بهینه‏ سازی تولید آنزیم پکتیناز در قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس جداسازی شده از میوه ‏های در حال پوسیدن

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه اصفهان، ایران

2 دانشیار بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: آنزیم پکتیناز یکی از مهم‏ترین آنزیم‏های صنعتی جهان محسوب می‏‏شود که از طیف وسیعی از میکروارگانیسم‏ها مانند باکتری‏ها و قارچ‏های رشته‏ای تولید می‏‏شود. این آنزیم استفاده‏های زیادی در صنایع آبمیوه‏سازی، نساجی، روغن‏کشی و غیره دارد. در این پژوهش، جداسازی و بهینه‏سازی قارچ تولید کننده آنزیم پکتیناز از میوه‏های سیب و پرتقال در حال پوسیدن بررسی شد. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: جداسازی قارچ‏های تولید کننده آنزیم پکتیناز با استفاده از محیط کشت پکتین‏دار و با رنگ‏آمیزی لگول انجام شد. سویه آسپرژیلوس فومیگاتوس (AF293) به‏وسیله روش پیت شناسایی شد. بهینه‏سازی تولید آنزیم از این قارچ توسط طرح عامل‏یل در حضور 5 متغیر با 3 سطح در نظر گرفته شد. این 5 متغیر شامل منابع کربنی (آب پنیر، گلوکز و استویا) به همراه سولفات آمونیوم، سولفات منگنز، دما و ‏اسیدیته) در 3 آزمایش جداگانه انجام شد. اندازه‏گیری غلظت آنزیم پکتیناز با روش کلوریمتریک (میلر) انجام شد. ‏‏‏

نتایج: نتایج نشان داد که شرایط بهینه تولید آنزیم در دمای 32 درجه، ‏اسیدیته 6، غلظت 3 گرم بر لیتر سولفات منگنز، 75/2گرم بر لیتر از سولفات آمونیوم و غلظت 10 گرم بر لیتر منابع کربن آب پنیر، استویا و گلوکز است‏. بالاترین میزان تولید آنزیم در شرایط یاد‏ شده در حضور 10 گرم بر لیتر گلوکز با میزان 328/1 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر مشاهده شد. وزن مولکولی این آنزیم مطابق روش الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات 40 کیلودالتون به دست آمد. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: این سویه قادر به تولید آنزیم در حضور منابع مختلف کربن و رنج وسیع ‏اسیدیته و دماست. نتایج این پژوهش نشان می‏دهد که این سویه کاندید مناسبی برای کاربرد در صنعت است‏. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of pectinase enzyme production in Aspergillus fumigatus isolated from rotten fruits

نویسندگان [English]

  • Akram Songol 1
  • Mandana Behbahani 2
1 M.Sc. of Biotechnology, Isfahan university, Iran
2 Associate professor of Biotechnology, Isfahan university, Iran
چکیده [English]

Introduction: Pectinase is one of the most important industrial enzymes which was isolated from a wide variety of microorganisms such as bacteria and filamentous fungi. This enzyme has been usually used in the juice and textile industry. In this study, the isolation and optimization of pectinase-producing fungi on decaying rotten fruits were studied.

Materials and methods: Isolation and screening of pectinase producing fungi have been done by plate culture on pectin medium and staining with Lugol's iodine solution. The best strain was identified by method of Pitt and Hocking as Aspergillus fumigates. The enzyme production was optimized by application of the factorial design which involves five factors, each at three levels. Five factors were carbon sources (whey, sugar, stevia) and ammonium sulfate, manganese sulfate, temperature, and pH). Pectinase concentration was measured by the Miller method.

Results: The results showed that the optimum condition for enzyme production was at 32 °C, PH = 6 , 3g / L manganese sulfate, 2.75g / L of ammonium sulfate, 10g / L of each carbon source (whey, stevia, and glucose). Optimum of enzyme production was observed in the presence of 1.328 mg / ml of glucose. Molecular weight of enzyme was obtained about 40 kDa by SDS-PAGE.

Discussion and conclusion: The results demonstrated that this strain could grow in a wide range of carbon sources, PH and temperature. This study indicates that this strain is a good candidate for use in industrial application.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Pectinase Enzyme
  • Aspergillus fumigatus
  • Optimization
  • Factorial design method

مقدمه.

