جداسازی و شناسایی باکتری‌های نمک- قلیادوست تجزیه کننده فنل و ارزیابی عملکرد آن‏ ها

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه تهران، ایران

2 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه تهران، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی، پژوهشگاه صنعت نفت، ایران

چکیده

مقدمه: ترکیبات فنلی جزو سمی‌ترین آلاینده‌های محیط زیست به شمار می‌آیند. بنابراین، وجود این ترکیبات در پساب‌های صنعتی مشکل بزرگی محسوب می‌شود. تجزیه زیستی فنل روشی است که می‌تواند جایگزین روش‌های فیزیکی- شیمیایی مرسوم شود. هدف از این مطالعه جداسازی میکروارگانیسم‌های نمک- قلیادوست تجزیه کننده فنل به منظور حذف این ترکیب از پساب‌های صنعتی با شرایط شور و قلیایی است‏‏. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: نمونه‏برداری از خاک و آب‌های آلوده به ترکیبات نفتی انجام شد. بعد از غنی‏سازی نمونه‌ها در محیط پایه معدنی دارای فنل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی، کنسرسیوم میکروبی‏ به دست آمده خالص‏سازی شد. سویه‌های تجزیه کننده فنل شناسایی مولکولی شدند. بهترین سویه انتخاب و شرایط رشد آن در حضور فنل بهینه‏سازی شد. ‏‏‏
نتایج: سه سویه تجزیه‏کننده فنل متعلق به جنس‌های باکتریایی Halomonas، Janibacter و Pseudomonas از نمونه‌های آب مخزن جداسازی و شناسایی شد. در این میان سویه YF3 با 92/98 درصد شباهت به Janibacter cremeus به علت سرعت رشد بالاتر در محیط پایه معدنی دارای فنل به عنوان سویه برتر شناسایی شد. این سویه کوکوس گرم مثبت با محدوده تحمل سدیم کلراید 1 تا 10 درصد و بهینه غلظت 5 درصد است. ‏‏‏
بحث و نتیجه‏ گیری: YF3 قادر به رشد در شرایط قلیایی با اسیدتیه 5/9 و بهینه غلظت فنل 400 میلی‏گرم بر لیتر است. بیش‌ترین رشد این سویه در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و در حضور نمک سدیم نیترات به عنوان منبع نیتروژن است. دامنه تحمل شرایط سخت برای این سویه نمک- قلیادوست از نظر اسیدیته و غلظت فنل به ترتیب 5/6 تا 5/9 و 1000 میلی‏گرم بر لیتر بود که نشان‏دهنده پتانسیل بالای این سویه اکستریموفیل، در حذف فنل است و می‌تواند به عنوان سویه‏ای کاربردی در حذف ترکیبات فنلی از پساب‌های شور و قلیایی استفاده شود. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and identification of haloalkaliphilic phenol degrading bacteria and evaluating their applicability

نویسندگان [English]

  • Narges Abavisani 1
  • Mohammad Ali Amoozegar 2
  • Seyed Mohammad Mehdi Dastgheib 3
1 M.Sc. of Microbial Biotechnology, University of Tehran, Iran
2 Associate Professor of Microbiology, University of Tehran, Iran
3 Assistant Professor of Biotechnology, Research Institute of Petroleum Industry, Iran
چکیده [English]

Introduction:Phenolic compounds are toxic environmental pollutants. Removal of phenol from wastewaters is very important. Phenol biodegradation is generally preferred to common physico- chemical methods. The aim of this study is to enrich and isolate haloalkaliphilic phenol-degrading bacteria and evaluate their potential for caustic wastewater treatment in consortium and pure cultures.
Materials and methods: Soil and water samples were collected from hydrocarbon polluted areas. Samples were enriched in the mineral medium with phenol as the only carbon and energy source. Phenol degrading strains were isolated and identified using morphological and phylogenic techniques. Isolates were screened based on phenol removal ability and key parameters such as pH, temperature and various salt (NaCl, NaNO3, NH4Cl and KCl) and phenol concentration were evaluated for optimizing biodegradation activity of the selected strain.
Results: Three phenol-degrading strains were isolated from Yadavaran oilfield sample, which belong to bacterial genera Halomonas, Janibacter and Pseudomonas. The strain Janibacter sp.YF3 was selected due to its high phenol-degrading rate. The strain was gram positive coccus whose optimal growth condition was 30 ºC, Nacl 5 % (w/v), pH 8.5 and phenol 400 ppm. The results showed that this strain could thrive in highly saline conditions and preferred NaNO3among other salts.
Discussion and conclusion: Isolate entitled Janibacter sp. strain YF3 was a polyextremophile which could tolerate harsh conditions (NaCl concentration up to 10 % and pH 9.5) and could utilize phenol at high concentration up to 1000 ppm. These results showed that this strain could be potentially applicable for phenol removal from haloalkaline industrial wastewaters such as spent caustic.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Industrial wastewaters
  • Biodegradation
  • Phenolic compounds
  • Haloalkaliphile
  • Janibacter

