تأثیر کلرهگزیدین بر بیوفیلم برخی باکتری‌های بیمار‏ی‏‏زای انسانی جدا شده از عفونت‌ های بیمارستانی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار پاتوبیولوژی، دانشگاه شهرکرد، ایران

2 کارشناس ارشد باکتری‏‏ شناسی، دانشگاه شهرکرد، ایران

3 دانشیار علوم پایه، دانشگاه شهرکرد، ایران

4 دانشجوی دکتری باکتری‏‏ شناسی، دانشگاه بوعلی سینا، همدان، ایران

5 کارشناس ارشد باکتری‏ شناسی، دانشگاه شهرکرد، ایران

6 کارشناس ارشد باکتری ‏شناسی، دانشگاه شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: بیوفیلم‌ها جمعیتی از سلول‌های باکتری هستند که با تولید پلی‌مر‌های خارج سلولی و ایجاد ماتریکس اگزو‌پلی‌ ساکاریدی موجب اتصال برگشت‌ناپذیر باکتری‏ها ‏‏به سطوح می‌شوند. ایجاد بیوفیلم باعث مقاومت باکتری نسبت به عوامل ضد میکروبی شده و می‌تواند به بروز مشکلات حاد در این زمینه منجر شود. ‏‏‏‏‏
مواد و روش‏‏‏ها: بررسی حاضر با هدف ارزیابی تشکیل بیوفیلم در برخی ایزوله‏های ‏‏سودوموناس آئروجینوزا (13 مورد)، استافیلوکوکوس اورئوس (13 مورد)، انتروباکتر (13 مورد) و اسینتوباکتر (13 مورد) جدا شده از عفونت‌های انسانی بیمارستان الزهرا اصفهان انجام گرفت.‏ ‏جدایه‏ها با استفاده از آزمون‏‏‏های بیوشیمیایی تأیید شدند و در ادامه حداقل غلظت مهار کننده (MIC) کلرهگزیدین و تأثیر آن بر روی رشد پلانکتونی و تشکیل بیوفیلم توسط این جدایه‏‏‏ها بررسی شد. تجزیه‏های ‏‏‏آماری و رسم نمودار‏ها ‏‏‏با استفاده از نرم افزار‏های ‏‏‏SPSS نسخه ٢٠ و Excel انجام شد. ‏
نتایج: همه‌ جدایه‌ها (52 مورد) بیوفیلم تولید کردند. میانگین حداقل غلظت مهارکننده کلرهگزیدین برای باکتری‌های سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروباکتر و اسینتوباکتر به ترتیب 001/0، 00013/0، 001/0 و 00003/0 گرم بر میلی‌لیتر بود. رشد پلانکتونی باکتری سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏ و انتروباکتر در حضور کلرهگزیدین در 60 درصد موارد در MIC 4/1 و در 40 درصد موارد در MIC‏ ‏8/1 و برای باکتری‏های ‏‏‏اسینتوباکتر و استافیلوکوکوس اورئوس 40 درصد موارد در MIC‏ ‏4/1 و 60 درصد موارد در MIC‏ ‏8/1 مهار شده بود. بیوفیلم در هیچ یک از رقت‌های MIC و MIC2 تولید نشد، و با کاهش رقت ضدغقونی کننده قدرت تشکیل بیوفیلم به شکل معنادار‏‏‏ی افزایش پیدا کرد.
بحث و نتیجه‏ ‏گیری: نتایج نشان داد که استفاده از کلرهگزیدین در غلظت‌های مناسب (MIC) می‌تواند از تشکیل بیوفیلم در گونه‌های مختلف باکتری‏های ‏‏عامل عفونت‏های ‏‏بیمارستانی جلوگیری کند اما دوزهایی از کلرهگزیدین که کم‏تر از MIC هستند می‌توانند محرک تولید بیوفیلم باشند. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Chlorhexidine effect on bacterial biofilms isoleated from nosocomial infections

نویسندگان [English]

  • Aziz alah Ebrahimikahrizsangi 1
  • Ziba Shabanpour 2
  • Saeed Habibian 3
  • Reza Hakimi Alni 4
  • Majid Hemati 2
  • Fatemeh Aflakiyan 5
  • Mahdi Dokhtefaraj 6
1 Assistant Professor of Pathoniology, Shahrekord university, Shahrekord, Iran
2 M.Sc. of Bacteriology, Shahrekord university, Shahrekord, Iran
3 Associate Professor of Pathoniology, Shahrekord university, Shahrekord, Iran
4 Ph.D. Student of Bacteriology, University of Bu-Ali Sina, Hamedan, Iran
5 M.Sc. of Bacteriology, Shahrekord university, Shahrekord, Iran
6 M.Sc. of Bacteriology, Shahrekord university, Shahrekord, Iran
چکیده [English]