آنزیم پکتیناز یک گروه از آنزیم‏های پکتیک است‏ که پکتین موجود در بخش مرکزی دیواره سلولی گیاه را می‏شکند. کاربرد‏های تجاری این آنزیم برای نخستین‏‏ بار در 1930 برای آماده‏سازی آبمیوه‏ها بود. امروزه پکتیناز یکی از آنزیم‏های پرکاربرد بخش صنعتی و بیوتکنولوژی محسوب می‏شود. گزارش‏های موجود نشان می‏دهد که فروش تجاری کل آنزیم‏های صنعتی در سال 1995 در حدود یک بیلیون دلار بود که پکتیناز حدود 75 میلیون دلار از این سهم را شامل می‏شد. در سال 2005 کل فروش جهانی برای آنزیم‏های صنعتی تا حدود 7/1 تا 2 بیلیون دلار بود (1). پکتیناز‏ها به 2 دسته اسیدی و قلیایی تقسیم می‏شوند (2). قارچ‏ها و مخمرها به طور گسترده پکتیناز‏های اسیدی تولید می‏کنند در حالی‏که پکتینازهای قلیایی از باکتری‏ها تولید می‏شوند. با گسترش استفاده از پکتیناز دانشمندان درصدد بهینه کردن تولید این آنزیم برآمدند (3). موارد متعددی از بهینه‏سازی این آنزیم از میکروارگانیسم‏ها توسط پژوهشگران انجام شده است. بهینه‏سازی آنزیم پکتیناز بیشتر در شرایط مختلف محیط کشت، دمایی و منابع مختلف کربن انجام می‏شود. جداسازی آنزیم پکتیناز از قارچ‏ها و باکتری‏ها بیشتر با روش رسوب‏دادن و فیلتراسیون انجام می‏شود. امروزه برای اندازه‏گیری مقدار و فعالیت آنزیم از معرف‏ها استفاده می‏شود و با تغییرات در شرایط فیزیکی و شیمیایی کشت قارچ بهترین امکان را برای تولید زیاد آن فراهم می‏کنند. آسپرژیلوس[1] از مهم‏ترین قارچ‏های تولید‏کننده پکتیناز است‏ که از خاک و میوه‏های در حال پوسیدن جداسازی می‏‏شود. تاکنون منابع مختلف کربنی از جمله سبوس گندم، گلوکز، میوه‏ها و گیاهان پکتین‏دار، تفاله نیشکر، چغندر قند، سبوس برنج و غیره برای بهینه‏سازی این آنزیم گزارش شده است. ولی تاکنون هیچ گزارشی در مورد آب پنیر و استویا انجام نشده است. در این آزمایش تولید پکتیناز در حضور 3 منبع کربن، اسیدیته، دما و نمک‏های سولفات آمونیوم و سولفات منگنز بررسی شد (4).

 

‏‏مواد و روش‏ها.

.جداسازی نمونه‏های قارچی از میوه‏ و سبزیجات پوسیده: یک سری میوه‏‏ شامل: سیب و پرتقال پوسیده از مناطق اصفهان و جنوب کشور (از زمین‏های کشاورزی و سوپر میوه) جمع‏آوری شد. سپس، رقیق‏سازی نمونه‏ها در محیط حاوی PBS انجام شد. رقت‏های مختلف 5، 10، 20 و 30 میلی‏لیتری از محلول PBS روی محیط کشت دکستروز آگار سیب زمینی رشد داده شد.

به منظور جداسازی سویه‏های تولید‏کننده آنزیم پکتیناز از سایر سویه‏ها از یک محیط اختصاصی استفاده شد. از محیط کشت جامد پکتین‏دار (پکتین 10 گرم، فسفات پتاسیم 1 گرم، سدیم نیترات 2 گرم، پتاسیم کلراید 5/0 گرم، منزیم سولفات 7 آبه 5/0 گرم، سولفات آهن 7 آبه 01/0 گرم، آگار 20 گرم، پپتون 3 گرم، سولفات آمونیوم 2 گرم، سولفات منگنز 01/0 گرم، قند 3 گرم، عصاره مخمر 2 گرم، سولفات مس 5 آبه 001/0 گرم، اسیدیته (6- 7) استفاده شد.

محیط کشت در دمای 110 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه در اتوکلاو استریل شد. تلقیح نمونه‏ها در محیط کشت و انکوباسیون در 30 درجه سانتی‏گراد برای 5 روز انجام شد. پس از 7 روز انکوباسیون پلیت‏ها با رنگ لگول (پتاسیم یدید یدین) به منظور شناسایی سویه‏های تولید‏کننده آنزیم پکتیناز رنگ‏آمیزی شد. اگر هاله بنفش تیره اطراف کلونی مشاهده شود نشان‏دهنده وجود آنزیم پکتیناز در این سویه‏هاست‏.

ریخت‏شناسی قارچ‏های تولید‏‏کننده آنزیم پکتیناز: با توجه به ویژگی‏های ریخت‏شناسی، قارچ‏ها را می‏توان براساس شکل، حضور یا غیاب اسپورهای جنسی، ترتیب کنیدی‏ها، ساختار‏های تناسلی و تولید مثلی و ویژگی‏های هیفی شناسایی کرد. برای ریخت‏شناسی گونه‏های قارچی از محیط کشت‏های اختصاصی MEA[2] و CYA[3] به همراه کلید شناسایی پیت و هاکینگ [4] (رنگ‏آمیزی سویه و مشاهده آن زیر میکروسکوپ) استفاده شد (5).

.شناسایی مولکولی سویه‏ها با استفاده از توالی
ITS rDNA: در این روش ابتدا DNA قارچ مورد نظر با استفاده از کیت خریداری شده از شرکت سیناژن استخراج شد. پرایمر‏های مربوط به ناحیه rDNA ITSقارچ‏ها که به طور گسترده برای شناسایی و طبقه‏بندی یوکاریوت‏ها استفاده می‏شود در این پژوهش استفاده شد. ITS1 به عنوان پرایمر رفت با توالی
5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'وITS4 به عنوان پرایمر برگشت با توالی
 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' از شرکت امینسان تهیه شد. قسمت ژن مربوطه PCR و سپس الکتروفورز شد و در صورت مثبت بودن و عدم آلودگی DNA قارچ، قطعه مورد نظر تعیین توالی شده و سپس، نتیجه حاصل در سایت NCBI، BLASTشد.

بررسی میزان رشد و شمارش میکروارگانیسم‏ها: برای بررسی میزان رشد میکروارگانیسم‏ها در حین فرآیند تولید آنزیم از روش‏های اسپکتروفتومتری و همچنین، اندازه‏گیری قطر کلونی میکروارگانیسم‏های قارچی استفاده شد تا دوره زمانی که قارچ‏ها بالاترین میزان رشد را دارند، شناسایی شود (6).