مقدمه

‏آلاینده‌های محیطی با اثرات سمی خود بر روی ارگانیسم‌های زنده، اکوسیستم‌ها را تحت تأثیر‏ قرار می‌دهند. در میان این آلاینده‌ها، ترکیبات آروماتیک به علت پایداری ترمودینامیکی بالای حلقه بنزنی یکی از بزرگ‌ترین مشکلات زیست محیطی به شمار می‌آیند (1). یکی از این ترکیبات آروماتیک فنل است که طبق گزارش آژانس حفاظت محیط زیست آمریکا در گروه سمی‌ترین آلاینده‌ها قرار می‌گیرد (2).

پساب‌های تولید شده از سوخت‌های فسیلی، پالایشگاه‌ها، صنایع داروسازی،‏ کارخانه‌های رنگ‏سازی و حشره‏کش‌ها مهم‌ترین منابع برای تولید آلودگی‌های فنلی هستند (3). روش‌های فیزیکی- شیمیایی حذف فنل شامل: اکسیداسیون شیمیایی، جذب کربن فعال، استخراج با حلال و تجزیه فتوکاتالیستی است که انجام این روش‌ها با مشکلاتی روبروست (3- 4). این روش‌ها هزینه زیادی در بر دارند و با انجام آن‌ها معمولا فنل به محیطی دیگر منتقل شده یا به ماده‏ای با سمیت کمتر تبدیل می‌شود که خود به عنوان یک آلاینده شناخته می‌شود. اما تجزیه زیستی فنل روشی است که علاوه بر سازگاری با محیط زیست و هزینه پایین، به علت تجزیه کامل فنل به مواد معدنی (آب و دی اکسید کربن) بر سایر روش‌ها ترجیح داده می‌شود (5- 6). تجزیه زیستی فرآیندی است که بسیاری از عامل‏های زیستی و غیرزیستی بر روی آن تأثیر‏ می‌گذارند. عامل‏های زیادی وجود دارد که با جلوگیری و یا تحریک رشد میکروارگانیسم می‌تواند بر روی توانایی تجزیه یا متابولیسم آن تأثیر‏‏گذار باشد. این عامل‏ها شامل: دما، اسیدیته، غلظت سوبسترا، ویژگی‌های فیزیکی آلاینده و میزان اکسیژن و دسترسی به آن است (7). مطالعات زیادی در زمینه تجزیه زیستی فنل انجام شده است. یکی از باکتری‌های مهم در زمینه تجزیه زیستی فنل Pseudomonas putida است که تاکنون گزارش‌های متعددی درباره تجزیه فنل توسط این باکتری در شرایط مختلف از جمله حالت تثبیت شده و یا در بیورآکتورهای متفاوت ارائه شده است (8- 10). بیش‌ترین غلظتی که این باکتری توانایی تجزیه آن را داراست، 1000 میلی‏گرم در لیتر گزارش شده است (11). باکتری‌های دیگری از جمله جنس‌های Halomonas،‏ Acinetobacter، Alcaligenes و Ewingella در رابطه با تجزیه زیستی فنل گزارش شده‌اند. پساب‌های صنعتی شور و قلیایی که دارای فنل هستند، به علت شرایط فیزیکی خاص آن‌ها یکی از مشکلات صنایع برای تصفیه زیستی هستند. یکی از انواع این پساب‌ها که در حین تصفیه نفت خام تولید می‌شود، اسپنت کاستیک[1] نامیده می‌شود (12). شرایط اکستریم موجود در این پساب‌ها، می‌تواند باعث مرگ یا مهار رشد سویه‌های غیر اکستریم شود. هدف این مطالعه، تجزیه زیستی فنل در شرایط اکستریم است که به این منظور جداسازی، شناسایی و بررسی شرایط رشد میکروارگانیسم‌های نمک-قلیادوست[2] تجزیه کننده فنل در دستور کار قرار گرفت تا با کمک آن‏ها ‏بتوان پساب‌های صنعتی شور-قلیایی را تصفیه کرد.

