مطالعه شرایط بهینه رشد و طراحی فرمولاسیون برای افزایش ماندگاری Streptomyces rimosus strain C-2012 به عنوان عامل بیوکنترل

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیماری‌شناسی گیاهی، پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

2 استادیار ژنتیک مولکولی، پژوهشکده پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی ایران

چکیده

مقدمه: از موضوعات مهم در زیست‏فناوری میکروبی، برقراری پیوند میان سویه‏های سودمند غربال شده در آزمایشگاه با عرصه صنعت و مصرف‌کننده است. از این روی در توسعه عوامل سودمندی چون عوامل کنترل زیستی میکروبی، مطالعه بهینه‌سازی شرایط تغذیه‌ای و فیزیولوژیکی برای تکثیر انبوه و انتخاب حامل مناسب برای فرمولاسیون نهایی ضروری است. در پژوهش حاضر، کوشش شد تا بهترین شرایط رشد و فرمولاسیون مناسب برای سویه کنترل زیستی استرپتومایسس رایموسوس (C-2012) ارایه شود. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: برای بهینه‌سازی شرایط رشدی سویه C-2012، توان رشد بر روی منابع کربن، انواع محیط غذایی، اثر‏‏ دما، اسیدیته اولیه و کلرید سدیم ارزیابی شد. همچنین، اثر‏‏ انواع حامل و افزودنی‌ها در فرمولاسیون نهایی و میزان ماندگاری جمعیت میکروبی بررسی شد. ‏‏‏

نتایج: بررسی اثر‏‏ منابع کربنی نشان داد گلوکز، فروکتوز و مانیتول از منابع کربنی مناسب برای رشد بوده و بهترین اسیدیته اولیه و دما برای این سویه به ترتیب 7 و 28 درجه سانتی‌گراد است. بهترین محیط غذایی حاوی گلوکز، عصاره مخمر و عصاره جو بود. بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم نشان داد که با افزایش غلظت از صفر تا 300 میلی‌مولار میزان جمعیت میکروبی افزایش و پس از آن جمعیت کاسته شد. بر پایه نتایج به دست آمده بهترین حامل میکروبی، ماسه بادی ارزیابی شد؛ در حالی که پلی‌مر هیدروژل شرایط بهینه نگهداری را نداشت. بررسی 36 ماهه زنده‌مانی نشان داد جمعیت باکتری در نمونه حاوی نمک 200 برابر (cfu/g 106×8) بیش از نمونه فاقد آن در ماه پایانی بود. ‏‏‏

بحث و نتیجه ‏گیری: استفاده از منابع کربنی مانند گلوکز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته اولیه 7 در رشد این سویه اهمیت داشته و می‌تواند در تهیه فرمول نهایی با جمعیت ایده‌آل مؤثر باشد. توان تولید متابولیت‌های فرار و مایع در حضور کلرید سدیم و کنترل بیمارگرهای قارچی توسط استرپتومایسس رایموسوس نشان می‌دهد این سویه دارای پتانسیل بالایی برای بهره‌برداری هم در مناطق نرمال و هم دارای تنش شوری است. ماندگاری بالا (3 سال) در فرمولاسیون نهایی از دید اقتصادی برای تولیدکنندگان عوامل بیوکنترل و کشاورزان بسیار مهم است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Study on optimum growth condition and designing formulation for increasing shelf life of Streptomyces rimosus strain C-2012 as biocontrol agent

نویسندگان [English]

  • Ebrahim Karimi 1
  • Akram Sadeghi 2
1 M.Sc. of Plant pathology, Microbial biotechnology and Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran
2 Assistant Professor of Molecular genetics, Microbial biotechnology and Biosafety Department, Agricultural Biotechnology Research Institute of Iran
چکیده [English]

Introduction: An important issue in microbial biotechnology is linkage between screened beneficial strains in laboratory and industry. Therefore, to develop beneficial microbial biocontrol agents optimization of nutritional and physiological condition for high level production and selection of carrier for final formulation are necessary. In this research we tried to find the best growth condition and suitable formulation for biocontrol Streptomyces rimosus strain C-2012.

Materials and methods: For optimization of growth condition of strain C-2012, utilization of carbon sources, growth in different media, effect of temperature, pH and NaCl were investigated. Then the effect of different carriers and additives in final formulation and shelf life of microbial community were studied.

Results: Study on utilization of carbon sources showed that glucose, fructose and mannitole were suitable carbon sources for growth and the best initial pH and temperature were 7 and 28°C, respectively. Results showed that the culture medium containing glucose, yeast extract and malt extract was the best medium. Investigation on NaCl effect showed that from 0 up to 300 mM sodium chloride could increase microbial community and salinity more than this range decreased microbial community. Based on the results we found that sand is suitable as microbial carrier comparing hydrogel polymers. Viability test during 36 months showed that formulation with NaCl content could keep 200 times (8*106 cfu/g) more than samples without salinity at last month.

Discussion and conclusion: Using suitable carbon sources such as glucose at 28 °C and pH at 7 are important items in optimum growth and preparing final formulation with good level of microbial community. Capability in secondary volatile and liquid metabolites production and fungal pathogen control by Streptomyces rimosus in the presence of NaCl showed that this strain has high potentiality to apply in both normal and saline area. Long shelf life (3 years) without any saprophytic contamination of this strain in final formulation is important in industry and it can prepare a lucrative business.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Streptomyces
  • Biocontrol
  • Lyophilisation
  • Formulation
  • Shelf life

مقدمه.

