تولید هورمون رشد انسانی نوترکیب در سویه اوریگامی اشریشیاکلی و مقایسه میزان استخراج آن با دو روش اولتراسونیک و انجماد و ذوب

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران

2 دانشیار ایمونولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران

چکیده

مقدمه: هورمون رشد انسانی یک پروتئین تک‏رشته است که دارای 191 اسید‏آمینه و وزن مولکولی حدود 22 کیلودالتون است. به علت فعالیت‏های زیستی مهم و متنوع هورمون رشد، این هورمون دارای کاربردهای گسترده‏ایی در پزشکی و بیوتکنولوژیست. از اواخر سال 1970 استفاده از بیان ژن برای تولید پروتئین‏های نوترکیب صنعتی تبدیل به یک صنعت چند میلیارد دلاری شده است. از طرفی مشکلاتی که در استخراج پروتئین درون‏سلولی وجود دارد باعث شده است که چندین روش برای این کار ارایه شود که در بسیاری از این روش‏ها نیاز به تجهیزات خاص است. اما در بیشتر مطالعات، پژوهشگران نیاز به یک روش سریع و ارزان قیمت برای تخریب سلول دارند. هدف این پژوهش، تولید هورمون رشد انسانی توترکیب و مقایسه میزان استخراج آن با روش انجماد و ذوب و روش اولتراسونیک در سویه اوریگامی ‏اشریشیاکلی است‏‏. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: سلول‏ها‏ی مستعد سویه اوریگامی ‏اشریشیاکلی با وکتور حاوی ژن هورمون رشد انسانی ترانسفورم شده و با کشت در محیط LB و القا با IPTG هورمون رشد انسانی نوترکیب تولید و با دو روش انجماد و ذوب و اولتراسونیک، استخراج و سپس این پروتئین با استفاده از روش‏ها‏ی الایزا، برادفورد، دات‏بلات و وسترن‏بلات بررسی شد. ‏‏‏
نتایج: عمل ترانسفورم کردن باکتری با کارایی بالایی انجام گرفت و نتایج حاصل از دات‏بلات و وسترن‏بلات نشان داد که پروتئین هورمون رشد انسانی نوترکیب به خوبی تولید شد. با استخراج پروتئین با روش‏ها‏ی انجماد و ذوب و اولتراسونیک و بررسی نتایج حاصل از روش‏های الایزا و برادفورد مشخص شد که میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته بیشتر از انجماد و ذوب سریع و کمابیش هم اندازه پروتئین استخراج شده در روش اولتراسونیک است. ‏‏‏
بحث و نتیجه‏گیری: برابر بودن میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته و روش اولتراسونیک نشان دهنده این است که روش انجماد و ذوب آهسته، در مواردی که امکان استفاده از تجهیزات خاص و گران‏قیمت مثل اولتراسونیک وجود ندارد، جایگزین مناسبی برای این روش است. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Production of recombinant human growth hormone in Eschericia coli strain Origami and comparing freeze/ thaw and sonication methods for proteins extraction

نویسندگان [English]

  • Marzieh Savari 1
  • Sayyed Hamid Zarkesh-Esfahani 2
1 M.Sc. of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Associate Professor of Immunology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Human growth hormone (hGH) is a single-chain polypeptide derived from pituitary gland that participates in a wide range of biological functions and has therapeutic applications. The hormone consists of 191 amino acid residues (22kD) which folds into a four-helix bundle structure with two disulfide bridges. Due to the complication of internal cell protein extraction, several methods have been established for this purpose that most of them need special instruments. Thus, in the preliminary studies, scientists need a quick and simple method for cell disruption and protein extraction. The aim of the present study was production of hGH in E.coli and comparison between the freeze/thaw and Sonication method for protein extraction from cells.
Materials and methods: The competent cells of E. coli Origami (DE3) were transformed using plasmid containing human growth hormone gene and then cultured in LB medium. After IPTG induction, the hGH was extracted using various methods including bacterial lysing, freeze/thaw and sonication methods and then extracted protein was assessed using ELISA, Bradford, dot blot and Western blotting.
Results: According to our findings, bacterial transformation showed high efficiency of transformation. Furthermore, the results of dot blot and Western blot showed production of recombinant hGH at high levels. Protein extraction measurement using ELISA and Bradford methods indicated that the proportion of the extracted protein in the slow freeze/thaw method was higher than the fast freeze/thaw method and was almost equal to sonication method.
Discussion and conclusion: The extracted protein levels in both of the slow freeze/ thaw and ultrasonic methods was equal, which introduces the slow freeze/thaw method as an excellent substitution for ultrasonic method when special instruments are not available.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Origami (DE3)
  • Recombinant human growth hormone
  • Ultrasonic
  • Freeze/ thaw
  • dot blot
  • Western blot

