جداسازی و شناسایی مولکولی باکتری‏ های استرپتومایسس مولد آنزیم کیتیناز و بررسی آثار آنتاگونیستی آن‏ها در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار بیوتکنولوژی میکروبی، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تبریز، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی، دانشگاه زابل، ایران

3 دانشیار بیوتکنولوژی گیاهی، دانشگاه زابل، ایران

چکیده

مقدمه: به منظور کاهش استفاده از قارچ‏کش‏های شیمیایی در کنترل بیماری‏های گیاهی، رویکرد جایگزین کنترل بیماری‏ها به روش کنترل زیستی، مورد توجه قرار گرفته شده است. بیشتر اکتینومیست‏ها، به ویژه گونه‌های Streptomyces، عوامل کنترل زیستی با طیف گسترده در برابر پاتوژن‏های قارچی گیاهان هستند. هدف از انجام این پژوهش، استفاده از اکتینومیست‏های کیتینولایتیک جدا شده از خاک‏های استان آذربایجان‏شرقی برای تولید سموم زیستی است. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: نمونه‏های خاک از مناطق مختلف استان آذربایجان‏شرقی تهیه شد. با توجه به ویژگی‏های ریخت‏شناسی گونه‌های Streptomyces، تک کلونی‏ها جداسازی شد. برای شناسایی مولکولی، ابتدا DNA باکتریایی استخراج و سپس، توالی 16S rDNA آن‏ها تکثیر شد. با استفاده از آغازگرهای جهانی، جدایه‏های دارای ژن کیتیناز غربال‏گری شد. جدایه‏های مولد آنزیم کیتیناز با قارچ‏های پاتوژن جنس آلترناریا کشت آنتاگونیستی داده شد. ‏‏‏

نتایج: از 60 نمونه خاک جمع‏آوری شده، 31 جدایه باکتری استرپتومایسس جداسازی شد. از این تعداد، 4 جدایه به گزینش جدایه‌های مولد آنزیم کیتیناز نتیجه مثبت نشان دادند. کشت آنتاگونیستی، 3 جدایه منتخب باکتری با دو قارچ پاتوژن، نشان داد که جدایه AE09 دارای بیش‏ترین اثر ضد قارچی است. ‏‏‏

بحث و نتیجه گیری: خاک‏های استان آذربایجان‏شرقی واجد باکتری‏های استرپتومایسس مولد ترکیبات ضدقارچی هستند. دست‌یابی به باکتری‌های استرپتومایسس دارای ژن کد کننده کیتیناز می‌تواند به شناسایی سویه‌های بسیار مؤثر برای دفاع ضد قارچی منجر باشد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and molecular identification chitinase-producing Streptomyces strains and examination of their in-vitro antagonistic effects

نویسندگان [English]

  • Alireza Dehnad 1
  • Ebrahim Esmaili 2
  • Mahmood Solouki 3
1 Assistant Professor of Microbial biotechnology, East Azerbaijan Agricultural Education Center, AREEO, Tabriz, Iran
2 M.Sc. of Biotechnology, Zabol University, Iran
3 Associate Professor of Plant Biotechnology, Zabol University, Biocenter, Iran
چکیده [English]

Introduction: The chemical fungicides are used widely in the world. To reduce the application of synthetic fungicides in treating plant diseases, biological methods are considered as an alternative way to control plant diseases. Many actinomycetes, particularly Streptomyces species are biological agents against a broad spectrum of fungal plant pathogens. The purpose of this study was using the kitinolitik actinomycetes isolated from soil of Eastern Azerbaijan province In order to produce biological pesticides.

Materials and methods: Soil samples were taken from different areas of Eastern Azerbaijan province. According to Streptomyces morphological features, single colonies were isolated. To identify the bacteria by molecular characteristic, the genomic DNA was extracted and then the sequences of 16S rDNA were replicated. By using specific primers the bacterial isolates containing chitinase gene were screened. The isolates consisted Chitinase enzyme and were antagonistically cultured with Alternaria genus which is a fungal plant pathogen.

Results: Out of 60 soil collected samples, 31 Streptomyces bacterial isolates were separated. Four isolates showed positive results to selectivity action of the chitinase enzyme. Treatment of 3 bacterial isolates with 2 pathogenic fungi showed that AE09 is the most effective anti-fungal isolates.

Discussion and conclusion: Soils in Eastern Azerbaijan province are rich of Streptomyces bacteria which generate antifungal compounds. Obtaining the Streptomyces bacteria which have chitinase gene, can lead to identification of very effective strains as anti-fungal.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Streptomyces
  • Chitinase gene
  • 16S rDNA
  • Biological control

مقدمه.

اکتینومیست‏ها[1] حدود 40 درصد از جمعیت باکتریایی خاک را تشکیل می‏دهند (1 و 2) و ویژگی‏هایی دارند که آن‏ها را برای عوامل بیوکنترل بر علیه قارچ‏های خاک‏زاد[2] بیمارگر گیاهی مفید می‏سازد این باکتری‏ها توانایی تولید متابولیت‏های ‏ثانویه مانند آنزیم‏ها و آنتی بیوتیک‏ها را دارند و احتمالا دارای آثار ضدقارچی هستند. همچنین، آن‏ها هدایت‏گرهای اصلی بافرهای زیستی خاک‏ها بوده و با تجزیه مواد آلی در تولید محصول نقش دارند (3 و 5). از جمله ویژگی‏های شاخص این باکتری‏ها که آن‏ها را برای کنترل برخی از عوامل خسارت‏زای گیاهی مناسب نموده است، ترشح آنزیم کیتیناز است؛ به گونه‏ای که این باکتری‏ها تجزیه کننده اصلی کیتین[3] و عامل اصلی برگرداندن این ماده سخت به چرخه طبیعت هستند (6). کیتین یک پلی‏ساکارید[4] خطی بدون شاخه غیر محلول است که از واحدهای N استیل گلوکز آمین[5]‌ تشکیل و از طریق پیوند (4→1)β به یکدیگر متصل شده‌است. کیتین ماده اصلی تشکیل دهنده دیواره سلولی قارچی است (7).