به منظور این‏که میزان آنزیم پکتیناز از سویه‏های مختلف از یک حجم توده‏ای یکسانی از قارچ استفاده شود، از لام نئوبار برای شمارش اسپورهای تلقیحی استفاده شد. تعداد اسپور‏هایی که برای تلقیح بعد از 5 روز به کار برده شد به طور تقریبی حدود138 اسپور بر میلی‏لیتر در نظر گرفته شد.

.عامل‏های به کار برده شده برای بهینه‏سازی تولید آنزیم: عامل‏های مورد نظر در این پژوهش دما (5 و 60)، اسیدیته (3 و 9)، منبع کربنی  گلوکز (جدول 1)، استویا (جدول2) و آب پنیر (جدول 3)، سولفات آمونیوم (5/0 و 5) گرم بر لیتر و سولفات منگنز (1 و 5) گرم بر لیتر بود که اثر منفرد و متقابل آن‏‏ها بر تولید آنزیم پکتیناز از میکروارگانیسم بررسی شد.

استخراج آنزیم پکتیناز: برای استخراج آنزیم از سویه‏های قارچی تولید کننده محیط کشت مایع تهیه شد. محیط کشت مایع پکتین‏دار برای استخراج آنزیم حاوی (پکتین 10 گرم، فسفات پتاسیم 1 گرم، سدیم نیترات 2 گرم، پتاسیم کلراید 5/0 گرم، منزیم سولفات 7 آبه 5/0 گرم، سولفات آهن 7 آبه 01/0 گرم، آگار 20 گرم، سولفات آمونیوم 2 گرم، سولفات منگنز 01/0 گرم، سولفات مس 5 آبه 001/0 گرم، عصاره مخمر 1/0 گرم، پپتون 2/0 گرم و قند 1 گرم در 100 میلی‏‏لیتر) است‏ (7). پس از 7 روز انکوباسیون نمونه‏ها در محیط کشت مایع 22 میلی‏‏لیتر بافر فسفات 1/0 مولار با اسیدیته 5/6 به محیط کشت اضافه شده برای 30 دقیقه در 19 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm 140 برای شیکر چرخان قرار داده شد. مخلوط را از طریق کاغذ صافی واتمن فیلتر کرده محلول به دست امده در دور g 8000 در 4 درجه سانتی گراد برای 15 دقیقه سانتریفیوژ شد (7).

فعالیت آنزیم پکتیناز با روش کلوریمتریک میلر [5] اندازه‏گیری شد. در این روش 5/0 میلی‏‏لیتر از سوپرناتانت سلول‏های آزاد در 5/0 میلی‏‏لیتر پکتین به همراه بافر استات 1/0 مولار با اسیدیته 6 مخلوط و در شرایط ثابت برای 10 دقیقه در 40 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. سپس، 1 میلی‏لیتر از معرف دی‏نیتروسالیسیلیک اسید (DNSA)به مخلوط اضافه و برای 5 دقیقه در 90 درجه سانتی گراد جوشانده شد. واکنش با اضافه کردن 1 میلی‏لیتر نمک راچل [6] متوقف شد. سپس، جذب با دستگاه اسپکتروفتومتری در طول موج 540 اندازه‏گیری شد. هر واحد فعالیت پکتیناز به عنوان مقدار آنزیمی که 1 ماکرومول گلوکز را در هر دقیقه آزاد می‏کند تعیین می‏‏شود (8).

.الکتروفورز سدیم دو دسیل سولفات (SDS- PAGE): خلوص و وزن مولکولی آنزیم با روشSDS-PAGE 12 درصد تعیین شد. رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلو
R-250 برای ظاهر شدن باندها انجام شد.

طراحی آزمایش و تجزیه و تحلیل آماری: تجزیه و تحلیل آماری با نرم افزار مینی‏تب [7] و روش طراحی آزمایش انجام شد. روش طراحی آزمایش یکی از روش‏های بهبود کیفیت است که در دهه‏های 1980 و 1990 به عنوان یک مزیت رقابتی در کشور‏های غربی و ژاپن مطرح شد. استفاده صحیح از روش‏های طراحی آزمایش‏های آماری می‏تواند باعث سهولت در انجام مراحل کار، تولید محصولات جدید و بهبود محصولات موجود ‏شود. در این آزمایش با استفاده از روش و روش عامل‏یل در نرم‏افزار مینی‏تب یک سری آزمایش طراحی شد (9). در ابتدا با استفاده از طراحی آزمایش عامل‏یل کسری 8 آزمایش طراحی شد تا عامل‏های مؤثر شناسایی شوند سپس، با به کار‏گیری عامل‏‏های مؤثر طراحی آزمایش عامل‏یل کامل انجام شد (جدول 1).

جدول 1- آزمایش‏های مربوط به منبع کربنی گلوکز

ردیف

دما

اسیدیته

گلوکز

 (گرم بر لیتر)

سولفات منگنز (گرم بر لیتر)

1

60

9

15

5

2

5

9

15

1

3

5

3

5

1

4

5

9

5

5

5

60

9

5

5

6

60

9

15

1

7

60

3

15

5

8

5

9

5

1

9

60

3

5

1

10

60

3

15

1

11

5

3

15

1

12

5

3

5

5

13

32

6

10

3

14

60

9

5

1

15

5

3

15

5

16

5

9

15

5

 

جدول 3- آزمایش‏های مربوط به منبع کربنی آب پنیر

ردیف

دما

اسیدیته

آب پنیر

 (گرم بر لیتر)

سولفات آمونیوم (گرم بر لیتر)

