جداسازی باسیلوس ‏های مولد پلی‏ هیدروکسی ‏آلکانوات (PHA) از پساب پالایشگاه اصفهان و بررسی شرایط مناسب رشد و تولید پلی‏مر در کشت غوطه‎ور

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

2 استادیار گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

3 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه اصفهان، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: هدف از مطالعه حاضر، جداسازی انواع باسیلوس مولد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات از پساب پالایشگاه نفت اصفهان و تعیین شرایط مناسب تولید بوده است. پساب‏های نفتی از لحاظ منابع کربن غنی هستند و منابع نیتروژن و فسفر ضعیفی دارند. مهم‏ترین‏ عامل تولید دانه‏های درون سلولی، افزایش نسبت منبع کربن به نیتروژن است؛ بنابراین به نظر می‏رسید میکروارگانیسم‏های تولید کننده پلی‏هیدروکسی بوتیرات در آن‏ها ‏یافت شوند. ‏‏‏

مواد و روش‏‏ها: انواع باسیلوس از پساب پالایشگاه اصفهان جداسازی شد‏ند. پلی‏هیدروکسی بوتیرات با استفاده از رنگ آمیزی تأیید و با روش‏ هضمی استخراج شد‏. شرایط مناسب تولید پلی‏مر در محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی بررسی شد. میزان تولید با استفاده از روش‏های اندازه گیری وزن خشک و سنجش غلظت بر اساس جذب نوری بررسی شد. ‏‏‏

نتایج: در بین انواع باسیلوس‏ جدا شده جدایه‏های ‏B1 و B2 تولید کننده پلی‏هیدروکسی بوتیرات بودند. محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی به علت داشتن بیش‏ترین‏ نسبت کربن به نیتروژن (برابر با 15)، بهترین محیط کشت تولید پلی مر بود. بیش‏ترین‏ میزان تولید برای جدایه B1 (به مقدار 367 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) در زمان 72 ساعت گرمخانه‏گذاری، دمای 31 درجه سانتی‏گراد، وجود منبع کربن گلوکز، منبع نیتروژن عصاره مخمر، اسیدیته 7 و هوادهی 120 دور در دقیقه به دست آمد. جدایه B2 نیز در همان شرایط به استثنای دما (32 درجه سانتی‏گراد) بیش‏ترین‏ تولید (به مقدار 473 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) را داشت. همچنین، بیش‏ترین‏ درصد (راندمان) تولید پلی‏مر برای جدایه‏های‏ ‏B1 و B2 به ترتیب، 16/52 و 43/58 درصد گزارش شد. ‏‏‏

بحث و نتیجه‏ گیری: تولید پلی‏ هیدروکسی ‏بوتیرات با مناسب‏سازی ‏شرایط تولید، در هر دو جدایه باسیلوس افزایش یافت. استفاده از پساب‏های نفتی علاوه بر تولید پلاستیک‏های تجزیه‏پذیر، موجب کاهش آلودگی این پساب ‏ها می‏شود. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation of Bacillus sp Producing Polyhydroxyalkanoate (PHA) from Isfahan Refinery Wastewater and Qualification of Production in Submerged Fermentation

نویسندگان [English]

  • Mahsa Keshavarz Azam 1
  • Nafiseh Sadat Naghavi 2
  • Zahra Etemadifar 3
1 M.Sc. of Microbiology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
3 Assistant Professor of Microbiology, Isfahan University, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: The aim of present study was isolation of polyhydroxybutyrate producing Bacillus species from oil refinery waste water, Isfahan, Iran and primarily optimization of production condition. Petroleum wastes are rich of carbon sources and have low amounts of nitrogen and phosphorus sources. AS the most important factor in production of intracellular inclusions is increasing the C/N ratio, it seemed that polyhydroxybutyrate producing microorganisms will be found in these wastes.

Materials and methods: Bacillus species were isolated and purified from oil refinery wastewater. The polymer was verified using different staining procedures. Polymer was extracted by digestion method and the optimum production conditions were investigated in minimal salt medium with the organic carbon source by submerged fermentation. Production of polyhydroxybutyrate was studied using dry weight and optical density measurement.

Results: Between various isolated Bacillus strains, two of them (B1 and B2) were polyhydroxybutyrate producers. Maximum PHA production based on dry weight and concentration were obtained for strain B1 after 72 hours incubation, at 31°C, in the presence of glucose as carbon source and yeast extract as nitrogen source, pH=7, and aeration in 120 rpm and for strain B2 in the same condition, except optimal temperature which was 32°C. The most production amounts were 367 mg.ml-1 for B1 and 473 mg.ml-1 for B2 isolates. Also the most polymer percentage was 52/16 and 58.43 for B1 and B2 isolates respectively.

Discussion and conclusion: The results showed that the production of polyhydroxybutyrate was increased by optimization of the conditions in both isolates. Using petroleum wastes as well as production of biodegradable plastics, leads to decontamination of theses wastes.

کلیدواژه‌ها [English]

  • polyhydroxybutyrate
  • Biodegradable plastics
  • Bacillus
  • Optimized production conditions

مقدمه.

امروزه بیشتر پلاستیک‏های تولید شده در بازار از فرآورده‏های نفتی و زغال سنگ به دست می‏آیند و برگشت آن‏ها ‏به محیط چند هزار سال طول می‏کشد (1). علت اصلی زیست تخریب‏ناپذیر بودن این پلاستیک‏ها توسط موجودات تجزیه کننده، طویل بودن طول مولکول پلی‏مر و پیوند قوی بین مونومرهای آن است (2). بنابراین، پژوهشگران در پی جایگزین کردن پلاستیک‏های زیستی یا تجزیه‏پذیر با این پلاستیک‏ها هستند.

پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات[1] متداول‏ترین گروه پلی‏استرهای تجزیه‏پذیر یا همان پلی هیدروکسی‏آلکانوات‏ها[2] است که توسط تخمیر باکتریایی قند یا چربی تولید می‏شود و به شکل درون سلولی توسط طیف وسیعی از میکروارگانیسم‏های پروکاریوت از جمله گونه‏های باسیلوس[3]، ازتوباکتر[4]، آلکالیجنز[5]، سودوموناس[6] و ریزوبیوم[7] در شرایطی مانند محدود بودن نیتروژن، فسفر، سولفات و بالا بودن میزان کربن ساخته می‏شوند. این پلی‏مرها که در واقع پلی‏استرهای میکروبی به حساب می‏آیند (3). چگالی بیش‏تری نسبت به آب دارند، به قسمت‏های عمیق انتقال یافته و به وسیله میکروارگانیسم‏های موجود در رسوبات تجزیه می‏شوند. همچنین، به علت قابلیت تجزیه‏پذیری، غیر‏سمی بودن، انعطاف‏پذیری و ترموپلاستیک بودن نسبت به سایر پلی‏استرهای زیست‏تخریب‏پذیر مورد توجه بیشتری قرار گرفته‏اند (4).

پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات (رایج‏ترین پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات) در سال 1926، در مؤسسه پاستور پاریس در سیتوپلاسم باسیلوس مگاتریوم[8]  کشف شد. در سال 1960، روش اسپکتروفتومتری به عنوان روشی آسان و دقیق برای سنجش کمی پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات معرفی شد (5). پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات به عنوان دانه‏های ذخیره‏ شده در سلول باکتری که دارای عملکرد کمابیش مشابه نشاسته و گلیکوژن است، در سال 1973 به رسمیت شناخته شد (3). در سال 1981، فرآیند تولید زیستی کوپلی‏مرهای پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات از منابع کربن متفاوت ارایه شد (6). در آن زمان، پلی‏مر حاصل، بیوپل[9] نامیده شد. پس از آن، پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات درکاربردهای پزشکی مانند اندام‏های مصنوعی، نخ‏های بخیه و روکش کپسول‏های خوراکی استفاده شد (4). برای تعیین تولید پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات از رنگ‏آمیزی با سودان سیاه به عنوان روش غیر اختصاصی تأیید پلی‏مر استفاده می‏شود (7). برای استخراج پلی‏مر روش‏های مختلفی پیشنهاد شده است که از جمله آن‏ها ‏استخراج با کلروفرم و یا از طریق اسیدی کردن پالایه محیط کشت است (8- 10).

در گذشته مطالعات فراوانی در زمینه تولید پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات‏ها در دنیا و در ایران انجام شده است. در بررسی مختارانی[10] و همکاران در سال 2008 از میکروارگانیسم‏های لجن فعال فاضلاب برای تولید پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات‏ها، بدون جداسازی باکتری‏های تولید کننده استفاده شده است. بهینه‏سازی ‏منابع ازت و کربن موجب افزایش تولید پلی‏مر شده است (11). در بررسی گودرزی[11] و همکاران در سال 2011، ‏جدایه‏ای از باسیلوس ترنجینسیس از خاک آلوده به پساب کارخانه دلسترسازی شناسایی شد (12). در سال 2008 محسن‏پور[12] و همکاران، ‏جداسازی ژن بتاکتوتیولاز که تولید کننده آنزیم یک مرحله کلیدی در تشکیل کوپلیمرهای تجزیه‏پذیر زیستی است را از باکتری رالستونیا اوتروفا[13] ‏انجام دادند. این جداسازی با هدف اصلاح ویژگی‏های پلاستیک‏های تجزیه‏پذیر زیستی برای بهتر شدن کیفیت و کمتر شدن عیوب این پلاستیک‏ها مانند شکنندگی و کم استقامت بودن آن‏ها ‏بود (13).

با توجه به این که روی تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات توسط باکتری‏های موجود در پساب‏های نفتی مطالعه منتشر شده‏ای به ویژه در ایران یافت نشد و با وجود غنی بودن این پساب‏ها از ترکیبات کربنی، پژوهش حاضر با هدف تهیه جدایه‏های تولید کننده این پلی‏مر از پساب پالایشگاه نفت اصفهان انجام شد. همچنین، پس از بررسی تولید پلی‏مر، افزایش توانایی تولید توسط ‏جدایه‏ها در کشت غوطه ور، با مناسب‏سازی ‏اولیه زمان تولید، منابع کربن و نیتروژن، اسیدیته و سرعت همزنی بررسی شد.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

جداسازی باکتری‏ها: از آن جا که پساب‏های نفتی از منابع کربن غنی و منابع نیتروژن و فسفر ضعیف هستند، در پژوهش حاضر، از پساب پالایشگاه اصفهان (حوضچه هوادهی) به عنوان نمونه برای جداسازی باکتری‏های مولد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات استفاده شد. انواع باسیلوس با استفاده از شوک حرارتی و کشت بر روی محیط کشت نوترینت آگار (شارلو، اسپانیا) در دمای 30 درجه سانتی‏گراد جداسازی شدند. باکتری‏های جداسازی شده با رنگ آمیزی گرم بررسی و با آزمون‏های بیوشیمیایی مانند همولیز بر روی آگار خون‏دار، هیدرولیز لسیتین، متیل رد، وژپرسکوئر، اکسیداز، تخمیر قند‏ها، مصرف سیترات، هیدرولیز نشاسته، هیدرولیز کازئین و مشاهده اجسام کنار اسپور شناسایی شدند.

.بررسی تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات در محیط‏ کشت‏های مختلف: به منظور تولید پلی‏مر سه محیط کشت لوریا برتانی براث[14]، E2 و حداقل نمکی با منبع کربن آلی بررسی شد. این محیط‏های کشت‏ هر یک شامل مواد و شرایط متفاوتی هستند و در پژوهش‏های قبلی پیشنهاد شده بودند. یکی از اهداف پژوهش حاضر بررسی بهترین محیط کشت از میان این سه محیط کشت بوده است.