گزارش‏های متعددی در ارتباط با اثر آنتاگونیستی اکتینومایست‏های جدا شده از خاک علیه قارچ‏های بیماری‏زای گیاهی منتشر شده است (8 و 9). اثبات شده است که بسیاری از اکتینومیست‏ها، به ویژه گونه‏های استرپتومایسس، عوامل کنترل زیستی وسیع الطیف در برابر پاتوژن‏های قارچی گیاهان هستند (10). فعالیت آنتاگونیستی استرپتومایسس‌ها با قارچ‌های پاتوژن به طور معمول مربوط به تولید ترکیبات ضد‏‌قارچی و آنزیم‌های هیدرولیتیک است. به نظر می‌رسد که کیتیناز تولیدی باکتری‏های استرپتومایسس، آنزیم هیدرولیتیک مهمی در لیز دیواره سلولی قارچی است (11).

کنترل زیستی به عنوان راهکار جایگزین سموم شیمیایی گوناگون برای کنترل بیماری‌های گیاهی توسعه یافته است. بر خلاف عوامل سنتتیک، موادی که به شکل میکروزیستی از گونه‌های مؤثر گرفته شده‌اند سمیت کمتر داشته، به راحتی قابل تجزیه بوده، و آلرژی‌زایی کمی دارند. این مواد در محصولات غذایی انباشته نمی‏شوند و نیز ارزان و مناسب برای مصرف در مقیاس صنعتی هستند. با استفاده از کنترل زیستی، خود میکروارگانیسم‌ها، می‌توانند با تولید آنتی‏بیوتیک و یا آنزیم‌های تجزیه کننده‌ به طور مستقیم بر علیه بیماری‌های گیاهی گوناگون به کار روند (12 و 13). برای مثال، بر اساس رتبه‏بندی اداره کل مطالعات و بررسی‏های اقتصادی و اطلاعات برگرفته شده از اداره آمار و فن‏آوری سازمان جهاد کشاورزی، در سال زراعی 89- 90، استان آذربایجان‏شرقی رتبه ششم تولید سیب‏زمینی در کشور را دارد. همچنین، با توجه به گستردگی سطح زیر کشت سیب‏زمینی در سایر استان‏ها و وابسته بودن بشر از لحاظ تامین کربوهیدرات‏ها به این محصول، گسترش راهکارهایی برای مبارزه غیر شیمیایی با بیماری‏هایی که متوجه سیب زمینی و سایر گیاهان خانواده سولاناسه مانند گوجه فرنگی است‏، ضروری به نظر می‏رسد. هدف از این بررسی، جداسازی و شناسایی گونه‏هایی از باکتری استرپتومایسس در خاک‏های استان آذربایجان شرقی است که برای کاهش عوارض ناشی از استفاده از کود و سموم شیمایی با تولید آنزیم کیتیناز قابلیت بیوکنترلی داشته باشند(30).

 

مواد و روش‏ها

در این پژوهش وسایل، مواد شیمیایی، بافرها و محیط‏های ‏کشت به شرح ارایه شده در جدول 1 استفاده شدند.

جدول 1- فهرست مواد شیمیایی، وسایل، دستگاه‏ها

مواد شیمیایی

مواد

شرکت سازنده

SDS

سیناژن

Trisbase

سیناژن

Tris-HCl

سیناژن

Primer(F/R)

سیناژن

Mastermix

سیناژن

Ethidiumbromide

سیناژن

آب مقطرDNasefree

سیناژن

EDTA

سیناژن

PVP

سیگما

Glucose

سیگما

Starch

سیگما

CTAB

مرک

DMSO

مرک

HighPurePCRProductPurificationkit

مرک

Isoamylalcohol

مرک

Chloroform

مرک

CaCO3

مرک

FeSO4

مرک

K2HPO4

مرک

KNO3

مرک

MgSO4

مرک

1kbDNALadder

فرمنتاز

Agar

لیوفیلم

Glycerol

باکر

Casein

کیمیا

Agarose

اینویتروژن

Isopropanol

دکتر مجللی

Nystatin

جابر بن حیان

NaCl

ارج

اتانول 96 درصد

جهان الکل طب

آب مقطر

کسری

ازت مایع

-

وسایل و دستگاه‏ها

نامدستگاه‌ها

شرکت سازنده- کشور

هودلامینار(JLBVI2Ors)

ژال ایران

هودشیمیایی(VWR105)

فرپژوه ایران

ورتکسمیکسر(S0100-230V)

لابنت ایران

بن‌ماری(1092)

فاطر ایران

هیتراستریر(MR3003)

هایدولف آلمان[6]

ترمال سایکلر(M)

بیوسیستم آمریکا

میکرو سانتریفیوژ یخچال‌دار

 (VS-15000CFNII)

ویژن کره[7]

ترازوی دو صفر(GP5202)

سارتریوس آلمان

ترازوی چهار صفر(CP324S)

سارتریوس آلمان[8]