1

60

3

15

5/0

2

32

6

10

275/0

3

60

3

5

5/0

4

5

9

5

5

5

5

9

15

5/0

6

60

9

5

5

7

5

9

5

5/0

8

5

3

5

5

9

60

9

15

5

10

5

3

15

5/0

11

5

3

5

5/0

12

60

3

5

5

13

5

3

15

5

14

5

9

15

5

15

60

9

5

5/0

16

60

3

15

5

17

60

9

15

5/0

 

جدول 2- آزمایش‏های طراحی شده با روش طراحی عامل‏یل کامل مربوط به منبع کربنی استویا

ردیف

دما

اسیدیته

استویا

 (گرم بر لیتر)

سولفات آمونیوم

 (گرم بر لیتر)

سولفات منگنز

 (گرم بر لیتر)

1

60

3

15

5

5

2

60

3

5

5/0

5

3

5

9

5

5/0

5

4

60

9

5

5/0

5

5

5

3

5

5

5

6

60

9

15

5/0

1

7

5

3

5

5/0

5

8

60

9

15

5

5

9

60

9

15

5

1

10

60

3

5

5/0

1

11

5

9

5

5

5

12

5

3

5

5/0

1

13

60

9

5

5

5

14

5

9

15

5

5

15

5

3

15

5

1

16

60

3

15

5/0

1

17

5

3

5

5

1

18

5

3

15

5

5

19

5

9

5

5

1

20

32

6

10

275/0

3

21

5

9

15

5/0

1

22

5

9

15

5/0

5

23

5

3

15

5/0

5

24

60

3

15

5

1

25

60

3

5

5

5

26

5

9

15

5

1

27

60

9

5

5/0

1

28

60

9

5

5

1

29

5

9

5

5/0

1

30

60

3

5

5

1

31

5

3

15

5/0

1

32

60

9

15

5/0

5

33

60

3

15

5/0

5

 

 

نتایج.

. رشد میکروارگانیسم‏های قارچی در فرآیند تولید آنزیم: قارچ‏های تولید کننده آنزیم پکتیناز با رنگ‏آمیزی لگول از بین سویه‏های مختلف با دیدن هاله بنفش رنگ جداسازی شد. با بررسی رشد و میزان تولید آنزیم پکتیناز در سویه‏های انتخابی، سویه‏ای که بالاترین میزان رشد و تولید آنزیم را داشت برای بهینه‏سازی تولید آنزیم انتخاب شد. سویه‏ای که در این آزمایش بهترین عملکرد را نشان داد توسط کلید شناسایی پیت و هاکینگ به عنوان آسپرژیلوس فومیگاتوس (AF293) مشخص شد. این سویه دارای رنگ کلونی فیروزه‏ای تیره، کلونی کرکی و میسلیوم دارای دیواره عرضی و کونیدیفور بر روی کونیدیوفور، وزیکول کشیده و تقرییا گرد است. روی وزیکول استریگمای یک ردیفی قرار دارد و بر روی استریگما کونیدی قرار دارد. نتایج نشان داد که با افزایش زمان اندازه و  قطر کلونی افزایش می‏یابد. به‏طوری‏که بالاترین میزان رشد پس از 7 روز به‏دست آمد و پس از آن رشد ثابت ماند (جدول 4).

 

 

 

شکل 1- ریخت‏شناسی ظاهری و میکروسکوپی قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس

 

 

شکل 2- نمودار رشدی قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس در یک دوره زمانی 7 روزه

 

جدول 4- اندازه‏گیری قطر کلونی و جذب نوری رشد قارچ‏ها در دوره زمانی 6 روزه

روز ششم

روز پنجم

روز چهارم

روز سوم

روز دوم

روز اول

میکروارگانیسم

سکون

مرحله سکون

مرحله زایشی و اسپوردهی

5/4

5/3

2

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 1

. . . . . .

542/2

102/2

486/1

347/1

895/0

جذب نوری

5/4

5/3

2/3

5/2

1

4/0

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 2

422/2

283/2

996/1

752/1

550/1

252/1

جذب نوری

5/4

5/3

5/2

5/1

1

2/0

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 3

580/2

412/2

709/1

585/1

352/1

700/0

جذب نوری

3

2

5/1

1

5/0

1/0

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 4

301/2

749/1

259/1

014/1

783/0

726/0

جذب نوری

سکون

5/3

9/2

5/2

2

5/1

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 5

. . . . . .

983/1

548/1

343/1

289/1

924/0

جذب نوری

سکون

3

5/2

8/1

2/1

8/0

قطر کلونی

 (سانتی‏متر)

سویه 6

. . . . . . .

145/2

687/1

158/1

822/0

306/0

جذب نوری

سکون

5/4

5/3

2

1

بدون رشد

قطر کلونی

(سانتی‏متر)

سویه 7

. . . . . . . .

523/2

149/2

373/1

139/1

285/0

جذب نوری

 

 

 

جدول 5- میزان تولید آنزیم پکتیناز (میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) توسط قارچ‏های جداسازی شده

ʎ=540

میکروارگانیسم

358/0

سویه 1

414/0

سویه 2

567/0

سویه 3

357/0

سویه 4

447/0

سویه 5

230/0

سویه 6

249/0

سویه 7


همان‏طور که در جداول مشاهده شد قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس [8] (سویه 3) دارای بالاترین میزان رشد و تولید آنزیم پکتیناز نسبت به بقیه سویه‏ها بود (جدول 5، شکل 1). همچنین، مشاهده شد که با شروع فرآیند تولید آنزیم، میزان کدورت محیط نیز افزایش یافته و همزمان با تولیدات پروتئینی و آنزیمی در محیط، رشد میکروارگانیسم نیز وجود دارد. این افزایش کدورت تا پایان دوره تولید آنزیم به شکل صعودی ادامه پیدا می‏کند(شکل 2). نمودارهای مربوط به آزمایش‏های عامل‏یل کسری انجام شده بر روی قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس در 3 منبع کربنی مختلف گلوکز، آب پنیر و استویا در زیر نشان داده شده است (شکل‏های 3، 4 و 5).