Introduction:Biofilms are population of bacteria cells that cause irreversible binding to the surfaces by producing extracellular polymers. Biofilm formation in bacteria causes resistance to antimicrobial agents and can lead to severe problems in this ground.
Materials and methods: The purpose of this study was to evaluate biofilm formation in some isolates of Pseudomonas aeruginosa (13 case), Staphylococcus aureus (13 case), Enterobacter (13 case) and Acinetobacter (13 case) which were collected from human infections of Alzahra hospital in Isfahan. Also the minimum inhibitory concentration of chlorhexidine and its impact on the growth of planktonic and biofilm formation for these isolates were determined. Statistical analysis and graphing have been carried out by using SPSS software (version 20) and Excel.
Results: All isolates (52 isolates) have produced biofilm. The mean of MIC of chlorehexidine antiseptic for the p.aeruginosa, S.aureus, Enterobacter and Acinetobacter were 0/001, 0/00013, 0/001, 0/0003 g/ml respectively. Planktonic bacterial growth inhibition from p.aeruginosa and Enterobacter in 1/4 MIC and 1/8 MIC respectively was seen in 40 and 60 % cases. Acinetobacter and Staphylobacter aureus, have been controlled in 40 % of cases in 1/4 MIC and 60 % of cases in 1/8 MIC. Biofilm has not been produced in any of MIC and 2MIC dilution, and the power of biofilm formation had been increased significantly by reducing concentration of chlorhexidine dilution.
Discussion and conclusion: The results indicate that the use of chlorhexidine in appropriate concentrations (MIC) can prevent bacterial growth and biofilm formation in different species causing hospital infections, but doses of chlorhexidine that are less than the MIC can stimulate biofilm formation.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biofilm
  • Chlorhexidine
  • Pseudomonas aeroginosa
  • Staphylococcus areus
  • Enterobacter
  • Acinetobacter

مقدمه

عفونت‌های بیمارستانی از علل شایع و مهم مرگ و میر و افزایش طول مدت بستری بیماران، افزایش هزینه‌های بیمارستانی و مشکلات بهداشتی هستند (1). میکروارگانیسم‏های متفاوتی می‏توانند باعث بروز عفونت بیمارستانی به شکل اندمیک واپیدمیک شوند‏ ‏با وجود این، باکتری‏ها 90 درصد از عفونت‏های ‏‏بیمارستانی را به خود اختصاص می‏دهند که در بین آن‏ها‏ ‏اشریشیاکلی[1]شایع‏ترین ‏عامل بیماری‏زا ‏بوده و پس از آن استافیلوکوکوس اورئوس[2] در مرتبه دوم قرار دارد(2). سودوموناس آئروژینوزا [3]‏‏‏ یکی از مهم‏ترین عوامل عفونت‏های ‏‏‏بیمارستانی در طیف وسیعی از بیماران دارای نقص سیستم ایمنی شامل مبتلایان به بدخیمی‏ها، سیستیک فیبروزیس[4] و سوختگی‏هاست (3).

برای کنترل بیوفیلم باکتریایی با استفاده از ضدعفونی کننده‏ها ‏‏پژوهش‏های زیادی انجام شده است. در بین این ضدعفونی‏کننده‏‏‏ها، کلرهگزیدین[5] آنتی‌سپتیکی است که بر طیف وسیعی از باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی و همچنین، برخی از قارچ‌ها و برخی از ویروس‌ها از جمله ویروس‌ عامل ایدز و هپاتیت و بر بیوفیلم‏های ‏‏باکتریایی مؤثر است (4). از مزایای این آنتی‏‏‏سپتیک آن است که به سطح سوبستراهای زیادی بدون از دست دادن فعالیت ضدعفونی خود اتصال می‏‏‏‏‏‏یاید و همچنین، به آرامی آزاد می‏شود‏ ‏که این عمل به تداوم غلظت مؤثر آن در محیط منجر می‏‏‏‏‏‏شود (5). دی‏ ‏استات کلرهگزیدین[6] و دی‏گلوکونات کلرهگزیدین[7]، دو شکل نمکی کلرهگزیدین هستند که فعالیت شدید آنتی‏باکتریال[8] دارند. دی‏‏گلوکونات کلرهگزیدین در آب و الکل محلول بوده و از این رو در دهان شویه‏ها ‏‏برای ممانعت از ایجاد پلاک دهان به کار می‏‏‏‏‏‏رود (6).

بیوفیلم توده‌ای از باکتری‌ها را در بر می‌گیرد که روی یک سطح جامد به یکدیگر می‌چسبند و بر روی هم اثر متقابل دارند. پیرامون آن‌ها را ماتریکس خارجی از جنس پلی ساکارید احاطه می‌کند (7). بیوفیلم‌هایی که با یک گونه باکتری به وجود می‌آیند، مونوکالچر[9] نامیده شده است ولی بیوفیلم‌های تشکیل شده روی سطوح مخاطی مانند روده که بیشتر آمیزه‌ای از گونه‌های گوناگونی از باکتری‌ها هستند را مولتی کالچر[10] گویند (8). میکروب‌ها، بیوفیلم را در پاسخ به عوامل مختلفی تشکیل می‌دهند، که این عوامل ممکن است شامل شناسایی جایگاه‌های اتصال اختصاصی و یا غیر اختصاصی سلول بر روی یک سطح باشد و یا در برخی موارد، از طریق در معرض قرار گرفتن سلول‌های پلانکتونی در برابر غلظت‌های تحت مهاری آنتی‌بیوتیک‌ها انجام می‌گیرد (9).