با وجود مطالعات متعدد در زمینه موفقیت کنترل زیستی بیمارگرهای گیاهی، تنها تعداد معدودی محصول تجاری در بازار موجود است. افزون بر این، بیشتر این محصولات برای کنترل بیماری‌های گیاهان گلخانه‌ای و تنها تعداد انگشت شماری برای استفاده در مزرعه معرفی شده‌اند (1 و 2). کوشش زیادی برای توسعه گونه‌های استرپتومایسس به عنوان عوامل کنترل کننده بیماری‌های قارچی انجام شده است (3- 5). یکی از علت‏های اصلی فعالیت بر روی این باکتری‌ها چند عملکردی بودن آن‌ها بر علیه بیمارگرهای گوناگون گیاهی که به کاهش سلامت گیاه در طول دوره رشد منجر می‌شوند، است. ویژگی‏های آنتاگونیستی یک سویه بومی استرپتومایسس رایموسوس (C-2012)[1] بر علیه رایزوکتونیا سولانی AG-4[2] (عامل ایجاد مرگ گیاهچه چغندرقند) در شرایط آزمایشگاه، گلخانه و مزرعه بررسی شده است. نتایج نشان داده است که تیمار بذر با این جدایه باکتری علاوه بر کنترل بیماری مرگ گیاهچه رایزوکتونیایی و کاهش پوسیدگی‌های قارچی، موجب افزایش جوانه‏زنی و عملکرد گیاه در گلخانه و مزرعه می‏شود (6 و 7).

علاوه بر کارایی، عامل کنترل زیستی باید قابلیت تبدیل به یکی از فرمولاسیون‌های[3] رایج را داشته باشد تا بتوان آن را در حجم انبوه تولید و در سطح وسیع استفاده کرد. پس از بهینه‏سازی محیط کشت، فرمولاسیون محصول نهایی تولید شده نقطه اوج دانش در فناوری تولید کودها و عوامل کنترل زیستی به حساب می‏آید. بنابراین، بقای میکروارگانیسم‌ها در محصول نهایی اهمیت ویژه‏ای دارد (1). در فرمولاسیون، انواع متفاوتی از اجزای فعال استفاده می‏شود. در مرحله تهیه توده فرموله شده میکروبی، سه مورد حفظ توانایی توده زیستی در خلال تثبیت، خشک کردن و مرطوب‏سازی مجدد آن باید در نظر گرفته شود. نوع محیط کشت و سن آن در اثربخشی، پایداری و تحمل خشک شدگی بسیاری از عوامل کنترل زیستی مؤثر است. شرایط تخمیر[4] و مراحل پس از آن مانند لیوفیلیزاسیون[5] اهمیت زیادی در فرمولاسیون کودها و عوامل کنترل زیستی دارند (8).

ترکیبات شیمیایی و یا زیستی فعال مختلفی (افزودنی‏ها) وجود دارند که می‏توانند فرمولاسیون را در برای اهداف مورد نظر تغییر دهند. افزودنی‌های مهمی چون قارچکش‌ها می‌تواند از طریق هم‏افزایی، کارایی فرمول نهایی را با هدف کنترل بیمارگرها بالا ببرد. اما نکته بسیار مهم در زمینه افزودنی‌ها در فرمولاسیون‌های میکروبی، ارزیابی سمیت چنین ترکیباتی بر روی عامل کنترل زیستی است (1 و 9). در فرمولاسیون‌های میکروبی از حامل‏های گوناگونی چون کائولن[6]، تالک[7]، خاک، ماسه و بذر استفاده می‌شود. مواد پلیمری[8] چون هیدروژل (سوپر جاذب)[9] نیز در کشاورزی استفاده‌های گوناگونی دارند. هیدروژل‌ها پلیمرهایی با ساختار سه بعدی مناسب هستند که می‌توانند به میزان زیاد آب و فرآورده‌های زیستی را در خود نگهداری کنند. همین ویژگی هیدروژل‌ها سبب بهره‏برداری آن‏ها در عرصه‌های گوناگونی چون کشاورزی، صنعت غذا و پزشکی شده است. از این مواد می توان به عنوان حامل‌های زیستی بهره گرفت (10).

نتایج پژوهش حاضر بهترین شرایط غذایی و فیزیولوژیک برای رشد، حامل مناسب و افزودنی‌های مناسب برای نگهداری بلند مدت سویه بومی استرپتومایسس رایموسوس (C-2012) در انبار را معرفی می‏‏کند. همچنین، در این مطالعه قابلیت کنترل زیستی سویه C-2012 پس از فرمولاسیون نهایی ارزیابی شده تا از کارایی فرمولاسیون نهایی در طول زمان اطمینان حاصل شود.

 

‏‏مواد و روش ‏ها.

سویه باکتریایی: سویه باکتریایی مورد استفاده، سویه بومی استرپتومایسس رایموسوس (C-2012)، از خاک مزرعه گندمی واقع در کرمان جداسازی و شناسایی شد. این سویه پس از تأیید توان بیوکنترلی (7) برای طراحی فرمولاسیون با ماندگاری بالا در این بررسی، ارزیابی شد. لازم به یادآوری است که در آزمون‏های انجام شده در محیط‏های کشت مایع برای بررسی جمعیت سویه باکتریایی، یک میلی‏لیتر از باکتری با جمعیت اولیه cfu/ml 107×1 برای تلقیح در 50 میلی‏لیتر محیط کشت مایع استفاده شد.

. بررسی توان رشد سویه C-2012 بر روی منابع کربن: در این مطالعه، قندهای فروکتوز[10]، رافینوز[11]، مانیتول[12]، ساکارز[13]، گلوکز[14] و زایلوز[15] با غلظت نهایی 1 درصد به عنوان منبع کربن محیط کشت حداقل[16] (آب آگار حاوی عناصر معدنی) اضافه شد (11 و 12). محیط کشت حداقل بدون قند به عنوان شاهد منفی و محیط کشت غنی حاوی گلوکز به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد. پلیت‌های کشت شده به مدت 7 روز در انکوباتور 28 درجه سانتی‏گراد ‌نگهداری شد. برای نمایش رشد یا عدم رشد باکتری از چهار دامنه ++ (همانند یا بیشتر از شاهد مثبت)، + (بیشتر از شاهد منفی ولی کمی کمتر از شاهد مثبت)، +- (کمی بیشتر از شاهد منفی و لی به طور معنی دار کمتر از شاهد مثبت) و - (همانند شاهد منفی) استفاده شد.

