بررسی و تولید روغن امگا3 غنی از دوکوزاهگزانوئیک اسید توسط سویه بومی آئورانتیوکیتریوم TA4

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته، کرمان، ایران

چکیده

مقدمه: اسیدهای چرب امگا‏3 در سلامتی انسان نقش مهمی را بازی می‏کنند. دوکوزاهگزانوئیک اسید جزو مهم‏ترین اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه است که از طریق مصرف روغن ماهی تامین می‏شود. در نتیجه به علت احتمال وجود آلودگی‏های فلزات سنگین در روغن ماهی، نیاز به منابع جایگزین جدید مثل روغن‏های تک سلولی وجود دارد‏‏. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: در این پژوهش از جنگل‏های مانگرو در خلیج فارس و دریای عمان نمونه‏برداری شد. سویه‏های پروتیست دریازی در محیط اختصاصی جداسازی شد. غربال‏گری سویه‏های تولید کننده روغن توسط میکروسکوپ فلورسانت انجام شد. سویه منتخب از طریق تعیین توالی ژن 18S rRNA شناسایی و پروفایل اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه توسط کروماتوگرافی گازی تعیین شد. ‏‏‏
نتایج: بیش از 20 سویه پروتیست دریازی جداسازی شد. گرانول‏های تری آسیل گلیسرول در سویه TA4 با رنگ فلورسانت نارنجی شناسایی شد. سلول‏های دوتایی، چهارتایی و هشت‏تایی و زئوسپورها در سیکل سلولی مشاهده شد. توالی ژن 18S rRNA این سویه (1730bp) بیش از 97 درصد با سویه آئورانتیوکیتریوم مشابهت داشت (شماره دسترسی: KJ938302). محتویات روغن در این سویه 46 درصد وزن خشک سلولی است. اسیدهای چرب دوکوزاهگزانوئیک اسید، دوکوزاپنتانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید به مقدار 105، 46 و 26 میلی‏گرم در لیتر تولید شد. محتویات آن‏ها به ترتیب برابر با 16، 7 و 4 درصد از کل اسیدهای چرب است. ‏‏‏
بحث و نتیجه ‏گیری: سویه‏های ترائوستوکیتریدها به علت داشتن توانایی منحصر به فرد در تولید اسیدهای چرب غیراشباع و دوکوزاهگزانوئیک اسید می‏توانند جایگزین مناسبی برای این ترکیبات با ارزش باشند. با توجه به پتانسیل سویه‏های بومیترائوستوکیتریدها در تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید، این سویه‏ها می‏توانند برای تولید روغن‏های امگا3 استفاده شوند. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Investigation and production of omega 3 oil rich in docosahexaenoic acid by native strain of Aurantiochytrium TA4

نویسندگان [English]

  • Farzaneh Fekrat 1
  • Shahryar Shakeri 2
1 M.Sc. of Agricultural Biotechnology, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
2 Assistant Professor, Institute of Science and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: Omega 3 fatty acids play an important role in human health. Docosahexaenoic acid is the most important of polyunsaturated fatty acids that is supplied through the consumption of fish oil. Consequently, there is a need for new alternative sources like as single cell oils, because of possibility of heavy metal contamination in fish oil.
Materials and methods: In this research, the samples were collected from mangrove forests in the Persian Gulf and Oman Sea. The strains of marine protist were isolated in GYP medium. Oil-producing strains were screened by fluorescence microscopy. Selected strain was identified by sequencing 18s rRNA gene and polyunsaturated fatty acids profile was determined by gas chromatography.
Results: More than 20 marine protist strains were isolated. Triacylglycerol granules were detected in strain TA4 by orange fluorescent. Dyad, tetrad, octad cells and zoospore were observed in cell cycle. 18s rRNA gene sequence of this strain (1730 bp) was similar more than 97 % to Aurantiochytrium strain (Accession number: KJ938302). Its oil content is 46 % of CDW. The quantity of DHA, DPA and EPA fatty acids was 105, 46 and 26 mg per liter, respectively. Their contents were 16, 7 and 4 % of the total fatty acids, respectively.
Discussion and conclusion: Thraustochytrids strains have a unique ability to produce polyunsaturated fatty acids, especially DHA and can be an alternative to these valuable compounds. These strains can be used for production of omega 3 oils due to their potential for production of DHA.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Omega 3 fatty acids
  • Docosahexaenoic acid
  • Native strains of Thraustochytrids
  • Aurantiochytrium

