بررسی تأثیر استراتژی‏ های خوراک‏ دهی ‏‏روغن زیتون بر تولید لیپاز یارروویا لیپولیتیکا

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه مراغه، ایران

2 کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه مراغه، ایران

چکیده

مقدمه: آنزیم لیپاز مخمر lipolytica Yarrowia درصنایع شوینده‏ها‏‏، آرایشی و بهداشتی، داروسازی و غذایی به‏کار می‌رود. تولید این آنزیم به ترکیب محیط‌ کشت به ویژه منبع کربن بستگی دارد. هدف پژوهش حاضر‏‏، بررسی تأثیر استراتژی‏های خوراک‏دهی مختلف روغن زیتون بر تولید لیپاز Y. lipolytica بود. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: سویه مخمر Y. lipolytica FDY1390 در محیط‏های کشت با استرتژی‏های مختلف خوراک‏دهی کشت شد. سه الگو مختلف برای روش خوراک‏دهی نیمه پیوسته به کار رفت. رشد مخمر به روش شمارش مستقیم توسط لامنئوبار بررسی و فعالیت لیپاز با استفاده از روش تیتراسیون اندازه گیری شد. ‏‏‏

نتایج: هر سه الگو خوراک‏دهی نیمه پیوسته میزان تولید تولید لیپاز را نسبت به کشت بسته افزایش داد. Fed3 بهترین الگو خوراک‏دهی نیمه پیوسته بودکه به تولید لیپاز با فعالیت برابر با 526 واحد در میلی‏لیتر پس از 120 ساعت منجر شد و ضریب بهره‏وری به 38/4 واحد بر ساعت رسید. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: نتایج نشان داد که الگوهای خوراک‏دهی کشت نیمه پیوسته نسبت به کشت بسته میزان تولید لیپاز را افزایش می‏دهد. بهترین استراتژی افزودن روغن زیتون به عنوان منبع کربن و سوبسترای القایی پس از 48 ساعت از زمان تلقیح مخمر Y. lipolytica به محیط کشت است. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation the effect of olive oil feeding strategies on Yarrowia lipolytica lipase production

نویسندگان [English]

  • Farshad Darvishi 1
  • Barumand Hosseini 2
1 Associate professor of Microbiology, University of Maragheh, Maragheh, Iran
2 M.Sc. of Microbial biotechnology, University of Maragheh, Maragheh, Iran
چکیده [English]

Introduction: Lipase of the yeast Yarrowia lipolytica used in detergents, cosmetics, pharmaceuticals and food industries. This enzyme production depends on medium composition, especially carbon source.  The purpose of this study was to investigate the effect of olive oil different feeding strategies on Y. lipolytica lipase production.

Materials and methods: The yeast strains Y. lipolytica FDY1390 was cultured in media with different feeding strategies. Three different models were used to fed-batch feeding method. The yeast growth is monitored by direct counting method with neubauer chamber. Lipase activity was measured using titration method.

Results: All three models of fed-batch feeding increased lipase toward the batch culture. Fed3 was the best model of fed-batch feeding, in which the model leads to the production of lipase activity with 526 U/ml after 120 hours and the productivity reached to 4.38 U/ h.

Discussion and conclusion: The results showed that feeding patterns of fed-batch culture increase production rate of lipase production towards batch culture. The best strategy is to add olive oil as the carbon source induction substrate in medium after 48 hours of inoculation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lipase
  • Yarrowia Lipolytica
  • Batch culture
  • Fed-batch culture
  • Feeding

مقدمه.

لیپاز ‏‏‏(EC 3. 1. 1. 3) جزو هیدرولازهاست که در درجه اول مسؤول هیدرولیزآسیل گلیسرول‏ها می‏باشد. لیپاز برای تجزیه و زیست تبدیلی لیپیدها به ویژه تری‏آسیل‏گلیسرول‏ها در طبیعت ضروری هستند. علاوه بر اهمیت زیستی، لیپازها توانایی بالقوه‏ای برای بهره‏برداری در بیوتکنولوژی دارند (‏‏‏1 و 2). لیپاز توسط حیوانات، گیاهان و میکروارگانیسم‏ها تولید می‏شود. لیپاز‏های میکروبی به علت ثبات در عمل، گزینش و استفاده از سوبستراهای متنوع مورد توجه صنایع مختلف هستند. بسیاری از میکروارگانیسم‏ها از جمله باکتری‏ها‏‏، مخمر‏ها و قارچ‏ها به عنوان تولید کنندگان لیپاز خارج سلولی شناخته شدند (‏‏‏3- 5).