. بررسی اثر‏‏ محیط غذایی بر رشد سویه C-2012: رشد باکتری در چهار نوع محیط غذایی مایع شامل: GYM، PDB، NB و LB بررسی شد. ارلن‌های تلقیح شده با باکتری به مدت چهار روز داخل انکوباتور متحرک با دمای 28 درجه سانتی‏گراد ‌با 150 دور در دقیقه نگهداری شدند. به منظور ارزیابی تعداد باکتری از روش شمارش کلونی[17] سری رقت میکروبی در سرم فیزیولوژی (کلرید سدیم 9/0 درصد) تهیه و جمعیت میکروبی موجود در یک میلی‏لیتر محیط کشت محاسبه شد (13).

. بررسی اثر‏‏ دما، اسیدیتهاولیه و کلرید سدیم بر رشد و جمعیت باکتری: رشد باکتری در محیط GYM مایع با اسیدیته اولیه 5، 6، 7 و 8 و در سه دمای 28، 37 و 46 درجه سانتی‏گراد ‌بررسی شد (13). پس از تعیین دما و اسیدیته اولیه بهینه، باکتری در محیط GYM مایع حاوی غلظت‌های متوالی کلرید سدیم (صفر، 50، 100، 200، 300 و 400 میلی‏مولار) کشت شد. ارلن‌های تلقیح شده با باکتری به مدت 4 روز داخل انکوباتور با دمای 28 درجه سانتی‏گراد ‌با دور 150 در دقیقه نگهداری شدند. برای محاسبه جمعیت باکتری نیز سری رقت در سرم فیزیولوژیک[18] تهیه و شمارش انجام شد.

. بررسی میکروسکوپی اثر‏‏ کلرید سدیم بر میسلیوم و توده زیستی باکتری: از سوسپانسیون‌های[19] میکروبی به دست آمده از آزمون پیشین، لام میکروسکوپی تهیه و تصویربرداری میکروسکوپی برای بررسی بیشتر انجام شد (14).

. بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم بر تولید متابولیت‌های فرار[20] ضد قارچی: 200 میکرولیتر از سوسپانسیون با غلظت 107×1 باکتری در هر میلی‌لیتر سرم فیزیولوژی بر روی محیط کشت GYM آگاردار حاوی غلظت‌های صفر، 100، 200 و 300 میلی‏‏مولار کلرید سدیم پخش شد. پلیت‌ها به مدت 24 ساعت در دمای 28 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (در تیمار شاهد آب مقطر سترون تلقیح شد). سپس، یک حلقه 5 میلی‌متری از حاشیه کشت 7 روزه سویه‏های قارچ‌های بیمارگر در وسط پلیت حاوی محیط کشت PDA تلقیح شد. دو پلیت حاوی قارچ و باکتری بر روی یکدیگر قرار داده و با استفاده از نوار پارافیلم، منفذ میانی پلیت‌ها مسدود شد. پلیت‌ها به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد نگهداری و درصد بازداری از رشد میسلیومی قارچ بیمارگر محاسبه شد. قارچ‌های بیمارگر رایزوکتونیا سولانی[21]، فوزاریوم سولانی[22] و فیتوفتورا[23] بودند (15).

. بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم بر تولید متابولیت‏های مایع ضد قارچی: در این آزمون سویه C-2012در وسط پتری دیش حاوی محیط PDA (با غلظت‌های صفر، 100، 200 و 300 میلی‏‏مولار کلرید سدیم) به شکل نقطه‏ای کشت شد. یک قرص 5 میلی‌متری از کشت 5 روزه قارچ بیمارگر در دو طرف پلیت تلقیح شد. در پلیت شاهد نیز آب مقطر سترون تلقیح شد. کشت‌های یاد شده به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی‌گراد نگهداری شدند (16).

. بررسی اثر‏‏ کاربرد همزمان قارچکش ویتاواکس[24] بر سویه C-2012: مقدار 1، 2، 3، 4 و 5 گرم در لیتر از پودر ویتاواکس به محیط کشت GYM آگاردار (پس از اتوکلاو) افزوده شد. 100 میکرولیتر از سوسپانسیون تازه کشت سویه میکروبی با استفاده از پیپت پاستور بر روی پلیت حاوی محیط دارای قارچ‏کش پخش شد. کشت‌ها در دمای 28 درجه به مدت 72 ساعت نگهداری و سپس، نتایج بررسی شد (13).

. بررسی اثر‏‏ پلی‌مر هیدروژل (به عنوان حامل) بر باکتری: غلظت‌های مختلف پلی‌مر سوپر جاذب (صفر، 5، 10، 20، 100، 1000 و 2000 میلی‏‏گرم در لیتر) به محیط کشت GYM مایع افزوده شد. سپس، یک میلی‏‏لیتر سوسپانسیون سویه C-2012 با غلظت 107×1 باکتری در هر میلی‌لیتر در سرم فیزیولوژی سترون به هر ارلن اضافه شد. کشت‌های یاد شده به مدت 4 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد ‌نگهداری شدند (13).

. بررسی جذب و بازپس دهی متابولیت‌های تولیدی باکتری به پلی‌مر هیدروژل: یک گرم پلی‌مر سوپرجاذب به مایع رویی کشت باکتری اضافه شده و به مدت یک ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر رومیزی با شدت 70 دور در دقیقه قرار گرفت. پس از این مرحله، دانه‌های پلی‌مر سوپر جاذب از مخلوط بالا جداشده و بر روی فویل آلومینیومی گسترده و خشک شدند. به منظور بررسی باز پس دهی متابولیت‌های جذبی، پلی‌مرها در 5 میلی‏‏لیتر آب مقطر استریل شسته شدند.