مقدمه

‏ از دهه 1930 کشف شد که اسیدهای چرب امگا3 برای رشد طبیعی و سلامتی انسان ضروری هستند. ارزش اسیدهای چرب امگا3 در دهه 1970 با مطالعه و بررسی‏هایی ‏که بر روی قبایل و جمعیت‏های اسکیموهای گرینلند انجام شد، به اثبات رسید.‏ این جمعیت‏ها به علت‏ مصرف مقدار زیادی از روغن ماهی هیچ نشانه‏ای از علایم بیماری‏های قلبی-‌ عروقی در آن‏ها مشاهده نشده بود، و این سطح بالای مصرف اسید‏های چرب امگا3، از میزان تری‏گلیسرید، حمله قلبی و فشار خون و بیماری آترواسکلروزیس در جمعیت آن‏ها کاسته بود (1). همچنین، شیوع پایین بیماری‏های قلبی در دیگر جمعیت‏هایی ‏مانند نوروژی‏ها و ژاپنی‏ها که غذای ماهی زیادی مصرف می‌کنند؛ کمک کرد که پژوهش‏های ویژه و مهمی بر روی اسید‏های چرب امگا3 انجام شود (2). فایده و نقش مهم اسیدهای چرب امگا3 به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید[1] (DHA: C22: 6 n-3) ‏و ایکوزاپنتانوئیک اسید[2]
(EPA: C20:5 n-3) با مطالعات گسترده‏ای که در این زمینه انجام شد به اثبات رسیده است. اسیدهای چرب امگا3 گروه بزرگی از اسیدهای چرب غیراشباع با زنجیره کربنی بلند و چندین باند دوگانه در ساختارشان [3] (PUFAs) هستند (1 و 3). این اسیدهای چرب موجب ویژگی‏های منحصر به فرد سیالیت، نفوذ‏پذیری و انعطاف پذیری در غشاهای سلولی می‌شوند (4).گیاهان توانایی سنتز ایکوزاپنتانوئیک اسیدو دوکوزاهگزانوئیک اسید را ندارند و این ترکیبات تنها از طریق منابع دریایی تامین می‏شوند. به علت‏ اینکه این اسیدهای چرب برای متابولیسم نرمال بدن، حیاتی و ضروری هستند، آن‏ها را به عنوان اسید چرب ضروری در نظر می‌گیرند (2 و 5). انسان و سایر حیوانات برای تامین مقدار کافی از دوکوزاهگزانوئیک اسید و سایر اسید‏های چرب غیر اشباع، از قبیل ایکوزاپنتانوئیک اسید، دو مسیر را طی می‏کنند. یکی این‏که آن‏ها را به طور مستقیم از طریق رژیم غذایی خود و با مصرف منابع دریایی به‏دست آورند و یا این‏که آن‏ها را از طریق مصرف رژیم غذایی گیاهی حاوی پیش ماده آلفا لینولنیک اسید[4] (ALA:C18:3 n-3) و تبدیل ناچیز آن به ایکوزاپنتانوئیک اسید و دوکوزاهگزانوئیک اسید تأمین می‏کنند (3‏). اسید‏های چرب امگا3 به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید در سلامتی انسان، رشد، توسعه و تکامل مغز و چشم نقش مهمی دارند (6‏). تجمع دوکوزاهگزانوئیک اسید در غشاهای سلول‏های عصبی به عنوان شاخص مهمی از پایداری، برد عملیاتی و توان مغزی است. آزمایش‏های کلینیکی با رژیم غذایی غنی شده از دوکوزاهگزانوئیک اسید نشان داده‏اندکه افزایش چشمگیری در سطح و ظرفیت یادگیری بچه‏ها در سنین مدرسه مشاهده می‌شود (4‏). همچنین، دوکوزاهگزانوئیک اسید در ساختار فسفاتیدیل سرین که یکی از مواد مغذی و مهم برای مغز است، حضور دارد. غشای سلول‏های نورونی دارای مقدار زیاد فسفاتیدیل سرین است. فسفاتیدیل ‏سرین ‏نقش مهمی در فعالیت‏ها و عملکرد‏هایی ‏که نیاز به هوش زیاد دارند ایفا می‌کند و از این رو دارای آثار مثبت در خلق و خوی افراد، کنترل و مدیریت استرس افراد است (4‏). همچنین شواهد زیادی وجود دارد که اسیدهای چرب غیر اشباع به عنوان رژیم غذای مکمل در تمام دوران زندگی فرد و به ویژه دوران بارداری، شیر دهی، کودکی و کهن‏سالی مورد نیاز است. امروزه توصیه‏های زیادی می‌شودکه این دو اسید چرب (EPA و به ویژه DHA) در رژیم غذایی انسان وجود داشته باشند. همچنین، دوکوزاهگزانوئیک اسید ‏تحریک کننده فرآیند آپوپتوز در سلول‏های سرطانی است (2 و 4‏). از این رو لازم است تا به دنبال منابع جدید، سالم و مناسب برای تامین آن بود. در اوایل دهه 1990 تنها منبع مصرفی دوکوزاهگزانوئیک اسید که توسط متخصصین تغذیه معرفی شده بود، روغن ماهی بود (1‏). اما روغن ماهی دارای معایبی چون مزه و بوی نامطلوب و پایداری اکسیداتیو پایین هستند. استفاده از روش‏های شیمیایی در استخراج آن، کم بودن منابع تولیدی به علت‏ صید زیاد و آلودگی دریاها با فلزات سنگین چون جیوه و به دنبال آن احتمال حضور این ترکیبات سمی در اسید‌های چرب امگا3 استخراج شده از ماهی از دیگر معایب آن بوده و از این رو پژوهشگران به دنبال منابع جایگزین روغن ماهی بوده‏اند (1، 3 و 5). پژوهش‏های جدید نشان داده‏اند که تعدادی از میکروارگانیسم‏ها توانایی تولید روغن‏های خوراکی شامل اسید‌های چرب امگا3 را به مقدار چشمگیری دارند. این سویه‏ها شامل جنس‏های ژاپونوکیتریوم[5]، آئورانتوکیتریوم[6]، اولکنیا[7]، شیزوکیتریوم[8]، ترائوستوکیتریوم[9]و کریپتکودینیوم کوهنی[10]بوده و بیشتر مربوط به خانواده ترائوستوکیتریدها[11] هستند. محتوی روغن آن‏ها بیش از 50 درصد وزن خشک‌شان ‏بوده و ترکیب با ارزش دوکوزاهگزانوئیک اسید در میان کل محتویات روغن‌های تولیدی توسط آن‏ها بیش از 30 درصد است. مزیت و فایده دیگر روغن تک سلولی‏ها این است که معمولا به طور مشخص شامل مقدار زیاد آنتی اکسیدان‏های طبیعی از قبیل کاروتنوئیدها، آستازانتین و توکوفرول‏ها هستند که توانایی محافظت اسیدهای چرب امگا3 از اکسیداسیون را دارند (7‏). از این رو با توجه به ارزش بالای این سویه‏های میکروارگانیسمی در تولید اسید‏های چرب امگا‏3 و به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید، هدف از انجام این پژوهش نمونه‏برداری وسیع از اکوسیستم جنگل‏های مانگرو در نواحی جنوبی ایران، جداسازی و غربال‏گری سویه‌های ‏پروتیست دریازی از خانواده ترائوستوکیتریدها و بررسی تولید اسید چرب امگا‏3 دوکوزاهگزانوئیک اسید برای نخستین بار در ایران است.

 

‏‏.مواد و روش‏ها

مواد مورد استفاده: ترکیبات مورد استفاده در محیط کشت شامل گلوگز، عصاره مخمر، پپتون و آگار از شرکت مرک آلمان[12] خریداری شد. رنگ فلوروسنت نایل رد از شرکت سیگما امریکا[13] خریداری شد. تمامی حلال‏های مورد استفاده نیز از شرکت مرک آلمان خریداری شد.

نمونه‏برداری: نمونه‏برداری در طی چند مرحله و از مناطق مختلف اکوسیستم‏های جنگل‏های مانگرو در مناطق جنوبی ایران، در سواحل خلیج فارس و دریای عمان شامل قشم، کیش، چابهار و بوشهر انجام شد. یک‏سری از برگ‌های درختان حرا[14] ‏و چندل[15] که شامل برگ‏های تازه و پوسیده و در حال فساد و تجزیه بودند جمع‏آوری شد. از آب دریا نیز چند نمونه جمع‏آوری شد. نمونه‏ها بعد از انتقال به آزمایشگاه، تا زمان استفاده در دمای 4 درجه سانتی‏گراد و در یخچال نگه داری شد.