هدف اصلی این پژوهش بررسی تعیین حداقل غلظت مهاری[11] ضدعفونی کننده‌ کلرهگزیدین بر بیوفیلم حاصل از برخی جدایه‌های‏ ‏استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏، اسینتوباکتر[12] و انتروباکتر[13] جدا شده از عفونت‌های بیمارستانی است‏‏‏.‏ ‏

 

‏ ‏‏‏.مواد و روش‏ ‏ها

نمونه‌های باکتریایی مشکوک به سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏، استافیلوکوکوس اورئوس، اسینتوباکتر و انتروباکتر از آزمایشگاه میکروبیولوژی بیمارستان الزهرا اصفهان که از موارد عفونت‌های بیمارستانی بودند دریافت شده و برای‏‏‏‏‏‏ انجام آزمون‏‏‏‏‏‏‏‏های ‏‏تاًییدی به آزمایشگاه میکروب‏شناسی دانشکده دامپزشکی شهرکرد منتقل شد‏‏‏‏‏‏‏. آزمون‏‏‏‏‏‏‏‏های ‏‏بیوشیمیایی مربوط به تأیید و تشخیص هر گونه بر اساس روش موجود در کتاب تکنیک‌های عملی در آزمایشگاه تشخیصی باکتری شناسی انجام گرفت(10).

آزمایش بیوفیلم به روش تندولکار[14] و همکاران در سال 2004 انجام گرفت (11). برای انجام این کار جدایه‏های ‏‏‏مورد بررسی در محیط TSB به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. پس از این مدت نمونه‏ها به مدت 10 دقیقه با سرعت RPM 6000 سانتریفیوژ و رسوب حاصل با 5 میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر از TSB‏ ‏استریلمخلوط شد‏‏‏‏‏‏‏ و جذب نوری سوسپانسیون حاصل در 595 نانومتر به عدد 1 رسانده شد. به هر ایزوله یک ردیف 12 تایی از میکروپلیت اختصاص و به مقدار 200 میکرولیتر از سوسپانسیون رقیق شده به آن اضافه شد‏‏‏‏‏‏‏. بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، محتویات میکروپلیت دور ریخته شده و سه مرتبه با فسفات بافر سالین[15] شستشو داده شد. در ادامه 200میکرولیترکریستال ویوله[16] 2 درصد اضافه شد. ارزیابی تأثیر ماده‌ ضدمیکروبی در کاهش ضخامت بیوفیلم و میزان مرگ باکتری‌های بیوفیلم از طریق محاسبه‌ جذب نوری انجام شد. در هر میکروپلیت یک ردیف به کنترل منفی اختصاص داده شد به این منظور محیط TSB خالص و بدون باکتری به هر گروه اضافه شد و تمامی مراحل یاد شده بر روی آن انجام گرفت.

برای تعیین حداقل غلظت مهاری کلرهگزیدین 50 میکرولیتر از محلول 1 درصد کلرهگزیدین، با همین مقدار از محیط تریپتوز سوی‏ ‏براث [17] (TSB) در گوده‌ اول میکروپلیت مخلوط شد. سپس، عمل رقت‌سازی در گوده‌های دیگر انجام شد. در مرحله بعد، 1/0 میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر از نمونه نیم مک فارلند[18] باکتری مورد نظر با 9/9 میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر TSB استریل مخلوط شده و از این سوسپانسیون به مقدار 50 میکرولیتر به هرگوده میکروپلیت اضافه شد. سرانجام میکروپلیت‏ها ‏‏به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شدند.

در ادامه به منطور بررسی اثر کلرهگزیدین بر رشد پلانکتونی باکتری و تشکیل بیوفیلم از جذب نوری[19] (OD) استفاده شد‏‏‏‏‏‏‏. برای بررسی اثر کلرهگزیدین بر رشد پلانکتونی باکتری‏‏ها، ابتدا از محیط کشت 24 ساعته باکتری مورد نظر غلظت نیم مک فارلند تهیه شد‏‏‏‏‏‏‏. 50 میکرولیتر از باکتری فوق و همین مقدار از رقت‏های ‏‏مختلف کلرهگزیدین (رقت‏های ‏‏MIC1:16، MIC1:8،‏ ‏MIC1:4، MIC1:2، MIC و MIC2) در هر چاهک مخلوط شد‏‏‏‏‏‏‏ و بعد از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، رشد پلانکتونی باکتری‏ها ‏‏‏در طول موج 630 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر[20] اندازه‌گیری شد. در بررسی تأثیر کلرهگزیدین بر ایجاد بیوفیلم باکتری‏ها ‏‏از روش تندولکار و همکاران استفاده شد و غلظت‏های ‏‏یاد شده کلرهگزیدین به گوده‏های ‏‏میکروپلیت قبل از گرمخانه‏گذاری اضافه شد.

در انتها تجزیه‌ و تحلی‏های آماری و رسم نمودار‌ها با استفاده از نرم افزارهای SPSS نسخه‌ 20 و اکسل[21] انجام شد. مقایسه‌ی میانگین صفات با استفاده از آزمون چند دامنه‌ای دانکن[22] در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

.نتایج

نتایج حاصل از بررسی تولید بیوفیلم در جدول 1 ارائه شده است. در این روش ابتدا میزان OD نمونه و تراکم نوری کنترل منفی[23] (ODc) محاسبه شد و بر حسب کمتر یا بیشتر بودن میزان OD به ODc، در چهار گروه فاقد بیوفیلم (OD ≤ ODc)، بیوفیلم ضعیف
(ODc < OD ≤ 2 ODc)، بیوفیلم متوسط
‏‏(2OD < OD < 4 ODc) و بیوفیلم قوی
(OD > 4ODc) قرار گرفتند. نکته قابل توجه عدم تشکیل بیوفیلم ضعیف در سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏ بود.

برای تعیین MIC از جدایه‌هایی استفاده شد که بیوفیلم متوسط تا قوی را تشکیل داده بودند. آزمایش‌ها در 3 نوبت تکرار شد. MIC که برابر است با پایین‌ترین غلظت مهارکننده که مانع از رشد قابل مشاهده باکتری می‌شود پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی‏گراد تعیین شد.‏‏‏‏‏‏‏ نتایج میزان MIC ضدعفونی کننده کلرهگزیدین بر چهار باکتری سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏، استافیلوکوکوس اورئوس، انتروباکتر و اسینتوباکتر به ترتیب 001/0، 00013/0، 001/0 و 00003/0 گرم بر میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر گزارش شد. نتایج تأثیر کلرهگزیدین بر رشد پلانکتونی در چهار باکتری مورد مطالعه انجام گرفت. نتایج به شکل خلاصه در جدول 2 آورده شده است.

 

 

جدول 1- بررسی تولید بیوفیلم

عنوان

بیوفیلم ضعیف

بیوفیلم متوسط

بیوفیلم قوی

استافیلوکوکوس اورئوس

4 (31 درصد)

8 (62 درصد)

1 (7 درصد)

سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏

صفر

8 (62 درصد)

5 (38 درصد)

انتروباکتر

3 (23 درصد)

6 (46 درصد)

4 (31 درصد)

اسینتوباکتر

2 (12 درصد)

5 (38 درصد)

6 (46 درصد)

 

جدول 2- رشد پلانکتونی در حضور ضدعفونی کننده‌ کلرهگزیدین

باکتری

MIC‏ ‏2

MIC

MIC 1:2

MIC1:4

MIC1:8

MIC 1:16

سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏

عدم رشد

عدم رشد

عدم رشد

4

6

-

استافیلوکوکوس اورئوس

عدم رشد

عدم رشد

عدم رشد

4

6

-

انتروباکتر

عدم رشد

عدم رشد

عدم رشد

6

4

-

اسینتوباکتر

عدم رشد

عدم رشد

عدم رشد

4

6

-

*اعداد نشانگر تعداد ایزوله‌های رشد یافته است‏‏‏.

 

 

نتایج حاصل از مقایسه میانگین رشد پلانکتونی و بیوفیلمی چهار باکتری مورد بررسی در معرض رقت‌‏های ‏‏مختلف کلرهگزیدین با استفاده از آزمون چند دامنه‏‏ای دانکن به شکل جداگانه در ‏‏‏شکل‏‏های ‏‏1 و 2 نشان داده شده است. به جز در اسینتوباکتر، در بقیه باکتری‏ها ‏‏با کاهش MIC میزان جذب نوری زیاد می‏‏‏‏‏‏شود که ناشی از کاهش غلظت مهار کننده کلرهگزیدین و به دنبال آن افزایش رشد باکتری‏هاست. همچنین، جذب نوری در بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس نسبت به بقیه باکتری‏ها ‏‏خیلی کمتر بود که این نشان دهنده حساسیت زیاد این باکتری به کلرهگزیدین است (‏شکل‏ ‏‏‏‏2).

 

‏ ‏‏

شکل‏ ‏‏‏‏1- میانگین رشد پلانکتونی باکتری‏ها ‏‏در حضور ضدعفونی کننده‏ ‏ کلرهگزیدین

‏ ‏

شکل‏ ‏‏‏‏2- میانگین رشد بیوفیلم باکتری‌ها در حضور ضدعفونی کننده‏ کلرهگزیدین

 

 

میزان افزایش کدورت گوده‏های ‏‏مربوط به باکتری‌های یاد شده نسبت به گوده‌ حاوی رقت MIC در جدول‏های 3 و 4 نمایش داده شده است. در جدول 3 با افزایش غلظت کلرهگزیدین میزان جذب نوری هم زیاد شده است که در واقع به این خاطر است که با رقیق شدن کلرهگزیدین افزایش تشکیل بیوفیلم در گوده‏های ‏‏میکروپلیت انجام شده و به دنبال آن جذب رنگ کریستال ویوله توسط این بیوفیلم‏ها ‏‏زیاد شده است. در نتیجه در مرحله رنگ بری میزان زیادی از این رنگ در گوده‏ها ‏‏آزاد شده و افزایش OD را سبب شده است. همچنین، در جدول 4 هم با رقیق شدن کلرهگزیدین افزایش رشد پلانکتونی و به دنبال آن افزایش OD به شکل معنادار‏‏‏ (در سطح P value≤/05) انجام شده است. برای بررسی وجود رابطه بین رشد پلانکتونی و بیوفیلمی چهار باکتری مورد مطالعه، از ضریب همبستگی پیرسون استفاده شد. با محاسبات انجام شده ضریب همبستگی بین رشد پلانکتونی و بیوفیلمی برابر 579/0 به دست آمد. بنابراین، در سطح احتمال 99 درصد بین رشد پلانکتونی و بیوفیلمی آن‏ها ‏‏‏رابطه معنادار‏‏‏ی وجود داشت و با افزایش رشد پلانکتونی، میزان رشد بیوفیلمی نیز افزوده می‏‏‏‏‏‏شد.