 

‏‏. مواد و روش ‏ها

به منظور جداسازی سویه‌های نمک- قلیادوست تجزیه کننده فنل نمونه‏گیری از خاک‌های شور و آلوده به نفت پالایشگاه تهران، خاک‌های شور قم، خاک‌های شور و آلوده به نفت جزیره خارک و آب مخزن میدان نفتی یادآوران انجام شد. نمونه‌ها در شرایط استریل به آزمایشگاه منتقل و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‌داری شدند. میزان شوری، TDS و اسیدیته نمونه‌ها توسط دستگاه مالتی‌متر MettlerToledo اندازه‏گیری شد. غنی‌سازی نمونه‌ها بر روی محیط پایه معدنی که فنل به عنوان تنها منبع کربن و انرژی به آن افزوده شد، انجام شد (13). درصد شوری محیط 5 درصد و اسیدیته محیط کشت بر روی 5/8 تنظیم شد. این محیط پایه معدنی شامل مونوپتاسیم فسفات 1 گرم در لیتر، دی آمونیوم هیدروژن فسفات 1 گرم درلیتر، پتاسیم نیترات 1 گرم درلیتر، منیزیم سولفات 2/0 گرم درلیتر و فریک کلرید 05/0 گرم درلیتر بود. فنل به عنوان تنها منبع کربن به میزان 200 میلی‏گرم در لیتر افزوده شد.

جداسازی کشت مخلوط میکروبی: یک گرم از نمونه‌های خاک و آب مناطق مختلف، در ارلن 100 میلی‏لیتری با 20 میلی‏لیترمحیط کشت حاوی 200 میلی‏گرم در لیتر فنل به مدت دو روز در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm 150 انکوبه شد. بعد از 2 روز مخلوط‏سازی‏،‏200 میکرولیتر از محیط اولیه به محیط جدید منتقل شد و به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و دور شیکر rpm 150 گرمخانه‏گذاری شد. پاساژ دادن نمونه‌ها در محیط حاوی فنل تا 5 دور انجام شد. در نهایت، محیط‌هایی که رشد میکروبی‏ مشخص در آن‌ها مشاهده شد، برای جداسازی سویه‌های خالص از کشت مخلوط میکروبی‏ تجزیه کننده فنل انتخاب شدند.

خالص‏سازی‏: برای جداسازی سویه‌های خالص، رقت‌های متوالی تا 6-10 از کشت مخلوط تهیه و به محیط R2A آگار منتقل شد و با استفاده از میله L شکل در داخل پلیت پخش شدند. R2A آگار محیطی کمابیش فقیر با تنوع ترکیات منبع کربن برای جداسازی بیشتر باکتری‏های محیطی است. ترکیبات این محیط کشت (گرم بر لیتر) شامل پپتون 5/0، کازآمینواسید 5/0، دکستروز 5/0،‏ نشاسته 5/0،‏ سدیم پیرووات 3/0،‏ دی پتاسیم فسفات 3/0،‏ منیزیم سولفات 05/0 و سدیم کلراید 50‏ است (14). پلیت‏ها ‏به مدت یک هفته در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شدند. بعد از این مدت تک کلونی‌های رشد کرده، به روش خطی در محیط جدید R2A آگار کشت داده شد.خالص‏سازی جدایه‏ها ‏براساس اختلافات ریخت‏شناسی (شکل و رنگ کلونی و ...) انجام شد. تجدید کشت تا زمان اطمینان از خالص بودن سویه‌ها انجام شد (15).

انتخاب سویه برتر: بعد از خالص‏سازی سویه‌ها، برای اطمینان از اینکه هر سویه به تنهایی قابلیت تجزیه فنل را داراست، سویه‌ها به محیط کشت مایع پایه معدنی تلقیح شدند. به این شکل که سوسپانسیون با کدورت نیم مک فارلند از سویه‌ها تهیه شد و به محیط پایه معدنی با غلظت 200 میلی‏گرم درلیتر فنل تلقیح شد. در این مرحله بهترین سویه از نظر رشد و تجزیه کنندگی فنل در مقایسه با سایر سویه‌ها انتخاب شد و بهینه‏سازی‏ شرایط رشد برای سویه مورد نظر انجام گرفت (16).

بهینه‏سازی‏ شرایط رشد سویه برتر: مهم‌ترین شاخص‏ها برای فعالیت سویه برتر، میزان تحمل سدیم کلراید و قلیایی بودن و میزان تحمل فنل با توجه به سمیت بالای این ترکیب بود.