جداسازی سویه‏ها با روش کشت مستقیم نمونه‏ها: در این روش تعدادی از نمونه‏های برگ به منظور از بین بردن آلودگی‏های سطحی به مدت 1 دقیقه توسط الکل 70 درصد ضدعفونی، با آب مقطر شسته و توسط اسکارپل به قطعات کوچکی تقسیم شد (8‏). ‏سپس آن‏ها بر روی محیط کشت گلوگز، عصاره مخمر، پپتون و آگار حاوی آنتی بیوتیک[16]،‏ قرار داده شد. ترکیبات این محیط کشت شامل ‏گلوگز 15 میلی‏گرم بر لیتر، عصاره مخمر 1 گرم بر لیتر، پپتون گرم بر لیتر 1، آگار 15 گرم بر لیتر، ‏آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین هر کدام 3/0 گرم بر لیتر و با نسبت50 درصد از آب دریا بودند. پلیت‏های تلقیح شده در دمای 30 درجه سانتی‏گراد به مدت 3 تا 7 روز انکوبه شدند. در مدت زمان انکوباسیون، سویه‌های ترائوستوکیترید در حاشیه قطعات برگ‏ها بر روی محیط جامد آگاردار رشد کردند. سپس آن‏ها توسط لوپ استریل به یک محیط کشت جدید GYP آنتی بیوتیک‏دار انتقال داده و دوباره به مدت 48 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از رشد مناسب سویه‏ها و خالص‏سازی آن‏ها، از سویه‏های خالص اسلنت تهیه و در دمای 4 درجه به مدت یک ماه نگه‏داری شد. به علت‏ آن که محیط کشت GYP دارای آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین بود، مانع رشد آلودگی‏های باکتریایی شده و جداسازی سویه پروتیست مورد نظر راحت‏تر انجام شد (9‏).

روش جداسازی سویه‏ها با استفاده از دانه گرده: نمونه‏هایی ‏از هر دو گروه آب دریا و برگ‏های پوسیده به ارلن‏های کوچک انتقال داده، به آن‏ها مقداری دانه استریل گرده کاج افزوده، درب ارلن‏ها با پنبه بسته و به مدت 7 روز در30 درجه سانتی‏گراد و در rpm ‏150 انکوبه شد. پس از آن مقداری از دانه‏های گرده از روی سطح محیط کشت توسط لوپ برداشته، به شکل استریک به محیط کشت GYP آنتی بیوتیک دار ‏انتقال داده و به مدت 3 تا 7 روز در 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد (1‏).‏ بعد از رشد سویه‏ها و خالص‏سازی آن‏ها، کشت‏های خالص از سویه‏ها در دمای 4 درجه یخچال نگه‏داری شد.

شناسایی ریخت‏شناسی سویه غربال‏گری شده: شناسایی اولیه سویه‏های غربال‏گری شده براساس آزمون‏های اولیه شامل شکل میکروسکوپی، شکل و رنگ کلونی و مشاهده مراحل مختلف چرخه زندگی سویه انجام شد و از بین آن‏ها سویه‏ای که بیش‏ترین شباهت را به ترائوستوکیتریدها را داشت، انتخاب شد (11‏).

.شناسایی مولکولی ترائوستوکیتریدها و تعیین توالی ژن 18S rRNA: DNA ژنومی با استفاده از روش فنل/ کلروفرم استخراج شد. ژن 18S rRNA با استفاده از PCR و بر طبق برنامه جدول 1 تکثیر شد. پرایمر رفتی T18S1F (5'-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3')

 و پرایمر برگشتی T18S5R

(5'-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3') برای تکثیر ژن، استفاده شد. سپس، محصول PCR تخلیص و تعیین توالی شد (8 و 22).

پس از انجام شدن واکنش PCR،‏ محصول تکثیر شده بر روی ژل آگاروز 1 درصد در شرایط بافری TAE و با ولتاژ 80 ولت به مدت 60 دقیقه الکتروفورز شد. در این واکنش بتائین و دی متیل سولفوکساید به عنوان افزایش دهنده کارآیی در واکنش PCR استفاده شد.

 

جدول 1- برنامه PCR برای جفت پرایمرهای T18S1F و T18S5R

سیکل‏ها

زمان (ثانیه)

دما
(درجه سانتی‏گراد)

فازها

1

180

94

P1

30

45

30

120

94

64

72

P2

1

10 دقیقه

72

P3

Hold

Hold

4

Hold

.محیط کشت تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید و تری‏آسیل گلیسرول‏های ذخیره‏ای: یک کشت تازه از سویه پروتیست غربال‏گری شده بر روی محیط کشت GYP آگار دار جامد شامل گلوگز 15گرم بر لیتر،‏ عصاره مخمر ‏1 گرم بر لیتر، پپتون 1 گرم بر لیتر،‏ آگار 15 گرم بر لیتر و با نسبت 50 درصد از آب دریا تهیه شد. سپس معادل نصف لوپ از کشت برداشته و به محیط کشت تولیدی (محیط کشت مایع فوق بدون آگار ) تلقیح انجام شد. ارلن‌های تلقیح شده در دمای 30 درجه و rpm 150 به مدت 72 ساعت انکوبه شد.

.غربال‏گری سویه‏های تولید کننده تری آسیل‏گلیسرول توسط میکروسکوپ فلورسنت: از سویه‌هایی که روی محیط گلوگز، ‏عصاره مخمر و پپتون کشت داده شدند یک لوپ برداشته و در روی لام شیشه‏ای پخش و بعد از خشک شدن، چند قطره از رنگ نایل رد با غلظت5/0میکروگرم در میلی‏لیتر در حلال دی‏متیل سولفوکساید[17] به سلول‏های تثبیت شده بر روی لام افزوده شد. سپس سلول‏ها توسط میکروسکوپ فلورسنتمدل Axioplan2 Imaging مشاهده شد. دانه‏های تری‏آسیل‏گلیسرول در معرض نور یووی[18] به شکل نارنجی در داخل سلول‏ها مشاهده شد (10‏).

تعیین وزن خشک سلولی: به منظور سنجش بیوماس، ‏25 میلی‏لیتر از محیط کشت در ‏rpm 4000 و به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژ و سوپرناتانت دور ریخته شد. سپس، پلت سلولی برای خشک شدن در آون با دمای 105 درجه تا رسیدن به وزن ثابت (مدت 24 ساعت) قرار داده شد (9‏).