مقدمه

اشریشیاکلی[1] به طور گسترده‏ای به عنوان یک ارگانیسم مدل برای مطالعه‏ی جنبه‏ها‏ی مختلف متابولیسمی استفاده می‏شود. علاوه بر این ‏اشریشیاکلی، بیشتر برای تولید پروتئین نوترکیب با مقادیر بالا و هزینه‏ها‏ی کم نیز کاربرد دارد که از علت‏های استفاده ازآن سهولت کشت و ویژگی‏ها‏ی رشد، سهولت دستکاری ژنتیکی ودر دسترس بودن ابزار ملکولی آن، توانایی تغییرات پس از ترجمه (مانند گلیکوزیلاسیون، پیوند‏ها‏ی دی‏سولفیدی) است (1 و 2). یکی از پروتئین‏ها‏یی که امروزه مورد نیاز است هورمون رشد انسانی[2] است. این هورمون یک پلی‏پپتید تک رشته‏ای شامل 191 اسیدآمینه با وزن 22کیلودالتون است که دارای دوپیوند دی‏سولفیدی، چهار ساختار هلیکسی راست‏گرد و دو جایگاه فعال برای اتصال به گیرنده‏اش است. این هورمون توسط سلول‏ها‏ی سوماتوتروف غده هیپوفیز جلویی ترشح می شود. هورمون رشد انسانی نقش مهمی در رشد سوماتیک از طریق اثر بر روی متابولیسم پروتئین، کربوهیدرات و لیپد دارد (3 و 4). کمبود یا نقص این هورمون به کند ‏ذهنی و کوتاهی قد، سندروم ترنر[3]، سندروم پرادرویلی[4] و نارسایی مزمن کلیه منجر می‏شود. همچنین، برای درمان سندروم تونل ‏مچ‏دست[5] نیز مؤثر است (5- 7). منبع اصلی هورمون رشد انسانی برای استفاده‏ها‏ی انسانی، هورمون رشد نوترکیب تولید شده توسط باکتری است. از اواخر سال 1970 استفاده از بیان ژن نوترکیب برای تولید پروتئین‏ها‏ی صنعتی تبدیل به یک صنعت چند میلیاردی شده است. از طرفی پس از تولید پروتئین هدف، استخراج پروتئین نوترکیب تولید‏شده‏ داخل سلولی، یک مرحله مهم است که روش‏ها‏ی مختلفی از جمله اولتراسونیک[6]، دستگاه‏ها‏ی برش و آنزیم‏ها برای این امر استفاده می‏شود. این روش‏ها در تخریب ‏اشریشیاکلی مؤثر هستند اما برای انجام آن‏ها نیاز به تجهیزات خاص است که گاهی اوقات این تجهیزات وجود ندارند. یکی از روش‏ها‏یی که بسیار متداول است، اولتراسونیک است. در این روش امواج صوتی با فرکانس بالا باعث لیز شدن سلول‏ها می‏شود. این امواج به وسیله‏ یک پروب ارتعاشی، که در دستگاه اولتراسونیک تعبیه شده است، به نمونه‏ها وارد می‏شود. در بسیاری از موارد، به ویژه در مطالعه‏ها‏یی که تعداد آزمایش‏ها و نمونه‏ها زیاد است، به یک روش ساده، سریع وارزان قیمت نیاز است که یکی از این روش‏ها استفاده از روش انجماد و ذوب[7] است. انجماد و ذوب یک روش متداول برای لیز کردن سلول‏ها‏ی پروکاریوتی و یوکاریوتی است که به دو شکل انجماد وذوب سریع و آهسته انجام می‏شود. در این روش تشکیل کریستال‏ها‏ی یخ ومتورم شدن سلول‏ها و در نهایت، قرار‏دادن آن‏ها در دمای 37 درجه سانتی‏گراد باعث لیزسلولی می‏شود. برای کارآمد شدن این روش باید سیکل انجماد وذوب، بسته به نوع نمونه، چندبار تکرارشود (1، 8 و 9). از آنجا که اولتراسونیک یک روش خوب و مورد قبول است و در این روش تقریبا 80 درصد پروتئین باکتری استخراج می‏شود (19)، در این پژوهش به منظور بررسی کارآمد بودن روش انجماد و ذوب، ابتدا پروتئین هورمون رشد انسانی نوترکیب در سویه اوریگامی[8]اشریشیاکلی تولید و سپس، میزان پروتئین استخراج شده در دو روش انجماد و ذوب و اولتراسونیک مقایسه شد.

