئروجینوزا استاندارد 27853 به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. مخلوط واکنش PCR به شکل زیر است‏:

5/0 میکرولیتر از DNA استخراج شده به
mastermix PCR که خود شامل 5/2 میکرولیتر بافر PCR 10X، 5/1 میکرولیتر کلرید منیزیم 25 میلی‏مولار، 6/0 میکرولیتر دئوکسی‏نوکلئوتید‏تری‏فسفات [10] 10 میلی‏مولار، 5/0 میکرولیتر از هر پرایمر با غلظت 10 پیکو مول و 1/0 میکرولیتر از آنزیم Taq پلیمراز (5 واحد به ازای هر میکرولیتر) بود اضافه شد و حجم نهایی‏ به 25 میکرولیتر رسید. زمان‏‏های ‏چرخه‏‏های ‏تکثیر عبارتند از: زمان ذوب ابتدایی‏ 4 دقیقه، ذوب 1 دقیقه، اتصال 45 ثانیه و گسترش 1 دقیقه و تعداد چرخه‏‏‏ها 40 چرخه بود. الکتروفورز محصول PCR با استفاده از DNAلدر [11] (فرمنتاز [12]) در ژل آگاروز 5/1 درصد به مدت 60 دقیقه در ولتاژ 95 انجام شد و با استفاده از گرین ویوور [13] در دستگاه آشکار ساز ژل [14] مشاهده شد‏‏.

القای فرم کوکئید: کلونی‏‏های ‏تازه 24 ساعته (8 نمونه) از سودوموناس آئروجینوزا برداشته و شکل باسیل آن‏‏ها به‏وسیله رنگ آمیزی گرم تایید شد. سپس، درون محیط عصاره قلب مغز [15] تلقیح شد. پس از 24 ساعت انکوباسیون در 37 درجه سانتی‏گراد، در شرایط استرس‏‏های ‏مختلف شامل کمبود مواد غذایی‏ و آنتی‏بیوتیک‏ قرار داده شدند. به لوله‏‏های ‏با استرس آنتی‏بیوتیکی غلظت‏‏های ‏مختلف ((MIC, 1/2 MIC and 2×MIC آنتی‏بیوتیک‏‏‏های ‏ایمیپنم، مروپنم و آمیکاسین اضافه شد. یک لوله بدون آنتی‏بیوتیک‏ به عنوان کنترل قرار داده شد. نمونه‏‏‏ها پس از 24 ساعت رشد، تا 60 روز نگهداری شد. هر روز ریخت‏شناسی آن‏‏ها با رنگ آمیزی گرم و با میکروسکوپ (دیجیتال دی پی ایکس شرکت المپیوس ژاپن [16]) با بزرگنمایی‏ 1000 بررسی شد. زمانی که بیش از 90 درصد باکتری‏‏ها به فرم کوکوئید تبدیل شدند زنده ماندن آن‏‏ها بررسی شد. همچنین، با این میکروسکوپ اندازه شکل باسیل و کوکوئید نیز اندازه‏گیری شد. درصد شکل‏‏های ‏کوکوئید به شکل شمارش 100 باکتری در 3 میدان دید برای هر اسمیر اندازه‏گیری شد. زمانی که کوکوئید‏‏ها 95 درصد کل سلول‏های ‏باکتری را شامل شدند آزمایش قابلیت زنده بودن [17] انجام شد.

یکپارچگی غشا و سنجش زنده بودن سلول: این کار با روش فلوسایتومتری و مطابق مراحل زیر انجام شد:

1-       پس از تهیه سوسپانسیون باکتری، 3 مرتبه با فسفات بافر سالین [18] (5 میلی لیتر با اسیدیته 8) و سانتریفیوژ در دور 1000 به مدت 10 دقیقه شستشو شد.

2-       سپس، به باکتری‏های ‏رسوب کرده 1 میکرولیتر رنگ پروپیدیوم یودید [19] اضافه و 30 دقیقه در تاریکی انکوبه شد.

3-       سوسپانسیون سلولی با فلوسایتومتری (فاکس کالیبور شرکت بکتون دیکنسون [20]) با طول موج 488 نانومتر تحلیل شد.