شیکرانکوباتور(3527-6)

سهندیران

انکوباتور رومیزی(B34)

بندر آلمان[9]

ژل ‌داک(BioDocAnalyze)

بیومترا آلمان[10]

اسیدتیه سنج(1.691.0020)

متروم سوییس[11]

اتوکلاو(SX-300E)

تومی ژاپن[12]

الکتروفورز افقی

اختریان

فریزر منفی 80 درجه سانتی‏گراد

ویژن کره

فریزر منفی 20 درجه سانتی‏گراد

فیلور- ایران

یخچال 4 درجه سانتی‏گراد

فیلور- ایران

     

 

در این بررسی نمونه‏های خاک از استان آذربایجان‏شرقی و از عمق 10 تا 20 سانتی‏متری جمع‌آوری شد. نمونه‌ها بر حسب موقعیت مکانی کد‏گزاری و به آزمایشگاه انتقال داده شد. از نمونه‌های خاک، رقت‌های 1- 10 و 2- 10 به شکل سری تهیه و هم‏زمان اسیدیته تمامی نمونه‏ها اندازه‏گیری و ثبت شد (14). با کشت 50 مایکرو لیتر از رقت دوم در محیط کشت استارچ کازئین آگار[13](S.C.A) (جدول 2)، تک کلونی‏های استرپتومایسس بر اساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی خاص کلونی‌شان (شامل: ظاهری خشک و گچی، سفید یا رنگی، چسبیده به محیط و دارای میسلسوم‌های رویشی) از محیط کشت جداسازی شد (15). برای تهیه استوک باکتریایی به منظور نگهداری طولانی مدت جدایه‏ها برای مطالعات بعدی، یک تک کلون از هر جدایه باکتری‌های استرپتومایسس به محیط کشت مایع ISP2[14] (جدول 2)، انتقال داده و پس از ورتکس به همراه گلیسرول در فریزر منفی 80 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد (16).

 

جدول 2- اجزا و مقادیر بافر استخراج DNA و محیط کشت

گرم/ لیتر DNA بافر استخراج

گرم/ لیتر (ISP2)

گرم/ لیتر (SCA)

Tris-base: 1/12

Maltextract:10

Starch:10

EDTA-Na2:44/7

Yeastextract:10

Casein:3/0

PVP(%2) :1

CaCO3:2

CaCO3:02/0

NaCl:182/8

اسیدیته: 3/7

FeSO4:01/0

اسیدیته: 8

 

K2HPO4:2

 

 

KNO3:2

 

 

MgSO4:05/0

 

 

NaCl:2

 

 

Agar:15

 

 

Nystatin:02/0

 

 

DMSO:

 1 میلی‏لیتر

 

 

اسیدیته: 2/7

 

استخراج DNAژنومی باکتریایی: با توجه به این نکته که دیواره پپتیدوگلیکانی باکتری استرپتومایسس بسیار سخت و مقاوم است، روش‏های متداول لیز سلولی برای از بین بردن و لیز کردن آن کافی نیست. بنابراین، به کمک اعمال شوک حرارتی شدید یعنی با استفاده از انجماد و ذوب متناوب، ابتدا دیواره پپتیدوگلیکانی[15] باکتری شکسته شده و سپس، بقیه مراحل استخراج بر اساس روش یاد شده در بالا انجام گرفت.

برای استخراج DNA ژنومیک جدایه‏های ‏باکتری استرپتومایسس، ابتدا نمونه‏های باکتریایی بر روی محیط استارچ کازئین آگار (S.C.A) کشت و به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. سپس، باکتری‌ها از روی پلیت‌ها برداشته و به یک میکروتیوب حاوی 300 مایکرو لیتر بافر لیزکننده (17) (جدول 2)، منتقل شد. میکروتیوب‌ها ابتدا داخل ازت مایع قرار گرفته و بلافاصله به بن‌ماری 65 درجه سانتی‌گراد منتقل و سپس ورتکس شدند (این عملیات 7 بار تکرار شد). پس از افزودن 200 مایکرو لیتر دیگر از بافر لیز کننده، میکروتیوب‌ها به مدت 10 دقیقه با g 58/126 سانتریفیوژ شدند. سپس، مایع رویی برداشته شده و هم حجم آن محلول کلروفرم- ایزوامیل[16] الکل (به نسبت 1:24) افزوده شد و به مدت 10 دقیقه با g 74/6 سانتریفیوژ شدند. دوباره مایع رویی برداشته شده، هم حجم آن ایزوپروپانول[17] سرد افزوده و به مدت 8 ساعت در منفی 20 درجه سانتی‏گراد نگهداری و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شدند. مایع رویی دور ریخته، محتویات درون تیوب با 100 مایکرو لیتر الکل 70 درصد شستشو داده و به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع رویی دور ریخته، 100 مایکرو لیتر آب مقطر به ویال‌ها اضافه و در فریزر منفی 20 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. غلظت DNA استخراجی، از طریق مقایسه با سایز مارکر بر روی ژل آگاروز تخمین زده شد (17).

تکثیر قطعه 16S rDNA:برای تایید شناسایی جنس استرپتومایسس از طریق روش‏های ریخت‏شناسی، توالی 16SrDNA تمامی جدایه‏ها با استفاده از آغازگرهای جهانی AF, AR تکثیر شد (جدول 3) (18).

واکنش PCR شامل مخلوط (DionizedH2: 50 میکرو لیتر، MasterMix: 25 میکرو لیتر، PR: 2 میکرو‏لیتر، PF: 2 میکرو لیتر، DNATemplate: 1 میکرو لیتر)، طبق برنامه دمایی جدول 4، انجام شد. سپس، محصول PCR بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شد.