محیط کشت لوریا برتانی براث شامل ترکیبات گلوکز 10 گرم در لیتر (مرک، آلمان)، کلرید سدیم 10 گرم در لیتر (مرک، آلمان)، عصاره مخمر 5 گرم در لیتر (شارلو، اسپانیا)، تریپتون 10 گرم در لیتر (شارلو، اسپانیا) با ‏اسیدیته 7 است (14). محیط کشت E2 مایع نیز شامل ترکیبات فسفات آمونیوم هیدروژن سدیم، 4 آب 5/3 گرم در لیتر، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 7/3 گرم در لیتر، فسفات منو هیدروژن پتاسیم 7/5 گرم در لیتر، سولفات منیزیم 7 آب 2/0 گرم در لیتر و گلوکز 10 گرم در لیتر و یک میلی‏لیتر از محلول فلزی شامل ترکیبات سولفات آهن 7 آب 78/2 گرم در لیتر، کلرید کلسیم 2 آب 47/2 گرم در لیتر، کلرید منگنز 4 آب 98/1 گرم در لیتر، کلرید کبالت 6 آب 38/2 گرم در لیتر، کلرید مس 2 آب 17/0 گرم در لیتر و سولفات روی 7 آب 29/0 گرم در لیتر با اسیدیته 7 (همه مواد از شرکت مرک آلمان) است (15). محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی شامل فسفات منو هیدروژن پتاسیم یک گرم در لیتر، فسفات دی هیدروژن پتاسیم 2/0 گرم در لیتر، کلرید سدیم یک گرم در لیتر، کلرید کلسیم 2 آب 002/0 گرم در لیتر، سولفات آمونیوم 1 گرم در لیتر، سولفات منیزیم 7 آب 5/0 گرم در لیتر، سولفات مس 5 آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات روی 7 آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات منگنز یک آب 001/0 گرم در لیتر، سولفات آهن 7 آب 001/0 گرم در لیتر و گلوکز 10 گرم در لیتر با ‏اسیدیته 7 (همه مواد از شرکت مرک آلمان) است. به علت اضافه شدن قند گلوکز، باکتری‏های هتروتروف هم در آن قادر به رشد هستند (14). شایان ذکر است با محاسبه نسبت مولکول‏ها، نسبت کربن به نیتروژن (C/N) در محیط‏های کشت یاد شده برابر با 2 در محیط کشت لوریا برتانی براث، 5 در محیط کشت E2 و 15 در محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی است. محیط‏های کشت یاد شده به علت جلوگیری از تجزیه قند موجود در آن‏ها، در دمای 110 درجه سانتی‏گراد استریل شدند.

یک کلونی خالص از کشت باکتریایی توسط لوپ به محیط نوترینت براث (شرکت شارلو) تلقیح شد و تا زمان رسیدن به کدورت نیم مک فارلند (حدود 18 ساعت) در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد. پس از آن یک میلی‏لیتر از محیط کشت‏ یاد شده برداشته و به محیط کشت‏های تولید پلی‏مر در ارلن‏های 250 میلی‏لیتر اضافه شد‏. ارلن‏ها در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و هوادهی 120 دور در دقیقه، در انکوباتور شیکردار (شرکت شاین سینگ[15]) انکوبه شدند. نمونه‏برداری برای تعیین وزن خشک سلولی و تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات در زمان‏های 24، 48 و 72 ساعت انجام شد.

.ردیابی پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات تولید شده در جدایه‏ها.

رنگ آمیزی سودان سیاه: بر روی گستره خشک شده سلولی، رنگ سودان سیاه[16] (مرک، آلمان) ریخته و پس از 15 دقیقه با زایلل[17] (مرک، آلمان) شسته شد. سپس، به مدت 10 ثانیه سافرانین[18] (مرک، آلمان) اضافه و با آب شستشو داده شد. پس از خشک شدن، دانه‏های پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات با رنگ سیاه در سلول‏های باکتری با رنگ قرمز قابل مشاهده بود (15).

.رنگ آمیزی نیل بلو برای مشاهده میکروسکوپی: برای رنگ آمیزی، 100 میکرولیتر از محیط کشت تولید برداشته و با 10 میکرولیتر از رنگ نیل بلو مخلوط شد‏. گرانول‏های پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات با درخشش آبی توسط میکروسکوپ فلئورسنت مشاهده شد‏ (16).

.رنگ‏آمیزی نیل بلو به شکل مستقیم بر روی کلونی‏های زنده: ابتدا محیط کشت جامد حداقل نمکی با منبع کربن آلی با محتویاتی که پیش از این شرح داده شد به علاوه 5/1 درصد آگار و رنگ نیل بلو با غلظت 25/0 میلی‏گرم در میلی‏لیتر در حلال دی‏متیل‏سولفوکساید ساخته شد. کلونی باکتری‏های تلقیح شده، پس از طی شدن 72 ساعت دوره گرمخانه‏گذاری در 30 درجه سانتی‏گراد در معرض نور فرابنفش با طول موج 460 نانومتر قرار گرفت و درخشش فلئورسنت آن‏ها ‏بررسی شد‏ (16).