مخمر lipolytica Yarrowiaجزو گروه مخمرهای غیر معمول است که در دهه‏های گذشته در پژوهش‏های بنیادی و بیوتکنولوژی مورد توجه قرارگرفته است. این مخمر برای انسان غیر بیماری‏زا و برای چند فرآیند صنعتی ایمن شناخته شده است (‏‏‏6).

آنزیم لیپاز Y. lipolyticaبا ایجاد آرایش فضایی اختصاصی و دارا بودن فعالیت آنزیمی بالا برای آبکافت، ساخت و ترانس- استریفیکاسیون، دامنه وسیعی از استرها و روغن‌هاست که به همین علت می‌توان از آن برای انجام بیوترانسفورماسیون‌های میکروبی در صنایع دارویی، آرایشی- بهداشتی و غذایی استفاده کرد (‏‏‏7 و 8)(Barth and Gaillardin 1997; Vakhlu and Kour 2006). همچنین، این آنزیم به خاطر پایداری بالا، عدم نیاز به کوفاکتور، فعالیت سنتزی در حلال‌های آلی و طیف گسترده سوبسترا می‌تواند برای تبدیل مخلوط راسمیک به ترکیبات دارویی تک آنانتیومری به کار رود (‏‏‏9 و 10).

تولید لیپازهای میکروبی بیشتر تحت تأثیر ترکیب محیط و عوامل فیزیکی شیمیایی مانند دما، اسیدیته و اکسیژن محلول قرار دارند. از آنجا که معمولا لیپاز جزو آنزیم‏های القایی می‏باشد، در نتیجه منبع کربن عامل مهمی در بیان و تولید لیپاز است. این آنزیم‏ها معمولا در حضور لیپیدها و مشتقات آن‏ها‏‏ مانند تری‏آسیل‏گلیسرول، اسیدهای چرب، استرهای قابل هیدرولیز، توئین، نمک‏های صفراوی و گلیسرول تولید می‏شود (‏‏‏11 و 12).

به طور کلی فرآیندهای تخمیری به روش‏ها‏‏ی بسته[1]، خوراک‏دهی ‏‏نیمه پیوسته[2] و پیوسته[3] انجام می‏شود. در روش بسته چیزی به محیط کشت اضافه نمی‏شود و یا از آن خارج نمی‏گردد. در روش خوراک‏دهی ‏‏نیمه پیوسته ماده مغذی طی فرآیند تخمیر به محیط کشت اضافه می‏‏‏شود. در روش خوراک‏دهی پیوسته ماده مغذی به محیط کشت اضافه می‏‏‏شود و معادل آن محصول از محیط کشت خارج می‏‏‏گردد (‏‏‏13).

هدف پژوهش حاضر،‏‏ بررسی اثر استراتژی‏های مختلف خوراک‏دهی ‏‏بسته و نیمه پیوسته روغن زیتون به عنوان منبع کربن و القا کننده لیپاز بر فرآیند تخمیر و تولید لیپاز مخمر Y. lipolytica است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

سویه میکروبی و شرایط کشت: در این پژوهش از سویه مخمر Y. lipolytica FDY1390استفاده شد. از محیط کشت YPD حاوی 20 گرم در لیتر گلوکز، 20 گرم در لیتر پپتون و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر و 17 گرم در لیتر آگار برای کشت این مخمر در دمای 29 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت 2 تا 3 روزه استفاده و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد‏‏ نگهداری شد (‏‏‏14).