برای بهینه‏سازی غلظت سدیم کلراید، محیط کشت پایه معدنی با غلظت 200 میلی‏‏گرم در لیتر فنل با درصدهای متفاوتی(صفر، 5، 10، 15 و 20 درصد) در ارلن‏های 100 میلی‏لیتری تهیه شد. برای مطالعه اثر اسیدیته روی رشد باکتری، اسیدیته‏های 5/6، 5/7، 5/8،‏ 5/9 و 5/10 بررسی شد. در مورد بهینه‏سازی‏ شرایط رشد در حضور فنل، غلظت‌های 50 تا 1000 میلی‏گرم بر لیتر فنل تهیه شد. علاوه بر عوامل یاد شده، دو عامل‏ دیگر یعنی دما (15، 20، 25، 30، 35، 40 و 45 درجه سانتی‏گراد) و تأثیر‏ نمک‌های مختلف (NaNO3،‏ KCl، Na2SO4و NaCl) در غلظت 5 درصد حجمی- وزنی نیز با توجه به شرایط فرآیند تصفیه پساب بررسی شد.

سنجش حذف فنل: به منظور بررسی میزان حذف فنل در هر آزمایش، یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی‏ به ویال منتقل شد و به مدت 10 دقیقه در دور
g11500 سانتریفوژ شد. پس از آن محلول رویی برای خواندن جذب در270 نانومتر (طول موجی که در آن ترکیبات آروماتیک دارای پیک جذب نوری هستند.) به کووت‏های کوارتز منتقل شد. جذب نمونه‌ها در برابر محیط کشت بدون فنل به عنوان شاهد خوانده شد. تمام آزمایش‌ها با سه با تکرار انجام شد (16- 19).

به منظور تایید حذف فنل، از روش HPLC استفاده شد. بدین منظور در ابتدا و انتهای آزمایش یک میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی‏ به ویال منتقل شد و به مدت 10 دقیقه در دورg  11500 سانتریفوژ شد. برای استخراج ترکیبات فنلی از محلول رویی، سه بار هم‏حجم آن حلال تری‏کلرومتان افزوده و استخراج انجام شد. با قرار دادن حلال تری‏کلرومتان حاوی ترکیبات فنلی در دمای محیط، این حلال فرار به ‏سرعت تبخیر شد و در نهایت، رسوب باقی‏مانده در بافر پتاسیم‏فسفات به اندازه همان حجمی از مخلوط واکنش که استخراج شده بود، حل شد (20).

برای تحلیل‏ HPLC نمونه‏ها از ستون [3] C18 به عنوان فاز سکون و از آب و متانول با نسبت حجمی 50 درصد استفاده شد. دستگاه مجهز به UV detector 2500 مدل Knauer بوده و برای تشخیص ترکیبات فنلی از طول موج 270 نانومتر استفاده و 20 میکرولیتر از نمونه‏های استخراج‏ شده به دستگاه تزریق شد (20).

.شناسایی مولکولی سویه‌های تجزیه کننده فنل: شناسایی مولکولی سویه‌های تجزیه کننده فنل با تکثیر و تعیین توالی ژن 16S rRNA سویه‌ها انجام شد. برای این منظور ابتدا از سویه‌ها زیست توده تهیه و سپس استخراج DNA براساس روش اصلاح شده Marmur انجام شد (20). پس از تعیین کمیت و کیفیت DNA استخراج شده با روش‌های اسپکتروفتومتری و الکتروفورز، از این DNA برای انجام PCR و تکثیر ژن مربوط به زیر واحد کوچک ریبوزومی استفاده شد. این تکثیر با استفاده از پرایمرهای عمومی 16S rRNA،‏ 27F (پرایمر رفت) با توالی 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' و 1492 R (پرایمر برگشت) با توالی
5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' و از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز انجام شد. تکثیر ژن
16S rRNA با استفاده از الکتروفورز تایید شد. واکنش زنجیره ای پلیمراز در حجم نهایی 30 میکرولیتر انجام شد که 3 میکرولیتر بافر 10X PCR با غلظت برابر 1X، 1-2 میکرولیتر MgCl2 با غلظت برابر 50 میلی‏‏مولار، dNTP با غلظت 4/0 میلی‏مول در حجم نهایی، 1میکرولیتر از پرایمرهای رفت و برگشت با غلظت 100 پیکومولار، آنزیم Taq پلیمراز 50U/2 میکرولیتر و DNA به میزان مناسب استفاده شد. در انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز از نمونه با شرایط مشابه نسبت به سایرنمونه‏ها ‏که در آن به جای DNA الگو از آب دیونیزه استریل استفاده شده بود، به عنوان شاهد منفی استفاده شد. برنامه تکثیری واکنش زنجیره‏ای پلیمراز طبق برنامه ذیل انجام شد: واسرشت اولیه در دمای 95 درجه سانتی‏گراد به مدت 5 دقیقه، سپس 30 چرخه تکرار شونده شامل واسرشت با دمای 95 درجه سانتی‏گراد و اتصال با دمای 57 درجه سانتی‏گراد هر کدام به مدت 60 ثانیه و سنتز با دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 50 تا 60 ثانیه و پس از اتمام 30 چرخه برای سنتز نهایی دمای 72 درجه سانتی‏گراد به مدت 7 دقیقه. محصول نهایی واکنش زنجیره ای پلیمراز توسط روش دی‌داکسی به شکل رفت و برگشت تعیین ترادف شد. نتایج حاصل با استفاده از نرم افزار Chromas pro ویرایش شده و با کمک ابزار BLAST با توالی‌های معتبر ثبت شده در پایگاه ژنی EzTaxon مقایسه و نزدیک‌ترین سویه از نظر مشابهت در توالی ژن 16S rRNA شناسایی شد. تحلیل‏ فیلوژنتیک سویه منتخب با استفاده از نرم افزارهای ClustalX و Mega6 و رسم درخت فیلوژنتیک مربوط به این سویه با استفاده از الگوریتم Neighbour Joining انجام شد (21- 24).
.نتایج