4-       با این دستگاه 150 تا 500 سلول در ثانیه شمارش شد.

5-       داده‏‏‏ها بر اساس شمارش 10 هزار سلول بر طبق FSC، SSC و فلورسانس قرمز اندازه‏گیری شد.

یک سوسپانسیون سلولی از باکتری‏های ‏با کشت تازه به عنوان کنترل مثبت استفاده شد. از یک سوسپانسیون باکتری‏‏های ‏با کشت تازه به عنوان کنترل مثبت واز یک سوسپانسیون باکتری کشته شده با حرارت به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

 

نتایج.

در روز اول که باکتری‏‏‏ها در شرایط استرس قرار داده شدند از آن‏‏ها لام گرفته و با میکروسکوپ شکل آن‏‏ها بررسی شد. کمابیش 100 درصد به شکل باسیل بودند (شکل 1: الف). سپس، هر روز شکل آن‏‏ها بررسی شد و در نمونه‏‏های ‏با استرس مواد غذایی‏ در روز 10 و در نمونه‏‏های ‏با استرس آنتی‏بیوتیک‏ پس از 72 ساعت باسیل‏‏های ‏بسیار کشیده و شکل‏های ‏U و خمیده دیده شد. در روز 16 استرس غذایی‏ باکتری به شکل کوکوئید دیده شد (شکل 1: ب). در روز 39 استرس غذایی‏ و روز 8 استرس آنتی‏بیوتیک‏ کمابیش همه نمونه‏‏‏ها به شکل کوکوئید تبدیل شده بودند (شکل1: ج).

 

شکل 1- تصاویر میکروسکوپی از رنگ آمیزی گرم سودوموناس آئروجینوزا در مراحل مختلف شکلی. الف) شکل باسیل باکتری پس از 24 ساعت انکوباسیون ب) شکل باسیل، U شکل و باسیل کشیده ج) شکل کوکوئید باکتری پس از 8 روز در استرس آنتی‏بیوتیک‏

 

 

A

 

B

 

Gated%

Marker

100. 00

All

0. 00

M1

100. 00

M2

C

 

Gated%

 

Marker

100. 00

All

98. 20

M1

1. 91

M2

 

شکل 2- Light scatter of gated (A سلول‏‏های ‏سودوموناس آئروجینوزا B) نسبت جذب پروپیدیوم آیودید در نمونه کنترل مثبت سودوموناس آئروجینوزا که باکتری‏‏‏ها کشته شده اند (جذب بالا در ناحیه M2)(Cنسبت جذب پروپیدیوم آیودید در نمونه کنترل منفی که باکتری به فرم باسیل و زنده است‏ (جذب بالا در ناحیه M1).

M1درصد سلول‏‏های ‏زنده و M2 درصد سلول‏‏های ‏مرده است‏.

 

 

Gated%

Marker

100. 00

All

73. 97

M1

26. 23

M2

 

 

Gated%

Marker

100. 00

All

55. 05

M1

45. 10

M2

شکل 3- میزان جذب متفاوت پروپیدیوم آیودید در 2 نمونه مختلف. در نمونه اول مدت زمان استرس کمتر بوده و در نتیجه تعداد سلول‏‏های ‏زنده بیشتر است‏(M1).در نمونه دوم مدت زمان استرس بیشتر بوده و در نتیجه تعداد سلول‏‏های ‏مرده بیشتر است‏ (M2).

در نمونه کنترل که به روش گرم رنگ آمیزی شده بود نشان داد که تمام باکتری‏‏ها به شکل باسیل بودند. در نمونه‏‏های ‏در استرس آنتی‏بیوتیک‏ میزان غلظت آنتی‏بیوتیکی که موجب القای شکل کوکوئید یا از بین رفتن شکل کوکوئید شد به ترتیب زیر بود: در نمونه در استرس ایمیپنم و مروپنم نتیجه مشابه بود و غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 2 میکروگرم در لیتر و غلظت کشندگی این دو آنتی‏بیوتیک‏ بالاتر از 4 میکروگرم در لیتر بود. نتیجه سویه استاندارد برای ایمیپنم و مروپنم مشابه با سویه‏‏های ‏بالینی بود.