. غربال‏گری جدایه‏های مولد ترکیبات ضد‏قارچی (آنزیم کیتیناز): برای تکثیر ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19 و غربال جدایه‏های مولد این نوع آنزیم، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) برای ژنوم تمامی جدایه‏های مورد آزمایش انجام گرفت. برای تکثیر قطعه مربوط به ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19، از آغازگرهای به کار برده شده توسط هاستر[18] و همکارانش در سال 2005 استفاده شد، که طراحی آن‏ها بر اساس تکثیر یک قطعه bp 885 از ژن کیتیناز خانواده 19 بوده است (19). ویژگی‏های آغازگرهای رفت CH19F(ForwardPrimer) و برگشت CH19R (ReversePrimer& ComplementaryPrimer) به شرح جدول 5 است. توالی آغازگر همولوگوس دقیقاً همان توالی ژنومیک است و نقطه ابتدایی قطعه تکثیر شده را مشخص می‌کند و توالی آغازگر برگشت نوکلئوتیدهای انتهایی قطعه مورد تکثیر است.

برای تکثیر ژن کیتیناز، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز در حجم 15 میکرولیتر (MasterMix: 7 میکرو لیتر، PR: 5/. میکرو لیتر، PF: 5/. میکرو لیتر، DNATemplate: 1 میکرولیتر) طبق برنامه دمایی جدول 6 انجام شد.

 

 

جدول 3- آغازگرهای جهانی تکثیر قطعه 16S rDNA

طول محصول حاصل پس از PCR

توای آغازگر

F/R

1500 bp

5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′

AF

1500 bp

5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGC-3′

AR

 

جدول 4- برنامه دمایی واکنش PCR برای تکثیر ژن 16SrDNA

مرحله

دما (سانتی‏گراد)

زمان

تعداد چرخه

واسرشت اولیه

95

5 دقیقه

1

واسرشت

95

1 دقیقه

40

اتصال

56

1 دقیقه

تکثیر

72

90 ثانیه

تکثیر نهایی

72

15 دقیقه

1

 

جدول 5- آغازگرهای جهانی تکثیر ژن کیتیناز

طول محصول حاصل پس از PCR

توای آغازگر

F/R

bp 885

5′-ACGTGTATCGACGTGTCATGAGT-3′

CH19F

bp 885

5′-TACGACATCAGCAGCTCAGGTTC-3′

CH19R

 

جدول 6- برنامه دمایی واکنش PCR برای تکثیر ژن کیتیناز

مرحله

دما (سانتی‏گراد)

زمان

تعداد چرخه

واسرشت اولیه

96

5 دقیقه

1

واسرشت

96

1 دقیقه

35

اتصال

54

1 دقیقه

تکثیر

72

1 دقیقه

تکثیر نهایی

72

10 دقیقه

1

 


برای آشکارسازی محصولات PCR، نمونه‌ها به مدت 1 تا 5/1 ساعت در بافر (LoadingBuffer) 6X با ولتاژ 85 تا 100 میلی‏ولت بر روی ژل آگاروز 1 درصد الکتروفورز شدند. سپس، به مدت 10 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید[19] رنگ‏آمیزی و باندهای مربوطه در زیر نور UV (دستگاه ژل داک)، مشاهده شد. جدایه‏هایی که ژن کیتیناز در آن‏ها تکثیر شد، در پلیت‏های ‏حاوی محیط کشت اختصاصی باکتری‏ها (NA) برای بررسی آثار‏ آنتاگونیستی ذخیره شدند.

. ارزیابی میزان قدرت آنتاگونیستی جدایه‏های مولد آنزیم کیتیناز: به منظور تعیین توانایی آنتاگونیستی باکتری‏های جداسازی شده در تولید مواد ضد‏قارچی، 5 جدایه از جدایه‏های مولد آنزیم کیتیناز با دو جدایه قارچ بیماری‏زا گیاهی (آلترناریا آلترناتا[20]، الترناریا سولانی[21]) کشت متقابل داده شد. آزمون آنتی‏بیوگرام[22] به روش کشت متقابل[23] انجام و بر اساس قطر ناحیه بازدارنده رشد[24]، فعال‏ترین جدایه انتخاب شد.

1- جدا سازی عامل بیماری: به منظور تهیه و جداسازی عامل بیماری، از مزارع آلوده سیب زمینی و گوجه فرنگی اطرف شهر تبریز نمونه‏برداری شد. نمونه‏ها به طور جداگانه در پاکت‏های کاغذی قرار داده و پس از انتقال به آزمایشگاه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. با استفاده از اسکالپل استریل قطعات کوچکی به اندازه 1 سانتی‏متر از بافت‏های آلوده بریده شد. قطعات بریده شده به مدت 10 دقیقه در محلول هیپوکلرید سدیم[25] 10 درصد ضدعفونی سطحی شده و بلافاصله دو بار با آب شستشو شد. نمونه‏ها پس از آب‏گیری با کاغذ صافی بر روی محیط مغذی (سیب‏زمینی دکستروز آگار)[26]PDA کشت داده شد. سپس، پلیت‏ها به مدت 3 تا 5 روز در دمای 25 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. از کلونی‏های رشد یافته‏ایی که دارای ویژگی‏های‏ آلترناریا بودند با برداشتن تک هاگ یا زنجیره هاگ خالص شدند. قطعاتی به اندازه 5 میلی‏متر از کلونی‏های درحال رشد برداشته شده و بر روی محیط غذایی (سیب زمینی هویج آگار)[27] PCA کشت داده شد. برای تحریک الگوی هاگ‏زایی، پلیت‏ها در دمای 24 درجه سانتی‏گراد با چرخه نوری 8 ساعت روشنایی و 16 ساعت تاریکی به مدت 5 تا 7 روز انکوبه شدند. شناسایی جدایه‏ها با استفاده از کلید قوستا[28] و همکاران (الگوهای کلی هاگ‏زایی شامل آرایش هاگ‏ها رو هاگ‏بر، تعداد هاگ‏ها در هر زنجیره و الگوی انشعاب یافتن زنجیره‏ها هستند) انجام شد و آزمون بیماری‏زایی جدایه‏ها به اثبات رسید (20).