. پوشش‏دهی باکتری بر سطح پلی‌مر هیدروژل: مقادیر صفر، 5، 10 و 20 میلی‏‏گرم از پلی‌مر به محیط کشت GYM مایع افزوده شد. پس از تلقیح باکتری ارلن‌ها به مدت 5 روز در دمای 28 درجه سانتی‏گراد ‌نگهداری شدند. از سانتریفیوژ[25] برای رسوب توده زیستی حاصل استفاده شد. توده زیستی به همراه پلی‌مر به مدت 48 ساعت وکیوم شد. در نهایت، پلی‌مرها به گرانول‌های خشک آغشته به باکتری تبدیل شدند.

. بررسی اثر‏‏ لیوفیلیز بر جمعیت سویه C-2012: رسوب حاصل از سانتریفیوژ باکتری کشت شده در محیط مایع GYM با استفاده از ازت مایع منجمد و سپس، به مدت 3 و 6 ساعت با‏‏ فشار 8/0 اتمسفر لیوفیلیز (دستگاه لیوفیلیزاسیون Operon، کره جنوبی) شد. یک گرم از توده آبگیری شده با 100 گرم ماسه اسیدشوی شده مخلوط شده و به مدت یک ماه در دمای اتاق نگهداری شد. پس از این مدت جمعیت باکتری موجود در هر گرم مخلوط حاصل (فرمولاسیون اولیه) در سرم فیزیولوژیک به دست آمد. همچنین، اثر افزودن 300 میلی‌مولار نمک به بستر ماسه و استفاده از دو روش مخلوط‏سازی (همزن دستی و آسیاب برقی) بر روی جمعیت باکتری موجود در فرمولاسیون اولیه پس از یک ماه بررسی شد (17).

. بررسی زنده مانی سویه C-2012 در طول زمان: میزان جمعیت باکتری زنده موجود در فرمولاسیون اولیه (تهیه شده بر اساس بهترین روش) در بازه زمانی 36 ماه در سرم فیزیولوژیک محاسبه شد (17).

تحلیل آماری: آزمون‏های بالا در قالب طرح کاملا تصادفی و در سه تکرار اجرا شد. برای تحلیل آماری داده‏های به دست آمده از نرم‏افزار SPSS استفاده شد. همچنین، میانگین‏ها با استفاده از آزمون چند دامنه‏ای دانکن در سطح احتمال 1 درصد مقایسه شد.


نتایج.

. بررسی توان رشد استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012 بر روی انواع منبع کربن: نتایج نشان داد که میزان رشد سویه C-2012 بر روی محیط‏های حاوی گلوکز، فروکتوز و مانیتول در دامنه ++ بوده و در سایر قندها باکتری نتوانست رشد کند. همچنین، در پلیت‏های دارای رشد مثبت توانست همانند محیط شاهد مثبت اسپور تولید کند (شکل 1).

. بررسی اثر‏‏ محیط غذایی بر رشد استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012: نتایج این مطالعه نشان داد محیط کشت GYM حاوی گلوکز (برگزیده شده از بین قندهای ارزیابی شده بر اساس تأثیر بر روی رشد و میزان دسترسی در صنعت)، عصاره مخمر و عصاره جو در مقایسه با سایر محیط‏های کشت توانست جمعیت بیشتری از باکتری (cfu/ml 108×1) را تولید کند. همچنین، سویه C-2012 در این محیط توانست اسپوردهی خود را حفظ کند در صورتی که در دو محیط LB و PDA این ویژگی دیده نشد. البته در محیط Nutrient Broth نیز ویژگی اسپوردهی دیده شد اما نتوانست جمعیت بالایی نسبت به محیط GYM فراهم کند (جدول 1).

 

 

 

شکل 1- توان رشدی سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012بر روی انواع منبع کربن. الف: محیط غنی (شاهد مثبت) ؛ ب: D-Fructose؛

ج: D-Glucose؛ د: D-Mannitol؛ ه: محیط حداقل (شاهد منفی) ؛ و: Raffinose؛ ز: Sucrose؛ح: Xylose

جدول 1- ویژگی‏های رشد، اسپوردهی و رنگ میسلیوم‌های رویشی و هوایی سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012بر روی محیط‌های کشت مختلف

محیط کشت

میزان رشد (cfu/ml) پس از 4 روز

اسپوردهی

رنگ میسلیوم

میسلیوم هوایی

GYM

108×1

+

زرد پررنگ

سفید

LB

105×6

-

زرد پررنگ

-

PDA

107×2/1

-

زرد پررنگ

-

Nutrient Broth

106×7/3

+

سفید متمایل به سبز

سفید

 

 

. بررسی اثر‏‏ دما، اسیدیته اولیه و کلرید سدیم بر رشد و جمعیت باکتری: نتایج پژوهش حاضر نشان داد که اسیدیته اولیه و دمای رشد بهینه برای این سویه به ترتیب 7 و 28 درجه سانتی‏گراد ‌است. با افزایش اسیدیته از دامنه 5 تا 7 جمعیت میکروبی افزایش یافته و پس از آن کاهش یافت. همچنین، با افزایش دما از میزان جمعیت کاسته شد و در دمای 46 درجه سانتی‏گراد ‌هیچ رشدی دیده نشد (جدول 2).

 

جدول 2- اثر‏‏ دما و اسیدیته اولیه محیط غذایی بر جمعیت (cfu/ml) استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012

اسیدیته

دمای 28 درجه سانتی‏گراد

دمای 37 درجه سانتی‏گراد

5

105×2

105×1

6

106×2

105×8

7

107×3/3

107×1

8

106×2/4

106×7/3

 

نتایج بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم بر جمعیت میکروبی نشان داد که بهترین غلظت کلرید سدیم 300 میلی‏‏مولار است به طوری که از غلظت صفر تا 300 میلی‏‏مولار میزان جمعیت میکروبی افزایش یافته و پس از آن میزان جمعیت کاسته شد (شکل‌های 2 و 3).