ویژگی‌های فیزیکی نمونه‌ها سنجیده شد و نتایج آن در جدول 1 آورده شده است.

در مرحله غنی‏سازی‏، فقط کشت حاصل از نمونه آب مخزن یادآوران به ایجاد کدورت منجر شد. با توجه به حضور فنل به عنوان تنها منبع کربن در محیط، ایجاد کدورت نشان دهنده توان میکروارگانیسم‏ها در تجزیه فنل است که نتایج HPLC نیز حذف فنل از محیط کشت را تایید کرد (شکل 1).

 

جدول 1- شوری و اسیدیته نمونه‌های مورد بررسی

نمونه‌ها

شوری

 اسیدیته

خاک پالایشگاه تهران

8 درصد

5/7

آب مخزن یادآوران

12 درصد

7/7

خاک شور قم

15 درصد

5/7

خاک پالایشگاه خارک

5 درصد

2/7

 

 

 

 

شکل 1- تایید حذف فنل در کشت به دست آمده از نمونه آب مخزن یادآوران با کمک HPLC

 

 

در ادامه کار سه سویه با توانایی تجزیه فنل از نمونه‌ کشت غنی‏شده جدا شدند. برای انجام مراحل بعدی پژوهش انتخاب سویه براساس توانایی تحمل غلظت بالای فنل و میزان حذف آن انجام شد. همان‏طور که در شکل 2 مشاهده می‌شود، جدایه YF3 با 97 درصد تجزیه فنل پس از سه روز گرماگذاری به عنوان سویه برتر انتخاب شد.

بهینه‏سازی‏ شرایط رشد سویه YF3:برای اینکه سویه برتر بیش‌ترین بازدهی در تجزیه فنل را داشته باشد، شرایط رشد بهینه‏سازی‏ شد. تمام نتایج بعد از 72 ساعت تلقیح خوانده شد. همان‏طور که در شکل3 قابل مشاهده است، بهینه نمک برای رشد سویه YF3 غلظت 5 درصد وزنی- حجمی سدیم کلراید است . اما این سویه قادر به رشد در غلظت‌های سدیم کلراید بالاتر از 10 درصد نبود. همچنین، سویه YF3 توانایی رشد در محیط بدون نمک را نداشت.

با توجه به شکل 4، اسیدیته بهینه برای رشد سویه YF3،‏5/8 است. در طی این آزمایش مشاهده شد که این سویه در محیط پایه معدنی دارای فنل، توانایی رشد در شرایط قلیایی بالاتر از 5/9 را ندارد.

بیش‌ترین رشد و حذف فنل، درغلظت 400 میلی‏‏گرم بر لیتر فنل در شکل 5 قابل مشاهده است. کمترین غلظت مورد بررسی 50 میلی‏گرم بر لیتر بود. البته سویه YF3 قادر به رشد تا غلظت 1000 میلی‏گرم بر لیتر فنل نیز است.