در نمونه‏‏های ‏کلینیکی با استرس آمیکاسین غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 4 میکروگرم بر لیتر و غلظت کشندگی بیشتر از 8 بود. در نمونه استاندارد با استرس آمیکاسین غلظت القا کننده آنتی‏بیوتیک‏ 2 میکروگرم بر لیتر و غلظت کشندگی بیشتر از 4 بود. زنده بودن نمونه‏‏‏ها در شکل کوکوئید با روش فلو سایتومتری تایید شد (شکل 2 و 3).

بحث و نتیجه‏‏گیری.

عفونت این باکتری در بیماران بستری به عنوان یک خطر جدی به شمار می‏رود به‏طوری که در موارد سپتی سمی با سودوموناس آئروجینوزا با وجود درمان با آنتی‏بیوتیک‏ها، در بیماران دچار سوختگی میزان مرگ و میر به 50 درصد می‏رسد (22). هدف از انجام این پژوهش، افزایش دانش درباره اثر عوامل محیطی روی القای تغییر شکل سودوموناس آئروجینوزا است. شکل هر باکتری بیشتر با پپتیدوگلیکان آن تعیین می‏شود که جزو اصلی دیواره سلولی است (23). برخی آنتی‏بیوتیک‏‏‏های ‏بتالاکتام مانند ایمیپنم که توانایی‏ اتصال به پروتئین‏‏های ‏متصل شومنده به پنی سیلین را دارند موجب تغییر شکل باکتری می‏شوند (14). یکی از اصلی‏ترین ‏رفتار‏های ‏مشاهده شده در باکتری‏‏های ‏گرم منفی با شرایط استرس محیطی کاهش اندازه سلول و تغییر شکل باسیل به کوکوئید است‏ (10).

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که هم کمبود مواد غذایی‏ و هم آنتی‏بیوتیک‏ موجب القای شکل کوکوئید در سودوموناس آئروجینوزا شدند. یکی از نتایج مهم پژوهش حاضر این بود که هر سه آنتی‏بیوتیک‏ مورد استفاده در غلظت‏‏های ‏کمتر از حداقل غلظت مهاری موجب القای شکل کوکوئید شدند.

در مطالعه سفالی [xxi] و همکاران در ایتالیا سویه سودوموناس آئروجینوزا از روز 9 شروع به تغییر شکل و تبدیل به شکل کوکوئید کرده است. در پژوهش حاضر سویه‏‏های ‏با استرس مواد غذایی‏ و دما از روز 16 و سویه‏‏های ‏با استرس آنتی‏بیوتیک‏ از روز 5 شروع به تغییر شکل و تبدیل به شکل کوکوئید کردند. علت‏ این تفاوت می‏تواند اختلاف در ویژگی‏های سویه مورد مطالعه، نوع و زمان استرس و نوع محیط کشت مورد استفاده باشد (24). در مطالعه فقری [xxii] و همکاران در ایران روی هلیکوباکتر پیلوری پس از 3 روز استرس آنتی‏بیوتیکی باکتری شروع به تبدیل به شکل کوکوئید کرد. در پژوهش حاضر این تغییر از روز 5 آغاز شد. علت‏ این اختلاف می‏تواند میزان تحمل متفاوت باکتری‏‏ها در برابر استرس، مقاومت ذاتی آن‏‏ها به آنتی‏بیوتیک‏ و نوع آنتی‏بیوتیک‏ مورد استفاده باشد (25). بسنارد [xxiii] و همکاران با مطالعه روی کمپیلوباکتر ژژونی نشان دادند که این باکتری با استرس مواد غذایی‏ در روز 14 شروع به تغییر شکل کرد (26). روش‏‏های ‏مختلفی برای سنجش زنده بودن شکل کوکوئید وجود دارد. در پژوهش حاضر از روش فلوسایتومتری به علت‏ سریع بودن، آسان بودن و معتبر بودن استفاده شد (24).

