ارزیابی ‏‏تولید ‏‏داکسی ‏‏نیوالنول ‏‏در ‏‏جدایه‏ های ‏‏Fusarium graminearum ‏‏دارا ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA ‏‏ با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏توتون‏ های ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏ژن ‏‏AYT1

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار ‏‏‏‏بیماری‏شناسی ‏‏گیاهی، پژوهشکده ‏‏‏‏کشاورزی هسته ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ‏ای ‏‏ایران

2 دانشیار ‏‏بیماری ‏شناسی ‏‏گیاهی، ‏‏دانشگاه ‏‏تربیت ‏‏مدرس، ‏‏تهران، ‏‏ایران

3 دانشیار ‏‏بیوتکنولوژی ‏‏گیاهی، ‏‏پژوهشکده ‏‏ملی ‏‏تحقیقات ‏‏ژنتیک ‏‏و ‏‏مهندسی ‏‏زیستی، ‏‏تهران، ‏‏ایران

4 استادیار ‏‏بیوتکنولوژی ‏‏گیاهی، ‏‏پژوهشکده ‏‏ملی ‏‏تحقیقات ‏‏ژنتیک ‏‏و ‏‏مهندسی ‏‏زیستی، ‏‏تهران، ‏‏ایران

5 کارشناسی ‏‏ارشد ‏‏بیوتکنولوژی ‏‏کشاورزی، ‏‏دانشگاه ‏‏پیام ‏‏نور، ‏‏تهران، ‏‏ایران

چکیده

مقدمه: ‏‏از ‏‏مخرب‏ترین ‏‏بیماری‏های ‏‏گندم، ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏است ‏‏که ‏‏علاوه ‏‏بر ‏‏کاهش ‏‏عملکرد ‏‏مایکوتوکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏را ‏‏که ‏‏یک ‏‏ممانعت ‏‏کننده ‏‏از ‏‏سنتز ‏‏پروتیین ‏‏است ‏‏و ‏‏سلامت ‏‏انسان ‏‏و ‏‏دام ‏‏را ‏‏به ‏‏خطر ‏‏می‏اندازد، ‏‏تولید ‏‏می‏کند‏. ‏‏ویژگی‏های‏ ‏‏ریخت‏شناسی‏ ‏‏و ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏جدایه‏های ‏‏Fusarium graminearum ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏دستخوش ‏‏تغییراتی ‏‏مانند ‏‏کاهش ‏‏شدت ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏و ‏‏کاهش ‏‏میزان ‏‏مایکوتوکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏می‏شوند. ‏‏مطالعات ‏‏گذشته ‏‏نشان ‏‏داده‏اند ‏‏که ‏‏بیان ‏‏استیل ‏‏ترانس ‏‏فراز ‏‏مخمری ‏‏(ScAYT1) ‏‏که ‏‏یک ‏‏3- ‏‏O- تریکوتسین ‏‏استیل ‏‏ترانس ‏‏فراز ‏‏است ‏‏و ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏را ‏‏به ‏‏شکل‏ ‏‏استیله ‏‏آن ‏‏که ‏‏به ‏‏مراتب ‏‏سمیت ‏‏پایین‏تری ‏‏‏دارد ‏‏تبدیل ‏‏می‏کند، ‏‏قادر ‏‏است ‏‏حساسیت ‏‏به ‏‏توکسین ‏‏را ‏‏در ‏‏مخمرهای ‏‏موتانت ‏‏به ‏‏شدت ‏‏کاهش ‏‏دهد. ‏‏‏‏‏

مواد ‏‏و ‏‏روش‏‏ها: ‏‏در ‏‏این ‏‏مطالعه، ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏اگروباکتریوم ‏‏به ‏‏گیاه ‏‏مدل ‏‏توتون ‏‏انتقال ‏‏داده ‏‏شد. ‏‏به ‏‏منظور ‏‏بررسی ‏‏اینکه ‏‏بیان ‏‏ScAYT1 ‏‏در ‏‏توتون‏های ‏‏تراریخت ‏‏می‏تواند ‏‏در ‏‏سم‏زدایی ‏‏از ‏‏مایکوتوکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏موجود ‏‏در ‏‏عصاره ‏‏قارچ ‏‏مؤثر ‏‏باشد ‏‏و ‏‏همچنین، ‏‏مطالعه ‏‏اثر ‏‏آلودگی ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏در ‏‏میزان ‏‏سم‏زدایی ‏‏و ‏‏مقاومت ‏‏گیاهچه‏ها، ‏‏نسل ‏‏دوم ‏‏گیاهان ‏‏توتون ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏عصاره ‏‏استخراج ‏‏شده ‏‏از ‏‏کشت ‏‏جدایه‏های ‏‏F.graminearum ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏آن ‏‏تیمار ‏‏شدند. ‏‏‏‏‏

نتایج: ‏‏ارزیابی‏های ‏‏درون ‏‏شیشه‏ای ‏‏انجام ‏‏شده ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏جدایه‏های ‏‏فوزاریوم ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏آن ‏‏و ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏مایکوتوکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول، ‏‏بروز ‏‏سطوح ‏‏متفاوتی ‏‏از ‏‏مقاومت ‏‏را ‏‏در ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏نشان ‏‏داد. ‏‏‏‏‏

بحث ‏‏و ‏‏نتیجه‏ گیری: ‏‏نتایج ‏‏این ‏‏مطالعه ‏‏نشان ‏‏می‏دهد ‏‏که ‏‏بیان ‏‏تراژن ‏‏AYT1 ‏‏و ‏‏آلودگی ‏‏فوزاریوم ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏می‏توانند ‏‏در ‏‏القای ‏‏تحمل ‏‏به ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏و ‏‏به ‏‏دنبال ‏‏آن ‏‏افزایش ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏بیماری ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏مؤثر ‏‏باشند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of deoxynivalenol production in dsRNA Carrying and Cured Fusarium graminearum isolates by AYT1 expressing transformed tobacco

نویسندگان [English]

  • Samira Shahbazi 1
  • Naser Safaeie 2
  • Amir Mousavi 3
  • Forough Sanjarian 4
  • Mahsa Karimi 5
1 Ph. D. of Molecular mycology- Plant pathology- Agricultural, Medical and Industrial Research School, Nuclear Science and Technology Research Institute, Iran
2 Ph. D. of Molecular mycology, Tarbiat Modares University, Iran
3 Ph. D. of Biotechnology, National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Iran
4 Ph. D. of Biotechnology, National Institute of Genetic engineering and Biotechnology, Iran
5 M.Sc. of Agricultural biotechnology, Payam Noor University (PNU), Iran
چکیده [English]

Introduction: Fusarium head blight (FHB), is the most destructive disease of wheat, producing the mycotoxin deoxynivalenol, a protein synthesis inhibitor, which is harmful to humans and livestock. dsRNAmycoviruses-infected-isolates of Fusariumgraminearum, showed changes in morphological and pathogenicity phenotypes including reduced virulence towards wheat and decreased production of trichothecene mycotoxin (deoxynivalenol: DON).

Materials and methods: Previous studies indicated that over expression of yeast acetyl transferase gene (ScAYT1) encoding a 3-O trichothecene acetyl transferase that converts deoxynivalenol to a less toxic acetylated form, leads to suppression of the deoxynivalenol sensitivity in pdr5 yeast mutants. To identify whether ScAYT1 over-expression in transgenic tobacco plants can deal with mycotoxin (deoxynivalenol) in fungal extract and studying the effect of dsRNA contamination on detoxification and resistance level, we have treated T1 AYT1 transgenic tobacco seedlings with complete extraction of normal F. graminearum isolate carrying dsRNA metabolites. First, we introduced AYT1into the model tobacco plants through Agrobacterium-mediated transformation in an attempt to detoxify deoxynivalenol.

Results: In vitro tests with extraction of dsRNA carrying and cured isolates of F. graminearum and 10 ppm of deoxynivalenol indicated variable resistance levels in transgenic plants.