 

 

شکل 2- میزان رشد و درصد تجزیه فنل جدایه‏های تجزیه کننده فنل در حضور ppm 200 فنل، اسیدیته 5/8 و دمای 30 درجه سانتی‏گراد

 

 

شکل 3- بهینه‏سازی‏ غلظت سدیم کلراید در حضور ppm200 فنل، اسیدیته5/8 و دمای 30 درجه سانتی‏گراد

 

شکل 4- بهینه‏سازی‏ اسیدیته در حضورppm 200 فنل و سدیم کلراید 5 درصد و دمای 30 درجه سانتی‏گراد

 

‏‏‏

شکل 5- بهینه‏سازی‏ غلظت فنل در اسیدیته 5/8 و سدیم کلراید 5 درصد (W/V)و دمای 30 درجه سانتی‏گراد

 

 

شکل 6- بهینه‏سازی‏ دما در اسیدیته 5/8 و سدیم کلراید 5 درصد (W/V)وppm 200 فنل

 

 

شکل 7- تأثیر‏ نمک‌های مختلف با غلظت 5 درصد حجمی- وزنی در رشد سویه YF3

 

همچنین با مشاهده شکل‏های 6 و 7 مشاهده می شود که این سویه بیش‌ترین میزان رشد و حذف فنل را در دمای 30 درجه سانتی‏گراد و در حضور نمک NaNO3 دارد.

نتایج حاصل از تعیین توالی ژن 16S rRNA سه سویه موردنظر و مقایسه آن‏ها با داده‌های ثبت شده در پایگاه EzTaxon در جدول 2 مشخص شده است. در این میان سویه YF6 با30/99 درصد شباهت، بیش‌ترین میزان شباهت را داراست.

درخت فیلوژنتیک سویه‌های شناسایی شده بر پایه روش neighbor joining و با استفاده از نرم افزار MEGA6 ترسیم شد.

 

 

جدول 2- مقایسه میزان شباهت ژن 16S rRNA سویه‌ها با سویه‌های استاندارد

نام سویه

شماره دستیابی

درصد شباهت

سویه استاندارد با بیش‌ترین میزان شباهت

YF3

KP027471

9/98

Janibacter cremeus HR08-44

YF6

KP027470

3/99

Halomonas aidingensis Ad-1

YF7

KP027472

7/97

Pseudomonas pelagia CL-AP6

 

 

شکل 7- درخت فیلوژنتیک سویه‌های تجزیه کننده فنل بر پایه روش neighbour joining


. بحث و نتیجه‏‏ گیری

در سال‌های اخیر، با توجه به افزایش رو به رشد صنایع و حجم بالای آلودگی تولید شده ناشی از پساب‌های صنعتی، جوامع صنعتی و نیمه صنعتی با مشکلات زیست محیطی بسیاری رو به رو هستند. آلودگی آب، خاک، هوا، رسوبات و آب‌های زیرزمینی با آلاینده‌های شیمیایی و سمی یکی از مهم‌ترین مشکلات این جوامع محسوب می‌شود (25). پساب‌های صنعتی معمولا توسط روش‌های فیزیکی- شیمیایی مرسوم تصفیه می‌شوند. اما ناکارآمدی و هزینه‌های بالای این روش‏ها، باعث توجه به روش‌های جایگزین شده است.

باکتری‏های کلیدی در مسیر تجزیه فنل، سودوموناس‏ها ‏هستند که توانایی متابولیکی بالایی در تجزیه انواع ترکیبات آروماتیک دارند. در این مطالعه سه سویه تجزیه کننده فنل، از اعضای جنس Halomonas،‏ Pseudomonas و Janibacter بودند. در مورد توانایی تجزیه فنل توسط دو جنس نخست، مطالعات زیادی انجام شده است. اما در مطالعه حاضر سویه برتر تجزیه کننده فنل، از جنس Janibacter بود. این مطالعه نخستین گزارش در مورد توانایی اعضای این جنس از اکتینوباکتریا در زمینه تجزیه زیستی فنل است. این سویه،‏ با 9/98 درصد به Janibacter cremeus شباهت دارد و قادر به تجزیه فنل در غلظت‌های بالای این ترکیب آروماتیک است. به طور کلی جنس Janibacter با توانایی آن‌ها در تجزیه ترکیبات پلی آروماتیک شناخته می‌شوند. در بررسی‏هایی که انجام شده است،‏ سویه باکتریایی مربوط به اعضای جنس Janibacter قادر به تجزیه گروهی از ترکیبات پلی آروماتیک از جمله آنتراسن، فنانترن، دی بنزوتیوفن و فلوئورن بودند (26- 27).

مطالعات محدودی در مورد تجزیه زیستی فنل در شرایط اکستریم (شوری و قلیایی) وجود دارد. فنل به عنوان یک ترکیب هیدروکربنی آروماتیک و بسیار سمی هدف بسیاری از این مطالعات در شرایط نمکی بوده است. در مطالعه بوستس[iv] و همکاران سویه باکتریایی جدا شده قابلیت تجزیه فنل در غلظت 6/5 درصد سدیم کلراید و تا بیشینه غلظت فنل 700 میلی‌گرم بر لیتر را دارا بود (28). در زمینه تجزیه فنل در شرایط قلیایی نیز گزارش‌های کمی موجود است که یک مورد آن مطالعه کناکار[v] و همکاران است. در این مطالعه چهار سویه قلیادوست جدا شده، برای تصفیه پساب‌های صنعتی در اسیدیته 10 استفاده شدند که بیش‌ترین میزان حذف فنل توسط این سویه‌ها 660 میلی‌گرم درلیتر بود (29).