.استخراج روغن از وزن خشک و تعیین میزان تری‏آسیل گلیسرول‏های ذخیره ای به روش وزن‏سنجی: ‏استخراج روغن از بیومس خشک سلولی بر طبق پروتکل استخراجی بلایت و دایر[19] با کمی تغییرات انجام شد (12‏). در این روش ابتدا مقدار مشخصی از بیومس خشک سلولی وزن کرده و به فالکون انتقال داده شد. سپس به آن مقدار 2 میلی‏لیتر آب مقطر افزوده شد. پس از آن خورد کردن بیومس خشک سلولی توسط دستگاه التراسونیک مدل UP200S به مدت 5 دقیقه انجام گرفت. سپس، مقدار 5/2 میلی‏لیتر از محلول کلروفرم و 5 میلی‏لیتر از محلول متانول به آن اضافه شد و توسط دستگاه هموژنیزر و التراسونیک خرد شدن دیواره سلولی به مدت 4 دقیقه انجام گرفت. دوباره مقدار 5/2 میلی‏لیتر کلروفرم و 5/2 میلی‏لیتر آب مقطر اضافه شد و به دنبال آن به مدت 2 دقیقه هموژنیزر و ورتکس شدن انجام شد. سپس، آن‏ها در rpm 4000 به مدت 15 دقیقه سانتریفیوژشده و به دنبال آن دو فاز تشکیل شد. لایه پایین (فاز آلی) برداشته و به فالکون تمیز از قبل وزن شده دیگر انتقال داده شد. سپس، عمل تبخیر حلال کلروفرم در زیر هود انجام شد (13 و 14). پس از آن توزین دوباره اپندورف انجام شده و از اختلاف آن با وزن اپندورف خالی، وزن روغن تولیدی توسط سویه پروتیست مورد نظر محاسبه شد. روغن تولیدی برای نگه‏داری برای انجام تحلیل‏های دیگر، به فریز منفی 20 منتقل شد (13 و 15).

.روش آماده‏سازی نمونه برای انجام تحلیل کروماتوگرافی گازی: برای آن که روغن‏های ذخیره‏ای سویه قابلیت تحلیل توسط دستگاه کروماتوگرافی گازی را داشته باشند باید به فرم متیل استر اسید چرب تبدیل شوند. زمانی که اسیدهای چرب به فرم متیل استر تبدیل می‏شوند اطلاعات کروماتوگرافی محکم‏تر و از قابلیت تکرار پذیری بالاتری برخوردار هستند (16‏). مقدار مشخصی از روغن استخراج شده، وزن شده به یک لوله آزمایش درپیچ دار منتقل شد. سپس به آن مقدار 3 میلی‏لیتر متانولیک سولفوریک اسید 4 درصد اضافه و درب لوله آزمایش محکم بسته شد. سپس، توسط دستگاه حمام التراسونیک به مدت 10 دقیقه در دمای 40 درجه التراسونیک بیومس انجام شد. پس از آن، نمونه در بن ماری و در دمای 80 درجه به مدت 90 دقیقه قرار داده شد. بعد از اتمام زمان فوق، نمونه برداشته و در دمای محیط برای سرد شدن قرار داده شد. زمانی که نمونه به مقدار کافی سرد شد به آن 1 میلی‏لیتر آب افزوده و به دنبال آن عمل ورتکس شدن به مدت 30 ثانیه انجام شد. سپس، 1 میلی‏لیتر هگزان اضافه شده و دوباره 30 ثانیه ورتکس شد. برای مدتی نمونه را ثابت گذاشته تا دو فاز تشکیل شد. پس از آن فاز رویی (فاز آلی) که شامل فاز متیل استر‏های موجود در هگزان بوده برداشته و به لوله آزمایش تمیز دیگری انتقال داده شد. به مقدار کم (نوک یک اسپاتول) از نمک سدیم سولفات[20] برای جذب آب یا اسید در محلول اضافه شد، تا آب به ستون دستگاه GC آسیبی وارد نکند (13‏). پس از افزودن نمک فوق دوباره 30 ثانیه عمل ورتکس انجام ، فاز آلی برداشته و به اپندورف تمیز دیگری منتقل شد. نمونه برای تزریق به دستگاه کروماتوگرافی رقیق شد. به این شکل که 50 ماکرولیتر از آن برداشته و در اپندرف دیگر 950 ماکرولیتر حلال هگزان به آن افزوده و پس از آن دوباره 30 ثانیه عمل ورتکس شدن انجام شد. نمونه برای تحلیل کروماتوگرافی آماده شده و تا زمان تزریق به دستگاه کروماتوگرافی در یخچال 4 درجه نگه‏داری شد. پس از تزریق نمونه به دستگاه و اتمام تحلیل برای نگه‏داری استوک، نمونه به فریز منفی 20 منتقل شد (9، 15 و 17).

.تحلیل کروماتوگرافی گازی برای تعیین تولید DHA: در این پژوهش برای بررسی تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید، محاسبه مقدار آن و همچنین طیف اسید‏های چرب تولیدی توسط سویه پروتیست، تحلیل متیل استرهای چرب تولید شده توسط کروماتوگرافی گازی انجام شد (17‏). دستگاه کروماتوگرافی گازی مورد استفاده در این پژوهش مدل N, Agilent 6890 وساخت کشور امریکا بود. ستون دستگاه از نوع DB-23 بوده که 30 متر طول و 32/0 میلی‏متر عرض داشت. این ستون پوشیده از سیانوپروپیل با فاز ثابت مویینه بود و جداسازی خوب و تخمین مناسب از اسید‏های چرب امگا3 را انجام داد. و همچنین، قابلیت تشخیص و جداسازی ترکیبات دوکوزاهگزانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید را دارا بود. تنظیمات دستگاه شامل دمای دتکتور و اینجکتور هر دو 300 درجه سانتی‏گراد، حجم تزریق نمونه 5/0 میکرو لیتر، گاز نیتروژن گاز حامل و برنامه دمایی و زمانی آون به شکل 50 درجه سانتی‏گراد به مدت 2 دقیقه، 10 درجه سانتی‏گراد در هر دقیقه تا رسیدن به 180 درجه سانتی‏گراد با زمان ماندگاری 5 دقیقه و سپس، 5 درجه سانتی‏گراد در هر دقیقه تا رسیدن به 240 درجه سانتی‏گراد با زمان ماندگاری 7 دقیقه تنظیم شد.