Discussion and conclusion: The results of this study indicate that the transgene expression AYT1 and Fusarium infection to dsRNA can induce tolerance to deoxynivalenol, followed by increased resistance to Fusarium head blight disease of wheat.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Fusarium head blight
  • Detoxification
  • Deoxynivalenol
  • ScAYT1
  • dsRNA

مقدمه. ‏‏

بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏[1] ‏‏علاوه ‏‏بر ‏‏کاهش ‏‏چشمگیر ‏‏عملکرد، ‏‏خسارت ‏‏غیر ‏‏مستقیمی ‏‏از ‏‏طریق ‏‏تجمع ‏‏مایکوتوکسین‏هایی ‏‏مانند ‏‏دی‏اکسی‏نیوالنول ‏‏به ‏‏دانه‏های ‏‏برداشت ‏‏شده ‏‏وارد ‏‏می‏سازد. ‏‏نبود ‏‏منابع ‏‏مقاومت ‏‏در ‏‏ارقام ‏‏زراعی ‏‏بر ‏‏لزوم ‏‏مطالعات ‏‏در ‏‏زمینه ‏‏انتقال ‏‏ژن‏های ‏‏مؤثر ‏‏در ‏‏افزایش ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏توکسین‏های ‏‏این ‏‏بیماری ‏‏افزوده ‏‏است. ‏‏از ‏‏جمله ‏‏ژن‏های ‏‏منتخب ‏‏در ‏‏این ‏‏زمینه ‏‏ژن ‏‏استیل‏ترانس ‏‏فراز ‏‏مخمری ‏‏AYT1 ‏‏[2] ‏‏است ‏‏که ‏‏یک ‏‏گروه ‏‏استیل ‏‏را ‏‏جایگزین ‏‏گروه ‏‏هیدروکسیل ‏‏C3 ‏‏تریکوتسن‏ها ‏‏می‏کند ‏‏و ‏‏از ‏‏سمیت ‏‏آن‏ها ‏‏به ‏‏میزان ‏‏قابل ‏‏توجهی ‏‏می‏کاهد ‏‏(1). ‏‏ارزیابی‏های ‏‏درون ‏‏شیشه‏ای ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏توتون ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏AYT1 ‏‏گویای ‏‏افزایش ‏‏تحمل ‏‏نسبی ‏‏به ‏‏دی‏اکسی‏نیوالنول ‏‏در ‏‏نتیجه ‏‏بیان ‏‏تراژن ‏‏یاد ‏‏شده ‏‏بوده ‏‏است ‏‏(2). ‏‏در ‏‏F.graminearum ‏‏وجود ‏‏dsRNA‏هایی ‏‏با ‏‏اندازه ‏‏7/1 ‏‏تا ‏‏10 ‏‏کیلوباز ‏‏گزارش ‏‏شده ‏‏است. ‏‏این ‏‏آلودگی ‏‏سبب ‏‏بروز ‏‏تغییراتی ‏‏در ‏‏ریخت‏شناسی ‏‏قارچ ‏‏و ‏‏کاهش ‏‏شدت ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏و ‏‏تولید ‏‏مایکوتوکسین‏ها ‏‏می‏شود ‏‏(3). ‏‏بررسی‏ها ‏‏نشان ‏‏داده‏اند ‏‏که ‏‏در ‏‏حدود ‏‏7 ‏‏درصد ‏‏از ‏‏جدایه‏های ‏‏F.graminearum ‏‏در ‏‏ایران ‏‏به ‏‏dsRNA‏هایی ‏‏با ‏‏اندازه5/1 ‏‏تا ‏‏6 ‏‏کیلوباز ‏‏آلوده ‏‏هستند ‏‏(4). ‏‏در ‏‏این ‏‏مطالعه، ‏‏از ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏جمع ‏‏آوری ‏‏شده ‏‏از ‏‏مزارع ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏Fusarium ‏‏Head ‏‏Blight ‏‏(FHB) ‏‏در ‏‏شمال ‏‏کشور ‏‏که ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏آلودگی ‏‏داشته‏اند ‏‏برای ‏‏ارزیابی ‏‏میزان ‏‏مقاومت ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏نسل ‏‏دوم ‏‏گیاهان ‏‏توتون ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏استفاده ‏‏شد؛ ‏‏تا ‏‏در ‏‏مقایسه ‏‏با ‏‏توکسین ‏‏خالص ‏‏و ‏‏عصاره ‏‏همان ‏‏جدایه‏ها ‏‏در ‏‏زمان ‏‏عدم ‏‏آلودگی ‏‏به ‏‏dsRNA، ‏‏اثر ‏‏آلودگی ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏کاهش ‏‏میزان ‏‏توکسین ‏‏قارچ ‏‏بر ‏‏بروز ‏‏مقاومت ‏‏در ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏بررسی ‏‏شود. ‏‏

 

‏‏مواد ‏‏و ‏‏روش‏ها. ‏‏

جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum: ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏جمع‏آوری ‏‏شده ‏‏از ‏‏مزارع ‏‏گندم ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏که ‏‏وجود ‏‏dsRNA ‏‏در ‏‏آن‏ها ‏‏پیش‏تر ‏‏مشخص ‏‏شده ‏‏بود ‏‏بر ‏‏روی ‏‏محیط ‏‏PDA ‏‏کشت ‏‏شد ‏‏(4). ‏‏از ‏‏بین ‏‏کشت‏های ‏‏خالص‏سازی ‏‏شده، ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏F38 ‏‏و ‏‏F42 ‏‏در ‏‏محیط ‏‏بذر ‏‏برنج ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏روش ‏‏لورن ‏‏و ‏‏اگنو ‏‏[3] ‏‏(5). ‏‏به ‏‏منظور ‏‏تولید ‏‏توکسین ‏‏کشت ‏‏شد. ‏‏حذف ‏‏dsRNA ‏‏از ‏‏این ‏‏دوجدایه ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏روش ‏‏مکانیکی ‏‏و ‏‏نوک ‏‏هیف ‏‏کردن ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏عصاره‏گیری ‏‏از ‏‏کشت ‏‏هر ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏در ‏‏دو ‏‏حالت ‏‏واجد ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA ‏‏با ‏‏روش ‏‏جنینگ ‏‏‏‏[4] و ‏‏همکاران ‏‏(6) ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏

.بررسی ‏‏کمی ‏‏توکسین ‏‏دی‏اکسی‏نیوالنول ‏‏موجود ‏‏در ‏‏.عصاره ‏‏قارچ ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏کروماتوگرافی ‏‏مایع ‏‏با ‏‏کارآیی ‏‏بالا: ‏‏پس ‏‏از ‏‏تخلیص ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ، ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏ازسیستم ‏‏کروماتوگرافی ‏‏مایع ‏‏با ‏‏کارآیی ‏‏بالا ‏‏WatersTM600 ‏‏باستون ‏‏LunaTMC1825 ‏‏(سانتی‏متری ‏‏با ‏‏قطر ‏‏منافذ ‏‏5/4 ‏‏میکرومتر) ‏‏و ‏‏دتکتور ‏‏فرابنفش ‏‏2487 ‏‏UV ‏‏با ‏‏طول ‏‏موج220 ‏‏نانومتر ‏‏و ‏‏فاز ‏‏متحرک ‏‏شامل ‏‏متانول/ ‏‏آب ‏‏با ‏‏نسبت ‏‏حجمی ‏‏(۵/۹۵)، ‏‏میزان ‏‏کمی ‏‏دی‏اکسی‏نیوالنول ‏‏موجود ‏‏در ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏هر ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏در ‏‏دو ‏‏حالت ‏‏واجد ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA ‏‏بررسی ‏‏شد. ‏‏

همسانه‏سازی ‏‏سازه ‏‏ژنی ‏‏AYT1: ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏با ‏‏انجام ‏‏واکنش ‏‏PCR ‏‏بر ‏‏روی50 ‏‏نانوگرم ‏‏از ‏‏DNA ‏‏ژنومی ‏‏مخمر ‏‏به ‏‏عنوان ‏‏رشته ‏‏الگو ‏‏و ‏‏جفت ‏‏آغازگرهای ‏‏AYT1Fw ‏‏و ‏‏AYT1Re، ‏‏طراحی ‏‏شده ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏توالی ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏مخمر ‏‏موجود ‏‏در ‏‏بانک ‏‏ژن ‏‏NCBI ‏‏و ‏‏یک ‏‏واحد ‏‏از ‏‏آنزیم ‏‏Expand ‏‏DNA ‏‏polymerase ‏‏تکثیر ‏‏شد. ‏‏محصولات ‏‏PCR ‏‏در ‏‏پلاسمید ‏‏pBluescript ‏‏SK ‏‏(Strategen) ‏‏همسانه‏سازی ‏‏و ‏‏سپس ‏‏توالی‏یابی ‏‏شد. ‏‏

تراریختی ‏‏گیاهان ‏‏توتون ‏‏با ‏‏AYT1:پس ‏‏از ‏‏همسانه‏سازی ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏در ‏‏ناقل ‏‏دوگانه ‏‏گیاهی ‏‏pBI12، ‏‏و ‏‏انتقال ‏‏به ‏‏سویه ‏‏LBA4404 ‏‏باکتری ‏‏Agrobacterium ‏‏tumefaciens ‏‏تراریختی ‏‏قطعات ‏‏برگی ‏‏[5] ‏‏گیاهچه‏های ‏‏توتون ‏‏(Nicotiana ‏‏tabacum ‏‏cv. ‏‏Xanthi) ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏گیاهچه‏های ‏‏باززایی ‏‏شده ‏‏در ‏‏محیط ‏‏دارای ‏‏صد ‏‏میلی‏گرم ‏‏در ‏‏لیترکانامایسین ‏‏رشد ‏‏داده ‏‏و ‏‏در ‏‏محیط ‏‏گلخانه‏ای ‏‏تا ‏‏مرحله ‏‏گل‏دهی ‏‏و ‏‏تولید ‏‏بذر ‏‏نگهداری ‏‏شد. ‏‏به ‏‏عنوان ‏‏کنترل ‏‏منفی ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏ژن ‏‏گزارشگر ‏‏GUS ‏‏تولید ‏‏شد. ‏‏بذر‏های ‏‏حاصل ‏‏خود ‏‏لقاحی ‏‏(نسل ‏‏T0) ‏‏برای ‏‏ارزیابی ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏توکسین ‏‏استفاده ‏‏شد. ‏‏