2-آزمون هاله بازدارندگی: برای بررسی اثر آنتاگونیستی جدایه‏های‏ Streptomyces علیه قارچ‏های ‏بیمارگر یاید شده از روش کشت متقابل بر روی محیط کشت PDA استفاده شد. بدین صورت که ابتدا از هر کدام از جدایه‏های‏ باکتری مقطعی به قطر 5 میلی‏متر برداشته و در یک سمت پلیت حاوی محیط کشت PDA قرار داده شد. باکتری‏های ‏کشت داده شده به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از این مدت، از هر کدام از قارچ‌های آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتا یک بلوک میسلیوم چهار روزه به قطر 5 میلی‏متر برداشته شده و در مقابل هر جدایه باکتری کشت شده در پلیت‌ها قرار داده شد (شکل 4).این عمل در 5 تکرار برای هر کشت آنتاگونیستی انجام گرفت. به طور هم‏زمان 5 نمونه از هر کدام از جدایه‏های‏ قارچ نیز به عنوان شاهد در محیط مغذی PDA کشت داده شد. کشت‏های ‏انجام گرفته شده به مدت 20 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از سپری شدن مدت یاد شده، میانگین شعاع‌ هاله‏های ‏ایجاد شده در اطراف هر باکتری آنتاگونیست با استفاده از کولیس اندازه‌گیری و ثبت شد.

 

نتایج.

نمونه‏برداری و جداسازی اکتینومایست‏ها: از مناطق مختلف استان‌ آذربایجان‏شرقی 60 نمونه خاک جمع‏آوری شد و طبق روش گفته شده در بخش مواد و روش‏ها در مجموع 31 جدایه استرپتومایسس جداسازی شد (‏شکل 1) ‏(‏21).

 

شکل1- نمای ریخت‏شناسی کلونی تعدادی از جدایه‏های جداسازی شده

 

تکثیر قطعه 16SrDNAجدایه‏ها: تعداد 31 ایزوله، از 60 نمونه خاک، به تکثیر قطعه 16S rDNA پاسخ مثبت دادند ‏(‏شکل 2).

تکثیر ژن آنزیم کیتیناز: ژن آنزیم کیتیناز خانواده 19، بر اساس برنامه یاد شده در جدول 6 تکثیر شد. نتیجه این واکنش نشان داد که از 31 جدایه مورد آزمایش، تنها 4 جدایه دارای این ژن بودند که اندازه قطعه تکثیری در تمامی آن‏ها در محدوده بین 750 تا 1000 bp بود ‏(‏شکل 3).

. ارزیابی میزان قدرت آنتاگونیستی جدایه‏ها و تعیین جدایه فعال: در این بررسی 3 جدایه از جدایه‏های مولد آنزیم کیتیناز با دو جدایه قارچ بیماری‏زا گیاهی ‏(‏آلترناریا آلترناتا و آلترناریا سولانی) کشت متقابل داده شد. پس از 20 روز انکوباسیون تمامی جدایه‏های‏ استرپتومایسس توانستند رشد میسلیوم قارچی را مهار و در اطرافشان هاله عدم رشد قارچ ایجاد کنند. این در حالی است که کشت‏های ‏شاهد قارچ توانستند در طی این مدت تمامی قطر پلیت را پر کنند.

نتایج تجزیه واریانس صفات مورد بررسی نشان می‏دهد که اختلاف معنا‏داری بین صفات اصلی وجود نداشته است و بنابراین به تجزیه و تحلیل آن‏ها پرداخته نشده است. اما بین آثار متقابل اختلاف معنا‏داری وجود داشته وطبق نمودار زیر بررسی شده است ‏(‏جدول 7).

 

جدول 7- نتایج تجزیه واریانس تیمار‏های باکتری و قارچ بر شعاع هاله عدم رشد

منابع تغییر

درجات آزادی

میانگین مربعات

باکتری

2

ns0423/0

قارچ

1

ns0333/0

باکتری×قارچ

2

*0803/0

خطا

24

0157/0

ضریب تغییرات ‏(‏درصد)

70/13

ضریب تبیین ‏(‏درصد)

57/42

ns، ٭٭ و ٭ به ترتیب غیر معنا‌دار و معنادار در سطح احتمال 1 و 5 درصد هستند.

 

 

شکل 2- نتابج PCR مربوط به تکثیر قطعه 16S rDNA به طول bp1500 با جفت آغازگرهای AF/AR

 

 

شکل 3- نتایج PCR مربوط به تکثیر قطعه bp885


 

شکل 4- میانگین آثار‏ اصلی شعاع هاله عدم رشد قارچ‏های آلترناریا توسط باکتری‏های استرپتومایسس

حروف در نمودار بیانگر اختلاف معنادار میانگین تیمارها با آزمون دانکن در سطح احتمال 5 درصد است.