.استخراج و خالص‏سازی ‏پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات: 50 میلی‏لیتر از محیط کشت‏های یاد شده برای تولید پلی‏مر با سرعت 9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به رسوب حاصل 20 میلی‏لیتر محلول سدیم هیپوکلریت اضافه شد. گرمخانه‏گذاری در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. پس از سانتریفوژ با سرعت 2300 بر اساس واحد g و به مدت 30 دقیقه، رسوب سفید رنگ حاصل توسط الکل و استون به نسبت دو به یک شسته و به طور کامل در دمای 50 درجه سانتی‏گراد خشک شد. سپس، برای استخراج پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات، به رسوب سفید رنگ 10 میلی‏لیتر کلروفرم اضافه شد و در 50 درجه سانتی‏گراد به مدت یک ساعت قرار گرفت (17). پس از سرد شدن، محلول پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات در کلروفرم در یک بشقابک تمیز ریخته شد و برای تبخیر کلروفرم در زیر هود شیمیایی قرار گرفت. پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات به شکل یک لایه نازک در ته لوله باقی ‏ماند که به راحتی قابل جدا شدن بود (18).

سنجش پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات: برای سنجش کمی پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات پس از استخراج و خالص‏سازی، پلی‏مر به دست آمده توسط ترازوی دقیق عددی توزین شد. درصد پلی‏مر طبق رابطه زیر به دست آمد (19).

 

 

 

×100

مقدار وزن خشک پلی هیدروکسی بوتیرات

= درصد پلی هیدروکسی بوتیرات

مقدار وزن خشک رسوب سلولی

 

 

همچنین، برای تعیین غلظت پلی‎هیدروکسی بوتیرات یک میلی‏لیتر از محیط کشت تولید پلی‏مر با سرعت ‏9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شد. به رسوب حاصل یک میلی‏لیتر محلول سدیم هیپوکلریت یک درصد اضافه شد. گرمخانه‏گذاری ‏در دمای 37 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 دقیقه انجام گرفت. سپس، سانتریفوژ و شستشوی رسوب سفید رنگ توسط آب مقطر انجام شد. افزون بر این، رسوب حاصل توسط الکل و استون به نسبت دو به یک شسته و در نهایت، در دمای 50 درجه سانتی‏گراد به طور کامل خشک شد‏. سپس، یک میلی‏لیتر سولفوریک اسید 98 درصد به آن اضافه شد و در دمای 100 درجه سانتی‏گراد به مدت 10 دقیقه در حمام جوش قرار گرفت. سولفوریک اسید غلیظ، پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات را تبدیل به کورتونیک اسید[19] می‏کند. پس از سرد شدن محلول، جذب نوری کورتونیک اسید در طول موج 235 نانومتر در مقابل سولفوریک اسید غلیظ به عنوان شاهد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مجهز به نور فرابنفش خوانده و غلظت پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات بر‏اساس منحنی استاندارد این پلی‏مر بررسی شد (5).

رسم منحنی استاندارد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات: برای رسم منحنی استاندارد غلظت‏های 1 تا 7 میلی‏گرم در میلی‏لیتر از پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات خالص به یک میلی‏لیتر محلول سدیم هیپوکلریت یک درصد اضافه شد و به مدت 10 دقیقه در حمام آب جوش قرار گرفت. سپس، جذب نوری کورتونیک اسید تولید شده در طول موج 235 نانومتر اندازه‏گیری شد (5). منحنی استاندارد ترسیم شده در شکل 1 مشاهده می‏شود.

 

شکل 1- منحنی استاندارد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات بر اساس جذب نوری غلظت‏های مختلف در طول موج 235 نانومتر

 

.مناسب‏سازی ‏رشد توده زیستی سلولی و تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات: برای هر مرحله از مناسب‏سازی، محیط کشت با شرایط آزمایش مورد نظر ساخته شد و تعداد 108x3 سلول باکتری (بر اساس استاندارد 5/0 مک فارلند) به 250 میلی‏لیتر این محیط تلقیح شد. مراحل مناسب‏سازی ‏بر اساس نوع محیط کشت (لوریا برتانی براث، E2 و حداقل نمکی با منبع کربن آلی)، زمان تولید (8، 16، 24، 32، 40، 48، 56، 64، 68، 72 و 76 ساعت)، دما (25، 28، 30، 31، 32، 33، 35، 37 و 39 درجه سانتی‏گراد)، منابع کربن (گلوکز، ساکارز، مانیتول، لاکتوز، فروکتوز، گزیلوز و ملاس به میزان 10 گرم در لیتر)، منابع نیتروژن (تریپتون، عصاره مخمر، کلرید آمونیوم، سولفات آمونیوم به مقدار یک گرم در لیتر)، اسیدیته محیط (5، 6، 7، 8 و 9) و دور شیکر (100، 120، 140، 200 و 250 دور در دقیقه) انجام شد. نحوه چینش آزمایش‏ها بر اساس روش یک متغیر در یک زمان تعیین شد (11).

نتایج.

شناسایی جدایه‏ها: پس از انجام آزمون‏‏های بیوشیمیایی برای شناسایی دو جدایه B1 و B2 نتایج در جدول 1 گزارش شد. بر اساس آزمایش‏های بیوشیمیایی انجام شده، جدایه B1 باسیلوس تورنجنسیس و ‏B2 باسیلوس سرئوس شناسایی شد‏. با توجه به شکل‏های 2 و 3، گرانول‏های PHAتوسط رنگ‏آمیزی سودان سیاه و نیل بلو رؤیت شد. در شکل 4 کلونی‏های حاوی پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات به شکل آبی درخشان مشاهده شد.