 

جدول 3- درصد افزایش OD در غلظت‏های ‏‏‏مختلف کلرهگزیدین نسبت به غلظت MIC در مرحله رشد بیوفیلمی

جدایه باکتری

غلظت اولیه

نام باکتری

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

76/16

18/41

57/20

95/56

41/19

68/13

76/16

58/12

9/14-

5/17-

MIC : 2/1

انتروباکتر

12/37

70/38

23/69

47/65

60

36/23

53/26

23/36

69/7

10-

MIC : 4/1

55

58/57

08/81

88/76

71/50

43/41

84/36

24/48

96/36

78/6

: MIC 8/1

30/65

02/59

23/84

63/85

29/64

50

83/44

86/56

48/66

42/26

: MIC 16/1

30/69

33/61

78/84

15/87

08/65

59

86/54

80/64

43/69

72/38

: MIC 32/1

61/8

80/12

11/6

92/71

70/8

83/4

95/8

92/8

35/1

00/4

MIC : 2/1

اسینتوباکتر

58/19

19/30

13/25

88/62

22/22

31/48

43/16

02/39

71/8

09/18

MIC : 4/1

51/24

44/75

72/32

78/66

71/29

80/57

38/31

39/41

40/14

53/20

: MIC 8/1

47/30

00/44

60/41

08/67

62/43

53/59

02/56

54/6

14/24

52/74

: MIC 16/1

75/34

36/48

85/43

55/67

70/49

02/61

91/56

34/46

48/35

77/32

: MIC 32/1

30/16

63/7

18/18

29/14

76/4

29/24

51/7

73/5

24/10

69/10

MIC : 2/1

استافیلوکوکوس اورئوس

49/25

45/9

08/23

50/0

61/15

40/35

09/12

11/32

93/44

88/12

MIC : 4/1

33/32

13/2

23/26

71/24

80/30

39/42

53/17

48/36

75/28

17/37

:MIC 8/1

77/42

08/23

50/30

77/30

71/36

23/50

69/34

56/52

67/36

60/47

: MIC 16/1

28/43

34/31

58/32

78/32

83/40

17/61

44/44

20/77

48/46

78/54

: MIC 32/1

31/36

29/14

25/36

43/43

46/7

69/18

14/7

47/9

37/18

46/0

MIC : 2/1

سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏

50/43

86/33

71/41

70/51

18/49

28/24

34/10

38/19

27/27

09/27

MIC : 4/1

19/48

50/46

66/51

86/57

66/42

80/26

85/30

95/33

05/33

35/30

:MIC 8/1

30/40

82/67

85/57

59/64

34/60

77/30

48/42

76/36

06/44

54/33

: MIC16/1

24/60

28/72

65/36

74/66

27/62

33/36

02/49

43/29

37/49

87/41

: MIC 32/1

 

جدول 4- درصد افزایش OD در غلظت‏های ‏‏‏مختلف‏ ‏کلرهگزیدین نسبت به غلظت MIC در مرحله رشد پلانکتونی

جدایه باکتری

غلظت اولیه

نام باکتری

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

45/0

83/0

25/0

53/0

35/0

42/0-

36/1

32/0

46/0-

50/0

MIC : 2/1

انتروباکتر

52/3

34/3

16/11

63/3

06/1

44/4

21/6

84/2

82/5

86/2

MIC : 4/1

75/21

84/14

46/15

65/7

50/4

24/7

16/9

45/4

32/9

85/7

: MIC 8/1

37/30

81/16

40/20

83/10

94/12

30/12

55/21

58/12

57/10

33/11

: MIC 16/1

03/34

26/23

72/28

24/20

66/17

90/14

39/23

52/14

71/15

07/17

: MIC 32/1

11/0

69/0-

47/0-

27/1-

85/0

20/0-

05/1

61/0

28/1

94/0

MIC : 2/1

استافیلوکوکوس اورئوس

39/3

69/5

50/3

11/2

61/2

16/5

34/6

55/3

23/4

41/1

MIC : 4/1

68/56

92/8

36/6

91/5

24/11

15/8

78/8

51/8

93/8

76/3

: MIC8/1

52/23

58/11

39/11

48/7

07/20

33/17

94/16

18/15

99/13

98/4

: MIC16/1

13/27

17/14

73/13

71/13

10/24

99/39

55/19

55/20

54/22

81/7

: MIC 32/1

39/0

19/0

59/0

59/0-

61/0-

36/0-

07/0

00/0

17/0

17/0

MIC: 2/1

سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏

11/4

60/5

85/5

03/8

17/4

09/7

12/1

21/1

52/5

84/8

MIC: 4/1

24/5

85/5

90/7

55/10

73/4

11/13

58/4

28/6

62/11

20/12

:MIC8/1

55/6

41/8

13/16

83/8

69/8

94/19

27/7

89/7

72/18

26/15

: MIC 16/1

22/8

88/11

72/24

98/14

71/11

03/21

69/9

10/13

24/22

08/19

: MIC32/1

 

.بحث و نتیجه‏ ‏‏‏گیری

عفونت‏های ‏‏‏بیمارستانی از علل شایع و مهم مرگ و میر و افزایش طول مدت بستری بیماران هستند (12). سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏ و اسینتوباکتر بیش‏ترین عوامل ایجاد کننده‏ عفونت‏های ‏‏‏بیمارستانی به ویژه در بخش مراقبت‏های ‏‏‏ویژه هستند که مقاومت وسیع آنتی‏بیوتیکی و توانایی تشکیل بیوفیلم را دارند (13).