 

در مجموع جدایه‏های Streptomyces توانستند قارچ آلترناریا آلترناتا را بهتر از آلترناریا سولانی کنترل کنند. در بین جدایه‏های‏ استرپتومایسس بیش‏ترین میزان ایجاد هاله بازدارندگی بر روی قارچ آلترناریا آلترناتا را، جدایه AE12 با 92/0 سانتی‏متر شعاع هاله ثبت کرده (a2b1)و پس از آن به ترتیب جدایه‏های‏ AE09 و AE30 قرار داشتند. بیش‏ترین میزان ایجاد هاله بازدارندگی بر روی قارچ آلترناریا سولانی را، جدایه AE09 با 06/1 سانتی‌متر ثبت کرد (a1b2) و پس از آن به ترتیب جدایه‏های‏ AE30 و AE12 قرار داشتند. بیش‏ترین میزان مهارکنندگی بر روی رشد هردو قارچ آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتا توسط جدایه AE9 به میزان 98/0 سانتی‌متر ایجاد شد و پس از آن به ترتیب جدایه‏های‏ AE30 و AE12 قرار داشتند. ، جدایه AE9 به عنوان مؤثرترین باکتری Streptomyces در کنترل رشد قارچ آلترناریا تشخیص داده شد.

 

بحث و نتیجه‏‏ گیری.

دامنه اسیدیته نمونه‏های ‏خاک مورد آزمایش در این بررسی بین 7/7  تا 9 بوده است. دانشمندان دریافته‏اند که باکتری‌های Streptomyces به طور معمول اسیدیته‏های ‏قلیایی و خنثی را برای رشد ترجیح می‌دهند (22). باتوجه به ویژگی‏های ظاهری تک کلونی‏های رشد یافته در محیط کشت، 31 جدایه باکتری Streptomyces جداسازی شد. این باکتری‌ها دارای شکل‏های مختلف با خواص ریخت‏شناسی‏ متفاوت هستند. در ضمن بر اساس رنگدانه (پیگمنت) پشت کلونی نیز امکان جداسازی نمونه‌ها وجود دارد. بنابراین، باکتری‏های ‏Streptomyces، بر اساس ریخت‏شناسی‏ خاص کلونی‌شان از محیط کشت جداسازی شدند (23).

تکثیر توالی 16S rDNAتوسط آغازگرهای جهانی اثبات کرد که جدایه‏های جداسازی شده به جنس Streptomyces تعلق دارند. استرپتومایسس‏ها بیشتر باتوجه به معیارهای ریخت‏شناسی‏ و بیوشیمیایی شناسایی می‏شوند، و در نتیجه ترتیب گونه‏ها به شکل گروه‏های ‏خوشه‏ای هستند و بر اساس رشته‏های هوایی (اسپوروفورز) و بستر قارچ، رشد زنجیره اسپور مارپیچی و سطح صاف اسپور استرین، آن‏ها تحت جنس استرپتومایسس قرار می‏گیرند. این هویت تاکسونومی مسلم و قطعی نیست، اما شاخص‏های مختلف فیزیکی- شیمیایی و شناسایی توالی 16S rDNAروش مطمئنی بوده و می‏توان جدایه را به عنوان جنس Streptomyces تعیین کرد. علاوه بر این، مطالعه ویژگی‏های‏ رشد در مواد محیط کشت مغذی تا حد زیادی بر رشد و ریخت‏شناسی‏ موجودات زنده تاثیر می‏گذارد (24). با تکثیر ژن رمزگردان آنزیم کیتیناز خانواده 19 مشخص شد که تنها 4 جدایه از 31 جدایه باکتری Streptomyces جداسازی شده دارای این ژن هستند. این نتیجه نشان دهنده کمیاب بودن ژن کیتیناز خانواده 19 در بین باکتری‏های استرپتومایسس است. اگر چه درصد نمونه‏های آنتاگونیست غربال‏گری شده کم است، اما این نتایج در مقایسه با مطالعات انجام شده قبلی، از این فرضیه که جدایه‏های Streptomyces چند اثر بوده و نویدی برای کاربرد در بسیاری از فرآیندهای بیوتکنولوژی، از جمله بیوکنترل پاتوژن‏های قارچی خاک‏زاد هستند، حمایت می‏کند (25).

آنزیم کیتیناز یکی از مهم‌ترین متابولیت‏های ‏ثانویه تولیدی باکتری‌های استرپتومایسس است. زیرا این آنزیم با تجزیه کیتین دیواره سلولی قارچ‌ها، به نوعی یک فعالیت ضدقارچی را برای باکتری‏های ‏استرپتومایسس ایجاد می‌کند. کیتینازهای باکتری‌های استرپتومایسس در دو خانواده 18 و 19 گلیکوزیل هیدرولازها طبقه‌بندی می‌شوند. در این میان کیتینازهای خانواده 19 مشابه کیتینازهای گیاهی بوده و فعالیت ضد‌قارچی در خور توجهی را نشان می‌دهند (18 و 26).

در بررسی آثار‏ آنتاگونیستی، تمامی جدایه‏های باکتری Streptomyces مورد آزمایش توانستند از رشد هر دو قارچ پاتوژن گیاهی آلترناریا آلترناتا و آلترناریا سولانی ممانعت کنند، اما قادر به از بین بردن کامل آن نشدند. این در حالی بود که کشت‏های ‏شاهد قارچ توانستند در طی این مدت تمامی قطر پلیت را پر کنند. فعالیت آنتاگونیستی میکروارگانیسم‏‏های بیوکنترلی، بیشتر با مهار رشد قارچ و یا کاهش علایم آلودگی بوته‏هاست (11).