 

.نتایج

نتایج حاصل از جداسازی با کشت مستقیم: از بین کشت‌های مربوط به نمونه‏های جمع آوری شده از درختان مانگرو که شامل برگ‏های پوسیده، برگ‏های تازه و قسمت‏های ساقه و ریشه این درختان بود، بیش‏ترین رشد میکروارگانیسم‌ها مربوط به برگ‌های پوسیده بود که کلونی‌ها از نواحی حاشیه‏ای برگ‏ها رشد کردند. کلونی سویه‌های رشد یافته، جداسازی و بر روی محیط کشتGYP جامد آنتی‏بیوتیک‏دار خالص‏سازی شدند. آنتی‏بیوتیک‏های پنی‏سلین و استرپتومایسین از رشد کلونی‏ باکتری‏ها جلوگیری کرده و جداسازی و خالص‏سازی کلونی‏‏های تک سلولی ترائوستوکیتریدها راحت‏تر انجام شد. با گذشت زمان یکسری از قارچ‏های ریسه‏ای و پرسلولی با انتشار هاگ‌های خود با سرعت زیادی رشد کرده و تمام سطح پلیت را می‏پوشانند و مانع دیده شدن کلونی‏ ترائوستوکیتریدها می‏شوند. اما از آنجا که کلونی‏‏های تک سلولی ترائوستوکیتریدها زودتر از قارچ‏های ریسه دار رشد می‏کنند زودتر جداسازی شدند که مانع از پوشیده شدن آن‏ها توسط قارچ‏های ریسه‏ای شد. در این پژوهش، بیش از 20 سویه پروتیست از نمونه‏های جمع‏آوری شده، جداسازی شد. سپس، سویه‏های خالص جهت نگه‏داری و انجام سایرآزمایشات بر روی محیط کشت GYP اسلنت کشت و در یخچال با دمای 4 درجه به نگه‏داری شد.

.بررسی ویژگی‏های ریخت‏شناسی سویه‏های غربال‏گری.‏شده: از سویه‌های خالص کشت تازه 24 ساعته تهیه شد. این سویه‌ها از نظر رنگ کلونی‏، شکل، ظاهر کلونی‏ روی محیط جامد و میزان و نحوه رشد در کشت مایع مورد بررسی قرار گرفتند و از بین آن‏ها با توجه به ویژگی‏های ظاهری و بررسی‏های میکروسکوپ نوری سویه TA4 که مشابهت بیشتری به سویه‏های پروتیست تک سلولی دریازی خانواده ترائوستوکیتریدها داشته، برای آزمایشات بعدی انتخاب شد. اندازه سلولی این سویه بین 5 تا 20 میکرومتر بوده و در سیکل زندگی آن سلول‏های دوتایی، چهارتایی، هشت تایی و شکل‏های نامنظم آمیبی[21] مشاهده شد. همچنین، تولید زئوسپورها در این سویه مشاهده شد که برای تکثیر غیر جنسی از آن استفاده می‏کند. رنگ کلونی‏ سویه TA4 بر روی محیط کشت جامد، نارنجی روشن و دارای سطح براق و لعابی بود. همچنین، این سویه در محیط کشت مایع به صورت کلامپ رشد کرد. ژن
18S rRNA (1780 bp) تکثیر شد (شکل 1) و توالی آن با داده‏های بانک ژنی و با استفاده از برنامه بلست[22] مقایسه شد. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-joining و با استفاده از نرم افزار مگا4[23] ترسیم شد (شکل 2). سویه TA4 بیش از 97 درصد با سویه جنس آئورانتیوکیتریوم از خانواده ترائوستوکیتریدها مشابهت داشت. شماره دسترسی این سویه در سایت NCBI با کد KJ938302 قابل دسترسی است.

 

 

شکل 1- تصویر ژل رنگ آمیزی شده با اتیدیوم برماید برای محصول PCR با 1700 جفت باز

 

 

شکل 2- تحلیل فیلوژنتیکی سویه TA4. درخت فیلوژنتیکی با استفاده از روش Neighbor-joining و ‏با 1000 تکرار ترسیم شد.

فاصله تکاملی با استفاده از Kimura 2 parameter محاسبه شد.

 

 

شکل 3- A عکس میکروسکوپ نوری سویه TA4 و B: عکس میکروسکوپ فلورسانت از سلول‏ها.

دانه‏های ذخیره ای تری‏آسیل‏گلیسرول به شکل دانه‏هایی با فلورسانت زرد مشاهده شد.

 


.بررسی سویه TA4 توسط میکروسکوپ فلوروسنت: از سویه ‏TA4 که بر روی محیط کشت گلوگز، ‏عصاره مخمر، پپتون و آگار رشد کرده بود لام تهیه و توسط نایل رد رنگ آمیزی انجام شد. سپس لام میکروسکوپی توسط میکروسکوپ فلوروسنت مشاهده شد (شکل 3). رنگ نایل رد به تری آسیل گلیسرول‌های داخل سلول متصل شده و سلول‏ها در معرض نور UV به شکل سلول‌های حاوی گرانول‏های زرد و یا نارنجی فلورسانت مشاهده شد. هرچه سویه توانایی تولید تری‏آسیل‏گلیسرول‏های ذخیره‌ای بیشتری داشته باشد فلورسانت زرد بیشتری از خود ساطع می‏کند.

.بررسی رشد سلولی و تولید روغن در سویه TA4: نتایج رشد سلولی و تولید روغن در جدول 2 نشان داده شده است. سویه TA4 بعد از 48 ساعت 37/1 گرم بر لیتر بیومس تولید کرده که 6/46درصد آن را روغن تشکیل داده است. در این سویه مقدار 642/0 گرم بر لیتر روغن تولید شد.

 

 

جدول 2- مقدار بیومس، روغن تولیدی و درصد آن

درصد روغن در وزن خشک سلولی

گرم روغن در یک گرم وزن خشک سلولی

روغن

(گرم بر لیتر)

وزن خشک سلولی (گرم برلیتر)

سویه

6/46

462/0

642/0

37/1

TA4

 

 