 

 

شکل 2- اثر غلظت‌های صفر تا 400 میلی‏‏مولار کلرید سدیم بر رشد سلول در میلی‏لیتر سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012

 

شکل 3- اثر‏‏ غلظت‌های صفر تا 400 میلی‏‏مولار کلرید سدیم بر وزن خشک توده زیستی استرپتومایسس رایموسوس سویه
 C-2012

 

 

. بررسی میکروسکوپی اثر‏‏ کلرید سدیم بر میسلیوم و توده زیستی باکتری: نتایج رنگ آمیزی گرم توده میسلسومی باکتری در محیط حاوی غلظت‌های متوالی نمک نشان داد که نمک موجب کاهش طول میسلیوم‌های باکتری و کوتاه و کلفت شدن آن‌ها می‏شود (شکل 4).

 

. بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم بر تولید متابولیت‌های فرار ضد قارچی: نتایج این آزمون نشان داد که در تمامی موارد با افزایش میزان شوری، اثر‏‏ بازدارندگی سویه
C-2012 بر قارچ‌های بیمارگر گیاهی افزایش یافت. همچنین، مشخص شد نمک اثر بازدارندگی بر تولید متابولیت‌های فرار ندارد (جدول 3).

 

 

 

شکل 4- اثر‏‏ نمک بر میسلیوم‌های استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012. الف: محیط فاقد نمک: میسیلیوم‏های بلند و منشعب؛

ب: محیط حاوی 300 میلی‌مولار نمک: میسیلیوم‏های کوتاه و غیرمنشعب

 

جدول 3- تولید و اثر بازدارندگی متابولیت‌های فرار ضد قارچی در غلظت‌های مختلف کلرید سدیم توسط سویه استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012

بیمارگر قارچی

درصد بازدارندگی رشد در غلظت‏های مختلف کلرید سدیم

صفر میلی‌مولار

100 میلی‌مولار

200 میلی‌مولار

300 میلی‌مولار

R. solani

c 33

c 37

b 47

a64

F. solani

c 22

c 27

b 45

a 61

Phytophthora sp.

c 20

b 26

a 41

a 43

 

جدول 4- تولید و اثر بازدارندگی متابولیت‌های مایع ضد قارچی در غلظت‌های مختلف کلرید سدیم توسط سویه استرپتومایسس رایموسوس سویهC-2012

بیمارگر قارچی

درصد بازدارندگی رشد در غلظت‏های مختلف کلرید سدیم

صفر میلی‌مولار

100 میلی‌مولار

200 میلی‌مولار

300 میلی‌مولار

R. solani

b 45

a 60

c 23

c28

F. solani

b 53

a 70

c 21

c 21

Phytophthora sp.

d 26

c 67

a 79

b 70

 

 

 

. بررسی اثر‏‏ کلرید سدیم بر تولید متابولیت‌های مایع ضد قارچی: نتایج نشان داد که در تقابل با Rhizoctonia solaniو Fusarium solani با افزایش میزان شوری، توان بیوکنترلی سویه C-2012 کاهش یافت. اما در تقابل با Phytophthora sp.. با افزایش میزان شوری، توان بیوکنترلی آن افزایش یافت (جدول 4).

. بررسی اثر‏‏ کاربرد همزمان قارچکش ویتاواکس بر سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012: بررسی‌ها نشان داد که سویه C-2012 قادر به رشد در هیچ یک از غلظت‌های ویتاواکس نیست.

. بررسی اثر‏‏ پلی‌مر هیدروژل (به عنوان حامل) بر باکتری: نتایج نشان دادند که سویه C-2012 در همه غلظت‌های پلی‌مر سوپر جاذب رشد کرده (cfu/ml 108×2/1) و تفاوت جمعیتی با غلظت صفر به عنوان شاهد از خود نشان نداد.

. بررسی جذب و بازپس دهی متابولیت‌های تولیدی باکتری به پلی‌مر هیدروژل: نتایج نشان داد که طی انبساط و انتقباض پلی‌مر در این آزمون بازپس دهی آرام متابولیت‌های مایع میکروبی بر سطح فویل آلومینیوم به طور کامل رخ داده و دوباره بافت روشن پلی‌مر در انتهای آزمون مشاهده شد. این موضوع نشان دهنده توان مناسب بازپس بدهی متابولیت‌های جذب شده در پلی‌مر سوپر جاذب است.

. پوشش‌دهی باکتری بر سطح پلی‌مر هیدروژل: شکل نهایی پلی‌مر سوپر جاذب پس از استقرار باکتری بر آن دچار تغییر شد و توان جذب و نگهداری آب (با ظرفیت قبل از استقرار باکتری) را از دست داد. بنابراین، در ترکیب فرمولاسیون از آن استفاده نشد و بستر ماسه برای دستیابی به فرمول نهایی انتخاب و سایر آزمایش‌ها بر روی آن انجام شد (شکل 5).

. بررسی اثر‏‏ لیوفیلیز بر جمعیت سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012: نتایج نشان داد که آب‏گیری کامل در میزان ماندگاری جمعیت میکروبی اثر‏‏ دارد و افزایش طول آبگیری به ماندگاری جمعیت کمک می‏‏کند. یک ماه پس از نگهداری فرمولاسیون اولیه، جمعیت میکروبی در نمونه‌هایی که 3 و 6 ساعت لیوفیلیز شده بود به ترتیب cfu/g 107×3 و cfu/g109×2 بود (شکل 6). جمعیت باکتری بلافاصله پس از تهیه فرمولاسیون (روز اول) cfu/g109×2 بود.