بیوفیلم انتروکوک‏ها ‏‏‏در طیف وسیعی از وسایل پزشکی که معمولاً بیماران بستری با آن در ارتباط هستند، یافت می‏‏‏‏‏‏شود و احتمالاً یکی از عوامل ابتلا به عفونت‏های بیمارستانی است (14). توانایی تشکیل بیوفیلم در استافیلوکوکوس‏ها ‏‏از عوامل مهم مزمن شدن عفونت‏های ‏‏‏ناشی از این باکتری‏هاست که اهمیت زیادی در پزشکی و دامپزشکی دارد (15).

برای تشخیص بیوفیلم، روش‏های مختلفی مانند میکروسکوپ الکترونی نگاره [xxiv] (نمونه‏های بالینی)، روش‏های هیبریدیزاسیون [xxv] DNA و رنگ آمیزی اختصاصی ماتریکس و غیره وجود دارد (16). در این بررسی که ابتدا قدرت تشکیل بیوفیلم در نمونه‏های ‏‏باکتریایی استافیلوکوکوس اورئوس، سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏، اسینتوباکتر و انتروباکتر به روش میکروتیتر پلیت انجام گرفت، همه جدایه‏ها ‏‏‏بیوفیلم ایجاد کردند که کم‏ترین قدرت تشکیل بیوفیلم مربوط به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس، و بیش‏ترین قدرت تشکیل بیوفیلم مربوط به باکتری سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏‏ ‏بود. این میزان تشکیل بیوفیلم در مورد سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏ و انتروباکتر با نتایج سوماریا[xxvi] و همکارانش در سال 2012 مطابقت داشت (17).

پژوهشگران به علت اهمیت بیوفیلم در ایجاد بیماری‏ها و مقاومت دارویی در جستجوی راه‏های مناسبی برای مهار و پیشگیری از تشکیل بیوفیلم هستند. که در این مورد می‏‏‏‏‏‏توان به استفاده از آنتی‏‏بیوتیک‏های ‏‏مختلف (18)، شلاتور کننده‏های ‏‏فلزی (19)، مواد ضدباکتریایی مانند ان- استیل سیتوزین [xxvii] (20)، عسل (21)، کرم (22)، و در نهایت، به مهار کننده‏های ‏‏کویوروم سنسینگ [xxviii] (16) و غیره اشاره کرد. در این پژوهش نیز به آثار ضد بیوفیلمی ماده ضدعفونی کننده کلرهگزیدین پرداخته شده است که یک ضدعفونی کننده‏ ‏با طیف اثر گسترده، ارزان و در دسترس است (23). برای این کار میزان‏ ‏MIC کلرهگزیدن بر روی جدایه‏های ‏‏مربوط به هر 4 باکتری مورد مطالعه که بیوفیلم قوی و متوسط داشتند محاسبه شد. در این میان اسینتوباکتر کم‏ترین میزان MIC (0003/0گرم بر میلی‏‏‏‏‏‏‏‏‏‏لیتر) را به خود اختصاص داد. بقیه جدایه‏ها ‏‏با میزان MIC کمتر از 001/0 بودند که با نتایج منگیستو[xxix] و همکاران در سال 1999 (24) و‏ ‏گرار[xxx] و همکاران در سال 2010 مطابقت داشت (25).

در مرحله تعیین میزان اثر کلرهگزیدین بر رشد پلانکتونی، که به شکل مرئی گزارش شد طبق تحلیل آماری داده‌ها، میانگین رشد پلانکتونی جدایه‌های مورد مطالعه در غظت‏ ‏های MIC 2، MIC و MIC1:2 هیچ گونه رشدی وجود نداشت و از غلظت MIC1:4 به بعد، رشد هر چهار باکتری گزارش شد‏‏‏‏‏‏‏ که از این نظر با نتایج ابراهیمی [xxxi] و همکاران در 2014 مطابقت داشت (26).‏ ‏همچنین، در مطالعه‏ای که توسط هندیانی [xxxii] و همکاران در سال 2014 انجام گرفت از 74 جدایه بالینی اسینتوباکتر‏ ‏بومانی[xxxiii]، 13 درصد (10 مورد) بیوفیلم قوی ایجاد کردند (27) که در مقایسه با نتایج پژوهش حاضر (46 درصد) میزان پایینی است که احتمالاً مربوط به اختلاف در گونه باکتری و شرایط محیطی می‏‏‏‏‏‏باشد. در این پژوهش می‏‏‏‏‏‏توان گفت که برای مهار رشد هر چهار باکتری یاد شده به غلظتی بالاتر از MIC نیازی نبود و این غلظت از کلرهگزیدین، در مهار رشد باکتری‏های ‏‏یاد شده به شکل مؤثری عمل کرد.

برای کنترل بیوفیلم باکتریایی، بایستی MIC مواد ضدباکتریایی علاوه بر روی حالت پلانکتونیک، بر روی بیوفیلم حاصله نیز بررسی شود زیرا ممکن است میزان MIC برای یک باکتری در حالت بیوفیلمی تا 100 برابر بیشتر از حالت پلانکتونی باشد (28). در پژوهش حاضر نیز اثر کلرهگزیدین بر تشکیل بیوفیلم در هر کدام از چهار باکتری یاد شده انجام شد و نتایج نشان داد که درصد افزایش OD در مرحله‌ رشد بیوفیلمی بیشتراز مرحله‌ رشد پلانکتونی است که این ناشی از مقاومت بالای باکتری در این مرحله می‏‏‏باشد.‏ ‏علت مقاومت می‏‏‏تواند ناشی از ایجاد فنوتیپ تطبیقی (19)، وجود ساختار گلیکوکالیکس‏ ‏در اطراف سلول‌های بیوفیلم و قدرت چسبندگی سلول‌های بیوفیلم (29)، انتقال ژن‏‏‏های مقاومتی در بین سویه‏‏‏ها و نیز در بین باکتری‏‏‏های مختلف (30)،‏ ‏بیان ژن‏‏‏های مقاومتی مختلف (31)، کاهش متابولیسم و آهسته شدن رشد (32) در حالت بیوفیلم باشد.