 

 

شکل 3- توزیع احتمال نیمه نرمال عامل‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با منبع کربنی استویا نوع اثر: بی اثر (دایره مشکی)، مؤثر (مربع قرمز)

عامل‏ها: دما (A)، اسیدیته (B)، آب پنیر (C)، سولفات آمونیوم (D) و سولفات منگنز (E)

 

شکل 4- تأثیر عامل‏‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با روش عامل‏یل کسری با منبع کربنی استویا

نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

شکل 5- تأثیر عامل‏‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با روش عامل‏یل کسری با منبع کربنی گلوکز

نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

شکل 6-توزیع احتمال نیمه نرمال عامل‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با منبع کربنی گلوکز

نوع اثر: بی اثر (دایره مشکی)، مؤثر (مربع قرمز)

عامل‏ها: دما (A)،اسیدیته (B)،آب پنیر (C)،سولفاتآمونیوم(D)وسولفاتمنگنز(E)

 

 

شکل 7- تأثیر عامل‏‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با روش عامل‏یل کسری با منبع کربنی آب پنیر

نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

 

شکل 8- توزیع احتمال نیمه نرمال عامل‏های مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز با منبع کربنی آب پنیر

نوع اثر: بی اثر (دایره مشکی)، مؤثر (مربع قرمز) عامل‏ها: دما (A)،اسیدیته (B)،آب پنیر (C)،سولفاتآمونیوم(D)،سولفاتمنگنز(E)

 

همان‏طور که بیان شد، در این آزمایش، از 3 منبع کربن مختلف برای بررسی تولید آنزیم پکتیناز در کنار 4 عامل‏ دیگر که بهینه‏سازی آنها مد نظر است، استفاده شد. در آزمایشی که با منبع کربنی استویا انجام شد عامل‏هایی که با انجام طراحی آزمایش عامل‏یل کسری مؤثر معرفی شد (شکل 3 و 4)، شامل: دما، ‏اسیدیته، غلظت استویا، غلظت سولفات آمونیوم و سولفات منگنز بود. همچنین، اثر متقابل بین غلظت استویا- ‏اسیدیته و غلظت MNSO4-pH نیز نشان داده شد. با انجام آزمایش عامل‏یل کامل برای این 5 عامل‏ مؤثر نتایج به دست آمده نشان داد (شکل 3 و 4) که نقطه مرکزی مقدار‏های استفاده شده برای عامل‏‏های مورد نظر بالاترین میزان تولید آنزیم (876/0 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر) را از خود نشان داد. همچنین، در این آزمایش مشاهده شد که قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس در دمای 60 درجه، اسیدیته 3، غلظت 15 گرم بر لیتر استویا، 5 گرم بر لیتر سولفات آمونیوم و غلظت 5 گرم بر لیتر سولفات منگنز نیز توانایی تولید آنزیم را به طور قابل توجهی دارد. آزمایش‏های عامل‏یل کسری که با منبع گلوکز برای آسپرژیلوس فومیگاتوس انجام شد (شکل 5 و 6) 4 عامل‏ دما، ‏اسیدیته، غلظت گلوکز و غلظت سولفات منگنز را مؤثر معرفی کرد. برهمکنش متقابل بین غلظت گلوکز-pHو pH- MNSO4 را نیز نشان داد. با طراحی آزمایش عامل‏یل کامل برای این 4 عامل‏ مؤثر نتایجی که بدست آمد نشان دهنده تولید بالای آنزیم پکتیناز (328/1 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر) در نقطه مرکزی عامل‏های به کار رفته بود . همچنین، این قارچ با استفاده از گلوکز با غلظت 15 گرم بر لیتر، دمای 60 درجه، اسیدیته 3 و غلظت 5 گرم بر لیتر سولفات منگنز نیز رشد مناسب و تولید و فعالیت خوبی از آنزیم پکتیناز را از خود نشان داد. در مورد منبع کربنی آب پنیر نیز 4 عامل‏ دما، ‏اسیدیته، غلظت آب پنیر و غلظت سولفات آمونیوم مؤثر معرفی شد؛ که با انجام طراحی آزمایش عامل‏یل کامل با این 4 عامل‏ مؤثر نتایجی که بدست آمد نشان دهنده بالاترین میزان تولید آنزیم (892/0 میلی‏‏گرم بر میلی‏‏لیتر) در شرایط میانی مقدار مورد استفاده برای عامل‏های مورد نظر بود (شکل 7 ، 8، 9 و 10). تأثیر عوامل مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز به شکل جداگانه درشکل 11 تا 14 نشان داده شد.یک نکته مهمی که در این آزمایش بدست آمد رشد قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس در دمای 60 درجه، ‏اسیدیته 3، غلظت 15 گرم بر لیتر آب پنیر، 5/0 گرم بر لیتر سولفات آمونیوم بود که آنزیم پکتیناز با این شرایط نیز فعالیت قابل توجهی از خود نشان داد.

شناسایی مولکولی سویه‏ها از طریق توالی ITS rDNA: سویه مورد نظر به شکل مولکولی و از طریق توالی ITSrDNA و پرایمر‏های ITS1,4 توالی‏یابی شد. توالی‏ به دست آمده از پایگاه داده NCBI با توالی‏های مشابه بلاست شد. سویه مورد نظر حدود 100 درصد شباهت را با آسپرژیلوس فومیگاتوس سویه F207 نشان داد.