تحلیل‏ ‏‏مولکولی ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت: ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏آغازگرهای ‏‏اختصاصی ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏و ‏‏شرایط ‏‏مشابه ‏‏با ‏‏شرایط ‏‏تکثیر ‏‏آن ‏‏و ‏‏DNA ‏‏ژنومی ‏‏استخراج ‏‏شده ‏‏از ‏‏گیاهان، ‏‏انتقال ‏‏تراژن ‏‏به ‏‏لاین‏های ‏‏باززایی ‏‏شده ‏‏بررسی ‏‏شد. ‏‏نسخه‌برداری ‏‏از ‏‏تراژن ‏‏یاد ‏‏شده ‏‏با ‏‏تکثیر ‏‏cDNA ‏‏ساخته ‏‏شده ‏‏از ‏‏RNA ‏‏استخراجی ‏‏با ‏‏کیت
 ‏‏RNX-Plus ‏‏TM ‏‏(Cat. ‏‏No. ‏‏RN7713C) ‏‏و ‏‏با ‏‏جفت ‏‏آغازگرهای ‏‏AYT1Fw ‏‏و ‏‏AYT1Re ‏‏تایید ‏‏شد. ‏‏

.بررسی ‏‏مقاومت ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏به ‏‏توکسین: ‏‏به ‏‏محیط‏های ‏‏MS ‏‏مایع ‏‏به ‏‏غلظت ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏از ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏جدایه‏های ‏‏فوزاریوم ‏‏دارا ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA ‏‏اضافه ‏‏شد ‏‏تا ‏‏گیاهچه‏های ‏‏دو ‏‏برگی ‏‏حاصل ‏‏از ‏‏جوانه‏زنی ‏‏‏بذرهای ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏و ‏‏شاهد ‏‏(غیر ‏‏تراریخت ‏‏و ‏‏کنترل ‏‏منفی) ‏‏تیمار ‏‏شوند. ‏‏پس ‏‏از ‏‏سه ‏‏هفته ‏‏میزان ‏‏رشد ‏‏و ‏‏وزن ‏‏(خشک ‏‏و ‏‏تر) ‏‏گیاهان ‏‏اندازه‏گیری ‏‏و ‏‏مقایسه ‏‏آماری ‏‏شدند. ‏‏تیمارهای ‏‏شاهد ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏محیط ‏‏MS ‏‏فاقد ‏‏توکسین ‏‏و ‏‏محیط ‏‏حاوی ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏توکسین ‏‏خالص ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏و ‏‏3- ‏‏استیل ‏‏نیوالنول ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏تمام ‏‏مقایسه ‏‏میانگین‏ها ‏‏با ‏‏آزمون ‏‏LSD ‏‏و ‏‏تحلیل‏‏های ‏‏آماری ‏‏با ‏‏نرم ‏‏افزار ‏‏MSTAT-C ‏‏Ver. ‏‏1.42 ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏

 

نتایج. ‏‏

.ارزیابی ‏‏میزان ‏‏توکسین ‏‏در ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏دارای ‏‏.dsRNA: ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏پس ‏‏از ‏‏فعال‏سازی ‏‏مجدد ‏‏بر ‏‏روی ‏‏محیط ‏‏کشت ‏‏PDA ‏‏ابتدا ‏‏توده ‏‏میسلیومی ‏‏سفیدرنگ ‏‏تولید ‏‏کردند ‏‏و ‏‏پس ‏‏از ‏‏7 ‏‏تا ‏‏10 ‏‏روز ‏‏کلونی‏‏‏ها ‏‏به ‏‏رنگ ‏‏صورتی ‏‏در ‏‏آمدند. ‏‏وجود ‏‏dsRNA ‏‏در ‏‏آن‏ها ‏‏پیش‏تر ‏‏توسط ‏‏هاشمی [6] ‏‏و ‏‏همکاران ‏‏اثبات ‏‏شده ‏‏بود ‏‏(4). ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏روش ‏‏جنینگ [7] ‏‏و ‏‏همکاران ‏‏(6) ‏‏عصاره‏گیری ‏‏از ‏‏کشت ‏‏هر ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏F38 ‏‏و ‏‏F42 ‏‏در ‏‏دو ‏‏حالت ‏‏واجد ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA ‏‏انجام ‏‏شد. ‏‏نتایج ‏‏کروماتوگرافی ‏‏مایع ‏‏با ‏‏کارآیی ‏‏بالا ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏پس ‏‏از ‏‏حذف ‏‏dsRNA ‏‏کاهش ‏‏میزان ‏‏تولید ‏‏توکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏در ‏‏این ‏‏ایزوله‏ها ‏‏قابل ‏‏مشاهده ‏‏است ‏‏(شکل ‏‏1). ‏‏

 

 

شکل ‏‏1- ‏‏بررسی ‏‏کمی ‏‏توکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏موجود ‏‏در ‏‏عصاره ‏‏استخراج ‏‏شده ‏‏از ‏‏دو ‏‏جدایه ‏‏قارچ ‏‏فوزاریوم ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏کروماتوگرافی ‏‏مایع ‏‏با ‏‏کارآیی ‏‏بالا ‏‏( ‏‏سمت ‏‏چپ ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏سمت ‏‏راست ‏‏فاقد ‏‏dsRNA) ‏‏

 

 

همسانه‏سازی ‏‏سازه ‏‏ژنی ‏‏AYT1: ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏پس ‏‏از ‏‏انجام ‏‏واکنش ‏‏PCR ‏‏بر ‏‏روی ‏‏DNA ‏‏ژنومی ‏‏مخمر ‏‏به ‏‏عنوان ‏‏رشته ‏‏الگو ‏‏و ‏‏جفت ‏‏آغازگرهای ‏‏AYT1Fw ‏‏و ‏‏AYT1Re ‏‏با ‏‏اندازه ‏‏مورد ‏‏انتظار ‏‏قطعه‏ای ‏‏به ‏‏طول ‏‏4/1 ‏‏کیلوباز ‏‏تکثیر ‏‏شد ‏‏(شکل ‏‏2). ‏‏

 

 

شکل ‏‏2- ‏‏الکتروفورز ‏‏نتایج ‏‏تکثیر ‏‏و ‏‏همسانه‏سازی ‏‏ژن ‏‏AYT1
M: ‏‏نشانگر ‏‏وزنی ‏‏یک ‏‏کیلوباز ‏‏(Fermentas)، ‏‏1 و 2: ‏‏DNA ‏‏استخراج ‏‏شده ‏‏از ‏‏مخمر، ‏‏3 ‏‏و ‏‏4:محصول ‏‏تکثیر ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏از ‏‏ژنوم ‏‏مخمری، ‏‏5- 7: ‏‏محصول ‏‏تکثیر ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏از ‏‏ناقل ‏‏نوترکیب ‏‏pBluescript ‏‏SK

 

برای ‏‏جلوگیری ‏‏از ‏‏بروز ‏‏جهش‏های ‏‏ناخواسته ‏‏از ‏‏آنزیم ‏‏Expand ‏‏DNA ‏‏polymerase ‏‏که ‏‏دارای ‏‏توانایی ‏‏پروف ‏‏ریدینگ [8] ‏‏است‏‏ ‏‏استفاده ‏‏شد. ‏‏نتایج ‏‏توالی‏یابی ‏‏‏‏ژن ‏‏همسانه‏سازی ‏‏شده ‏‏در ‏‏پلاسمید ‏‏pBluescript ‏‏SK ‏‏(Strategen) ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏در ‏‏سطح ‏‏اسید ‏‏آمینه ‏‏هیچ ‏‏گونه ‏‏تغییری ‏‏در ‏‏توالی ‏‏این ‏‏ژن ‏‏در ‏‏مراحل ‏‏همسانه‏سازی ‏‏رخ ‏‏نداده ‏‏است ‏‏و ‏‏صحت ‏‏توالی ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏همسانه‏سازی ‏‏شده ‏‏پس ‏‏از ‏‏هم‏ردیفی ‏‏با ‏‏توالی ‏‏موجود ‏‏در ‏‏بانک ‏‏ژن ‏‏تایید ‏‏شد. ‏‏