فعال‏سازی ‏‏‏سویه‏ها با کشت بر روی محیط YPD انجام شد که پس از انکوبه کردن در دمای 29 درجه سانتی‏گراد به مدت 24 ساعت، یک کلونی به ارلن 100 میلی‏لیتری حاوی 20 میلی‏لیتر محیط YPD مایع و فاقد آگار به عنوان مایع تلقیح انتقال داده شد. سپس، ارلن در انکوباتور شیکر‏دار با دمای 29 درجه سانتی‏گراد با سرعت چرخش 200 دور در دقیقه به مدت 18ساعت انکوبه شد‏‏‏ (‏‏‏15).

روش‏های خوراک‏دهی: برای روش بسته، 50 میلی‏لیتر محیط کشت تولید حاوی یک درصد عصاره مخمر و تریپتون و یک درصد روغن زیتون در ارلن‏ها‏‏ی250 میلی‏لیتری در نظر گرفته شد. پس از استریل کردن محیط کشت، یک درصد مایع تلقیح از سویه مخمر Y. lipolytica FDY1390در شرایط استریل اضافه شد‏‏‏. سپس، ارلن‏ها به منظور انکوبه کردن به انکوباتور شیکردار با دمای 29 درجه سانتی‏گراد و با سرعت چرخش 200 دور در دقیقه منتقل شدند. هر 24 ساعت به منظور بررسی رشد مخمرها و فعالیت لیپاز از ارلن‏ها در شرایط استریل نمونه‏برداری شد‏‏‏.

برای روش خوراک‏دهی نیمه پیوسته، سه الگو مختلف با نام‏های Fed1، Fed2 و Fed3 به کار رفت. برای هر سه الگو محیط کشت اولیه، روش تلقیح و مطالعه نمونه‏ها مشابه روش بسته بود. برای الگو Fed1، پس از 24 ساعت 5/0 درصد روغن زیتون اضافه شد‏‏ و پس از 48 ساعت 5/0 درصد دیگر از روغن زیتون اضافه شد. برای الگو Fed2، تنها پس از 24 ساعت یک درصد روغن زیتون اضافه شد‏‏. برای الگو Fed3، تنها پس از 48 ساعت یک درصد روغن زیتون اضافه شد.

سنجش رشد و فعالیت آنزیمی: برای بررسی رشد و شمارش تعداد سلول‏ها‏‏ی مخمر از لام نئوبار استفاده شد. روش تیتراسیون برای سنجش فعالیت لیپاز به کار رفت. پس از هر بار نمونه‏برداری، نمونه‏ها در دور 13000 به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شد و از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. یک میلی‏لیتر از محلول رویی به طور مستقیم و یا رقیق شده به 5 میلی‏لیتر از سوبسترای سنجش فعالیت لیپاز (‏‏‏مخلوطی از روغن زیتون با هیدروکسید سدیم یک دهم مولار و پلی وینیل الکل دو درصد) به همراه 4 میلی‏لیتر بافر فسفات یک دهم مولار با اسیدیته حدود 7 اضافه شد‏‏‏. سپس، به مدت 15 دقیقه در بن ماری شیکر‏دار با دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. پس از این مرحله برای متوقف کردن واکنش، 5 میلی‏لیتر از محلول متوقف کننده (‏‏‏ترکیبی از الکل و استون به نسبت یک به یک حجمی/ حجمی) اضافه شد. در ادامه 3 تا 5 قطره از محلول فنل فتالئین دو در صد افزوده شد و با محلول هیدروکسید سدیم 50 میلی‏مولار تیتر شد‏‏‏. فعالیت لیپاز به شکل واحد در میلی‏لیتر گزارش می‏شود که یک واحد فعالیت آنزیمی، معادل مقدار آنزیمی است که یک میکرومول اسید چرب را در یک دقیقه تحت شرایط سنجش آزاد سازد (‏‏‏‏‏‏16). شایان ذکر است که تمام آزمایش‏ها حداقل با چهار تکرار انجام شد.

 

نتایج.