 

‏‏. مواد و روش‏ها

.بیان هورمون رشد انسانی در سویه اوریگامی

سویه باکتریایی و وکتور: در این مطالعه سویه (Novagen USA) E. coli Origami (DE3)و وکتورpTrcHis/ZRG pTrcHis Topo, Invitrogen USA حاوی ژن هورمون رشد انسانی، پروموتورtrc[9]، توالیlacO [10]برای القاء توسطIPGT[11]، به منظور بیان هورمون رشد نوترکیب انسانی تهیه شد.

.ترانسفورماسیون[12] و غربالگری سلول‏ها‏ی اوریگامی. حاوی ژن rhGH: از باکتری E. coli Origami سلول‏ها‏ی مستعد[13] تهیه و 5 میکرولیتر از پلازمیدی که حاوی ژن هورمون رشد انسانی است به 200 میکرو‏لیتر سلول‏ها‏ی مستعدشده باکتری اضافه و به آرامی مخلوط شد و با وارد کردن شوک سرمایی و حرارتی عمل ترانسفورماسیون انجام گرفت. سلول‏ها‏ی ترانسفورم شده به منظور غربالگری روی محیط کشت حاوی آمپی‏سیلین کشت داده شد (10 و 11).

بیان پروتئین نوترکیب هورمون رشد انسانی: کلونی انتخاب شده در محیط کشت LB[14] مایع در 37 درجه سانتی‏گراد کشت داده شد و پس از این که میزان جذب (OD) به 6/0 رسید با محلول 1 میلی‏مولار بر لیتر ایزوپروپیل تیو D-β-گالاکتوزید (IPTG) القا و به مدت 5 ساعت در دمای 25 درجه سانتی‏گراد با شیک 200 دور بر دقیقه انکوبه شد. پس از انکوباسیون جسم سلولی باکتری‏ها توسط سانتریفیوژ جمع‏آوری شد (10 و 11).

.لیز سلولی و مقایسه استخراج پروتئین محلول تولیدی با دو روش انجماد وذوب و اولتراسونیک: پس از کشت و القا بیان پروتئین نوترکیب مورد نظر، به منظور بررسی میزان تولید پروتئین در باکتری و مقایسه میزان استخراج آن در دو روش اولتراسونیک و انجماد و ذوب، استخراج این پروتئین با این دو روش انجام گرفت. یک روش متداول برای لیز سلولی اولتراسونیک است اما در بسیاری از پژوهش‏ها استفاده از این روش به صرفه نیست، به همین خاطر در این پژوهش کوشش شده تا روش دیگری مانند انجماد و ذوب برای استخراج پروتئین جایگزین شود. شایان ذکر است به علت این که این پژوهش یک آزمایش مقایسه‏ای است برای هر سه روش یک آزمایش انتخاب شد و از توده سلولی حاصل باکتری به میزان برابر و به مقدار 10 میکرو‏لیتر برداشته و تخریب شد.

انجماد و ذوب: این روش به دو شکل انجماد و ذوب آهسته و انجماد و ذوب سریع انجام شد.

انجماد و ذوب سریع: 100 میکرولیتر از بافر PBS 1X[15] به باکتری‏ها‏ی جمع‏آوری شده حاصل از بیان افزوده و ویال حاوی نمونه به مدت 60 ثانیه درون ظرف یخ خشک و سپس، به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. برای بررسی این‏که بعد از چند بار تکرار این مراحل، میزان پروتئین به دست آمده بیشتر است این مراحل 6 بار تکرار شده و بعد از هر مرحله میزان پروتئین به روش سنجش برادفورد[16] و الایزا[17] اندازه‏گیری شد (1 و 12).

انجماد و ذوب آهسته: 100 میکرولیتر از بافر PBS 1X به باکتری‏ها‏ی جمع‏آوری شده حاصل از بیان افزوده و ویال حاوی نمونه‏ درون فریزر منفی 20 درجه سانتی‏گراد به مدت 20 تا30 دقیقه و سپس، به مدت 15 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد. برای بررسی این‏که بعد از چندبار تکرار این مراحل، میزان پروتئین به دست آمده بیشتر است این مراحل 6 بار تکرار شده و بعد از هر مرحله میزان پروتئین به روش سنجش برادفورد و الایزا اندازه‏گیری شد (1 و 12).