 

 

جدول 1- نتایج آزمون‏‏های بیوشیمیایی دو جدایه B1و B2

تولید لستیناز

تخمیر مانیتول

تخمیر گلوکز

تخمیر گزیلوز

مصرف سیترات

هیدرولیز کازیین

هیدرولیز نشاسته

اجسام کنار اسپور

اندول

ژلاتیناز

تولید اکسیداز

MR

VP

همولیز

آزمون‏‏های بیوشیمیایی

+

-

+

-

+

+

+

+

-

+

+

-

+

β

B1

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

+

-

+

β

B2

 

شکل 2- رنگ‏آمیزی سودان سیاه باسیلوس‏ها: گرانول‏های سیاه رنگ پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات در باکتری‏های قرمز مایل به صورتی در جدایه‏های B1 و B2 (الف و ب) زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 1000 برابر

شکل 3- رنگ‏آمیزی نیل بلو باسیلوس‏ها: دانه‏های درخشان پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات در جدایه‏های B1(الف) وB2 (ب) زیر میکروسکوپ فلئورسنت با بزرگنمایی 1000 برابر

شکل 4- رنگ‏آمیزی نیل بلو به شکل مستقیم بر روی کلونی‏های زنده در جدایه‏‏های B1 و B2: کلونی‏های ‏B1 و ‏B2 ‏موجود در بشقابک حاوی رنگ نیل بلو قبل(1) و پس (2) از قرار دادن در معرض اشعه فرابنفش با طول موج 460 نانومتر

 

شکل 5- نمودار بررسی وزن خشک پلی هیدروکسی‏بوتیرات ‏استخراج شده (mg.L-1) از محیط کشت‏های لوریا برتانی براث (LB)، ‏E2 و حداقل نمکی (Minimal) در جدایه‏های B1 و ‏B2 بر اساس زمان (ساعت)

 

 

شکل 6- نمونه پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات خالص شده: پلی‏مر به شکل پودر سفید رنگی به دست آمد.

 

بر اساس شکل 5، نمودار مناسب‏سازی ‏محیط‏ نشان داد، محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی بهترین محیط برای تولید پلی‏مر در باسیلوس‏های جدا شده بود. این محیط کشت دارای بیش‏ترین‏ نسبت کربن به نیتروژن (C/N) نسبت به محیط‏های دیگر است و همین مورد می‏تواند از علت‏های اصلی تولید زیاد پلی‏مر در آن باشد. در این بررسی، پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات به شکل پودر خالص شده به دست آمد. ظاهر پلی‏مر در شکل 6 نشان داده شده است.

بهترین زمان تولید پلی‏مر بر اساس وزن خشک برای هر دو جدایه 72 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری ‏بود (شکل 7).

شکل 8 نشان می‏دهد که بهترین دمای تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات برای جدایه B1 31 درجه سانتی‏گراد و برای جدایه B2 32 درجه سانتی‏گراد بوده است.

شکل 9 نشان می‏دهد بهترین اسیدیته برای تولید پلی‏مر در هر دو جدایه، 7 بوده است.

بر اساس شکل 10 در هوادهی 120 دور در دقیقه بیش‏ترین‏ میزان تولید در هر دو جدایه گزارش شد.

بر اساس شکل‏های 11 و 12 گلوگز به عنوان بهترین منبع کربن و عصاره مخمر به عنوان ‏بهترین منبع نیتروژن گزارش شد.

 

 

 

شکل 7- نمودار ‏مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏های B1 و ‏B2 بر اساس زمان، در شرایط دمای 30 درجه سانتی‏گراد، منبع کربن گلوکز، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.

 

شکل 8- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏های B1 و B2 در شرایط دمایی متفاوت، منبع کربن گلوکز، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن ‏سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانه‏گذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.

 

 

شکل 9- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏‏های B1و B2در شرایط اسیدیته مختلف، منبع کربن گلوکز، دمای 30 درجه سانتی‏گراد، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن ‏سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانه‏گذاری.

 

 

شکل 10- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏های B1 و B2 ‏در‏ شرایط هم‏زنی مختلف، منبع کربن گلوکز، دمای 30 درجه سانتی‏گراد، اسیدیته 7 و منبع نیتروژن سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانه‏گذاری.

 

 

شکل 11- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏‏های B1 و B2 ‏بر اساس منابع کربن. در‏ شرایط دمایی به ترتیب 31 و 32 درجه سانتی‏گراد، منبع کربن متفاوت، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و منبع نیتروژن ‏سولفات آمونیوم و 72 ساعت گرمخانه‏گذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.

 

 

 

شکل 12- نمودار مقایسه غلظت (concentration) پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات و درصد (percent) تولید بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلولی در جدایه‏‏های B1و B2 ‏بر اساس منابع نیتروژن. در‏ شرایط دمایی به ترتیب 31 و 32 درجه سانتی‏گراد، منبع کربن گلوکز، منبع نیتروژن متفاوت، اسیدیته 7، هوادهی 120 دور در دقیقه و 72 ساعت گرمخانه‏گذاری، نتایج میانگین سه بار تکرار آزمایش است.

 

 

بحث و نتیجه ‏‏گیری.

تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات در گونه‏های مختلف باسیلوس در مطالعات قبلی بررسی شده است. یاکسدگ[xx] و همکاران در سال 2004 تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات را در باسیلوس مگاتریوم و باسیلوس سوبتیلیس بررسی کردند (20). آن‏ها ‏بیش‏ترین‏ میزان تولید را مقدار 101 و 162 میلی‏گرم بر لیتر پس از 45 ساعت گرمخانه‏گذاری ‏گزارش نمودند که پس از گذشت 48 ساعت تولید کاهش یافت. در پژوهش حاضر محیط حداقل نمکی به عنوان بهترین محیط تولید گزارش شد که 72 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری، تولید پلی‏مر توسط جدایه B1 به مقدار 67/366 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر و توسط جدایه B2، برابر با 473 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بود. رحمان[xxi] و همکاران در سال 2006 بیش‏ترین‏ مقدار پلی‏مر را در این محیط 350 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر اعلام کردند (21) به علت این که در مطالعات قبلی نیز از محیط کشت حداقل نمکی با منبع کربن آلی استفاده شده است، پژوهش حاضر نشان دهنده افزایش میزان تولید پلی‏مر است. این افزایش می‏تواند به علت توانایی بالاتر جدایه‏های مورد استفاده و حفظ قدرت تولید پلیمر با گذشت زمان گرمخانه‏گذاری ‏باشد. ‏در سال 2010 سانتانام و سیدهرن[xxii]، برای مشاهده گرانول‏های پلی‏هیدروکسی بوتیرات از رنگ آمیزی سودان سیاه استفاده کرده‏اند (15). در این مطالعه با استفاده از این روش‏ گرانول‏های سیاه رنگ موجود در جدایه‏ها مشاهده شد.