این باکتری به عنوان یک پاتوژن فرصت طلب در محیط‏های بیمارستانی مطرح است، بنابراین، باید با برنامه‏ای دقیق و هدفمند از بروز چنین سویه‏های مقاومی جلوگیری کرد(27). از آنجا که سودوموناس آئروجینوزا در زخم بیماران دچار سوختگی در معرض استرس‏‏های ‏مختلف از جمله کمبود مواد غذایی‏ و آنتی‏بیوتیک‏ قرار می‏گیرد و ممکن است به شکل کوکوئید تبدیل شود، دقت در تجویز غلظت آنتی‏بیوتیک‏‏‏‏ها برای جلوگیری از القای شکل کوکوئید می‏تواند در جلوگیری از مقاومت آنتی‏بیوتیکی و درمان بیماران مفید باشد. مطالعه روی شکل کوکوئید از نظر بررسی مقاومت آنتی‏بیوتیکی، تعیین نوع و دوز آنتی‏بیوتیک برای پیشگیری از ایجاد شکل کوکوئید ضروری است.



[1]- Pseudomonas aeruginosa

[2]- pH

[3]- Deoxyribonucleic acid

[4]- sub Minimum Inhibitory Concentration

[5]- Stationary state

[6]- Cetrimide agar

[7]- Oxidative-fermentative

[8]- Minimum Inhibitory Concentration

[9]- Polymerase chain reaction

[10]- Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs)

[11]- DNA Ladder

[12]- Fermentase

[13]- Green viewer

[14]- Gel documentation

[15]- Brain-heart infusion

[16]- Digital DP 72-BX 51, Olympus, Japan

[17]- Viability

[18]- Phosphate Buffer Saline

[19]- Propidium Iodide(PI)

[20]- FACSCalibur, Beckton Dickinson

[xxi]- Cefali

[xxii]- Faghri

[xxiii]- Besnard

(1)               Iversen BG., Brantsaeter AB., Aavitsland P. Nationwide study of invasive Pseudomonas aeruginosa infection in Norway: importance of underlying disease. The Journal of infection 2008; 57 (2): 139- 46.

(2)               Bert F., Maubec E., Bruneau B., Berry P., Lambert- Zechovsky N. Multi- resistant Pseudomonas aeruginosa outbreak associated with contaminated tap water in a neurosurgery intensive care unit. Journal of Hospital Infection 1998; 39 (1): 53- 62.

(3)               Rastegar Lari AR., Alaghehbandan R., Akhlaghi L. Burn wound infections and antimicrobial resistance in tehran., iran: an increasing problem. Annals of burns and fire disasters 2005; 18 (2): 68- 73.

(4)               De Vos D., Lim A Jr., Pirnay JP., Struelens M., Vandenvelde C., Duinslaeger L., et al.. Direct detection and identification of Pseudomonas aeruginosa in clinical samples such as skin biopsy specimens and expectorations by multiplex PCR based on two outer membrane lipoprotein genes. oprI and oprL. Journal of clinical microbiology 1997; 35 (6): 1295- 9.

(5)               Pirnay J- P., De Vos D., Duinslaeger L., Reper P., Vandenvelde C., Cornelis P., et al. Quantitation of Pseudomonas aeruginosa in wound biopsy samples: from bacterial culture to rapid `real- time' polymerase chain reaction. Critical Care 2000; 4 (4): 255- 62.

(6)               Bahar MA., Jamali S., Samadikuchaksaraei A. Imipenem- resistant Pseudomonas aeruginosa strains carry metallo- beta- lactamase gene bla (VIM) in a level I Iranian burn hospital. Burns 2010; 36 (6): 826- 30.

(7)               Murakami K., Ono T., Viducic D., Kayama S., Mori M., Hirota K., et al. Role for rpoS gene of Pseudomonas aeruginosa in antibiotic tolerance. FEMS microbiology letters 2005; 242 (1): 161- 7.

(8)               Murakami K., Ono T., Viducic D., Kayama S., Mori M., Hirota K., et al. Role for rpoS gene of Pseudomonas aeruginosa in antibiotic tolerance. FEMS Microbiology Letters 2005; 242 (1): 161- 7.

(9)               Marlo Firme HK., Lee C., Song D. RpoS Contributes to Variations in the Survival Pattern of Pseudomonas aeruginosa in Response to Ciprofloxacin. Journal of Experimentall Microbiology and Immunology (JEMI) 2010; 14: 21- 7.