اولتراسونیک: ابتدا 10 میکرولیتر از پلت باکتری برداشته، 100 میکرولیتر بافر PBS 1X به آن افزوده و روی یخ قرار داده و در سه نوبت 30 ثانیه‏ای سونیکیت شد. سپس میزان پروتئین استخراج شده به روش معرف برادفورد و الایزا اندازه‏گیری شد (8 و 13).

تحلیل با معرف برادفورد: پس از اولتراسونیک، 100 میکرو‏لیتر از نمونه به 5 میلی‏لیتر معرف برادفورد اضافه شد وجذب آن در طول موج برادفورد 595 نانو‏متر خوانده شد. همچنین، 100 میکرو‏لیتر آب مقطر نیز به طور جداگانه به پنج میلی‏لیتر معرف برادفورد افزوده و برای صفر کردن استفاده شد. برای تهیه منحنی استاندارد از غلظت‏ها‏ی مختلف آلبومین سرم گاوی BSA شرکت مرک استفاده شد. برای این کار ابتدا محلول غلیظ یک میکرو‏گرم در میلی‏لیتر از BSA ساخته، سپس از این محلول غلظت‏ها‏ی10تا 50 میکرو‏گرم در میلی‏لیتر ساخته شد. 100 میکرولیتر از غلظت‏ها‏ی استاندارد با 5 میلی‏لیتر از محلول برادفورد ترکیب و کاملاً مخلوط شد و جذب آن‏ها در طول موج ثبت شد. برای تهیه نمونه شاهد منفی (Blank) مقدار 100 میکرو‏لیتر آب مقطر با 5 میلی‏لیتر از محلول برادفورد ترکیب شد (14).

تحلیل با الایزا: در این آزمایش از یک ساندویچ الایزای خانگی با استفاده از آنتی بادی اولیه بر علیه هورمون رشد انسانی شامل آنتی‏بادی مونوکلونال 7F8 (آنتی‏بادی هدیه از طرف پروفسور ریچارد راس، دانشگاه شفیلد انگلستان) و آنتی بادی ثانویه بیوتینه شده10A7 (آنتی‏بادی هدیه از طرف پروفسور ریچارد راس، دانشگاه شفیلد انگلستان) استفاده و میزان پروتئین تولید شده بررسی شد. 10 میکرو‏لیتر از آنتی‏بادی اولیه 7F8 به 10 میلی‏لیتر بافر بی‏کربنات اضافه شده و در هر چاهک پلیت 100 میکرو‏لیتر از محلول آنتی‏بادی ریخته و به مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. در مرحله بعد، پس از شستشو عمل مسدود‏سازی[18] به مدت 24 ساعت انجام گرفت. در مراحل بعدی به ترتیب نمونه‏ها، آنتی‏بادی ثانویه، Streptavidin-HRP، TMB Solution[19] (شرکت سیتومتین ژن، ایران) و Stop Solution (شرکت سیتومتین ژن، ایران) افزوده و جذب نوری نمونه‏ها در طول موج 450 نانو‏متر خوانده شد (15).

تحلیل با دات‏بلات[20] و وسترن‏بلات[21]: برای تأیید نهایی تولید پروتئین نوترکیب بیان شده وتعیین ویژگی آن از روش دات‏بلات22 و وسترن‏بلات23 با آنتی‏بادی ضد هورمون رشد استفاده شد. برای انجام دات‏بلات، پس از تخریب دیواره سلولی، عصاره‏ سلولی حاصل که حاوی پروتئین نوترکیب است به کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد. رقت‏ها‏ی مختلف هورمون رشد انسانی نوترکیب تجاری به عنوان کنترل مثبت و عصاره سلولی باکتری که فاقد ژن هورمون رشد است به عنوان کنترل منفی استفاده شد. 2 میکرو‏لیتر از نمونه، کنترل مثبت و کنترل منفی به کاغذ نیتروسلولز انتقال داده شد و پس از خشک شدن نمونه‏ها بر روی کاغذ، مرحله‏ مسدود‏سازی کاغذ نیتروسلولز با قرار دادن آن در محلول شیر خشک یه مدت دو ساعت انجام شد. پس از سه بار شستشو کاغذ نیتروسلولز به مدت دو ساعت در مجاورت آنتی‏بادی ضدهورمون رشد انسانی رقت 1 به هزاراز آنتی‏بادی10A7 قرار داده‏شد. در مرحله‏ بعد پس از شستشو کاغذ نیتروسلولز با آنتی‏بادی ثانویه[22]، سوبسترای آنزیم TMB (HRP) به کاغذ نیتروسلولز اضافه شد. برای انجام وسترن‏بلات نیز پس از انجام الکتروفورز نمونه‏ها بر روی ژل SDS-PAGE 10 درصد، باند‏ها‏ی پروتئینی حاصل به‏دست‏آمده از رسوب باکتری به کاغذ نیتروسلولز منتقل شد. مراحل بعدی همانند مراحل شرح داده شده در بالا برای دات‏بلات انجام گرفت (10 و 11).