روند رشد سویه مخمر مورد استفاده و میزان تولید لیپاز در محیط‏ها‏‏ی کشت بسته و خوراک‏دهی ‏‏شده با سه الگو مختلف با فواصل زمانی 24 ساعت اندازه‏گیری ‏‏ و در زمان‏ها‏‏ی مقرر خوراک دهی انجام شد. نتایج مربوط به تولید لیپاز و میزان رشد سویه Y. lipolytica FDY1390در محیط‏ها‏‏ی مختلف کشت بسته و خوراک‏دهی ‏‏شونده نیمه پیوسته به ترتیب در شکل‏ها‏‏ی 1 و 2 نشان داده شده است.

 

 

شکل 1- نمودار تولید لیپاز توسط سویه مخمر Yarrowia lipolytica FDY1390 در محیط‏ها‏‏ی مختلف کشت بسته (‏‏‏‏‏‏Batch)، کشت نیمه پیوسته خوراک‏دهی ‏‏شونده با الگو اول (‏‏‏Fed1)، الگو دوم (‏‏‏Fed2) و الگو سوم (‏‏‏Fed3).

 

 

شکل 2- نمودار میزان رشد سویه مخمر Yarrowia lipolytica FDY1390 در محیط‏ها‏‏ی مختلف کشت بسته (‏‏‏Batch)، کشت نیمه پیوسته خوراک‏دهی ‏‏شونده با الگو اول (‏‏‏Fed1)، الگو دوم (‏‏‏Fed2) و الگو سوم (‏‏‏Fed3).

 

 

سویه مخمر Y. lipolytica FDY1390در تخمیر به حالت کشت بسته پس از 72 ساعت به حداکثر فعالیت لیپاز خود رسید که معادل 5/336واحد در میلی‏لیتر بود. طی این زمان که 48 ساعت از خوراک‏دهی ‏‏Fed1 و Fed2 و 24 ساعت از خوراک‏دهی ‏‏Fed3 گذشته بود، فعالیت لیپاز این به ترتیب 231، 5/239 و 260 واحد در میلی‏لیتر بود. بررسی روند رشد و فعالیت لیپاز تا 120 ساعت از آغاز فرآیند ادامه داده شد. طی این زمان که از خوراک‏دهی ‏‏Fed1 و Fed2 مدت 96 ساعت و از خوراک‏دهی ‏‏Fed3 مدت 72 ساعت می‏گذشت حداکثر فعالیت لیپاز در آن‏ها‏‏ مشاهده شد که به ترتیب برابر 483، 500 و 526 واحد در میلی‏لیتر بود. بهره‏وری تولید لیپاز (‏‏‏PL) به شکل میزان تولید لیپاز بر زمان تخمیر و بر حسب واحد فعالیت آنزیمی بر ساعت (‏‏‏U/h) گزارش می‏شود. در این پژوهش، بهره‏وری تولید لیپاز برای تخمیر در حالت کشت بسته برابر 67/4، برای خوراک‏دهی ‏‏نیمه پیوسته الگو یک، معادل با 02/4، الگو دو، معادل 16/4 و الگو سه، برابر 38/4 واحد فعالیت آنزیمی بر ساعت محاسبه شد‏‏.

 

بحث و نتیجه‏‏ گیری.

مخمر Y. lipolytica یک مخمر هوازی غیر‏بیماری‏زا‏ست که قادر به متابولیزه کردن تری‏گلیسریدها و اسیدهای چرب به عنوان منبع کربن است (‏‏‏17 و 18). منبع کربن موجود در محیط کشت می‏تواند باعث تحریک تولید لیپاز شود و یا تولید آن را مهار کند. برخی از چربی‏ها یا روغن‏ها به عنوان القا کننده تولید لیپاز در مخمر Y. lipolyticaاستفاده شدند (‏‏‏19 و 20). محیط‏ها‏‏ی رشد حاوی مواد چربی مثل روغن زیتون، اسید اولئیک و مشتقات آن‏ها‏‏ باعث القا تولید لیپاز می‏شوند. روغن زیتون غنی از اسید اولئیک است که باعث تنظیم مثبت بیان ژن مسؤول‏ تولید لیپاز می‏شود (‏‏‏21 و 22).