تراریختی ‏‏گیاهان ‏‏توتون ‏‏با ‏‏AYT1: ‏‏پس ‏‏از ‏‏انتقال ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏به ‏‏ریزنمونه‌های ‏‏برگی ‏‏گیاه ‏‏توتون، ‏‏بهینه‏سازی ‏‏محیط‏های ‏‏القای ‏‏شاخه ‏‏زایی ‏‏ابتدا ‏‏بر ‏‏روی ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏شده ‏‏با ‏‏پلاسمیدهای ‏‏شاهد ‏‏انجام ‏‏و ‏‏سپس ‏‏برای ‏‏باززایی ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏شده ‏‏با ‏‏قطعه ‏‏ژنی ‏‏مورد ‏‏نظر ‏‏استفاده ‏‏شد. ‏‏

 

شکل ‏‏3- ‏‏مراحل ‏‏تراریختی ‏‏توتون ‏‏با ‏‏تراژن ‏‏AYT1
(A) ‏‏تلقیح ‏‏ریزنمونه‏ها ‏‏با ‏‏اگروباکتریوم ‏‏و ‏‏قرار ‏‏دادن ‏‏در ‏‏محیط ‏‏هم ‏‏کشتی ‏‏(CoC)، ‏‏(B) ‏‏باززایی ‏‏گیاهچه‏های ‏‏تراریخت ‏‏در ‏‏محیط ‏‏القای ‏‏شاخه‏زایی ‏‏((SIM، ‏‏(C) ‏‏تشکیل ‏‏گیاهچه ‏‏سبز ‏‏بر ‏‏روی ‏‏محیط ‏‏انتخابی ‏‏طویل ‏‏شدن ‏‏شاخه ‏‏(SEM)

 

 

 

شکل ‏‏4- ‏‏مراحل ‏‏رشد ‏‏گیاهچه‏های ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏سازه ‏‏ژنی ‏‏AYT1: ‏‏(A) ‏‏نوساقه‌های ‏‏رشد ‏‏یافته ‏‏در ‏‏محیط ‏‏طویل ‏‏شدن ‏‏ساقه ‏‏((SEM،
‏‏(B) ‏‏انتقال ‏‏گیاهچه‏های ‏‏حاصل ‏‏به ‏‏محیط ‏‏ریشه ‏‏زایی ‏‏(RIM)،
(C) ‏‏مرحله ‏‏رشد ‏‏رویشی ‏‏کافی ‏‏گیاهچه‏ها ‏‏در ‏‏محیط ‏‏درون ‏‏شیشه‏ای، ‏‏(D) ‏‏انتقال ‏‏گیاهچه‏ها ‏‏به ‏‏خاک، ‏‏(E) ‏‏نگهداری ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏در ‏‏اتاقک‏های ‏‏رشد ‏‏و ‏‏(F) ‏‏گل ‏‏دهی ‏‏و ‏‏بذر‏گیری ‏‏از ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت. ‏‏

 

 

تیمارهای ‏‏شاهد ‏‏شامل ‏‏باکتری‏های ‏‏حاوی ‏‏ژن ‏‏گزارشگر ‏‏GUS ‏‏و ‏‏پلاسمید ‏‏بدون ‏‏قطعه ‏‏ورودی ‏‏pBI121 ‏‏(-) ‏‏بودند. ‏‏پس ‏‏از ‏‏72 ‏‏ساعت ‏‏قطعات ‏‏برگی ‏‏غیرترایخت ‏‏(شکل3، ‏‏A) ‏‏به ‏‏سرعت ‏‏زرد ‏‏شدند، ‏‏اما ‏‏تعداد ‏‏بسیار ‏‏زیادی ‏‏گیاهچه‏های ‏‏سبز ‏‏تراریخت ‏‏بر ‏‏روی ‏‏محیط ‏‏باززایی ‏‏دارای ‏‏آنتی‏بیوتیک ‏‏کانامایسین ‏‏با ‏‏غلظت ‏‏صد ‏‏میلی‏گرم ‏‏در ‏‏لیتر ‏‏رشد ‏‏کردند ‏‏(شکل 3، ‏‏C). ‏‏شایان ‏‏ذکر ‏‏است ‏‏برای ‏‏جلوگیری ‏‏از ‏‏رشد ‏‏اگروباکتریوم ‏‏از ‏‏آنتی ‏‏بیوتیک ‏‏سفوتاکسیم ‏‏با ‏‏غلظت ‏‏پانصد ‏‏میلی‏گرم ‏‏در ‏‏لیتر ‏‏در ‏‏محیط ‏‏القای ‏‏شاخه‏زایی ‏‏‏‏استفاده ‏‏شد ‏‏که ‏‏تا ‏‏آخرین ‏‏مرحله ‏‏رشد ‏‏رویشی ‏‏در ‏‏محیط ‏‏درون ‏‏شیشه‏ای ‏‏هم ‏‏ادامه ‏‏پیدا ‏‏کرد. ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏محیط ‏‏القای ‏‏شاخه‏زایی ‏‏‏‏باززایی ‏‏به ‏‏طور ‏‏مستقیم ‏‏انجام ‏‏شده ‏‏و ‏‏زمان ‏‏آن ‏‏نیز ‏‏بهبود ‏‏چشمگیری ‏‏یافت. ‏‏به ‏‏طوری ‏‏که ‏‏از ‏‏14 ‏‏روز ‏‏به ‏‏5 ‏‏روز ‏‏تقلیل ‏‏پیدا ‏‏کرد. ‏‏گیاهچه‌های ‏‏باززایی ‏‏شده ‏‏در ‏‏محیط ‏‏انتخابی ‏‏دارای ‏‏کانامایسین ‏‏تا ‏‏رسیدن ‏‏به ‏‏رشد ‏‏کافی ‏‏رویشی ‏‏و ‏‏آمادگی ‏‏برای ‏‏انتقال ‏‏به ‏‏شرایط ‏‏خاک، ‏‏در ‏‏محیط ‏‏درون ‏‏شیشه‏ای ‏‏نگهداری ‏‏شدند. ‏‏

مراحل ‏‏انتقال ‏‏این ‏‏گیاهان ‏‏به ‏‏خاک ‏‏و ‏‏نگهداری ‏‏تا ‏‏مرحله ‏‏تولید ‏‏گل ‏‏و ‏‏بذر ‏‏دهی ‏‏در ‏‏شکل 4 ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏شده ‏‏است. ‏‏در ‏‏نهایت، ‏‏بذرهای ‏‏حاصل ‏‏از ‏‏57 ‏‏گیاه ‏‏تراریخت ‏‏جمع‏آوری ‏‏و ‏‏تحلیل‏‏‏های ‏‏‏‏مولکولی ‏‏برای ‏‏بررسی ‏‏انتقال ‏‏ژن ‏‏به ‏‏آن‏ها ‏‏در ‏‏سطح ‏‏DNA ‏‏و ‏‏RNA ‏‏انجام ‏‏شد ‏‏(شکل ‏‏5). ‏‏

تحلیل‏ ‏‏مولکولی ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت:پس ‏‏از ‏‏طی ‏‏مراحل ‏‏باززایی ‏‏۵۷ ‏‏لاین ‏‏توتون ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏تراژن ‏‏AYT1 ‏‏به دست ‏‏آمد ‏‏که ‏‏از ‏‏نظر ‏‏ریخت‏شناسی‏ ‏‏تفاوتی ‏‏با ‏‏لاین‏های ‏‏تراریخت ‏‏شده ‏‏با ‏‏ناقل ‏‏واجد ‏‏ژن ‏‏گزارشگر ‏‏GUS ‏‏و ‏‏گیاهان ‏‏غیر ‏‏تراریخت ‏‏از ‏‏خود ‏‏نشان ‏‏ندادند ‏‏(شکل ‏‏6). ‏‏

 

 

 

تحلیل‏‏های ‏‏مولکولی ‏‏گیاهان ‏‏باززایی ‏‏شده ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏با ‏‏وجود ‏‏تکثیر ‏‏قطعه ‏‏4/1کیلوباز ‏‏در ‏‏محصول ‏‏PCR ‏‏بر ‏‏روی ‏‏DNA ‏‏ژنومی ‏‏همه۵۷ ‏‏لاین ‏‏(شکل ‏‏5)، ‏‏در ‏‏۵۳ ‏‏لاین ‏‏پس ‏‏از ‏‏استخراج ‏‏RNA ‏‏کل ‏‏و ‏‏سنتز ‏‏cDNA ‏‏قطعه‏ای ‏‏با ‏‏همان ‏‏اندازه 4/1 ‏‏کیلوباز ‏‏تکثیر ‏‏شد ‏‏(شکل ‏‏6). ‏‏نسخه‏برداری ‏‏کامل ‏‏از ‏‏تراژن ‏‏یاد شده ‏‏در ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏را ‏‏با ‏‏کارآیی ‏‏کمابیش ‏‏بالایی ‏‏نشان ‏‏می‏دهد. ‏‏در ‏‏عین ‏‏حال ‏‏هیچ ‏‏یک ‏‏از ‏‏گیاهان ‏‏غیر ‏‏تراریخت ‏‏و ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏واجد ‏‏ژن ‏‏گزارشگر ‏‏GUS ‏‏هیچگونه ‏‏باندی ‏‏را ‏‏با ‏‏دو ‏‏آغازگر ‏‏اختصاصی ‏‏ژن ‏‏مزبور ‏‏نشان ‏‏نداد. ‏‏