 

 

 

شکل 5- پوشش‌دهی باکتری بر روی پلی‌مر هیدروژل. الف: هیدروژل پیش از پوشش با باکتری که دارای رنگ سفید با دانه‏بندی یک دست است؛ ب: هیدروژل پس از پوشش با باکتری و تغییر رنگ و اندازه پلی‏مر بر اثر پوشش با سلول‏های باکتری

 

 

استفاده از نمونه آب‏گیری شده (لیوفیلیزه) و مخلوط کردن آن با آسیاب برقی، جمعیت میکروبی در فرمولاسیون نهایی را در مقایسه با نمونه آبگیری نشده و مخلوط شده با همزن دستی افزایش داد و موجب ماندگاری بیشتر باکتری در طول زمان شد. (جدول 5).

 

جدول 5- اثر‏‏ آسیاب برقی و آبگیری توده زیستی بر ماندگاری جمعیت استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012

نوع تیمار توده زیستی

جمعیت (cfu/g)

آبگیری نشده –همزن دستی

105×3/1

آبگیری نشده -آسیاب برقی

105×6

آبگیری شده –همزن دستی

106×2

آبگیری شده – آسیاب برقی

106×5/3

 

. بررسی زنده مانی سویه C-2012 در طول زمان: بررسی جمعیت باکتری در فرمولاسیون اولیه نشان داد که تعداد باکتری زنده موجود در نمونه با طول زمان کاهش می‏یابد. این جمعیت سنجی به مدت 6 ماه با فاصله هر یک ماه یک بار تکرار شد (جدول 6).

. اثر کلرید سدیم بر زنده‏مانی سویه C-2012 در فرمولاسیون نهایی: نتایج نشان داد که جمعیت باکتری در فرمولاسیون نهایی حاوی 300 میلی‏‏مولار نمک پس از سه سال در حدود cfu/g 106×8 و 

در فرمولاسیون بدون نمک در حدود cfu/g 104×4 بود. همچنین، در نمونه‌های بدون نمک آلودگی‌های قارچی و باکتریایی ناخواسته مشاهده شد (جدول 7).

 

جدول 6- زنده مانی جمعیت (cfu/g) استرپتومایسس رایموسوس سویهC-2012 در طول زمان

ماه نخست

ماه دوم

ماه سوم

ماه چهارم

ماه پنجم

ماه ششم

107 ×7

107 ×6

107 ×4

107 ×2/3

107 ×3/2

107 ×8/1

 

جدول 7- اثر‏‏ کلرید سدیم افزوده شده به فرمولاسیون بر میزان زنده‏مانی جمعیت (cfu/g) سویه استرپتومایسس رایموسوس C-2012

زمان (ماه)

1

2

3

4

5

6

18

24

36

فاقد نمک

109×3

109×7/2

109×1/2

109×5/1

109×1

107×5

106×3

106×2/1

104×4

حاوی نمک

109×40

109×36

109×31

109×24

109×17

109×10

108×5/0

106×22

106×8

 

 

شکل 6- نمای ظاهری توده میکروبی در‏‏ اثر‏‏ دستگاه لیوفیلیز

الف) توده زیستی پیش از آبگیری (لیوفیلیز) ب) 3 ساعت پس از لیوفیلیز (عدم آبگیری کامل) ج) 6 ساعت پس از لیوفیلیز (آبگیری کامل). نمونه‏های الف و ب بر خلاف نمونه ج، به علت‏‏ وجود رطوبت در متن توده میکروبی، هنوز دارای فعالیت زیستی بوده و برای فرمولاسیون مناسب نیستند.


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

استرپتومایسس از میکروارگانیسم‌های بسیار با ارزش در عرصه‌های گوناگون زندگی بشر از جمله کشاورزی و پزشکی به شمار می‌آیند. این باکتری‌ها در عرصه کشاورزی با عنوان باکتری‌های کلونیزه کننده ریزوسفر، عوامل کنترل قارچ‌های بیماری‏زای گیاهی و همچنین، تحریک کننده رشد گیاهان معرفی می‏شوند (18). بررسی ویژگی‌های عوامل کنترل زیستی، مطالعه زنده‏مانی و حفظ ویژگی‌های زیستی این گروه میکروبی از عوامل مهم در زمینه توسعه آن‌ها برای استفاده در مدیریت پاتوژن‌ها به شمار می‌آید. این موضوع در تولید انبوه و فرمولاسیون اهمیت ویژه‌ای دارد (9). بیشتر بررسی‏های انجام شده بر روی کاربرد عوامل بیوکنترل به شکل سوسپانسیون سلولی بوده است و این نوع از کاربرد نمی‏تواند در شرایط مزرعه عملی باشد. فناوری‏ای که نتواند در مزرعه کاربر داشته باشد نیز نمی‏تواند سبب توسعه عملی عوامل بیوکنترل در صنعت شود (19). در این مطالعه، شرایط بهینه رشد و فرمول نهایی قابل استفاده در شرایط مزرعه و همچنین دارای زنده‏مانی بالای یک سویه بومی از استرپتومایسس رایموسوس با نامC-2012(17) گزارش شده است.

مطالعات گوناگون نشان می‏دهند دستیابی به شرایط بهینه کشت یک سویه میکروبی نقش بالایی در موفقیت آن در عرصه صنعت و بازار دارد. برای این منظور باید متغیرهای مؤثر در این فرآیند شامل: انتخاب نوع محیط کشت مناسب با عامل‏های غذایی مناسب و طراحی و توسعه کشت با تراکم سلولی بالا با حفظ فیزیولوژی سلول ارزیابی شوند (20- 22). بررسی‌ها نشان داد که سویه C-2012 در مخلوط گلوکز، عصاره مخمر و جو به ترتیب به میزان 4، 4 و 10 گرم در لیتر دارای بالاترین مقدار رشد بود. همچنین، مشخص شد بهترین رشد در اسیدیته 7 انجام می‏شود. نتایج مطالعه اثر‏‏ منابع کربنی نشان داد که فروکتوز، گلوکز و مانیتول از منابع کربنی مناسب برای رشد این سویه هستند. استفاده از این منابع در رشد این سویه اهمیت داشته و می‌تواند در تولید فرمول نهایی و رسیدن به جمعیت ایده‏آل مؤثر باشد. در بررسی اثر‏‏ افزودنی کلرید سدیم به کشت غذایی برای بهینه‏سازی رشد میکروبی مشخص شد این سویه استرپتومایسس توان زیستی خود مانند تولید متابولیت‌های ثانویه گوناگون به ویژه متابولیت‌های مؤثر در کنترل زیستی را حفظ نموده و همانند شرایط نرمال توانایی کنترل بیمارگرهای گیاهی را دارد.