در مطالعه حاضر، سویه برتر قابلیت تحمل و رشد در شرایط اکستریم را داراست. بیشینه اسیدیته رشد سویه 5/10 و بیشینه غلظت نمک سدیم کلراید 10 درصد است. از این رو سویه YF3 به عنوان یک باکتری نمک- قلیادوست شناسایی می شود. بالاترین دمای رشد سویه 35 درجه سانتی‏گراد است. آنزیم کلیدی مسیر تجزیه فنل، فنل هیدورکسیلاز است که به دمای بالاتر از 35 درجه سانتی‏گراد حساس است و به طور درخور توجهی فعالیت خود را از دست می دهد (30). به نظر می رسد عدم رشد سویه YF3 در دمای بالاتر از 35 درجه سانتی‏گراد نیز به خاطر کاهش فعالیت این آنزیم است.

همچنین مشخص شد نمک بهینه برای رشد سویه YF3 در این پژوهش سدیم نیترات بود. از میان نمک‏های سدیمی و پتاسیمی مورد بررسی، این سویه نمک‏های سدیمی را ترجیح می دهد.

معدودی از مطالعات در زمینه تجزیه زیستی فنل در غلظت‌های بالای این ترکیب آروماتیک انجام شده‌اند که از جمله آن‌ها می‌توان به گزارشی اشاره کرد که بالاترین غلظت قابل تحمل برای میکروارگانیسم مورد بررسی، Candida tropicalis، 2000 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده شد (31). شایان ذکر است هیچ کدام از شرایط آزمایش اکستریم نبود.

در مطالعه حاضر با وجود شرایط اکستریم حاکم بر آزمایش، بیش‌ترین میزان تجزیه غلظت فنل توسط سویه YF3، 1000 میلی‏‏گرم در لیتر بود. با توجه به اینکه میزان فنل موجود در پساب‌های کمتر از این میزان است، این سویه می‌تواند نقشی کاربردی در تصفیه پساب‌های فنلی ایفا کند.

 



[1]- Spent caustic

[2]- Haloalkaliphile

[3]- 5 mm×4.66250 mm, MetaChem Technologies

[iv]- Bastos

[v]- Kanekar

(1)               Cao B., Nagarajan K., Loh K.C. Biodegradation of aromatic compounds: current status and opportunities for biomolecular approaches. Applied microbiology and biotechnology 2009; 85 (2): 207- 28.

(2)               Reda A.B., Ashraf T. Optimization of bacterial biodegradation of toluene and phenol under different nutritional and environmental conditions. Journal of Applied Sciences Research 2010; 6 (8): 1086- 95.

(3)               Amer R. Newly Isolated Pandoraea sp. Capable of Phenol Biodegradation. Research Journal of Microbiology 2008; 3 (10): 622- 29.

(4)               Basha K. M., Rajendran A., Thangavelu V. Recent advances in the biodegradation of phenol: a review. Asian Journal of Experimental Biological Sciences2010; 1(2): 219- 34.

(5)               Kim J. H., Oh K. K., Lee S. T., Kim S. W., Hong S. I. Biodegradation of phenol and chlorophenols with defined mixed culture in shake-flasks and a packed bed reactor. Process Biochemistry 2002; 37 (12): 1367- 73.

(6)            Nair C. I., Jayachandran K., Shashidhar S. Biodegradation of phenol. African Journal of Biotechnology 2008; 7 (25): 4951- 8

(7)               Al-Khalid T., El- Naas M.H. Aerobic Biodegradation of Phenols: A Comprehensive Review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 2012; 42 (16): 1630- 90.

(8)               Chung T. P., Tseng H. Y., Juang R. S. Mass transfer effect and intermediate detection for phenol degradation in immobilized Pseudomonas putida systems. Process Biochemistry 2003; 38 (10): 1497- 507.

(9)               Gonzalez G., Herrera G., Garcı́a M. T., Pena M. Biodegradation of phenolic industrial wastewater in a fluidized bed bioreactor with immobilized cells of Pseudomonas putida. Bioresource technology 2001; 80 (2): 137- 42.