. نتایج

ترانسفورماسیون: ازسویه‌ اوریگامی سلول مستعد تهیه و سپس، با پلازمید pTrcHisTopo کدکننده برای rhGH ترانسفورم و مشاهده شد که این سویه با کارایی بالایی ترانسفورم شده است. شکل 1 تصویری از رشد این سویه بر روی محیط کشت حاوی آنتی‏بیوتیک آمپی‏سیلین و تتراسایکلین برای اوریگامی را نشان می‏دهد.

.نتایج استخراج پروتئین به روش انجماد و ذوب سریع با برادفورد: پس از هر بار تکرار 100 میکرولیتر از نمونه با 5 میلی‏لیتر معرف برادفورد سنجیده شد. این روش کل پروتئین‏ها‏ی استخراج‏شده را می‏سنجد. جذب نمونه‏ها در طول موج برادفورد ثبت و طبق نمودار استاندارد (شکل 2) به غلظت میکرو‏گرم تبدیل شد. نمودار به دست آمده نشان‏دهنده این است که تا تکرار پنجم، با افزایش تکرار میزان پروتئین بیشتری استخراج شده اما پس از آن میزان پروتئین استخراجی کاهش می‏یابد (شکل3).

 

شکل 1- تصویری از کلونی‏های ترانسفورم شده سویه‏ی اوریگامی

 

 

 

شکل2- نمودار استاندارد آلبومین سرم گاوی در طول موج 595 نانو‏متر

 

شکل 3- نمودار میزان پروتئین استخراج شده بعد از تعداد دفعات متفاوت انجماد و ذوب سریع با روش برادفورد

میزان پروتئین استخراج شده تا تکرار پنجم با افزایش تکرار، افزایش یافته و از چرخه پنجم به بعد میزان پروتئین استخراجی کاهش می‏یابد.

 

 

شکل 4- نمودار استاندارد غلظت‏ها‏ی الایزا

 

 

.نتایج استخراج پروتئین به روش انجماد و ذوب سریع با الایزا: در این روش از آنتی‏بادی اختصاصی هورمون رشد انسانی برای بررسی میزان استخراج هورمون رشد انسانی پس از هر بار چرخه انجماد و ذوب سریع استفاده شد. الایزا برای هرکدام از نمونه‏ها به شکل تکرار دوتایی انجام گرفت و جذب آن‏ها در طول موج 450 نانو‏متر خوانده و بر اساس نمودار استاندارد (شکل 4) به غلظت نانو‏گرم تبدیل شد که نتایج به دست آمده نشان داده است که میزان استخراج پروتئین تا تکرار پنجم افزایش یافته اما از چرخه پنجم به بعد میزان پروتئین استخراجی کاهش می‏یابد (شکل 5).

 

 

 

شکل 5- نمودار میزان پروتئین استخراج شده بعد از تعداد متفاوت انجماد و ذوب سریع با روش الایزا

میزان پروتئین استخراج شده تا تکرار پنجم افزایش یافته اما از چرخه پنجم به بعد کاهش می‏یابد.

 

شکل 6- نمودار میزان پروتئین استخراج شده بعد از تعداد دفعات متفاوت انجماد و ذوب آهسته با روش برادفورد

 نتایج این نمودار نشان دهنده این است که میزان پروتئین استخراج شده تا چرخه سوم رو به افزایش و پس از آن کاهش می‏یابد.