.بررسی ‏‏مقاومت ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏به ‏‏توکسین: ‏‏به ‏‏منظور ‏‏مطالعه ‏‏اثر ‏‏میزان ‏‏کاهش ‏‏توکسین ‏‏اندازه‏گیری ‏‏شده ‏‏در ‏‏عصاره ‏‏قارچ ‏‏بر ‏‏واکنش ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت، ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏مایع ‏‏این ‏‏ایزوله ‏‏در ‏‏دو ‏‏حالت ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏تیمار ‏‏شده ‏‏در ‏‏ارزیابی ‏‏مقاومت ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏استفاده شد ‏‏(شکل ‏‏7). ‏‏

 

 

شکل ‏‏5- ‏‏الکتروفورز ‏‏نتایج ‏‏حاصل ‏‏ازتکثیر ‏‏تراژن ‏‏برای ‏‏تایید ‏‏تراریختی ‏‏گیاهان ‏‏توتون. ‏‏1:کنترل ‏‏مثبت ‏‏(AYT1 ‏‏در ‏‏pBluescript)، ‏‏2: ‏‏کنترل ‏‏مثبت ‏‏(AYT1 ‏‏در ‏‏pBI121)، ‏‏3- 8:گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏AYT1، ‏‏9:کنترل ‏‏منفی ‏‏(گیاه ‏‏غیرتراریخت) ‏‏و ‏‏M: ‏‏نشانگر ‏‏وزنی ‏‏یک ‏‏کیلوباز ‏‏(Fermentas) ‏‏

 

 

شکل 6- ‏‏الکتروفورز ‏‏نتایج ‏‏حاصل ‏‏از RT-PCR ‏‏برای ‏‏تایید نسخه‏‏‏برداری ‏‏تراژن ‏‏AYT1 ‏‏در ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت. 1: ‏‏کنترل ‏‏مثبت ‏‏(‏‏AYT1 در pBI121)، ‏‏2- 6: گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏AYT1، ‏‏7:کنترل ‏‏منفی ‏‏(گیاه ‏‏غیر تراریخت)، ‏‏8:کنترل ‏‏منفی ‏‏(RT-PCR ‏‏بدون ‏‏Reverse transcriptase) ‏‏و ‏‏M: ‏‏نشانگر ‏‏وزنی ‏‏یک ‏‏کیلوباز ‏‏(Fermentas) ‏‏

 

 

شکل ‏‏7- ‏‏عکس ‏‏العمل ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏تراریخت ‏‏(AYT1) ‏‏به ‏‏محیط ‏‏حاوی ‏‏عصاره ‏‏قارچ. ‏‏A: ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏(AYT1) ‏‏در ‏‏محیط ‏‏حاوی ‏‏عصاره ‏‏ایزوله ‏‏فاقد ‏‏dsRNA، ‏‏B: ‏‏گیاهان ‏‏غیرتراریخت ‏‏در ‏‏غلظت ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏(شاهد)، ‏‏C: ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏(AYT1) ‏‏در ‏‏محیط ‏‏حاوی ‏‏عصاره ‏‏ایزوله ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏و ‏‏D: ‏‏گیاهان ‏‏غیرتراریخت ‏‏در ‏‏غلظت ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏(شاهد) ‏‏

 

 

شکل ‏‏8- ‏‏مقایسه ‏‏میزان ‏‏اثر ‏‏توکسین ‏‏(3 ‏‏استیل ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏(3ADON) ‏‏و ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏(DON) ‏‏و ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏قارچ ‏‏فوزاریوم ‏‏گرامینیاروم ‏‏(F.g) ‏‏‏‏(دارا ‏‏و ‏‏فاقد ‏‏dsRNA) ‏‏در ‏‏محیط ‏‏MS ‏‏بر ‏‏رشد ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏AYTI، ‏‏(WT: ‏‏گیاه ‏‏غیر ‏‏تراریخت؛ ‏‏T: ‏‏گیاهان ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏AYTI) ‏‏

 

 

تحلیل‏های ‏‏آماری ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏اثر ‏‏ژنوتیپ ‏‏و ‏‏محیط ‏‏کشت ‏‏و ‏‏اثر ‏‏متقابل ‏‏آن‏ها ‏‏بر ‏‏تمامی ‏‏شاخص‏های ‏‏اندازه‏گیری ‏‏شده ‏‏در ‏‏سطح ‏‏01/0 ‏‏کاملا ‏‏معنادار ‏‏است. ‏‏به ‏‏عبارت ‏‏روشن‏تر، ‏‏عکس‏‏‏العمل ‏‏گیاهچه‏های ‏‏تراریخت ‏‏و ‏‏غیرتراریخت ‏‏در ‏‏حضور ‏‏توکسین ‏‏با ‏‏هم ‏‏متفاومت ‏‏بوده ‏‏و ‏‏بیان ‏‏تراژن ‏‏سبب ‏‏تغییر ‏‏در ‏‏شاخص‏های ‏‏اندازه‏گیری ‏‏شده، ‏‏به ‏‏شکل ‏‏معناداری ‏‏شده ‏‏است ‏‏(شکل ‏‏8). ‏‏

همان‏طور ‏‏که ‏‏درشکل ‏‏8 ‏‏مشاهده ‏‏می‏شود ‏‏میزان ‏‏ممانعت ‏‏از ‏‏رشد ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏جدایه‏های ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏پایین‏تراز ‏‏توکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏و ‏‏کمابیش ‏‏مشابه ‏‏اثر ‏‏ppm ‏‏10 ‏‏3- ‏‏استیل ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏بوده ‏‏است، ‏‏در ‏‏حالی که ‏‏عصاره ‏‏کشت ‏‏همان ‏‏جدایه‏ها ‏‏پس ‏‏از ‏‏حذف ‏‏dsRNA ‏‏میزان ‏‏سمیت ‏‏بالاتری ‏‏ازخود ‏‏نشان ‏‏دادند. ‏‏اثرآلودگی ‏‏با ‏‏dsRNA ‏‏برکاهش ‏‏اثر ‏‏ممانعت ‏‏کنندگی ‏‏از ‏‏رشد ‏‏گیاهان ‏‏با ‏‏کاهش ‏‏میزان ‏‏توکسین ‏‏در ‏‏عصاره ‏‏جدایه‏ها ‏‏مرتبط ‏‏می‏‏‏باشد ‏‏که ‏‏با ‏‏نتایج ‏‏بدست ‏‏آمده ‏‏از ‏‏بررسی ‏‏کمی ‏‏میزان ‏‏توکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏کروماتوگرافی ‏‏مایع ‏‏قابل ‏‏انطباق ‏‏است. ‏‏

‏‏بحث ‏‏و ‏‏نتیجه‏‏ گیری.

بیماری ‏‏بلایت ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏علاوه ‏‏بر ‏‏خسارت ‏‏کمی ‏‏ناشی ‏‏از ‏‏کاهش ‏‏میزان ‏‏محصول ‏‏و ‏‏وزن ‏‏هزار ‏‏دانه، ‏‏به ‏‏علت‏‏ ‏‏کاهش ‏‏درصد ‏‏پروتئین ‏‏و نشاسته ‏‏و ‏‏آلوده ‏‏کردن ‏‏دانه‏ها ‏‏به ‏‏مایکوتوکسین‏های ‏‏مختلف ‏‏کیفیت ‏‏محصول ‏‏را ‏‏نیز ‏‏کاهش ‏‏می‏دهد ‏‏و مصرف ‏‏دانه‏های ‏‏آلوده ‏‏توسط ‏‏انسان ‏‏و ‏‏دام ‏‏سبب ‏‏بروز ‏‏اختلالات ‏‏و ‏‏بیماری‏های ‏‏متعددی ‏‏در ‏‏آن‏ها ‏‏می‌شود‏‏ ‏‏(7). ‏‏