الکتروفورز سدیم دو دسیل سولفات: آنزیم پکتینازی که در این پژوهش از آسپرژیلوس فومیگاتوس استخراج شد طبق نتایج الکتروفورز سدیم دودسیل سولفات دارای وزن مولکولی 40 کیلودالتون بود که در شکل 15 مشاهده می‏‏شود.

 

 

 

شکل 9- تأثیر عوامل مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز به شکل جداگانه در آزمایش عامل‏یل کامل برای 4 عامل مؤثر در حضور منبع کربن آب پنیر 24=16 آزمایش نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

 

شکل 10- منحنی 3 بعدی سطحی تولید آنزیم در حضور منبع کربنی آب پنیر

 

 

شکل 11- تأثیر عوامل مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز به صورت جداگانه در آزمایش عامل‏یل کامل برای 4 عامل مؤثر در حضور منبع کربن گلوکز 24=16 آزمایش نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

شکل 12- منحنی 3 بعدی سطحی تولید آنزیم در حضور منبع کربنی گلوکز

 

 

شکل 13- تأثیر عوامل مؤثر بر تولید آنزیم پکتیناز به صورت جداگانه در آزمایش عامل‏یل کامل برای 5 عامل مؤثر در حضور منبع کربن استویا 25=32 آزمایش نقطه بالایی و پایینی (دایره مشکی) نقطه مرکزی (مربع قرمز)

 

 

شکل 14- منحنی 3 بعدی سطحی تولید آنزیم در حضور منبع کربنی استویا

 

شکل 15- باند‏های به دست آمده از آنزیم پکتیناز بر روی ژل
SDS-PAGE (باند A مارکر)، (باند B و C انزیم پکتیناز حاصل از آسپرژیلوس فومیگاتوس)

. بحث و نتیجه‏‏گیری

نتایج این پژوهش نشان داد که گلوکز بهترین منبع برای قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس برای تولید آنزیم پکتیناز است. علت این بهتر بودن را می‏توان در دسترس بودن آسانتر و جذب راحتر گلوکز برای قارچ نسبت به 2 منبع کربنی دیگر دانست؛ که این باعث رشد سریع‏تر و بیشتر قارچ می‏‏شود. همچنین، با توجه به نتایجی که در بالا یاد‏ شد می‏توان نتیجه گرفت این قارچ در دمای 60 درجه و ‏اسیدیته 3 در حضور هر 3 منبع کربن قابلیت رشد و تولید آنزیم را دارد. از آنجا که این شرایط در صنعت آبمیوه‏سازی مناسب است می‏توان گفت قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس گزینه‏ای مناسب برای تولید آنزیم پکتیناز برای این صنایع است. همچنین، سویه آسپرژیلوس فومیگاتوس قادر به تولید مقادیر متفاوتی از آنزیم در حضور منابع مختلف کربن و رنج وسیع ‏اسیدیته (3 تا 9) و دما (5 تا 60 درجه سانتی‏گراد) است. نتایج مشابهی نیز توسط پژوهشگران گزارش شده است که این سویه توانایی تولید آنزیم پکتیناز در حضور منابع کربن (سبوس گندم، پکتین، گلوکز، میوه‏های سیب، پرتقال و غیره) و ‏اسیدیته پایین را دارد (10). ولی تاکنون هیچ گزارشی از تولید آنزیم پکتیناز توسط این سویه در حضور منبع کربنی آب پنیر و استویا در ‏اسیدیته‏‏های بالا ارایه نشده است. آب پنیر یک سوبسترای ارزان قیمت و یک منبع کربنی و نیتروژنی غنی برای رشد میکروارگانیسم‏ها و تولید آنزیم است‏. بر اساس مطالعاتی که برای تولید آنزیم پکتیناز انجام شد این آنزیم از آنجا که در مرحله ساکن رشد میکروارگانیسم تولید می‏‏شود، استفاده از یک منبع قندی ساده برای رشد توده‏ای میکروارگانیسم مناسب است‏. منبع کربنی آب پنیرکه در این پژوهش استفاده شد علاوه بر اینکه با داشتن منبع قندی لاکتوز برای رشد میکروارگانیسم مناسب است برای تیمار ضایعات آب پنیر حاصل از کارخانجات پنیر‏سازی نیز مفید است‏. با مقایسه بین 3 منبع کربنی مختلف، منبع کربنی گلوکز بالاترین میزان تولید آنزیم را نشان داد که این نشان دهنده استفاده آسان و راحت‏تر قارچ از این منبع کربنی برای رشد بهتر و سریع‏تر خود و در نتیجه تولید بیشتر آنزیم در مرحله سکون از رشد از توده میسیلیومی است‏. به علت اینکه ابتدا قارچ از یک منبع کربنی غیر از پکتین برای رشد خود بهره می‏گیرد سپس، با اتمام آن منبع، قارچ به سراغ منبع کربنی پکتین خواهد رفت که لازمه استفاده از آن تولید آنزیم پکتیناز خواهد بود. مجد [ix] در سال 1387 از آسپرژیلوس اوریزه برای بهینه‏سازی تولید آنزیم پکتیناز استفاده کرد. وی در این روش از 6 عامل مانند دور شیکر، نوع منبع کربن، درصد کلسیم کلراید، درصد منبع کربن و نیتروژن و ‏اسیدیته محیط کشت استفاده کرد. بهترین شرایط بهینه برای تولید آنزیم دور همزن 150، منبع کربن پکتین مرکبات و سبوس گندم، کلسیم کلراید 2/0 درصد، منبع کربن حدود 6 درصد و ‏اسیدیته حدود 5/4 به دست آمد. (11). اوکافور [x] در سال 2010، 5 قارچ رشته‏ای به نام‏های آسپرژیلوس کلاواتوس [xi]، آسپرژیلوس نایجر [xii]، فوزاریوم [xiii]، پنی سیلیوم کریزوژنوم [xiv]و تریکودرما [xv] را از نمونه‏های مواد زاید کشاورزی جداسازی کرد و با کشت دادن آن‏ها بر روی محیط کشت پایه حاوی پکتین بهترین فعالیت تجزیه پکتین را در سویه آسپرژیلوس نایجر و پنی‏سیلیوم کریزوژنوم مشاهده کرد. زیرا مناطق شفاف بزرگتری اطراف این دو قارچ دیده شد. بهترین منبع کربن برای آن‏ها پوست گندم بود و تخمیر در حالت جامد نسبت به تخمیر در حالت غوطه‏ور برای هر دو قارچ سطح بالاتری از آنزیم پکتیناز را تولید را نشان داد (12).