از آن جا که بلوک‏های ‏قارچ‏های ‏بیمارگر آلترناریا سولانی و آلترناریا آلترناتای برداشته شده از حاشیه پرگنه‌ها در ناحیة بازدارندگی آزمون کشت متقابل در محیط تازه دوباره احیا و رشد کردند، مشخص شد که متابولیت‏های ‏ترشح شده در محیط کشت جامد روی قارچ‏های ‏یاد شده اثر بازدارندگی و نه کشندگی دارند. در بررسی آثار‏ آنتاگونیستی 23 جدایه باکتری بر علیه آلترناریا سلولانی عامل بلالت زودرس در گوجه فرنگی در محیط اینویترو به روش دوئل کالچر و در حالت گلخانه ای توسط یازی جی[xxix] و همکاران در سال 2011 بیان شد که در ارزیابی اینویترو تمامی 23 جدایه بر روی میسلیوم‏های ‏قارچی اثر کنترلی داشتند (27 و 28).

در سال‏های قبل، تعدد ژن کیتیناز بر روی ژنوم باکتری‏های ‏Streptomyces، توسط پژوهشگران به اثبات رسیده بود؛ اما تعداد کمی از ژن‌های مورد آزمایش، به کیتینازهای خانواده 19 که فعالیت ضد قارچی بالایی دارند، متعلق بودند. در کل کیتیناز‏های ‏خانواده 19 در ارگانیسم‏های ‏پروکاریوتیک کمابیش کمیابند (26 و 29). بنابراین، دست‌یابی به باکتری‌های Streptomyces دارای ژن رمزگردان کیتیناز خانواده 19 می‌تواند به شناسایی سویه‌های بسیار مؤثر برای دفاع ضد قارچی منجر شود. در نتیجه خاک‏های استان آذربایجان‏شرقی مستعد وجود گونه‏هایی از باکتری‏های Streptomyces هستند که توانایی کنترل زیستی قارچ‏های بیماری‏زای گیاهی را دارند و دارای پتانسیل بالقوه‌ای برای معرفی و استفاده به عنوان سم زیستی هستند. همچنین، این نتایج نشان می‏دهد که StreptomycesAE09 می‏تواند به عنوان یک عامل بالقوه بیوکنترلی برای توسعه آفت‏کش‏های زیستی با طیف گسترده‏ای باشد. شناسایی باکتری‏های ‏مولد آنزیم کیتیناز برای نخستین بار در منطقه آذربایجان بررسی شده است و می‏توان از آن برای جایگزینی سموم و کودهای شیمیایی بهره گرفت.

تشکر و قدردانی

از پژوهشکده بیوتکنولوزی کشاورزی ایران وزارت جهاد کشاورزی و مرکز آموزش جهاد کشاورزی استان آدربایجان شرقی برای حمایت‏های مالی و تبادل اطلاعات علمی تشکر و قدردانی می‏شود.

 



[1]- Actinomycetes

[2]- Soil borne

[3]- Chitin

[4]- Polysaccharide

[5]- N-Acetyl Glucose amin

[6]- Heidolph Persia

[7]- Vision Korea

[8]- Sartorius

[9]- Bender

[10]- Biometra

[11]- Metrohm

[12]- Tomy autoclave

[13]- Starch Casein Agar

[14]- International Streptomyces Project 2

[15]- Peptidoglycane

[16]- Chloroform Isoamyl

[17]- Isopropanol

[18]- Hoster

[19]- Ethidium Bromide

[20]- Alternaria alternata

[21]- Alternaria solani

[22]- Antibiogram

[23]- Dual Culture

[24]- Inhibitionzone

[25]- Sodium hypochlorite

[26]- Potato Dextrose Agar

[27]- Potato Carrot Agar

[28]- Ghosta

[xxix]- Yazici

(1)               AtlasRM.,BarthaR. Microbial ecology (Fundamentals and application). 2ndedition.Menlopark,CA:Benjamin/Cummingspublishingcompany;1987.

(2)               DavidA. Streptomyces in nature and medicine the antibiotic makers.NewYork: OxfordUniversityPress;2007.

(3)               BrownME. Seed and root bacterization. PaloAlto.,CA:Annualreviewofphytopathology;1974;12:181- 97.

(4)               HananH.,MohamedH.,VirrolM.,YedirO.Rockphosphate-solubilizingActinomycetes:screeningforplantgrowth-promotingactivities. World jornal of Microbiol Biotechnoogyl 2008;24 (11):2565- 75.

(5)               ShimizuM.,NakagawaY.,SatoY.,FurumaiT.,IgaroshiY.,OnakaH.,etal.StudiesonendophyticActinomycetes(I) Streptomyces sp.isolatedfromrododendronanditsantifungalactivity. General Plant Pathology 2000;66 (4):360- 6.

(6)               DeshpandeM.Enzymaticdegradationofchitinanditsbiologicalapplications. Journal of Scientific & Industrial Research 1986;45 (6):273- 81.

(7)               AslakE.Characterisationofchitinandastudyofitsacid-catalysedhydrolysis[Dissertation].Norwey:ScienceandTechnologyUniv;2007.

(8)               CrawfordDL.,LynchJM.,WhippsJM.,OusleyMA.IsolationandcharacterizationofActinomyceteAntagonistsofafungalrootpathogen. Appllied Environmental Microbiology 1993;59 (11):3899- 905.