مدیریت ‏‏کنترل ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندم ‏‏دربرگیرنده ‏‏روش‏های ‏‏متعددی ‏‏شامل ‏‏مبارزه ‏‏زراعی، ‏‏کشت ‏‏ارقام ‏‏مقاوم، ‏‏کنترل زیستی ‏‏و ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏قارچ‏کش ‏‏است ‏‏(8). ‏‏هر ‏‏چند ‏‏هیچکدام ‏‏راه ‏‏حل ‏‏کاملا ‏‏مؤثری ‏‏برای ‏‏مهار ‏‏این ‏‏بیماری ‏‏به ‏‏شمار ‏‏نمی‏روند. ‏‏نبود ‏‏منابع ‏‏مقاومت ‏‏مناسب ‏‏در ‏‏ارقام ‏‏زراعی، ‏‏موجب جلب توجه ‏‏پژوهشگران ‏‏در ‏‏سال‏های ‏‏اخیر ‏‏به ‏‏ارایه ‏‏راهکارهای ‏‏مؤثر برای ‏‏القای ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏این ‏‏بیماری ‏‏در ‏‏گندم ‏‏‏‏شده ‏‏است ‏‏(9). ‏‏به ‏‏علت‏‏ ‏‏پیچیدگی‏های ‏‏کنش ‏‏متقابل ‏‏F.graminearum ‏‏و گیاه ‏‏میزبان، ‏‏دانسته‏های ‏‏ما ‏‏درباره ‏‏ترکیبات ‏‏کلیدی ‏‏و ‏‏مکانیسم‏های ‏‏مولکولی ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏این ‏‏بیماری ‏‏در ‏‏گیاه ‏‏بسیار ‏‏اندک ‏‏است. ‏‏سال‏هاست ‏‏که ‏‏پژوهش‏های زیادی ‏‏برای ‏‏شناسایی ‏‏مکانیسم‏های ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏این ‏‏قارچ ‏‏و ‏‏ژن‏های ‏‏مسوول ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏آن ‏‏به ‏‏وسیله ‏‏دانشمندان ‏‏انجام ‏‏شده ‏‏و ‏‏یا ‏‏در ‏‏جریان ‏‏است. ‏‏تنها ‏‏اطلاعاتی ‏‏در ‏‏زمینه ‏‏نحوه ‏‏عمل ‏‏تریکوتسین‏ها ‏‏که ‏‏بخشی ‏‏از ‏‏مایکوتوکسین‏های ‏‏این ‏‏قارچ ‏‏می‏باشند، ‏‏در ‏‏دست ‏‏است‏‏ ‏‏و ‏‏همین ‏‏امر ‏‏سبب ‏‏شده ‏‏که ‏‏با ‏‏توجه ‏‏به ‏‏اهمیت ‏‏نقش ‏‏آن‏ها ‏‏در ‏‏فرایند ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏مطالعه ‏‏مکانیسم‏های ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏آن‏ها ‏‏نظر ‏‏بیشتر پژوهشگران ‏‏را ‏‏جلب کند. ‏‏

پیش‏تر ‏‏به ‏‏اهمیت ‏‏تولید ‏‏مایکوتوکسین‏ها ‏‏از ‏‏جمله ‏‏تریکوتسین‏ها ‏‏و ‏‏به ‏‏ویژه ‏‏دی ‏‏اکسی‏‏‏نیوالنول ‏‏و ‏‏تجمع ‏‏آن‏ها ‏‏در ‏‏دانه‏ها ‏‏اشاره ‏‏شد. ‏‏مطالعات ‏‏متعدد ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏است ‏‏که ‏‏دی‏‏‏اکسی‏‏‏نیوالنول ‏‏ویژگی ‏‏فیتوتوکسیک ‏‏داشته ‏‏و ‏‏یک ‏‏عامل‏‏ ‏‏بیماری‏زا‏ ‏‏در ‏‏بلایت ‏‏سنبله ‏‏است ‏‏و ‏‏سبب ‏‏افزایش ‏‏شدت ‏‏بیماری ‏‏در ‏‏گندم ‏‏و ‏‏ذرت ‏‏می‌شود ‏‏(7، ‏‏10 ‏‏و ‏‏11). ‏‏همچنین، ‏‏بررسی‏ها ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏است ‏‏که ‏‏سویه‏های ‏‏F.graminearum ‏‏فاقد ‏‏توانایی ‏‏تولید ‏‏تریکوتسین‏ها هستند و ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏کمتری ‏‏برروی ‏‏گیاهان ‏‏در ‏‏شرایط ‏‏مزرعه‌ای ‏‏دارند ‏‏(12). ‏‏بنابراین، ‏‏یکی ‏‏از ‏‏راهکارهای ‏‏کاهش ‏‏خسارت ‏‏بیماری ‏‏می‏تواند ‏‏کاهش ‏‏تولید ‏‏مایکوتوکسین ‏‏در ‏‏آن ‏‏از ‏‏طریق ‏‏انتقال ‏‏مایکوویروس ‏‏در ‏‏جمعیت ‏‏قارچی ‏‏باشد. ‏‏به ‏‏عبارت ‏‏دیگر، ‏‏وجود ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏مایکوویروس ‏‏می‏تواند ‏‏منبعی ‏‏از ‏‏انتقال ‏‏عامل ‏‏هایپویورولانس ‏‏در ‏‏جمعیت ‏‏پاتوژن ‏‏شود‏‏. ‏‏مطالعات ‏‏پیشین ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏است ‏‏انتقال ‏‏این ‏‏مایکوویروس‏ها ‏‏از ‏‏جدایه‏ای ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏جدایه‏های ‏‏وحشی ‏‏از ‏‏طریق ‏‏آسکوسپور ‏‏و ‏‏کنیدیوم ‏‏بین ‏‏30 ‏‏تا ‏‏100 درصد ‏‏است‏‏ ‏‏(13). ‏‏

مطالعات ‏‏گذشته ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏است ‏‏که ‏‏dsRNA ‏‏(مایکوویروس) ‏‏بر ‏‏اساس ‏‏ویژگی‏های ‏‏فیزیکوشیمیایی ‏‏خود ‏‏به ‏‏8 ‏‏خانواده ‏‏Birnaviridae، ‏‏Chrysoviridae ‏‏Cytoviridae، ‏‏Endornaviridae، ‏‏Hypoviridae، ‏‏Partiviridae، ‏‏Reoviridae ‏‏و ‏‏Totiviridae ‏‏تقسیم ‏‏می‏شوند ‏‏(14). ‏‏وجود ‏‏مایکوویروس‏های ‏‏dsRNA‏‏‏یی ‏‏در ‏‏دامنه ‏‏وسیعی ‏‏از ‏‏قارچ‏های ‏‏رشته‏ای ‏‏و ‏‏مخمری ‏‏گزارش ‏‏شده ‏‏است ‏‏(15- ‏‏17). ‏‏که ‏‏توالی ‏‏آن‏ها ‏‏در ‏‏پایگاه ‏‏اطلاعاتی ‏‏ژنوم ‏‏موجود ‏‏است‏‏ ‏‏و ‏‏بر ‏‏اساس ‏‏داده‏های ‏‏توالی ‏‏ژنوم ‏‏مایکویوروس‏ها ‏‏بیشتر ‏‏به ‏‏سه ‏‏جنس ‏‏Mitovirus، ‏‏Partitivirus ‏‏و ‏‏Totivirus ‏‏متعلق ‏‏هستند. ‏‏در ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏بررسی‏های ‏‏زیادی ‏‏در ‏‏مورد ‏‏جنس‏های ‏‏مایکوویروسی ‏‏و ‏‏ژنوم ‏‏و ‏‏نقش ‏‏آن‏ها ‏‏در ‏‏شدت ‏‏بیماریزایی ‏‏قارچ ‏‏انجام ‏‏شده ‏‏است ‏‏(18). ‏‏داریسا [ix] ‏‏و ‏‏همکارانش ‏‏در ‏‏10 ‏‏جدایه ‏‏F.graminearum ‏‏پنج ‏‏نوع ‏‏dsRNA ‏‏مختلف ‏‏جداکردند. ‏‏مطالعات ‏‏روی ‏‏توالی ‏‏ژنوم ‏‏آن‏ها ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏حداقل ‏‏سه ‏‏قطعه ‏‏از ‏‏این ‏‏قطعات ‏‏جداسازی ‏‏شده، ‏‏پروتئین‏های ‏‏ساختاری ‏‏را ‏‏کد ‏‏می‏کنند. ‏‏این ‏‏پنج ‏‏قطعه ‏‏به ‏‏شکل ‏‏جداگانه ‏‏کپسیده ‏‏شده ‏‏و ‏‏با ‏‏جمعیت ‏‏متفاوتی ‏‏در ‏‏ریسه‏ها ‏‏و ‏‏اسپور‏های ‏‏جنسی ‏‏و ‏‏غیر ‏‏جنسی ‏‏پراکنش ‏‏می‏یابند ‏‏(18). ‏‏تمامی ‏‏قطعات ‏‏ویروسی ‏‏جداشده ‏‏از ‏‏این ‏‏جدایه‏ها ‏‏به ‏‏خانواده ‏‏Chrysoviridae ‏‏تعلق ‏‏داشتند ‏‏(18). ‏‏در ‏‏مطالعه ‏‏دیگری ‏‏که ‏‏بر ‏‏روی ‏‏827 ‏‏جدایه ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏انجام ‏‏شده ‏‏است ‏‏وجود ‏‏dsRNA ‏‏در ‏‏حداقل ‏‏19 ‏‏جدایه ‏‏اثبات ‏‏شده ‏‏است. ‏‏نتایج ‏‏این ‏‏بررسی ‏‏نشان ‏‏داده‏است ‏‏که ‏‏وجود ‏‏dsRNA ‏‏با ‏‏تغییرات ‏‏ریخت‏شناسی ‏‏مانند ‏‏کاهش ‏‏سرعت ‏‏رشد ‏‏ریسه ‏‏و افزایش ‏‏تولید ‏‏رنگدانه ‏‏در ‏‏قارچ ‏‏که ‏‏به ‏‏رنگ ‏‏نارنجی ‏‏تیره ‏‏تا ‏‏قرمز ‏‏در ‏‏ریسه‏های ‏‏منجر ‏‏آن ‏‏شده ‏‏است، ‏‏ارتباط ‏‏صد در صد ‏‏داشته ‏‏است ‏‏(13). ‏‏همچنین، ‏‏میزان ‏‏اسپورزایی ‏‏و ‏‏شدت ‏‏بیماری‏‏‏زایی ‏‏جدایه‏های ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏نیز ‏‏در ‏‏مقایسه ‏‏با ‏‏جدایه‏های ‏‏فاقد ‏‏آن ‏‏بسیار ‏‏پایین‏‏‏تر ‏‏گزارش ‏‏شده ‏‏است ‏‏(13). ‏‏داده‏های ‏‏حاصل ‏‏از ‏‏این ‏‏پژوهش ‏‏نیز ‏‏با ‏‏این ‏‏نتایج ‏‏مشابهت ‏‏داشته ‏‏و ‏‏با ‏‏حدف ‏‏مکانیکی ‏‏dsRNA ‏‏از ‏‏ریسه‏های ‏‏F.graminearum ‏‏میزان ‏‏تولید ‏‏دی‏‏‏اکسی ‏‏نیوالنول ‏‏در ‏‏جدایه ‏‏بالاتر ‏‏‏‏و ‏‏به دنبال آن ‏‏شدت ‏‏بیماری‏زایی ‏‏‏‏آن ‏‏نیز ‏‏بالا ‏‏رفت. ‏‏