از دیگر روش‏های رنگ‏آمیزی، روش اختصاصی نیل بلو بود. در سال 2012 پریتی[xxiii] و همکاران، ‏با استفاده از این روش گرانول‏های درخشان پلی‏هیدروکسی بوتیرات را مشاهده کردند. از مزایای این روش نسبت به استفاده از سودان سیاه، سهولت بیشتر رنگ آمیزی است و به علت این که این رنگ مانع رشد باکتری نمی‏شود، می‏توان آن را قبل از رشد به محیط کشت اضافه و تولید پلی مر را در کلونی‏ها با استفاده از نور UV ردیابی کرد (16). در این پژوهش نیز توسط میکروسکوپ فلئورسنت این گرانول‏ها مشاهده شد.

در پژوهش حاضر از روش جیسیلان[xxiv] و همکاران برای استخراج پلی‏هیدروکسی بوتیرات استفاده شد (17). در این روش از حلال‏‏های سدیم هیپوکلریت، الکل و استون و کلروفرم استفاده شد‏. گرمخانه‏گذاری ‏در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و سانتریفوژ با سرعت 9300 بر اساس واحد g و به مدت 15 دقیقه انجام شد. خالص‏سازی ‏پلی‏مر از روش هان[xxv] و همکاران و با استفاده از کلروفرم انجام گرفت (18).

بیش‏ترین‏ میزان درصد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات برای جدایه‏های B1 و B2، 72 ساعت پس از گرمخانه‏گذاری ‏به ترتیب میزان 43 درصد و 43 درصد اعلام شد. سودش[xxvi] و همکاران در سال 2012 درصد پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات را برای باسیلوس سوبتیلیس به میزان 18 درصد و برای باسیلوس مگاتریوم به میزان 15 درصد اعلام کردند (22). در محیط حداقل نمکی نسبت توده زیستی سلولی به تولید پلی‏مر تعیین کننده درصد پلیمر بود. در پژوهش حاضر درصد تولید نسبت به پژوهش‏های سودش و همکاران افزایش یافت، زیرا نسبت توده زیستی سلولی به تولید پلیمر در مطالعه آن‏ها ‏بیشتر از پژوهش حاضر بود و باعث کاهش درصد تولید شد‏.

برای تعیین شرایط مناسب دما فواصل دمایی دوتایی در نظر گرفته شد. دمای مناسب تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات در جدایه‏ B1، 31 درجه سانتی‏گراد، با میزان تولید 47 درصد و در جدایه B2، 32 درجه سانتی‏گراد با میزان تولید 47 درصد گزارش شد. پس از رسم پروفایل دما، آزمایش یافتن منبع کربن مناسب انجام گرفت. منبع کربن گلوگز به عنوان بهترین منبع برای تولید پلی‏مر تعیین شد که بیش‏ترین‏ درصد تولید برای جدایه‏های B1 و B2، 85/47 و 16/50 درصد اعلام شد. سودش و همکاران تولید در حضور منبع کربن گلوکز را به مقدار 15 و 19 درصد گزارش کردند (22). برکا و تهودی[xxvii] نیز، گلوکز را به عنوان بهترین منبع کربن برای توده سلولی و تولید پلی مر، به میزان 35 درصد گزارش کردند (9). منبع کربن در پژوهش حاضر نیز گلوکز بود، اما مقدار درصد تولید پلی‏مر بیشتر گزارش شد.

همچنین، اسیدیته مناسب تولید برای جدایه‏های B1 و B2، 7 بود که بیش‏ترین‏ درصد تولید در جدایه‏ها به ترتیب 16/52، 40/58 به دست آمد. دور شیکر مناسب رشد و تولید پلی‏مر برای جدایه‏های‏ ‏B1 و B2، هوادهی 100 دور در دقیقه و 120 دور در دقیقه اعلام شد و بیش‏ترین‏ درصد تولید پلی‏مر برای جدایه‏های‏ ‏B1 و B2 به ترتیب، 16/52، 43/58 گزارش شد.

برای سنجش کیفی پلی‏مر از روش اسپکتروفتومتری استفاده شد که با استفاده از آن، غلظت پلی‏مر تعیین شد‏. غلظت پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات برای جدایه‏های ‏B1 و B2، پس از 72 ساعت گرمخانه‏گذاری ‏‏به میزان 3/1 و 5/1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر (بیش‏ترین‏ مقدار تولید پلی‏مر) گزارش شد. در سال 2009 راماداس[xxviii] و همکاران، بیش‏ترین‏ غلظت پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات را یک میلی‏گرم بر میلی‏لیتر برای گونه‏های باسیلوس اعلام کردند (23).

محیط تولید با منابع نیتروژن مختلف قرار گرفت که برای جدایه‏های B1 و B2، عصاره مخمر به عنوان منبع نیتروژن مناسب انتخاب شد. همچنین، بیش‏ترین‏ درصد تولید پلی‏هیدروکسی بوتیرات نیز مربوط به همین منابع نیتروژنی بود که برای جدایه‏های B1 و B2، به ترتیب 16/52 و 40/58 درصد به دست آمد. در مطالعه‏ای در ترکیه با بهینه کردن منبع نیتروژن تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات به وسیله مخمرهای جداسازی شده از چای کمبوجا به 25 درصد وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلول افزایش یافت (24). در بررسی دیگری، با استفاده از سویه‏های کلکسیونی باسیلوس سابتیلیس و باسیلوس مگاتریوم، با تغییر زمان گرمخانه‏گذاری ‏و منبع نیتروژن، تولید تا 77 درصد وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلول افزایش یافته است (20).