در رابطه با این مورد، در پژوهشی که تاکنو[xxxiv] و همکاران در سال 1994 تحت عنوان اثر ضدعفونی کننده‌ی کلرهگزیدین روی بیوفیلم و رشد پلانکتونی باکتری سودوموناس آئروژینوزا‏‏‏ انجام دادند، نتایج بدست آمده نشان داد که بیوفیلم دارای مقاومت بیشتری نسبت به سلول‌های پلانکتونی است (33). هوی‏ ‏کانگ[xxxv] و همکاران در سال 2006 نشان دادند که اثر ضدعفونی کننده کلرهگزیدین بر روی رشد پلانکتونی انتروباکتر‏ ‏بیشتر از بیوفیلم آن است‏‏‏ (34).

در پایان، می‏‏‏‏‏‏توان نتیجه گیری کرد که استفاده از ضدعفونی کننده‌ها (کلرهگزیدین) در غلظت‌های مناسب می‌تواند از رشد و توسعه‌ گونه‌های مختلف باکتریایی جلوگیری کند اما دوزهایی از ضدعفونی کننده که کم تر از MIC هستند می‌توانند محرک تولید بیوفیلم باشند. در نهایت، می‏‏‏‏‏‏توان گفت که درمان بیوفیلم هنوز یکی از مشکلات مهم بشر به حساب می‏‏‏‏‏‏آید و نیاز پژوهش و مطالعه بیشتری در این زمینه وجود دارد. با در نظر گرفتن اینکه از بین بردن بیوفیلم‏ها پس از تشکیل، کار‏ ‏سخت و طاقت فرساست بهتر است از تشکیل بیوفیلم جلوگیری شود.

 



[1]- Escherichia Coli

[2]- Staphylococcus aureus

[3]- Pseudomonas aeruginosa

[4]- Cystic Fibrosis

[5]- Chlorhexidine

[6]- Chlorhexidine diacetate

[7]- Chlorhexidine digluconate

[8]- Antibacterial

[9]- Mono culture

[10]- Multi culture

[11]- minimum inhibitory concentration

[12]- Acinetobacter

[13]- Enterobacter

[14]- Tendolkar

[15]- Phosphate buffered saline

[16]- Crystal violet

[17]- Tryptic Soy Broth

[18]- McFarland

[19]- Optical density

[20]- Elisa Reader

[21]- Excel

[22]- Duncan

[23]- Optical Density Control

[xxiv]- Scanning electron microscope

[xxv]- DNA Hybridization

[xxvi]- Summaiya

[xxvii]- N - acetyl cytosine

[xxviii]- Quorum sensing

[xxix]- Mengistu

[xxx]- Grare

[xxxi]- Ebrahimi

[xxxii]- Hendiani

[xxxiii]- A. baumannii

[xxxiv]- Takeno

[xxxv]- Hoikyung

(1)               Ernst R.K., Adams K.N., Moskowits S.M., Kraig G.M., Kavasaki K., Stead C.M. The Pseudomonas aeruginosa lipid A deacylase: selection for expression and loss within the cystic fibrosis airway. Journal of Bacteriology 2006; 188 (1): 191- 201.

(2)               Schaberg D.R., Culver D.H., Gaynes R.P. Major trends in the microbial etiology of nosocomial infection. American Journal of Medicine 1991; 91 (3): 72- 75.

(3)               Levin A.S., Barone A.A., Penço J., Santos M.V., Marinho J.S., Arruda E.A., et al. Intravenous colistin as therapy for nosocomial infections caused by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. Clinical Infectious Diseases1999; 28 (5): 1008- 11.

(4)               Yousefi Mashouf R., Nazari M., Shams M. Evaluation of efficacy of the current disinfectants on Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa isolated from hospitals of Hamadan in 2006. Tabib_e_shargh 2007; 8 (1): 287- 96.

(5)               Manau-Navarro C., Guasch-Serra S. Métodos de control de placa bacteriana. In: Cuenca E., Manau C., Serra L.L. Odontología Preventiva y Comunitaria: Principios Métodos y Aplicaciones. 2nd. ed. Barcelona: Masson; 2003: 69- 88.

(6)               Barthel CR., Zimmer S., Zilliges S., Schiller R., Göbel U.B., Roulet J.F. In situ antimicrobial effectiveness of chlorhexidine and calcium hydroxide: gel and paste versus gutta-percha points. Journal of Endodontics 2002; 28 (6): 427- 30.

(7)               Wolf G., Crespo J.G. Optical and Spectroscopic method for biofilm examination and monitoring. Reviews in Environmental Science and Biotechnology 2002; 1 (3): 227- 51.

(8)               Nowroozi J. General Bacteriology. 1st. ed. Tehran: Jafari Publications; 2011.

(9)               Jenkins S., Addy M., Wade W. The mechanism of action of chlorhexidine. Journal of Clinical Periodontology 1988; 15 (7): 415- 24.