بررسی‏های ‏‏یو [x] ‏‏و ‏‏همکارانش ‏‏در ‏‏جمعیتی ‏‏از ‏‏جدایه‏ها ‏‏در ‏‏F.graminearum ‏‏دارای ‏‏dsRNA ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏‏‏اندازه ‏‏ژنوم ‏‏این ‏‏dsRNA ‏‏بین ‏‏7/1 ‏‏تا ‏‏10 ‏‏متغیر ‏‏بوده ‏‏است. ‏‏این ‏‏آلودگی ‏‏سبب ‏‏بروز ‏‏تغییراتی ‏‏در ‏‏ریخت‏شناسی ‏‏قارچ، کاهش ‏‏شدت ‏‏بیماری‏زا‏یی ‏‏و ‏‏کاهش ‏‏تولید ‏‏مایکوتوکسین‏ها ‏‏در ‏‏جدایه‏های ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏شده ‏‏بود ‏‏(19). ‏‏همان‏طور ‏‏که ‏‏پیش‏تر ‏‏اشاره ‏‏شد ‏‏بررسی‏ها ‏‏روی ‏‏جمعیت‏های ‏‏F.graminearum ‏‏در ‏‏ایران ‏‏وجود ‏‏dsRNA‏هایی ‏‏با ‏‏اندازه ‏‏ژنوم ‏‏حدود ‏‏از ‏‏جدایه ‏‏با ‏‏اندازه ‏‏5/1 ‏‏تا ‏‏6 ‏‏کیلوباز ‏‏را ‏‏نشان ‏‏داده ‏‏و ‏‏پراکنش ‏‏میزان ‏‏این ‏‏جدایه‏ها ‏‏در ‏‏جمعیت ‏‏طبیعی ‏‏در ‏‏حدود 7 ‏‏درصد ‏‏تخمین ‏‏زده ‏‏شده است ‏‏(4). ‏‏در ‏‏این ‏‏مطالعه، ‏‏از ‏‏عصاره ‏‏کشت دو ‏‏جدایه ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏جمع‏آوری ‏‏شده ‏‏از ‏‏مزارع ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏بلایت ‏‏فوزاریومی ‏‏سنبله ‏‏گندمFHB
‏‏Fusarium) ‏‏Head ‏‏(Blight ‏‏ ‏‏در ‏‏شمال ‏‏کشور ‏‏که ‏‏آلودگی ‏‏به ‏‏dsRNA ‏‏داشته‏اند ‏‏استفاده ‏‏شد. ‏‏نتایج ‏‏آزمون کروماتوگرافی ‏‏تایید کرد ‏‏که ‏‏با ‏‏حذف ‏‏dsRNA ‏‏از ‏‏ریسه ‏‏میزان ‏‏تولید ‏‏مایکوتوکسین ‏‏داکسی‏نیوالنول ‏‏در ‏‏آن‏ها ‏‏کاهش ‏‏می‏یابد ‏‏که تایید کننده ‏‏یافته‏های ‏‏پیشین ‏‏بود ‏‏(13 ‏‏و 19). ‏‏پیشنهاد ‏‏می‏شود ‏‏که ‏‏ویژگی‏ها ‏‏و ‏‏درصد ‏‏انتقال ‏‏این ‏‏dsRNA‏ها ‏‏از ‏‏جدایه‏های ‏‏آلوده ‏‏به ‏‏وحشی ‏‏با ‏‏استفاده ‏‏از ‏‏آناستاموزیس ‏‏(هم‏دهانی ‏‏هیفی) ‏‏در ‏‏بین ‏‏جدایه‏های ‏‏قارچ ‏‏F.graminearum ‏‏بررسی ‏‏و ‏‏تعیین ‏‏شود. ‏‏همچنین، ‏‏برای ‏‏افزایش ‏‏کارایی ‏‏این ‏‏روش ‏‏کنترلی ‏‏هایپوویرولانس ‏‏(انتقال ‏‏dsRNA ‏‏به ‏‏منظور ‏‏کاهش ‏‏شدت ‏‏بیماری‏زایی ‏‏‏‏F.graminearum) ‏‏در ‏‏این ‏‏پژوهش ‏‏امکان ‏‏کاربرد ‏‏تلفیقی ‏‏روش ‏‏هایپوویرولانس ‏‏با ‏‏بیان ‏‏تراژن ‏‏استیل ‏‏کننده ‏‏مایکوتوکسین ‏‏(که ‏‏با ‏‏مکانیسم ‏‏سم ‏‏زدایی ‏‏از ‏‏مایکوتوکسین ‏‏مقاومت ‏‏به ‏‏بیماری ‏‏را ‏‏بالا ‏‏می‏برد) ‏‏در ‏‏دانه ‏‏رست‏های ‏‏نسل ‏‏دوم ‏‏گیاهان ‏‏توتون ‏‏تراریخت ‏‏با ‏‏ژن ‏‏AYT1 ‏‏استفاده ‏‏شد. ‏‏نتایج ‏‏نشان ‏‏داد ‏‏که ‏‏استفاده ‏‏هم‏زمان ‏‏از ‏‏هر ‏‏دو ‏‏روش ‏‏می‏تواند ‏‏با ‏‏کاهش ‏‏قدرت ‏‏توکسین‏زایی ‏‏‏‏قارچ ‏‏و ‏‏افزایش ‏‏مقاومت ‏‏گیاه ‏‏به ‏‏توکسین، ‏‏به ‏‏میزان ‏‏قابل ‏‏قبولی ‏‏در ‏‏کاهش ‏‏علایم ‏‏بیماری ‏‏در ‏‏دانه ‏‏رست‏ها ‏‏مؤثر ‏‏باشد. ‏‏

تشکر ‏‏و ‏‏قدردانی. ‏‏

‏‏از پژوهشگاه ‏‏ملی ‏‏مهندسی ‏‏ژنتیک ‏‏و ‏‏زیست ‏‏فناوری، ‏‏طرح ‏‏259 و ‏‏گروه ‏‏بیماری‏شناسی ‏‏دانشکده ‏‏کشاورزی ‏‏دانشگاه ‏‏تربیت ‏‏مدرس ‏‏برای ‏‏فراهم‏‏‏آوری ‏‏امکانات ‏‏انجام ‏‏این ‏‏پروژه تشکر و ‏‏قدردانی ‏‏می‏شود. ‏‏

 



[1]- Fusarium Head Blight(FHB)

[2]- (Yeast AcetylTransferase)

[3]- Lauren and Agnew

[4]- Jenning

[5]- Leaf disk

[6]- Hashemi

[7]- Jenning

[8]- Proof Reading

[ix]- Darissa

[x]- Yu

 

(1)               Alexander ‏‏NJ., McCormick ‏‏SP., ‏‏HohnTM. ‏‏The ‏‏identification ‏‏of ‏‏the ‏‏Saccharomyces ‏‏cerevisiae ‏‏gene ‏‏AYT1 ‏‏(ORF-YLL063c) ‏‏encoding ‏‏an ‏‏acetyltransferase. ‏‏Yeast 2002; 19 ‏‏(16): 1425- 30.