در مطالعه حاضر، نتایج به دست آمده از سنجش کمی پلی‏هیدروکسی ‏بوتیرات بر اساس وزن خشک (میلی گرم بر لیتر) و سنجش ‏بر اساس روش اسپکتروفتومتری (تعیین غلظت آن بر اساس میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) نشان داد که این دو نوع سنجش کمابیش بر هم منطبق بود و نتایج مشابهی گزارش شد.

نتایج پژوهش حاضر نشان داد بیش‏ترین‏ درصد تولید پلی‏مر برای جدایه‏های ‏B1 و B2باسیلوس به دست آمده از پساب پالایشگاه به ترتیب، 16/52، 43/58 و بیش‏ترین‏ میزان غلظت پلی مر تولید شده 66/1 و 92/1 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر است.

بررسی مطالعات انجام شده در زمینه بهینه‏سازی ‏شرایط تولید پلی هیدروکسی آلکانوات به وسیله جدایه‏های باکتریایی بومی یا کلکسیونی نشان دهنده نتایج مختلفی است. بررسی تأثیر ترکیبات ازت بر تولید پلی‏هیدروکسی‏آلکانوات‏ها با استفاده از لجن فعال توسط مختارانی و همکاران در سال 2008 انجام شد، آن‏ها ‏بیش‏ترین‏ میزان تولید این پلی استر را هنگام استفاده از عصاره مخمر به عنوان منبع ازت و به میزان 23 درصد بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلول معرفی کردند (11). خسروی دارانی[xxix] و همکاران در سال 2003 با بهینه کردن شرایط تولید از نظر منابع کربن و نیتروژن، هم زنی، دما و زمان تولید توسط باکتری کلکسیونی رالستونیا اتروفا (ATCC 17699) که به عنوان یکی از تولید کننده‏های قدرتمند پلی‏هیدروکسی آلکانوات شناخته شده است، توانستند تولید پلی‏هیدروکسی‏بوتیرات را به حداکثر 18/50 درصد بر اساس وزن خشک پلی‏مر نسبت به وزن خشک سلول افزایش دهند (25). همین پژوهشگران در طراحی آزمایش دیگری توانستند موجب افزایش بیشتری در تولید (85 درصد) به وسیله همان باکتری شوند (26). مقایسه این دو مطالعه، اهمیت روش‏های طراحی آزمایش در تولیدات میکروبی را نشان می‏دهد. در بررسی دیگری گودرزی و همکاران در سال 2011، ‏تولید پلی هیدروکسی آلکانوات توسط باسیلوس ترنجینسیس جداسازی شده از خاک آلوده به پساب کارخانه دلسترسازی را با مناسب‏سازی ‏دما، اسیدیته و هوادهی تا 35 درصد افزایش دادند (12). با وجود این که نتایج بررسی حاضر از میزان تولید در برخی پژوهش‏های دیگر بیشتر است، در مطالعات دیگر، نتایج بالاتری با استفاده از میکروارگانیسم‏های توانمند غیر بومی به دست آمده است. با این وجود که باکتری های مولد پلی هیدروکسی آلکانوات در گزارش قبلی از خاک های آلوده به نفت در مسجد سلیمان توسط کفیل زاده و همکاران جداسازی شده‏اند (27)، بررسی حاضر برای نخستین بار بر روی پساب نفتی انجام گرفت و نشان داد باکتری‏های بومی جداسازی شده از این محیط‏ها توانایی در خور توجهی برای تولید پلی استرهای میکروبی دارند که با طراحی آزمایش دقیق‏تر و بهینه‏سازی ‏بیشتر شرایط، می‏توان تولید توسط آن‏ها ‏را افزایش داد و با استفاده از آن‏ها ‏می‏توان در ضمن تولید پلی‏مرهای زیستی، در زمینه کاهش آلایندگی زیستی ترکیبات نفتی اقدام کرد.

تشکر و قدردانی

از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان برای در اختیار قرار دادن امکانات آزمایشگاهی و از مدیریت و کارکنان پالایشگاه نفت اصفهان برای همکاری در تهیه نمونه، تشکر و قدردانی می‏شود.



[1]- Polyhydroxybutyrate (PHB)

[2]- Polyhydroxyalkanoates (PHAs) ‏

[3]- Bacillus

[4]- Azotobacter

[5]- Alcaligenes

[6]- Pseudomonas

[7]- Rhizobium

[8]- Bacillus megaterium  ‏

[9]- Biopol

[10]- Mokhtarani

[11]- Goudarzi

[12]- Mohsenpoor

[13]- Ralstonia eutropha

[14]- Leuria Bertani Broth

[15]- Shin Saeng

[16]- Black Sudan

[17]- Xylene

[18]- Safranin

[19]- Crotonic acid

[xx]- Yüksekdag

[xxi]- Rehman

[xxii]- Santhanam and Sasidharan

[xxiii]- Preethi

[xxiv]- Jeyaseelan

[xxv]- Hahn

[xxvi]- Sudesh

[xxvii]- Berekaa  and Thawadi

[xxviii]- Ramadas

[xxix]- Khosravi-Darani

(1)               Scott G., Lemaire J., Jakubowicz L., Ojeda T., Hebbar P. Statement by oxo- biodegradable plastics association regarding biodegradability of plastics containing oxo- biodegradable additives. Oxo-Biodegradable Plastics 2010; 20: 1- 2.

(2)               Shamala TR., Chandrashekar A., Vijayendra SVN., Kshama L. Identification of polyhydroxyalkanoate (PHA) producing Bacillus spp. using the polymerase chain reaction (PCR). Journal of Applied Microbiolog 2003; 94: 369- 74.