(10)           Mahbad A., Mohamadi M., Hamidi Fard M. Practical techniques for the laboratory diagnosis of bacterial and virology. 3rd ed. Tehran: Ketab Mir; 2007.

(11)           Tendolkar P.M., Baghdayan A.S., Gilmore MS. Enterococcal surface protein: Esp Enhances biofilm formation by Enterococcus faecalis. Infection and Immunity 2004; 72 (10): 6032- 9.

(12)           Lewis K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2001; 45 (4): 999-1007.

(13)           Delissalde F., Amábile-Cuevas CF. Comparison of antibiotic susceptibility and plasmid content, between biofilm producing and non-producing clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. International Journal of Antimicrobial Agents 2004; 24 (4): 405- 08.

(14)           Kristich C.J., Li Y.H., Cvitkovitch D.G., Dunny G.M. Esp-independent biofilm formation by Enterococcus faecalis. Journal of Bacteriology 2004; 186 (1): 154- 63.

(15)           Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell DE., Korber DR., Lappin-Scott HM. Microbial biofilms. Annual Review of Microbiology 1995; 49 (1): 711- 45.

(16)           Høiby N., Bjarnsholt T., Givskov M., Molin S., Ciofu O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents2010; 35 (4): 322- 32.

(17)           Sharma V., Nainan M.T., Shivanna V. The effect of cavity disinfectants on the sealing ability of dentin bonding system: An in vitro study. Journal of Conservative Dentistry2009; 12 (3):109- 13.

(18)           Mulla Summaiya A.Assessment of biofilm formation by the causative organisms of ventilator associated pneumonia at intensive care unit of a tertiary care hospital. National Journal of Medical Research 2012; 2 (1): 15- 8.

(19)           Tre-Hardy M., Vanderbist F., Traore H., Devleeschouwer M.J. In vitro activity of antibiotic combinations against Pseudomonas aeruginosa biofilm and planktonic cultures. International Journal of Antimicrobial Agents 2008; 31 (4): 329- 36.

(20)           Turakhia M.H., Cooksey K.E., Characklis W.G. Influence of calcium-specific chelantonbiofilm removal. Applied and Environmental Microbiology1983; 46 (5): 1236- 8.

(21)           Roberts M.E., Stewart P.S. Modeling protection from antimicrobial agents in biofilms through the formation of persister cells.Microbiology 2005; 151: 75- 80.

(22)           Dunford C., Cooper R., Molan P., White R. The use of honey in wound management. Nursing Standard 2000; 15 (11): 63- 8.

(23)           Van der Plas M.J., Jukema G.N., Wai S.W., Dogterom-Ballering H.C., Lagendijk E.L., Van Gulpen C., et al. Maggot excretions/secretions are differentially effective against biofilms of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2008; 61 (1): 117- 22.

(24)           Mengistu Y., Erge W., Bellete B. In vitro susceptibility of gram-negative bacterial isolates to chlorhexidine gluconate. East African Medical Journal 2009; 76 (5): 243- 6.

(25)           Grare M., Dibama H.M., Lafosse S., Ribon A., Mourer M., Regnouf‐de‐Vains JB., et al. Cationic compounds with activity against multidrug‐resistant bacteria: interest of a new compound compared with two older antiseptics, hexamidine and chlorhexidine. Clinical Microbiology 2010; 16 (5): 432- 38.

(26)           Ebrahimi A., Hemati M., Dehkordi SH., Bahadoran S., Khoshnood S., Khubani S., et al. Chlorhexidine Digluconate Effects on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Some Field Isolates of Animal Bacterial Pathogens. Jundishapur Journal of Natural Pharmaceutical Products 2014; 9 (2): e14298.

(27)           Hendiani S., Abdi-Ali A., Mohammadi P. Comparison of two methods for quantification of Acinetobacter baumannii biofilm formation. Biological Journal of Microorganism2014; 2 (8): 51- 8.

(28)           Sandoe JA., Wysome J., West A.P. Measurement of ampicillin, vancomycin, linezolid and gentamicin activity against enterococcal biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy2006; 57 (4):767- 70.

(29)           Brown M.L., Aldrich H.C., Gauthier J.J. Relationship between glycocalyx and povidone-iodine resistance in Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) biofilms Applied and Environmental Microbiology 1998; 1 (1995): 187- 93.

(30)           Vu B., Chen M., Crawford R.J., Ivanova EP. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation. Molecules 2009; 14 (7): 2535- 54.

(31)           Dibdin G.H., Assinder S.J., Nichols W.W., Lambert P.A. Mathematical model of β-lactam penetration into a biofilm of Pseudomonas aeruginosa while undergoing simultaneous inactivation by released β-lactamases. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1996; 38 (5): 757- 69.

(32)           Keren I., Kaldalu N., Spoering A., Wang Y., Lewis K. Persister cells and tolerance to antimicrobials. FEMS microbiology letters 2004; 230 (1): 13- 18.

(33)           Takeo Y., Oie S., Kamiya A., Konishi H., Nakazawa T. Efficacy of disinfectants against biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Microbios 1993; 79 (318): 19-26.

(34)           Hoikynung K., Ryu J.H., Beuchat L.R. Effectiveness of disinfectants in killing Enterobacter sakazakii in suspension dride on the surface of stainless steel and in a biofilm. Applied and environmental microbiology 2007; 73 (4): 1256- 65.