.تحلیل کروماتوگرافی گازی متیل استرهای اسید‏های چرب تولید شده توسط سویه TA4: به منظور بررسی پروفایل اسید‏های چرب و تعیین نوع اسید‏های چرب تولید شده توسط سویه و تأیید نهایی تولید ترکیب ارزشمند دوکوزاهگزانوئیک اسید و همچنین، محاسبه مقدار آن و مقدار سایر اسید‏های چرب تولیدی و ترسیم پروفایل محصولات تولیدی، تحلیل کروماتوگرافی گازی متیل استر اسید‏های چرب انجام شد. ‏با توجه به بررسی دیاگرام به دست آمده از تحلیل گروماتوگرافی گازی سویه TA4 (شکل 4)؛ پیک و زمان خروج متیل استرها از دستگاه کروماتوگرافی گازی و نوع اسیدهای چرب اصلی که توسط سویه تولید شده بود، مشخص شد. پیک‏های مهم و شاخص که توسط سویه تولید شده هر کدام در زمان مشخصی از دستگاه خارج و با استاندارد متیل استر اسیدهای چرب مقایسه شدند. پیک اول مربوط به مریستیک اسید(C14:0)[24] بوده که در زمان 95/12 دقیقه از ستون خارج شد. پیک دوم و سوم مربوط به ترکیب پنتادکانوئیک اسید (C15:0)[25] و پالمیتیک اسید[26] (C16:0) هستند که به ترتیب در زمان‏های 78/13 دقیقه و 58/14 دقیقه از ستون خارج شدند. هر سه این ترکیبات از گروه اسید‏های چرب اشباع می‏باشند. پیک دوکوزاپنتانوئیک اسید DPA (C22:5 n-6)[27] از گروه اسیدهای چرب امگا6 در زمان 46/24 دقیقه از ستون خارج شد. EPA و DHA که مربوط به اسیدهای چرب مهم و با ارزش امگا3 هستند به ترتیب در زمان‏های 97/21 و 41/25 دقیقه از ستون خارج شدند.

 

 

 

شکل 4- پروفایل متیل استر اسیدهای چرب تولید شده

 

جدول 3- درصد اسیدهای چرب و مقدار آن‏ها در سویه آئورانتیوکیتریومTA4

میلی‏گرم اسید چرب در یک گرم روغن

میلی‏گرم در لیتر اسیدچرب

درصد کلی اسید چرب

انواع اسید چرب

80/70

49/45

08/7 درصد

C14

94/82

33/53

30/8 درصد

C15

47/568

38/365

86/56 درصد

C16

19/41

47/26

12/4 درصد

 (امگا 3)EPA

59/72

65/46

26/7 درصد

(امگا 6) DPA

7/163

2/105

38/16 درصد

(امگا 3) DHA

21/722

2/464

24/72 درصد

Total Saturated Fatty Acids

----

----

----

Total Muno Unsaturated Fatty Acids

48/277

32/178

76/27 درصد

Total Poly Unsaturated Fatty Acids

 

 

با توجه به شکل 4 ترکیب پالمیتک اسید (C16:0) در سویه‌ آئورانتیوکیتریوم[28] از خانواده ترائوستوکیتریدها به عنوان ترکیبی شاخص بوده و به مقدار زیاد تولید می‏شود. با در نظر گرفتن زمان جداسازی پیک اسیدهای چرب با پیک‏های اسیدهای چرب موجود در نمونه استاندارد، نوع آن اسیدهای چرب شناسایی شد. ترکیب اصلی DHA در زمان 41/25 دقیقه در ستون DB-23 جداسازی شده است. سویهTA4 قادر به تولید 32/178 میلی‏گرم در لیتر و 48/277 میلی‏گرم در گرم روغن اسید چرب غیر اشباع با چندین باند دوگانه از نوع DHA، EPA و DPA است (جدول 3 و شکل 5). این اسیدهای چرب غیراشباع با چند پیوند دوگانه 28 درصد از کل روغن تولید شده توسط سویه را به ‏خود اختصاص داده‏اند (شکل 6).

 

 

 

شکل 5- مقدار اسیدهای چرب اشباع، غیراشباع با یک پیوند دوگانه و یا چند پیوند دوگانه در سویه آئورانتیوکیتریوم ‏TA4

 

 

شکل 6- درصد اسیدهای چرب اشباع، غیراشباع با یک پیوند دوگانه و یا چند پیوند دوگانه در سویه آئورانتیوکیتریوم. اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه نزدیک به 28 درصد از کل روغن‏های تولیدی در سویه آئورانتیوکیتریوم را تشکیل داده اند.

 

.مقدار و ترکیب اسیدهای چرب تولید شده توسط سویه TA4: سویه TA4 ‏مقدار ‏38/365 میلی‏گرم بر لیتر اسید چرب C16 تولید کرده که این مقدار برابر با 86/56 درصد از کل روغن تولیدی است (شکل 7). مقدار DHA تولیدی این سویه 2/105 میلی‏گرم بر لیتر و EPA  26/47 میلی‏گرم بر لیتر است که به ترتیب38 /16 و 12/4 درصد از کل روغن تولید شده است (شکل 8). میزان تولید روغن‏های امگا3 این سویه 67/131 میلی‏گرم بر لیتر بوده که 5/20درصد از کل روغن تولیدی توسط سویه است.

 

 

شکل 7- مقدار و ترکیب اسیدهای چرب تولید شده توسط سویه آئورانتیوکیتریوم TA4

 

 

شکل 8- محتویات پروفایل اسیدهای چرب تولید شده توسط ‏سویه آئورانتیوکیتریوم TA4

 