(3)               Chee JY., Yoga SS., Lau NS., Ling SC., Abed RMM., Sudesh K. Bacterially produced Polyhydroxyalkanoate (PHA): Converting renewable resources into bioplastics. In: Mendez A., editor. Technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. 2nd ed. Spain: Formatx; 2010; 1395- 404.

(4)               Zinn M. Tailor-made synthesis of polyhydroxyalkanoate. European Cells and Materials 2003; 5: 38- 9.

(5)               Law JH., Slepecky RA. Assay of poly-β-hydroxybutyrate acid. Biological Sciences 1960; 82: 1- 4.

(6)               Holmes E., Bollard ME., Lindon JC., Mitchell SC., Branstetter D., Zhang W., et al. Crystallization and morphology of a bacterial thermoplastic. Journal of Material Sciences 1981; 19: 781- 94.

(7)               Joshi PA., Jaysawal SR. Isolation and characterization of poly-β-hydroxyalkanoate producing bacteria from sewage sample. Journal of Cell and Tissue Research 2010; 10: 2165- 168.

(8)               Kunasundari B., Sudesh K. Isolation and recovery of microbial polyhydroxyalkanoates. Expres Polymer Letters 2011; 7 (5): 620- 34.

(9)               Berekaa MM., Al Thawadi AM. Biosynthesis of polyhydroxybutyrate (PHB) biopolymer by Bacillus megaterium SW1-2: Application of Box-Behnken design for optimization of process parameters. African Journal of Microbiology Research 2012; 6 (4): 838- 45.

(10)           Fradinho JC., Domingos JMB., Carvalho G., Oehmen A., Reis MAM. Polyhydroxyalkanoates production by a mixed photosynthetic consortium of bacteria and algae. Bioresource Technology 2013; 132: 146- 53.

(11)           Mokhtarani N., Ghanjidoost H., Sarnami MS. The effect of Nitrogen compounds on polyhydroxyalkanoates production in activated sludge. Journal of Environmental Sciences and Technology 2008; 3: 85- 92.

(12)           Goudarzi Z., Zahiri HS., Chamani M., Noghabi KA. Isolation and characterization of a PHA-producing bacterial strain: biopolymer production under different growth conditions. New Cellular and Molecular Biotechnology Journal 2011; 1: 23- 32.

(13)           Mohsenpoor M., Amirmozafari N., Ghaemi N. Isolation of betaketothiolase gene (bktB) from Ralstonia eutropha for modification of biodegradable bioplastics. Journal of Biology Science 2008; 1: 67- 75.

(14)           Naima A., Safia S., Ishtiaq A., Saadia A., Bashir A., Geoffery R. Isolation and identification of polystyrene biodegrading bacteria from soil. African Journal of Microbiology Research 2010; 4 (14): 1537- 541.

(15)           Santhanam A., Sasidharan S. Microbial production of polyhydroxy alkanotes (PHA) from Alcaligens spp. and Pseudomonas oleovorans using different carbon sources. African Journal of Biotechnology 2010; 9: 3144- 50.

(16)           Preethi P., Sasikala R., Aravind J. Microbial production of polyhydroxyalkanoate (PHA) utilizing fruit waste as a substrate. Research in Biotechnology 2012; 3: 61- 9.

(17)           Jeyaseelan A., Pandiyan S., Ravi P. Production of polyhydroxyalkanoate (PHA) using hydrolyzed grass and syzygium cumini seed as low cost substrates. Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Sciences 2012; 2: 970- 82.

(18)           Hahn SK., Chang YK., Lee SY. Recovery and characterization of poly (3-hydroxybutyric acid) synthesized in Alcaligenes eutrophus and recombinant Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology 1995; 1 (61): 34- 9.

(19)           Macrae RM., Wilkinson JF. Poly-beta-hyroxybutyrate metabolism in washed suspensions of Bacillus cereus and Bacillus megaterium. Journal of General Microbiology 1958; 19: 210- 22.

(20)           Yüksekdag Z., Aslım B., Beyatlı Y., Mercan N. Effect of carbon and nitrogen sources and incubation times on poly-beta-hydroxybutyrate (PHB) synthesis by Bacillus subtilis 25 and Bacillus megaterium 12. African Journal of Biotechnology 2004; 3 (1): 63- 6.

(21)           Rehman SH., Jamil N., Hussnain SH. Characterization and optimization of antibiotic resistant bacterial strains for polyhydroxyalkanoates (PHAs) production. Pakistan Journal of Agricultural Research 2006; 4 (19): 1- 6.

(22)            Sudesh K., Abe H., Doi Y. Synthesis., structure and properties of polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Polymer Science 2000; 10: 1503- 55.

(23)           Ramadas N., Singh SK., Soccol CR., Pandey A. Polyhydroxybutyrate production using agro-industrial residue as substrate by Bacillus sphaericus NCIM 5149. Brazilian Archives of Biology and Technology 2009; 1: 17- 23.

(24)           Şafak S., Mercan N., Aslim B., Beyatli Y. A Study on the production of poly-beta-hydroxybutyrate by some eukaryotic microorganisms. Turkish Electronic Journal of Biotechnology 2002; Special Issue: 11- 17.

(25)           Khosravi-Darani K., Vasheghani-Farahani E., Shojaosadati SA. Application of the Plackett-Burman statistical design to optimize poly (hydroxybutyrate) production by Ralstonia eutropha in batch culture, Iranian Journal of Biotechnology 2003; 1: 155- 61.

(26)           Khosravi-Darani K., Vasheghani-Farahani E., Shojaosadati SA. Application of the Taguchi design for production of poly (ß- hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha, Iranian Journal of Chemistry and Chemical Engineering 2004; 23: 131- 36.

(27)           Kafilzadeh F., Parto A., Motamedi H. Isolation and identification of PHA producing bacteria from oil contaminanted soils in Masjed Soleiman and optimization of producing conditions. Biological Journal of Microorganisms. 2015; 4: 117- 28.