(9)               YoussefiYA.,El-TarabilyKA.,HusseiniAM.Plectosporiumtabacinumrootrotdiseaseofwhitelupine(lupinustermisforsk.)anditsbiologicalcontrolby Streptomyces species. Journal of Phytopathology2001;149 (1):29- 33.

(10)           GilJJ.Purificationandcharacterizationofanextracellularchitinasefromtheantifungalbiocontrolagent Streptomyces halstedii. Biotechnology Letters 2005;27 (19):1483- 6.

(11)           NguyenXH.,NaingKW.,LeeYS.,TindwaHG.,LeeH.,JeongBK.,etal.Biocontrolpotentialof Streptomyces griseus H7602 againstrootrotdisease(phytophthoracapsici)inpepper. Plant Pathol 2012;28 (3):282- 9.

(12)           AgriosGN. Plant Pathology. (3 rdEdition).SanDiego.,CA:AcademicPress;1988.

(13)           ChaterKF.,WildeLC.Restrictionofabacteriophageof Streptomyces albusGinvolvingendonucleaseSalI. journal of Bacteriology 1976;128(2):644- 50.

(14)           DhanasekaranD.,RajakumarG.,SivamaniP.,SelvamaniS.,PanneerselvamA.,ThajuddinN.Screeningofsaltpans actinomycetes forantibacterialagents. The Internet Journal of Microbiology 2005;1 (2):1- 6.

(15)           KhayatmaherR.,Amoozegar MA.,SeyyedmahdiSH.,HamediJ.,NaghaviMR.,etal.Isolationandscreeningofphytotoxinproducingactinomycetesanddeterminationofphytotoxineffectspectrumofselectedstrains.Biological Journal of Microorganism2012;1 (2):1- 22.

(16)           ShirlingEB.,GottliebD.Methodsforcharacterizationof Streptomyces species International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 1966;16(3):313- 40.

(17)           Khadivi F. Dehnad AR.PotentialofgoldnanoparticlesobtainedbyActinomistallsMakusoilandhotspringsofArdabil(above40 C)[Dissertation].Zanjan:IslamicAzaduniversityofZanjanUniv.;2009.

(18)           PrapagdeeB.,KuekulvongC.,MongkolsukS.AntifungalPotentialofExtracellularMetabolitesProducedby Streptomyces hyroscopicus againstphytopathogenicfungi. Biological Sciences 2008;4 (5):330- 7.

(19)           HosterF.,SchmitzJE.,DanielR.Enrichmentofchitinolyticmicroorganisms:Isolationandcharacterizationofachitinaseexhibitingantifungalactivityagainstphytopathogenicfungifromanovel Streptomyces strain. Microbiol Biotechnol 2005;66 (4):434- 42.

(20)           GhostaY.,ErshadD.,ZareR.,MohammadiGoltapeE.Taxonomicstudyon Alternaria speciesinIran(2). Rostaniha 2003;4 (3-4):105- 21.(inPersian).

(21)           KongLR.,TzengDeanD.,YangCH.GenerationofPCR-basedDNAfragmentsforspecificdetectionof Streptomyces saraceticus N45,Proceedings of the National Science Council, (B)2001;25 (2):119- 27.

(22)           LocciR. Streptmyces and related genera in: Bergeys manual of Systematic Bacteriology1998; 4: 2451- 508.

(23)           MousaviSM.,GhanbarvandF.,DehnadA.GrowthinhibitoryanddifferentiatingeffectsofethylacetatesolublemetaboliteofIraniannativebacteria, Streptomyces calvus,inhumanmyeloidleukemiaK562cellline. Medical Science Journal of Islamic Azad Univesity Tehran Medical Branch 2012;22 (3):175- 83.

(24)           SowndhararajanK.,KangSC.Invitroantagonisticpotentialof Streptomyces sp. AM-S1 againstplantandhumanpathogens. Agricultural Chemistry and Environment 2012;1 (1):141- 7.

(25)           KaniniGS.,KatsifasEA.,SavvidesAL.,KaragouniAD. Streptomyces rochei ACTA1551,anindigenousgreekisolatestudiedasapotentialbiocontrolagentagainst Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici. Hindawi Publishing Corporation 2013;ArticleID38723010pagesAvailableoninternetathttp://dx.doi.org/10.1155/2013/387230.

(26)           SaitoA.,FujiiT.,MiyashitaK.Chitinasesystemin Streptomyces. Actinomycetol 1990;13 (1):1- 10.

(27)           KawaseT.,YokokawaS.,SaitoA.,FujiiT.,NikaidouN.,Miyashita.,K.etal. Comparisonofenzymaticandantifungalpropertiesbetweenfamily18and19chitinasesfrom S. coelicolor A3(2). Bioscience Biotechnology and Biochemistry 2006;70(4):988- 98.

(28)           YaziciS.,YusufY.,IsaK.,Evaluationofbacteriaforbiologicalcontrolofearlyblightdiseaseoftomato. Biotechnology 2011;10 (9):1573- 77.

(29)           WatanabeT.,KanaiR.,KawaseT.,TanabeT.,MitsutomiM.,SakudaS.,etal.Family19chitinasesof Streptomyces species. Microbiology 1999;145 (12):3353- 63.

(30)           Khatiri Y.,A study on isolated endophytic bacteria from Glycine sp. and their role on control of some plant pathogenic fungi. Biological Journal of Microorganism, 2013; 2 (5): 51- 60.