یکی از عوامل افزایش بهره‏وری بهینه‏سازی ‏‏‏محیط کشت و شرایط محیطی است. بهینه‏سازی ‏‏‏غلظت هر ترکیب به کار رفته در محیط کشت معمولا یک روش وقت‏گیر است، ولی بهینه‏سازی ‏‏‏متغیر‏ها‏‏ی کلیدی از جمله منابع کربن لیپیدی در فرآیند تولید لیپاز یک روش منطقی است، زیرا منبع کربن از مهم‏ترین عامل مؤثر بر بیان و تولید لیپاز است (‏‏‏11 و 12).

کشت به روش خوراک‏دهی ‏‏نیمه پیوسته به علت دارا بودن ترکیبی از ویژگی‏ها‏‏ی کشت بسته و کشت پیوسته به کار گرفته می‏شود. مزیت اصلی کشت به روش خوراک‏دهی ‏‏نیمه پیوسته، امکان‏پذیر بودن کنترل نرخ واکنش و واکنش‏ها‏‏ی متابولیک با استفاده از نرخ خوراک‏دهی ‏‏است‏ (‏‏‏13).

حداکثر تولید لیپاز در مخمر Y. lipolytica نزدیک مرحله سکون منحنی رشد انجام می‏شود و برای این مخمر حدود 48 ساعت پس از تلقیح است (‏‏‏23 و 24). در نتیجه سه الگو مختلف خوراک‏دهی نیمه پیوسته با روغن زیتون در پژوهش حاضر‏‏ به کار گرفته شد. برای الگو Fed1، پس از 24 ساعت، 5/0 درصد روغن زیتون به محیط کشت اضافه شد‏‏ و پس از 48 ساعت، 5/0 درصد دیگر از روغن زیتون اضافه شد. برای الگو Fed2، تنها پس از 24 ساعت، یک درصد روغن زیتون به محیط کشت اضافه شد‏‏. برای الگو Fed3، تنها پس از 48 ساعت، یک درصد روغن زیتون به محیط کشت اضافه شد.

هر سه الگو خوراک‏دهی نیمه پیوسته میزان تولید تولید لیپاز را نسبت به کشت بسته افزایش داد که از بین آن‏ها‏‏ بهترین الگو، Fed3 بود. این الگو به تولید لیپاز با فعالیت برابر با 526 واحد در میلی‏لیتر پس از 120 ساعت منجر شد که ضریب بهره‏وری حدود 38/4 واحد بر ساعت به دست آمد.

نتایج پژوهش حاضر‏‏ نشان می‏‏‏دهد که الگوهای خوراک‏دهی نیمه پیوسته نسبت به کشت بسته میزان تولید تولید لیپاز را افزایش می‏‏‏دهد و بهترین استراتژی افزودن روغن زیتون به عنوان منبع کربن و سوبسترای القایی پس از 48 ساعت از زمان اولیه تلقیح مخمر
Y. lipolytica به محیط کشت است.



[1]- Batch

[2]- Fed-batch

[3]- Continuous 

(1)               Vakhlu J., Kour A. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology 2006; 9 (‏‏‏1): 69- 85.

(2)                Bora L., Gohain D., Das R. Recent advances in production and biotechnological applications of thermostable and alkaline bacterial lipases. Journal of Chemical Technology & Biotechnology 2013; 88 (11): 1959- 70.

(3)               Houde A., Kademi A., Leblanc D. Lipases and their industrial applications. Applied Biochemistry and Biotechnology 2004; 118 (‏‏‏1-3): 155- 70.

(4)               Griebeler N., Polloni A., Remonatto D., Arbter F., Vardanega R., Cechet J., et al. Isolation and Screening of Lipase-Producing Fungi with Hydrolytic Activity. Food and Bioprocess Technology 2011; 4 (4):578- 86.

(5)               Singh A., Mukhopadhyay M. Overview of Fungal Lipase: A Review. Applied Biochemistry and Biotechnology 2012; 166 (2): 486- 520.

(6)               Casaregola S., Neuveglise C., Lepingle A., Bon E., Feynerol C., Artiguenave F., et al. Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeasts: 17. Yarrowia lipolytica. FEBS Letters 2000; 487 (1): 95- 100.