(10)           Abuhamed T., Bayraktar E., Mehmetoğlu T., Mehmetoğlu Ü. Kinetics model for growth of Pseudomonas putida F1 during benzene, toluene and phenol biodegradation. Process Biochemistry, 2004; 39 (8): 983- 8.

(11)           Al-Zuhair S., El-Naas M. Immobilization of Pseudomonas putida in PVA gel particles for the biodegradation of phenol at high concentrations. Biochemical Engineering Journal 2011; 56 (1): 46- 50.

(12)           Li H., Liu Y. H., Luo N., Zhang X. Y., Luan T. G., Hu J. M and et al. Biodegradation of benzene and its derivatives by a psychrotolerant and moderately haloalkaliphilic Planococcus sp. strain ZD 22. Research in microbiology 2006; 157 (7): 629- 36.

(13)           Juang R. S., Tsai S. Y. Growth kinetics of Pseudomonasputida in the biodegradation of single and mixed phenol and sodium salicylate. Biochemical Engineering Journal 2006; 31 (2): 133- 40.

(14)           Yang C. F., Lee C. M. Enrichment, isolation, and characterization of phenol-degrading Pseudomonas resinovorans strain P-1 and Brevibacillus sp. strain P-6. International Biodeterioration & Biodegradation 2007; 59 (3): 206- 10.

(15)           Øvreås L., Torsvik V. Microbial diversity and community structure in two different agricultural soil communities. Microbial ecology 1998; 36 (3- 4): 303-15.

(16)           Alva V.A., Peyton B.M. Phenol and catechol biodegradation by the haloalkaliphile Halomonas campisalis: influence of pH and salinity. Environmental science & technology 2003; 37 (19): 4397- 402.

(17)           Santos V.L., Valter R. Linardi, Biodegradation of phenol by a filamentous fungi isolated from industrial effluents identification and degradation potential, Process Biochemistry 2003; 39 (2004): 1001- 6.

(18)           Ying W., Ye T., Bin H., Zhao H., BI J., Cai B. Biodegradation of phenol by free and immobilized Acinetobacter sp. strain PD12. Joumdl ot Emironmental Sciences 2006; 19 (2007): 222- 5.

(19)           Peyton B.M., Wilson T, Yonge D.R. Kinetics of phenol biodegradation in high salt solutions. Water Research 2003; 36 (2002): 4811- 820.

(20)           Asad S., Dabirmanesh B., Khajeh K. Phenol removal from refinery wastewater by mutant recombinant horseradish peroxidase. Biotechnology and applied biochemistry 2014; 61 (2): 226- 9.

(21)           Wilson K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Current protocols in molecular biology 1987; 2- 4.

(22)           Kumar S., Tamura K., Nei M. Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment, Briefings in Bioinformatics, 2004.

(23)          Mehrshad M., Amoozegar M. A., Yakhchali B., Fazeli A. S. Biodiversity of moderately halophilic and halotolerant bacteria in the western coastal line of Urmia lake. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (2): 49- 70.

(24)           Thompson G. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 1997; 24: 4876- 882.

(25)           Vidali M. Bioremediation. An overview. Pure and Applied Chemistry 2001; 73 (7): 1163- 72.

(26)           Yamazoe A., Yagi O., Oyaizu H. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by a newly isolated dibenzofuran-utilizing Janibacter sp. strain YY-1. Applied microbiology and biotechnology 2004; 65(2): 211- 18.

(27)           Zhang G. Y., Ling J. Y., Sun H. B., Luo J., Fan Y. Y., Cui Z. J., et al., Isolation and characterization of a newly isolated polycyclic aromatic hydrocarbons-degrading Janibacter anophelis strain JY11. Journal of hazardous materials 2009; 172 (2): 580- 86.

(28)           Bastos A. E. R., Moon D. H., Rossi A., Trevors J. T., Tsai S. M. Salt-tolerant phenol-degrading microorganisms isolated from Amazonian soil samples. Archives of microbiology 2000; 174 (5): 346- 52.

(29)           Kanekar P. P., Sarnaik S. S., Kelkar A. S. Bioremediation of phenol by alkaliphilic bacteria isolated from alkaline lake of Lonar, India. Journal of applied microbiology 1998; 85 (1): 128- 33.

(30)           Al-Khalid T., El- Naas M.H. Aerobic Biodegradation of Phenols: A Comprehensive Review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology 2012; 42(16): 1631- 90.

(31)           Yan J., Yan J., Jianping W., Hongmei L., Suliang Y., Zongding H. The biodegradation of phenol at high initial concentration by the yeast Candida tropicalis. Biochemical Engineering Journal 2005; 24 (3): 243- 7.