پلاکشمینارا سیمها [xvi] در سال 2012 با جداسازی و غربال‏گری قارچ‏های تولید کننده آنزیم پکتیناز از خاک‏های کشاورزی و غیر‏کشاورزی مختلف، 44 سویه قارچی را جداسازی کرد و کشت داد. وی با استفاده از روش رنگ آمیزی رتینیوم قرمز مشاهده کرد که 4 سویه آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، آسپرژیلوس ژاپونیکوس [xvii]و کیتومیوم گلوبوسوم [xviii] آنزیم تجزیه‏کننده پکتین بیشتری تولید می‏کنند. وی آن‏ها را در دما و ‏اسیدیته‏های مختلف برای تولید پکتیناز آزمایش کرد دمای بهینه حدود 30 درجه سانتی‏گراد و ‏اسیدیته بهینه حدود 8/6 بود (3).

 موهد [xix] در سال 2012 قارچ‏های تولیدکننده پکتیناز را از محیط‏های مختلف خاک و میوه‏های پوسیده جدا‏سازی و در محیط کشت آگار پکتین‏دار تغییر شکل یافته، رشد داد. سویه‏های به دست آمده شامل موکور، آسپرژیلوس، پنی سیلیوم، ریزوپوس و تریکودرما بود که از بین این‏ها ریزوموکور پاسیلوس با استفاده از پکتین 5/1 درصد به عنوان منبع کربن، اوره به عنوان منبع نیتروژن و منگنز سولفات در دمای 45 درجه سانتی‏گراد بیش‏ترین فعالیت را برای تولید پلی‏گالاکتوروناز نشان دادند. استخراج آنزیم خام با فیلتراسیون و سانتریفیوژ و خالص‏سازی آن با کروماتوگرافی انجام شد. اسیدیته مناسب برای خالص‏سازی پلی‏گالاکتوروناز از این قارچ حدود 5 و بهترین دما برای آن 55 درجه سانتی‏گراد‏ به دست آمد (13).

در این پژوهش، منبع کربنی گلوکز هما‏ن‏طور که در گزارشات قبلی نیز یاد‏ شده بود، منبع مناسبی برای تولید بالای آنزیم پکتیناز معرفی شد. علاوه بر گلوکز قارچ آسپرژیلوس فومیگاتوس توانایی تولید آنزیم پکتیناز در حضور منبع کربنی استویا و آب پنیر را نیز به خوبی نشان داد. فعالیت‏های آنزیماتیکی بین 153 تا 480 IU/g در تخمیر حالت جامد توسط سویه‏های آسپرژیلوسی که از پوسته گندم یا سویا به عنوان منبع کربن استفاده کرده است به دست آمده است (14). در حالی که فعالیت‏هایی از 162 تا 500 IU/g توسط چندین سویه میکروبی در تخمیر حالت غوطه‏ور بدست آمده است. با منابع کربنی و القا کننده مختلف (گلوکز، پکتین، گوشت میوه سیب، پکتین لیمو یا سلولز و پوسته گندم به همراه پکتین لیمو) با استفاده از استراتژی‏های ژنتیکی یا بهینه کردن شرایط محیط کشت و ویژگی‏‏های فیزیکی شیمیایی فعالیت‏های بالایی بدست آمده است. همچنین، مالوسی [xx] در پژوهشی به وضوح به تأثیر مثبت پکتین مرکبات بر افزایش تولید آنزیم اندو پلی‏گالاکتوروناز در قارچ آسپرژیلوس اوریزه [xxi] در کشت غوطه ور اشاره کرد (15). بلالی [xxii] نیز توانست از پکتین مرکبات به عنوان تنها منبع کربن برای القای ترشح آنزیم پکتیناز خارج سلولی برای قارچ‏های آسپرژیلوس نایجر و آسپرژیلوس فلاووس [xxiii] استفاده کند (16). یامان [xxiv] توانست با استفاده از پوست و ضایعات پرتقال به تولید بالایی از پکتیناز از آسپرژیلوس اوریزه در محیط کشت غوطه‏ور برسد (17). بر اساس نتایج این پژوهش، نمک‏های سولفات منگنز و سولفات آمونیوم از عوامل مؤثر بر تولید آنزیم معرفی شدند. در گزارش‏های مشابهی نیز پژوهشگران نشان دادند که برخی از یون‏ها مانند منیزیم، جیوه و روی فعالیت آنزیم پکتیناز را به علت بلوکه کردن گروه‏های تیول که در جایگاه فعال آنزیم قرار دارند کاهش می‏دهند (18). در حالی که یون‏هایی مانند منگنز فعالیت پلی گالاکتوروناز را افزایش می‏دهند (19). در مورد نمک آمونیوم سولفات و اثر آن روی فعالیت آنزیمی، مطالعات نشان داده که نمک‏های سولفات و فسفات در غلظت‏های مناسب باعث افزایش تولید آنزیمی از میکروارگانیسم‏ها می‏‏شود (20).