.بحث و نتیجه ‏‏گیری

با توجه به اهمیت و ضرورت وجود اسیدهای چرب امگا‏3 ‏در رژیم غذایی انسان و نقش مهم آن‏ها در جلوگیری از بیماری‌های قلبی- ‌عروقی، مشخص شده که مردان با مصرف روزانه 610 و زنان 430 میلی‏گرم، ریسک ابتلا به این بیماری در آن‏ها کاهش می‏یابد (3). همچنین، مشخص شده که با مصرف حداقل یک وعده غذای ماهی در هفته، 52 درصد ریسک مرگ ناگهانی بر اثر بیماریهای قلبی- عروقی (سکته قلبی) کاهش می‏یابد (18). افزایش مصرف چربی‏های اشباع و همچنین افزایش مصرف اسیدهای چرب امگا6 ‏نسبت به امگا3 ‏موجب افزایش بیماری آترواسکلروزیس می‏شود. مصرف دوکوزاهگزانوئیک اسید موجب افزایش نسبت کلسترول خوب[xxix] به کلسترول بد[xxx] و کاهش کلسترول کل به نسبت HDL ‏شده و ریسک ابتلای به بیماری‌های قلبی- عروقی را کاهش می‌دهد (4 و 18). روغن ماهی‏هایی از قبیل قزل آلا، شاه ماهی و ساردین در کنار سایر ماهی‏ها از منابع بزرگ مصرف دوکوزاهگزانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید است. از دیگر منابع معمول برای تامین اسیدهای چرب غیر اشباع با چند پیوند دوگانه برای انسان منابع گیاهی هستند، اما روغن‏های گیاهی دارای اسیدهای چرب امگا3 نیستند و دارای گروه اسیدهای چرب غیراشباع امگا‏6 ‏هستند. مصرف منابع گیاهی دارای امگا6 نسبت به منابع دریایی دارای امگا3، ‏می‏تواند سبب افزایش بیش از حد اسیدهای چرب امگا6 نسبت به امگا3 شده و خطر ابتلا به سرطان، دیابت، بیماری‌های مغزی و تحلیل رفتن نورون‌ها و بیماری‌های قلبی و عروقی را افزایش می‏دهد (19‏). احتمال وجود آلودگی‏های فلزات سنگین و کاهش ذخایر ماهی و افزایش روز افزون تقاضا برای مصرف مکمل‏های امگا3، موجب افزایش پژوهش در زمینه‏های استفاده از روغن تک سلولی‌ها (مخمرها و قارچ‏ها) به عنوان منابع جایگزین در استفاده از اسیدهای چرب امگا3 شده است (7‏). همچنین، چندین گونه باکتری دارای ترکیبات روغنی‏می‏باشند (7‏)، اما به عنوان منابع جایگزین روغن‏های امگا‏3 در نظر گرفته نمی شوند زیرا مقدار کم محتویات روغن آن‏ها (5 تا 20 درصد) و احتمال حضور ترکیبات نامطلوب در روغن آن‏ها ‏موجب شده که دوکوزاهگزانوئیک اسید و ایکوزاپنتانوئیک اسید باکتری‏ها از کیفیت و درجه خلوص مناسب برخوردار نباشند (3‏).سویه‌های ترائوستوکیتریدها که جزو یوکاریوت‏های دریازی می‏باشند، می‏توانند جایگزین مناسبی برای تامین منابع امگا3 باشند و دارای توانایی منحصر به فردی در تولید اسیدهای چرب غیراشباع به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید هستند (1 و 20). این سویه‏ها بیش از 50 درصد وزن خشک سلولی خودشان روغن تولید کرده و اسیدهای چرب آن‏ها به طور گسترده از نوع دوکوزاهگزانوئیک اسید ‏و ایکوزاپنتانوئیک اسید است. ترائوستوکیتریدها به گروه یوکاریوت‌های غیر فتوسنتزکننده هتروتروف متعلق و از پروتیست‌های تک سلولی دریازی هستند. دیواره سلولی ترائوستوکیتریدها بدون سلولز[xxxi] بوده وبه طور گسترده از L-گالاکتوز[xxxii] تشکیل شده است و بیشتر در یکی از 3 گروه زیر قرار دارند. این سویه‏ها دارای پراکنش وسیعی در سراسر دنیا هستند. تجمع آن‏ها بیشتر در نقاط ساحلی دریاها، اقیانوس‏ها و اکوسیستم‏های جنگل‏های مانگرو است و در کل با توجه به اقلیم آب و هوایی دریاها در سراسر دنیا، این سویه‏ها یا ساکن آب و هوای معتدله و سرد شمال (اقلیم معتدل) و یا ساکن اقلیم آب و هوایی ساحلی گرمسیری (اقلیم استوایی) هستند. کشور ایران در حوضه اقلیم آب و هوایی گرمسیری استوایی قرار دارد اما تا کنون جداسازی سویه‌های ترائوستوکیتریدها از این مناطق گزارش داده نشده است. در این پژوهش، برای نخستین بار از اکوسیستم‏های بسیار بکر و طبیعی جنگل‏های مانگرو در جنوب ایران نمونه‏برداری انجام شد.پس از انجام مراحل جداسازی و غربال‏گری تعدادی سویه جداسازی شد. سپس، با توجه به بررسی‏های میکروسکوپ نوری، فلوروسنت، ویژگی‏های ریخت‏شناسی، مولکولی و شاخص‌های رشدی و میزان تولید روغن و دوکوزاهگزانوئیک اسید، سویه TA4 انتخاب شد. سویه پروتیست TA4 مورد نظر دریازی بوده و بیشتر کلونی‏‏های آن بر روی برگ‏های درحال تجزیه وجود داشت. ترائوستوکیتریدهابسیار سریع رشد کرده و در بازه زمانی کوتاه بیومس قابل توجهی تولید می‏کنند. این سویه‏ها توانایی منحصر به فردی در تولید اسیدهای چرب غیراشباع به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید (DHA) دارند و با کنترل شرایط محیط کشت می‏توان به بازده‏های بسیار بالایی در تولید اسیدهای چرب امگا3 دست یافت. همچنین، با توجه به پژوهش‏های انجام شده میزان کلسترول تولیدی توسط ترائوستوکیتریدها در حدود 04/0±3/1 بوده که از میزان کلسترول روغن ماهی (5 تا 8) میلی‏گرم در گرم کمتر است. در ضمن میزان تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید سویه‏های ترائوستوکیتریدها در حدود 20 تا 45 درصد بوده، ‏که در مقایسه با میزان دوکوزاهگزانوئیک اسید موجود در روغن ماهی (2 تا 8) درصد بسیار بیشتر است. همچنین، با توجه به اینکه این سویه‌ها پروتیست یوکاریوتی هستند، بر خلاف باکتریهای پروکاریوت، مواد و ترکیبات مضری مانند: اندوتوکسین‌ها و لیپوپلی‏ساکاریدها را برای سلامتی انسان ندارند. همچنین، این سویه‏ها توانایی بالایی در تولید پالمیتیک اسید دارند که می‏توان از آن به عنوان منبع بسیار مناسب برای سوخت زیستی استفاده کرد (7‏).این پروتیست‌های با ارزش علاوه بر اسید‌های چرب امگا3 و آنتی اکسیدان‏های طبیعی، قادر به تولید متابولیت‌های بسیار متنوع دیگری از قبیل استرول‏ها، ‏استروئیدها، ‏ترکیب با ارزش اسکوالن، ‏سورفاکتانت و مواد متنوع زیست فعال از جمله پلی‏ساکارید‏های خارج سلولی سولفاته، ‏آنزیم‏ها، ‏کوآنزیم‏های مختلف و کاروتنوئید‌ها به ویژه آستازانتین می‏باشند (2 و 21). با توجه به اینکه سویه آئورانتیوکیتریوم جداسازی شده از اکوسیستم مانگرو ایران در سواحل خلیج فارس و دریای عمان دارای توانایی بالقوه ای در تولید اسید چرب امگا‏3 دوکوزاهگزانوئیک اسید است، می‏توان از این سویه در تولید صنعتی این ترکیب با ارزش استفاده کرد. آئورانتیوکیتریوم TA4یک سویه بومی تولید کننده روغن امگا‏3 است. این سویه از جنگل‏های مانگرو خلیج فارس جداسازی شد و در محیط کشت حاوی گلوکز به عنوان منبع کربن، محتویات روغن تولیدی آن به بیش از 50 درصد وزن خشک سلولی رسید. توانایی این سویه در تولید دوکوزاهگزانوئیک اسید تا بیش از 20 درصد از کل مقدار روغن تولیدی است. در این پژوهش نشان داده شد که با توجه به پتانسیل بالای سویه‏های بومی ترائوستوکیتریدها در تولید اسیدهای چرب امگا‏3 و به ویژه دوکوزاهگزانوئیک اسید، این سویه‏ها می‏توانند برای تولید صنعتی روغن‏های امگا‏3 و دوکوزاهگزانوئیک اسید استفاده شوند. همچنین، با توجه به این‏که بهینه‏سازی محیط کشت هنوز انجام نشده، قابلیت این سویه در تولید اسیدهای چرب امگا3 بدون بهینه‏سازی بسیار مناسب است.