(7)               Treichel H., de Oliveira D., Mazutti M., Di Luccio M., Oliveira J. A Review on Microbial Lipases Production. Food and Bioprocess Technology 2010; 3 (2):182- 96.

(8)               Fickers P., Marty A., Nicaud JM. The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 2011; 29 (6): 632- 44.

(9)               Guieysse D., Sandoval G., Faure L., Nicaud J-M., Monsan P., Marty A. New efficient lipase from Yarrowia lipolytica for the resolution of 2-bromo-arylacetic acid esters. Tetrahedron: Asymmetry 2004; 15 (22): 3539- 43.

(10)           Yu MR., Lange S., Richter S., Tan TW., Schmid RD. High-level expression of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris and its purification and characterization. Protein Expression and Purification 2007; 53 (2): 255- 63.

(11)           Sharma R., Chisti Y., Banerjee UC. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances 2001; 19 (8): 627- 62.

(12)           Gupta R., Gupta N., Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Applied Microbiology and Biotechnology 2004; 64 (6): 763- 81.

(13)           Stanbury PF., Whitaker A., Hall SJ., cartographers. Principles of fermentation technology. Burlington: Elsevirescience Ltd; 2003.

(14)           Mirbagheri M., Nahvi I., Emtiazi G., Mafakher L., Darvishi F. Taxonomic characterization and potential biotechnological applications of Yarrowia lipolytica isolated from meat and meat products. Jundishapur Journal of Microbiology 2012; 5 (1): 346- 51.

(15)           Mafakher L., Mirbagheri M., Darvishi F., Nahvi I., Zarkesh-Esfahani H., Emtiazi G. Isolation of lipase and citric acid producing yeasts from agro-industrial wastewater. New Biotechnology 2010; 27 (4): 337- 40.

(16)           Darvishi F., Destain J., Nahvi I., Thonart P., Zarkesh-Esfahani H. High-level production of extracellular lipase by Yarrowia lipolytica mutants from methyl oleate. New Biotechnology 2011; 28 (6): 756- 60.

(17)           Fickers P., Benetti PH., Wache Y., Marty A., Mauersberger S., Smit MS., et al. Hydrophobicsubstrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica, and its potential applications. FEMS Yeast Research 2005; 5 (6-7): 527- 43.

(18)           Papanikolaou S., Chevalot I., Galiotou-Panayotou M., Komaitis M., Marc I., Aggelis G. Industrial derivative of tallow: a promising renewable substrate for microbial lipid, single-cell protein and lipase production by Yarrowia lipolytica. Electronic Journal of Biotechnology 2007; 10 (3): 425- 35.

(19)           Guerzoni ME., Lanciotti R., Vannini L., Galgano F., Favati F., Gardini F., et al. Variability of the lipolytic activity in Yarrowia lipolytica and its dependence on environmental conditions. International Journal of Food Microbiology 2001; 69 (1- 2): 79- 89.

(20)           Fickers P., Nicaud JM., Gaillardin C., Destain J., Thonart P. Carbon and nitrogen sourcesmodulate lipase production in the yeast Yarrowia lipolytica. Journal of Applied Microbiology 2004; 96 (4):742- 9.

(21)           Dominguez A., Deive FJ., Sanroman MA., Longo MA. Effect of lipids and surfactants on extracellular lipase production by Yarrowia lipolytica. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 2003; 78 (11):1166-70.

(22)           Darvishi F., Nahvi I., Zarkesh-Esfahani H., Momenbeik F. Effect of Plant Oils upon Lipase and Citric Acid Production in Yarrowia lipolytica Yeast. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2009; 2009: 1-7.

(23)           Kar T., Delvigne F., Masson M., Destain J., Thonart P. Investigation of the effect of different extracellular factors on the lipase production by Yarrowia lipolytica on the basis of a scale-down approach. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2008; 35: 1053-9.

(24)           Darvishi F., Hosseini B. Effect of olive oil with different purity grades on Yarrowia lipolytica lipase production. Biological Journal of Microorganism 2015; 4 (13): 35-42.