(10)           Cefalì E., Patanè S., Arena A., Saitta G., Guglielmino S., Cappello S., et al. Morphologic variations in bacteria under stress conditions: Near- field optical studies. Scanning 2002; 24 (6): 274- 83.

(11)           Oliver JD. The Viable but Nonculturable State in Bacteria. The Journal of Microbiology 2004; 1-8.

(12)           Sachidanandham R., Yew- Hoong Gin K., Laa Poh C. Monitoring of active but non- culturable bacterial cells by flow cytometry. Biotechnology and Bioengineering2005; 89 (1): 24- 31.

(13)           Elabed H., Bakhrouf A., Hamza R., Azaiez M., Gaddour K. Evidence of the adaptive response in Pseudomonas aeruginosa to 14 years of incubation in seawater. Annals of Microbiol 2012; 62 (4): 1385- 94.

(14)           Fonseca AP., Sousa JC. Effect of antibiotic- induced morphological changes on surface properties, motility and adhesion of nosocomial Pseudomonas aeruginosa strains under different physiological states. Journal of Applied Microbiology 2007; 103 (5): 1828- 37.

(15)           Rowan NJ. Viable but non- culturable forms of food and waterborne bacteria: Quo Vadis? Trends in Food Science & Technology 2004; 15 (9): 462- 7.

(16)           McDougald D., Rice SA., Weichart D., Kjelleberg S. Nonculturability: adaptation or debilitation? FEMS Microbiology Ecology 1998; 25 (1): 1- 9.

(17)           Oliver JD. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews 2010; 34 (4): 415- 25.

(18)           Kana BD., Mizrahi V. Resuscitation- promoting factors as lytic enzymes for bacterial growth and signaling. FEMS Immunology & Medical Microbiology 2010; 58 (1): 39- 50.

(19)           Jørgensen F., Bally M., Chapon- Herve V., Michel G., Lazdunski A., Williams P., et al. RpoS- dependent stress tolerance in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 1999; 145 (4): 835- 44.

(20)           Sang- jin Suh ls- S.,Donald E. Woods., Daniel J. Hassett., Susan E. H. west., Dennis E. Ohman. Effect of rpoS Mutation on the Stress Response and Expression of Virulence Factors in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology 1999; 181:3890- 7.

(21)           Tyler SD., Strathdee CA., Rozee KR., Johnson WM. Oligonucleotide primers designed to differentiate pathogenic pseudomonads on the basis of the sequencing of genes coding for 16S- 23S rRNA internal transcribed spacers. Clinical and diagnostic laboratory immunology 1995; 2 (4): 448- 53.

(22)           Matthew R., Fogle BS., John A. Griswold M. D., Jeffrey W. Oliver M. D., Abdul N., Hamood Ph. D. Anti- ETA Igg Neutralizes The Effects of Pseudomonas Aeruginosa Exotoxin A. Journal Of Surgical Research 2002; 106: 86- 98.

(23)           Dworkin J. Form equals function? Bacterial shape and its consequences for pathogenesis. Molecular Microbiology 2010; 78:792- 5.

(24)           Oliver JD. The viable but nonculturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 2005; 43 (1): 93- 100.

(25)           Faghri J., Poursina F., Moghim S., Esfahani HZ., Esfahani BN., Fazeli H., et al. Morphological and Bactericidal Effects of Different Antibiotics on Helicobacter pylori. Jundishapur Journal of Microbiology 2014; 7 (1): 1- 7.

(26)           Besnard V., Federighi M., Cappelier J. Evidence of Viable But Non- Culturable state in Listeria monocytogenes by direct viable count and CTC- DAPI double staining. Food microbiology 2000; 17 (6): 697- 704.

(27)           Sedighi M., Ghasemian safaie H., Vaez H., Moghoofeie M., Hadifar SH., Oryan G., et al. Detection of blaSPM-1 metallo-β-lactamase gene in Imipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa strains isolated from hospitalized patients in Isfahan hospitals. Biological Journal of Microorganism 2015; 13 (1): 1- 14.