.تشکر و قدردانی

هزینه‏های این پژوهش از محل اعتبار پژوهشی (1849/1) دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته تامین شد.



[1]- Docosahexaenoic acid

[2]- Eicosapentaenoic acid

[3]- Poly unsaturated fatty acid

[4]- α-linolenic acid

[5]- Japonochytrium

[6]- Aurantiochytrium

[7]- Ulkenai

[8]- Schizochytrium

[9]- Thraustochytrium

[10]- Crypthecodiniumcohnii

[11]- Thraustochytids

[12]- Merk,Germany

[13]- Sigma,USA

[14]- Avicennia marina

[15]- Rhizophoramucronata

[16]- GYP

[17]- DMSO

[18]- UV

[19]- Bligh& Dyer

[20]- Na2SO4

[21]- Amoeboid

[22]- BLAST

[23]- MEGA4

[24]- Myristic acid

[25]- Pentadecanoicacid

[26]- Palmitic acid

[27]- Docosapentaenoic acid

[28]- Aurantiochytrium sp.

[xxix]- HDL

[xxx]- LDL

[xxxi]- non cellulosic

[xxxii]- L-galactose

  

(1)               Raghukumar S. Thraustochytrid marine protists: production of PUFAs and other emerging technologies. Marine Biotechnology 2008; 10 (6): 631- 40.

(2)               Gupta A., Barrow CJ., Puri M. Omega-3 biotechnology: thraustochytrids as a novel source of omega-3 oils. Biotechnology Advances 2012; 30 (6): 1733- 45.

(3)               Mendes A, Reis A., Vasconcelos R., Guerra P., Lopes da Silva T. Crypthecodiniumcohnii with emphasis on DHA production: a review. Journal of Applied Phycology 2009; 21 (2): 199- 214.

(4)               Valentine R.C., Valentine DL. Omega-3 fatty acids and the DHA principle. Boca Raton: CRC press; 2010.

(5)               Jakobsen A.N. Compatible solutes and docosahexaenoic acid accumulation of thraustochytrids of the Aurantiochytrium group [dissertation]. Trondheim: Norwegian university of Science and technology; 2008.

(6)               Kidd P.M. Omega-3 DHA and EPA for cognition behavior and mood: clinical findings and structural-functional synergies with cell membrane phospholipids. Alternative Medicine Review 2007; 12 (3): 207.

(7)               Armenta RE., Valentine MC. Single-Cell Oils as a Source of Omega-3 Fatty Acids. Journal of American Oil Chemist Society 2013; 90: 167- 82.

(8)               Yang H.L., lu K.C., Chen S.F., Chen Y.M., Chen Y.M. Isolation and characterization of Taiwanese heterotrophic microalgae: screening of strains for docosahexaenoic acid (DHA) production. Marine Biotechnology 2010; 12 (2): 173- 85.

(9)               Kamlangdee N., Fan K. Polyunsaturated fatty acids production by Schizochytrium sp. isolated from mangrove. Songklanakarin Journal of Science and Technology 2003; 25: 643- 50.

(10)           Rabinowitz C., Douek J., Weisz R., Shabtay A., Rinkevich B. Isolation and characterization of four novel thraustochytrid strains from a colonial tunicate. Indian Journal of Marine Science 2006; 35 (4): 341.

(11)           Perveen Z., Ando H., Ueno A., Ito Y., Yamamoto Y., Yamada Y., et al. Isolation and characterization of a novel thraustochytrid- like microorganism that efficiently produces docosahexaenoic acid. Biotechnology letters 2006; 28 (3): 197- 202.

(12)           Smedes F, Thomasen T.K. Evaluation of the Bligh & Dyer lipid determination method. Marine Pollution Bulletin 1996; 32 (8): 681- 8.

(13)           Burja A.M., Armenta RE., Radianingtyas H., Barrow CJ. Evaluation of fatty acid extraction methods for Thraustochytrium sp. ONC-T18. Journal of Agricultural Food chemistry 2007; 55 (12): 4795- 801.

(14)           Iverson S.J., Lang S.L., Cooper M.H. Comparison of the Bligh and Dyer and Folch methods for total lipid determination in a broad range of marine tissue. Lipids 2001; 36 (11): 1283- 87.

(15)           Hong W.K., Rairakhwada D., Seo P.S., Park S.Y., Hur B.K., Kim C.H., et al. Production of lipids containing high levels of docosahexaenoic acid by a newly isolated microalga, Aurantiochytriumsp. KRS101. Applied biochemistry and Biotechnology 2011. 164 (8): 1468- 80.

(16)           Shantha N.C., Napolitano GE. Gas chromatography of fatty acids. Journal of Chromatography A 1992; 624 (1): 37- 51.

(17)           Xiao L. Evaluation of extraction methods for recovery of fatty acids from marine products [dissertation]. Bergen: University of Bergen; 2010.

(18)           Horrocks L.A., Yeo YK. Health benefits of docosahexaenoic acid (DHA). Pharmaceutical Research 1999; 40 (3): 211- 25.

(19)           Cohen Z., Ratledge C. Single cell oil. USA: AOCS Press Champaign; 2005.

(20)           Jakobsen A.N., Aasen I.M., Josefsen K.D., Strøm A.R. Accumulation of docosahexaenoic acid-rich lipid in thraustochytrid Aurantiochytrium sp. strain T66: effects of N and P starvation and O2 limitation. Applied Microbiology and Biotechnology 2008; 80 (2): 297- 306.

(21)           Doughman S.D., Krupanidhi S., Sanjeevi C.B. Omega-3 fatty acids for nutrition and medicine: considering microalgae oil as a vegetarian source of EPA and DHA. Current Diabetes Reviews 2007; 3 (3): 198- 203.

(22)           Burja M., Radianingtyas H., Windust A., Barrow C. Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: screening of strains and optimization of omega-3 production. Applied Microbiology and Biotechnology 2006; 72: 1161- 69.