(2)               Sanjarian ‏‏F., ‏‏MousaviA., ‏‏PoppenbergerB., ‏‏WeindorferH., ‏‏Adam ‏‏G. ‏‏Evaluation ‏‏of ‏‏the ‏‏Yeast ‏‏acetyltransferase ‏‏(AYT1) ‏‏in ‏‏Detoxification ‏‏of ‏‏the ‏‏F. ‏‏graninearum ‏‏Toxin ‏‏Deoxynivalenol ‏‏in ‏‏Transgenic ‏‏Plants. ‏‏Iranian ‏‏Journal ‏‏of ‏‏Biology 2006; ‏‏19 ‏‏(2): 222- 31.

(3)               Chu ‏‏M., ‏‏Jean ‏‏J., ‏‏Yea ‏‏SJ., ‏‏Kim ‏‏YH., ‏‏LeeYW., ‏‏Kim ‏‏KH. ‏‏Double-strand ‏‏RNA ‏‏mycoviruses ‏‏from ‏‏Fusarium graminearum. ‏‏Applied ‏‏and ‏‏Environmental ‏‏Microbiology 2002; 68: ‏‏2529- 34. ‏‏

(4)               Hashemi ‏‏M., ‏‏Mozafari ‏‏J., ‏‏Alizadeh ‏‏A., ‏‏Shams-Bakhsh ‏‏M. ‏‏dsRNA ‏‏associated ‏‏with ‏‏Fusarium graminearum ‏‏isolates ‏‏in ‏‏Iran. ‏‏Iranian ‏‏Journal ‏‏Plant ‏‏Pathology ‏‏2004; 40: 313- 26.

(5)               Lauren ‏‏DR., ‏‏Agnew ‏‏MP. ‏‏Multitoxinscreening ‏‏for ‏‏Fusarium mycotoxins ‏‏grain. Journal of Agrichulture and Food Chemicals 1991; ‏‏39: ‏‏502- ‏‏07

(6)               Jenning ‏‏PME., ‏‏Coates ‏‏JA., ‏‏Turner ‏‏EA., ‏‏Chandler ‏‏Nicholson ‏‏p. ‏‏Name ‏‏ordering ‏‏is ‏‏different ‏‏from ‏‏others ‏‏Determination ‏‏of ‏‏a ‏‏deoxynivalenol- ‏‏and ‏‏nivalenol- ‏‏producing ‏‏chemotypes ‏‏of ‏‏Fusarium culmorum ‏‏isolates ‏‏from ‏‏England ‏‏and ‏‏Wales ‏‏by ‏‏PCR ‏‏assay. ‏‏European ‏‏Journal ‏‏of ‏‏Plant ‏‏Pathology ‏‏2004; 53: ‏‏182- 90.

(7)               Proctor ‏‏RH., ‏‏Desjardins ‏‏AE., ‏‏McCormick ‏‏SP., ‏‏Plattner ‏‏RD., ‏‏Alexander ‏‏NJ., ‏‏Brown ‏‏DW. ‏‏Genetic ‏‏analysis ‏‏of ‏‏the ‏‏role ‏‏of ‏‏trichothecene ‏‏and ‏‏Fumonisin mycotoxins ‏‏in ‏‏the ‏‏virulence ‏‏of ‏‏Fusarium. ‏‏European ‏‏Journal ‏‏of ‏‏Plant ‏‏Pathology 2002; ‏‏108: 691- 8.

(8)               PalazziniJM‏‏., ‏‏RamirezM ‏‏L., ‏‏TorresAM., ‏‏ChulzeSN. ‏‏Potential ‏‏biocontrol ‏‏agents ‏‏for ‏‏Fusarium ‏‏head ‏‏blight ‏‏and ‏‏deoxynivalenol ‏‏production ‏‏in ‏‏wheat. ‏‏Crop ‏‏Protection 2007; ‏‏26:1702- 10.

(9)               Bai ‏‏GH., ‏‏Shaner ‏‏G. ‏‏Management ‏‏and ‏‏Resistance ‏‏in ‏‏Whaet ‏‏and ‏‏Barely ‏‏to ‏‏Fusarium ‏‏Head ‏‏Blight. ‏‏Phytopathol 2004; 42: 135- 61

(10)           Desjardins ‏‏AE., ‏‏Proctor RH ‏‏. ‏‏Molecular ‏‏biology ‏‏of ‏‏Fusarium mycotoxins. ‏‏International ‏‏Journal ‏‏of ‏‏Food ‏‏Microbiology 2007; 119‏‏: 47- 50. ‏‏

(11)           Mesterhazy ‏‏A. ‏‏Role ‏‏of ‏‏deoxynivalenol ‏‏in ‏‏aggressiveness ‏‏of ‏‏Fusarium graminearum ‏‏and ‏‏F. ‏‏culmorum ‏‏and ‏‏in ‏‏resistance ‏‏to ‏‏Fusarium ‏‏head ‏‏blight. ‏‏European Journal of Plant Pathology ‏‏2002; ‏‏108: ‏‏675- 84. ‏‏

(12)           Harris LJ., Gleddie ‏‏SC. ‏‏A ‏‏modified ‏‏Rpl3 ‏‏gene ‏‏from ‏‏rice ‏‏confers ‏‏tolerance ‏‏of ‏‏the ‏‏Fusarium graminearum mycotoxin deoxynivalenol ‏‏to ‏‏transgenic ‏‏tobacco. Physiology and Molecular Plant Pathology ‏‏2001; 58: ‏‏173- 81. ‏‏

(13)           Chu ‏‏Y., ‏‏Lim ‏‏W., ‏‏Sang-Jin ‏‏Y., ‏‏ChoJ.‏‏, ‏‏LeeY.‏‏, ‏‏KimK. ‏‏Complexity ‏‏of ‏‏dsRNAMycovirus ‏‏Isolated ‏‏from ‏‏Fusarium graminearum. ‏‏Virus ‏‏Genes ‏‏2004; ‏‏28 ‏‏(1): 135- 43.

(14)           Mayo ‏‏MA. ‏‏A ‏‏summary ‏‏of ‏‏taxonomic ‏‏changes ‏‏recently ‏‏approved ‏‏by ‏‏ICTV. Archive of Virology ‏‏2002; 147: 1655- 63. ‏‏

(15)           Dawe ‏‏AL., ‏‏Nuss ‏‏DL. ‏‏Hypoviruses ‏‏and ‏‏chestnut ‏‏blight: ‏‏exploiting ‏‏viruses ‏‏to ‏‏understand ‏‏and ‏‏modulate ‏‏fungal ‏‏pathogenesis. Annual Review of Genetics 2001; ‏‏35: ‏‏1- 29.

(16)           Varga ‏‏J., ‏‏Toth ‏‏B., ‏‏Szencz ‏‏S., ‏‏Molnar ‏‏J., ‏‏Fekete, ‏‏CS. ‏‏Double- stranded ‏‏RNA ‏‏elements ‏‏and ‏‏virus- like ‏‏particles ‏‏in ‏‏Aspergillus ‏‏SPP. Acta Biologia 2001; 52: 355- 63.

(17)           Varga ‏‏J., ‏‏Rigo ‏‏K., ‏‏Molnar ‏‏J., ‏‏Toth ‏‏B., ‏‏Szencz ‏‏S. ‏‏Mycotoxin ‏‏production ‏‏and ‏‏evolutionary ‏‏relationships ‏‏among ‏‏species ‏‏of ‏‏Aspergillus ‏‏section. Acta Biologia ‏‏2003; 83: ‏‏191- 200. ‏‏

(18)           Darissa ‏‏O., ‏‏Willingmann ‏‏P., ‏‏Schäfer ‏‏W., ‏‏Adam ‏‏G. ‏‏A ‏‏novel ‏‏double-stranded ‏‏RNA ‏‏mycovirus ‏‏from ‏‏Fusarium graminearum: ‏‏nucleic ‏‏acid ‏‏sequence ‏‏and ‏‏genomic ‏‏structure. ‏‏Archives ‏‏of ‏‏Virology ‏‏2011; 4 (156): 647- 58. ‏‏

(19)           Yu ‏‏J., ‏‏Kwon ‏‏S., ‏‏Lee ‏‏K., ‏‏Son ‏‏M., ‏‏Kim ‏‏K. ‏‏Complete ‏‏nucleotide ‏‏sequence ‏‏of ‏‏double-stranded ‏‏RNA ‏‏viruses ‏‏from ‏‏Fusarium graminearum ‏‏strain ‏‏DK3. ‏‏Archives ‏‏of ‏‏Virology 2009. 11 (154)‏‏: 1855- 8.