پایداری کودها و عوامل کنترل زیستی، در طی انبارداری و پس از استفاده یکی از مشکلاتی است که بر سر راه تولید قرار دارد. در ایران بررسی چندانی در این زمینه انجام نشده است. بیشتر بررسی‏های انجام شده مربوط به مسائل آزمایشگاهی سویه‏های بیوکنترلی بوده است تا فرمولاسیون مناسب با پایداری و ماندگاری بالا (1 و 7). مطالعه در زمینه افزودنی‌هایی که بتواند زمینه پایداری عوامل بیوکنترلی را فراهم کند کمک شایسته‌ای در توسعه آن‌ها خواهد داشت. در این رابطه، نقش فرمولاسیون کلیدی است (9). افزودن کلرید سدیم به فرمولاسیون نهایی موجب حفظ جمعیت باکتری در محدوده cfu/g 106 (22 میلیون سلول در هر گرم) تا سه سال پس از تولید شد. این نتایج نشان می‌دهد که افزودن کلرید سدیم موجب حفظ جمعیت به میزان 200 برابر بیشتر در مقایسه با محیط بدون کلرید سدیم می‌شود. همچنین، کلرید سدیم موجود در فرمولاسیون موجب کاهش آلودگی‌های مربوط به اسپورها و یاخته‏های خارجی ساپروفیتی شد. از آنجا که این باکتری یک استرپتومایسس هالوفیل (نمک دوست ملایم) (17) است، افزودن کلرید سدیم به محیط کشت و فرمولاسیون نهایی نه تنها جمعیت آن را به طور معناداری افزایش داد، بلکه با اثر‏‏ منفی بر زنده‏مانی سایر میکروارگانیسم‌ها خلوص محصول را افزایش داد. بررسی‏های دیگر نیز نشان می‏دهند یافتن ماده‏ای که بتواند بر روی پایداری و افزایش ویژگی‏های زیستی جمعیت میکروبی موجود در فرمولاسیون اثر‏‏ مثبت داشته باشد حیاتی است (19).

استرپتومایسس باکتری میسلیوم‏دار بوده و در شرایط نا مساعد اسپور تولید می‏‏کند. از آنجا که این باکتری‌ها نسبت به تنش‌های محیطی مقاوم‏اند، علاوه بر اسپور رشته‌های میسلیومی آن‌ها نیز می‌تواند شرایط نامساعد را تا مدت‌ها تحمل ‏کند (17). آسیاب کردن نمونه آب‏گیری شده همراه با ماسه بادی (حامل میکروبی) رشته‌های میسلیومی را تا حد امکان به قطعات کوچک‏تر شکسته و جمعیت باکتری را در فرمولاسیون نهایی بالا برد. این در حالی است که در روش مخلوط‏سازی با همزن دستی امکان شکسته شدن میسلیوم‌ها وجود ندارد. شرایط نگهداری فرمولاسیون در حفظ جمعیت میکروبی بسیار مهم بوده و می‌تواند در میزان اثرگذاری و حتی بازارپسندی آن نقش کلیدی داشته باشد. بررسی‏ها نشان می‏دهند خشک کردن همراه با انجماد سریع (لیوفیلیز کردن) یکی از بهترین انواع روش‌ها در نگهداری جمعیت میکروبی به شمار می‌آید. پودر حاصل از این فرآیند قابلیت نگهداری بیشتری داشته و حمل و نقل آن نیز ایمن‏تر است (19 و 23). در این مطالعه نیز لیوفیلیز کردن توده میکروبی توانست زنده‏مانی سویه مورد مطالعه را به میزان زیادی در حامل ماسه بادی افزایش دهد.

در پایان باید اشاره کرد در بهینه‏سازی شرایط غذایی استرپتومایسس رایموسوس سویه C-2012، قند گلوکز به همراه دمای رشدی 28 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته 7 در رشد این سویه از متغیرهای مهم به شمار می‏روند. افزودن کلرید سدیم با غلظت 300 میلی‏مولار به محیط کشت نیز در فراهم کردن تراکم بالای سلولی نقش مهمی دارد. همچنین، توان تولید متابولیت‌های فرار و مایع در حضور کلرید سدیم و کنترل بیمارگرهای قارچی توسط استرپتومایسس رایموسوس نشان می‌دهد این سویه را می‏توان هم در مناطق نرمال و هم دارای تنش شوری استفاده کرد. ماندگاری بالا (3 سال) و غیر‏سوسپانسیونی بودن فرمولاسیون نهایی به دست آمده در این بررسی از دید اقتصادی برای تولید کنندگان عوامل بیوکنترل و کشاورزان بسیار مهم است و می‏تواند زمینه توسعه کنترل زیستی را فراهم کند.



[1]- Streptomyces rimosus strain C-2012

[2]- Rhizoctonia solani AG-4

[3]- Formulations

[4]- Fermentation

[5]- Lyophilisation

[6]- Kaolin

[7]- Talc Powder

[8]- Polymer

[9]- Hydrogel (Superabsorbent)

[10]- Fructose

[11]- Raffinose

[12]- Mannitole

[13]- Sucrose

[14]- Glucose

[15]- Xylose

[16]- Minimum medium

[17]- Colony Forming Unit (CFU)

[18]- Physiological serum

[19]- Suspension

[20]- Volatile metabolites

[21]- Rhizoctoniasolani

[22]- Fusariumsolani

[23]- Phytophthora sp.