تشکر و قدردانی

از حمایت‏های دانشکده علوم و فناوری نوین دانشگاه اصفهان و کمیته فرآورده‏های طبیعی تشکر و قدردانی می‏شود.

 



[1]- Aspergillus

[2]- Malt Yeast Agar

[3]- Czapek Yeast Extract Agar

[4]- Pitt and Hocking

[5]- Miller

[6]- Rochell

[7]- Minitab Software

[8]- Aspergillus fumigatus

[ix]- Majd

[x]- Okafor

[xi]- Aspergillus clavatus

[xii]- Aspergillus niger

[xiii]- Fusarium

[xiv]- Penicilium chrysogenum

[xv]- Tricoderma

[xvi]- plakshminarasimha

[xvii]- Aspergillus japanicum

[xviii]- Kitomicum glubosum

[xix]- Mohd

[xx]- Malvessi

[xxi]- Aspergillus oryzae

[xxii]- Balali

[xxiii]- Aspergillus flavus

[xxiv]- Yamane

 

(1)               Akhter Asifsiddiqui M., Pande V., Arif M. Production,purification,and characterization of polygalacturonase from rhizomucor pusillus isolated from decomposting orange peels. Hindawi Publishing Corporation Enzyme Research 2012; 8 (4): 234- 41.

(2)               Banu A., Kalpana M., Gnanaprabhal RG., Pradeep VB., Palaniswamy M. Production and characterization of pectinase enzyme from penicillium chrysogenum. Indian Journal of Scienceand Technology 2012; 3 (4): 377- 81.

(3)               Plakshminarasimha SS., Kurokawa J., Suryani Kimura T., Ohmiya K and Sakka K. A novel thermophilic pectate lyase containing two catalytic modules of Clostridium stercorarium. Bioscience. Biotechnol. Biochemistry 2012; 69 (3): 2138- 45.

(4)               Jacob N and Prema P. Influence of mode of fermentation on production of polygalacturonase by a novel strain of Streptomyces lydicus. Food Technol. Biotechnol 2006; 44 (8): 263- 7.

(5)               Pitt DM., Madarev SZ., Radulovic LM and Skrinjar M. Production of exo-pectinase by Penicillium roqueorti using pumpkin oil cake. Nature. Science 2007; 113 (5): 313- 20.

(6)               Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227 (7): 680- 5.

(7)               Lineweaver H and Burk D. The determination of enzyme dissociation constants. Journal. American. Chemical. Social 1934; 56 (6): 658- 66.

(8)               Miller GL. Use of Dinitrosalicylic acid for determination of reducing sugar. Anallysis. Chemical 1959; 31 (7): 426- 8.

(9)               Joshi VK., Parmar M., Rana N. Purification and characterization of pectinase produced from apple pomace and evaluation of its efficacy in fruit juice extraction and clarification. Indian Journal of Natural Products and Resources 2011; 2 (9): 189- 97.

(10)           Martiny N., Souza SR., Silva R and Gomes E. Pectinase production by fungal strains in solid state fermentation using agro-industrial bioproduct. Brazilian. Archive. Biology. Technology 2004; 47 (9): 813- 19.

(11)           Majd M., Uddin A., Begum F., sultan T., Azad AK. Production of pectinase by Aspergillus niger cultured in solid state media. International Journal of Biosciences 2011; 1 (6): 33- 42.

(12)           Okafor UA., Okachi VI., Chinedu SN., Ebuehi OAT., Onygemeokerenta BM. Pectinolytic activity of wild-type filamentous fungi fermented on agro-waste. African Journal of Microbiology Research 2014; 4 (7): 2729- 34.

(13)           Mellon JE and Cotty PJ. Expression of pectinase activity among Aspergillus flavus isolates from southwestern and southeastern United States. Mycopathologia 2004; 157 (7): 333- 8.

(14)           Mohd DR., Vohra PK., Chopra S and Tewari R. Applications of pectinases in the commercial sector: A review. Bioresoure. Technology 2012; 77 (5): 215- 27.

(15)           Malvessi E and Silveira MM. Influence of medium composition and pH on the production of polygalacturonases by Aspergillus oryzae. Brazilian Archive Biology Technology 2004; 47 (9): 693- 702.

(16)           Balali A., Bajwa R., Latif Z. Status of aspergillus niger srains for pectinase production potential. Institute of Mycology and Plant Pathology 2009; 21 (7): 77- 82.

(17)           Yaman M., Baumann A., Cruz N., Hours R., Garro O. Partial characterization of enzymatic activities produced by awild strain of A. niger. Journal of Microbiology, Biotecnology and Food Sciences 2013; 2 (3): 917- 32.

(18)            Macedonia R. The apple pulp waste used as a nourishing `base by aspergillus niger. International Conference Process Technology and Environmental Protection 2011; 43 (5): 1529- 34.

(19)            Mrudula S., Anitharaj R. Pectinase production in solid state fermentation by Aspergillus niger using orange peel as substrate. Global Journal of Biotechnology and Biochemistry 2011; 6 (7): 64- 71.

(20)            Wang XJ., Bai JG., Liang XY. Optimization of multienzyme production by two mixed strains in solid state fermentation. International Research Journal of Microbiology 2013; 73 (4): 533- 40.