[24]- Vitavax

[25]- Centrifuge 

(1)               Karimi E., Rohani H., Zafari D., Khodakaramian Gh., Taghinasab M. Biological control of vascular wilt disease of carnation caused by Fusarium oxysporum f. sp. dianthi by Bacillus and Pseudomonas strains isolated from rhizosphere of carnation. Journal of Science and Technology of Agriculture and Natural Resources 2007; 11 (41): 309- 20.

(2)               Heydari A., Pessarakli M. A review of biological control of fungal plant pathogen using microbial antagonists. Journal of Biological Sciences2010; 10 (4): 273- 90.

(3)               Ezziyyani M., Requena ME., Egea-Gilabert C., Candel ME. Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and Streptomyces rochei in combination. Journal of Phytopathology 2007; 155 (6): 342- 49.

(4)               Gyenis L., Anderson NA., Ostry ME. Biological control of Septoria leaf spot of hybrid poplar in the field. Plant Diseases 2003; 87 (7): 809- 13.

(5)               Tahtamouni MEW., Hameed KM., Saadoun IM. Biological Control of Sclerotinia sclerotiorum Using Indigenous Chitinolytic Actinomycetes in Jordan. Plant Pathology Journal 2006; 22 (2): 107- 14.

(6)               Karimi E., Sadeghi A., Dahaji PA., Dalvand Y., Omidvari M., Nezhad MK. Biocontrol activity of salt tolerant Streptomyces isolates against phytopathogens causing root rotof sugar beet. Biocontrol Science Technology2012; 22 (3): 333- 49.

(7)               Sadeghi A., Hesan AR., Askari H., Aghighi S., Shahidi Bonjar GH. Biological control potential of two Streptomyces isolates on Rhizoctonia solani, the causal agent of damping-off of sugar beet. Pakistan Journal of Biological Sciences 2006; 9 (5): 904- 10.

(8)               Satinder K. Recent advances in downstream processing and formulations of Bacillus thuringiensis based biopestisides. Process Biochemistry 2006; 41 (2): 323- 42.

(9)               Junaid JM., Dar NA., Bhat TA., Bhat AH., Bhat MA. Commercial Biocontrol Agents and Their Mechanism of Action in the Management of Plant Pathogens. International Journal of Modern Plant and Animal Sciences 2013; 1 (2): 39- 57.

(10)           Barihi R., Panahpour E., Mirzaee Beni HM. Super Absorbent Polymer (Hydrogel) and its Application in Agriculture. World of Sciences Journal 2013; 1 (15): 223- 28.

(11)           Ghashghaei S., Emtiazi G. Optimization of polyphosphate production by Bacillus megaterium strain G11. Biological Journal of Microorganism 2013; 2 (7): 69- 78.

(12)           Shirling EB., Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology 1966; 16 (3): 313- 40.

(13)           Sadeghi A., Karimi E., Abaszadeh Dahaji P., Ghorbani Javid M., Dalvand Y., Askari H. Plant growth promoting activity of an auxin and siderophore producing isolate of Streptomyces under saline soil conditions. World Journal of Microbiology and Biotechnology 2012; 28 (4): 1503- 09.

(14)           Narayanasamy P. Microbial Plant Pathogens-Detection and Disease Diagnosis: Bacterial and Phytoplasmal Pathogens Volume 2. New York: Springer; 2011.

(15)           Fiddaman PJ., Rossall S. The production of antifungal volatiles from Bacillus subtilis. Journal of Applied Bacteriology 1993; 74 (2): 119- 26.

(16)           Hagedron C., Gould WD., Bardinelli TR. Rhizobacteria of cotton and their repression of seedling disease pathogens. Applied and Environmental Microbiology 1989; 55 (11): 2743- 797.

(17)           Sadeghi A., Soltani BM., Salehi Jouzni G., Karimi E., Khayam Nekouei M., Sadeghizadeh M. Taxonomic study of a salt tolerant Streptomyces sp. strain C-2012 and the effect of salt and ectoine on lon expression level. Microbiological Research 2014; 169 (2-3): 232- 38.

(18)           Hastuti RD., Lestari Y., Saraswati R., Suwanto A., Chaerani A. Capability of Streptomyces spp. In Controlling Bacterial Leaf Blight Disease in Rice Plants. American Journal of Agricultural and Biological Sciences 2012; 7 (2): 217- 23.

(19)           Nakkeeran S., Fernando WGD., Siddiqui ZA. Plant growth promoting rhizobacteria formulations and its scope in commercialization for the management of pests and diseases. In: Siddiqui ZA., editor. PGPR: Biocontrol and Biofertilization. Netherlands: Springer; 2005: 257- 96.

(20)           Yakhchali B., Afzal-alghoum AH., Yeganegi P., Shorgashti H., Siami A., Alavi SM. Optimization of growth condition of Barvar2 plant growth promoting Bacteria. Iranian Journal of Biology 2011; 24 (4): 494- 07.

(21)           Riesenberg D., Guthke R. High–Cell–Density Cultivation of microorganisms. Applied Microbiology and Biotechnology 1999; 51 (4): 422- 30.

(22)           Choi SH., Son MJ., Kim SH., Choi SY., Lee YH., Choi JE., An G. Isolation and Medium Development of the Actinomycetes, Streptomyces griseofuscus CNU-A91231, Inhibiting Phytopathogenic Fungi. Korean Journal of Microbiology and Biotechnology2009; 37 (4): 322- 32.

(23)           Formulation of a Streptomyces Biocontrol Agent for the Suppression of Rhizoctonia Damping-off in Tomato Transplants. Biological Control 2002; 23 (3): 245- 53.