 


.نتایج استخراج پروتئین به روش انجماد و ذوب آهسته با برادفورد: در این روش نیز همانند روش انجماد و ذوب سریع، نمونه‏ها با معرف برادفورد سنجش شده و پس از تبدبل داده‏ها به غلظت میکرو‏گرم، برای داده‏ها نمودار رسم شد که نتایج نشان داده است که میزان پروتئین تا تکرار سوم روند افزایشی داشته و پس از آن کاهش می‏یابد (شکل 6).

.نتایج استخراج پروتئین به روش انجماد و ذوب آهسته با الایزا: در این روش پس از انجام الایزا با آنتی‏بادی اختصاصی ضد هورمون رشد انسانی به شکل دوتایی برای هر 6 نمونه بعد از هر تکرار و تبدیل جذب نوری نمونه‏ها به غلظت نانو‏گرم، این نتایج به دست آمده است. با سه بار تکرار چرخه انجماد و ذوب آهسته میزان هورمون رشد انسانی بیشتری استخراج شده است (شکل 7). نتایج این نمودار نشان دهنده این است که میزان پروتئین استخراج شده تا چرخه سوم رو به افزایش و پس از آن کاهش می‏یابد.

 

 

شکل 7- نمودار میزان پروتئین استخراج شده بعد از تعداد دفعات متفاوت انجماد و ذوب آهسته با الایزا

 


.نتایج استخراج پروتئین به روش اولتراسونیک با برادفورد: نتایج حاصل از انجام سه نوبت سونیکیت کردن توده سلولی باکتری و بررسی میزان پروتئین استخراج شده با برادفورد نشان دهنده این است که جذب نوری آن در طول موج برادفورد 58/26 میکرو‏گرم است (شکل 8).

 

 

شکل 8- نمودار بررسی میزان پروتئین استخراج شده از روش اولتراسونیک با برادفورد. جذب نوری نمونه در طول موج برادفورد 58/26 میکروگرم در میلی‏لیتر است.

.نتایج استخراج پروتئین به روش اولتراسونیک با الایزا: در این مرحله از کار نیز پس از سه نوبت سونیکیت کردن توده سلولی میزان هورمون رشد انسانی استخراج شده از باکتری با الایزا سنجیده شد. جذب نوری آن در 450 نانومتر 39/21 نانوگرم بود (شکل 9).

 

 

 

شکل 9- نمودار بررسی میزان پروتئین استخراج شده از روش اولتراسونیک با روش‏ الایزا. جذب نوری در طول موج 450 نانومتر 39/21 نانو‏گرم بود.

 

جدول 1- مقایسه میزان پروتئین استخراج شده با سه روش اولتراسونیک، انجماد و ذوب آهسته و انجماد و ذوب سریع

غلظت هورمون رشد سنجش شده با الایزا

غلظت پروتئین سنجش شده با برادفورد

 

39/21 نانوگرم در میلی‏لیتر

58/26 میکروگرم در میلی‏لیتر

اولتراسونیک

37/21 نانوگرم در میلی‏لیتر

84/23 میکروگرم در میلی‏لیتر

انجماد و ذوب آهسته

8/57 نانوگرم در میلی‏لیتر

4/14 میکروگرم در میلی‏لیتر

انجماد و ذوب سریع

 


.مقایسه میزان پروتئین استخراج شده با دو روش اولتراسونیک و انجماد و ذوب: پس از انجام استخراج پروتئین به دو روش اولتراسونیک و انجماد و ذوب به دو شکل آهسته و سریع، میزان پروتئین استخراجی در این دو روش مقایسه شد که این نتایج در جدول 1 نشان داده شد.

دات‏بلات و وسترن‏بلات: نتایج نشان داد در دات‏بلات، پس از انتقال نمونه‏ها به کاغذ نیتروسلولز و اضافه کردن سوبسترای آنزیم، پروتئین به خوبی تولید شده است (شکل 10). پس از انجام الکتروفورز ژل دوبعدی و انتقال ژل به کاغذ نیتروسلولز و انجام سایر مراحل وسترن بلات، باند‏ها‏یی در ناحیه 22 کیلودالتون ظاهر شدند که نشان دهنده تولید پروتئین هورمون رشد انسانی با وزن صحیح است (شکل 11).

 

 

شکل 10- نتایج حاصل از دات‏بلات. ردیف اول از سمت چپ به راست به ترتیب کنترل مثبت با رقت‏ها‏ی 1/1000، 1/100، 1/10 و کنترل منفی، ردیف دوم نمونه‏ها‏ی حاصل از بیان

 

شکل 11- نتایج حاصل از وسترن‏بلات. از سمت راست ردیف اول کنترل مثبت، ردیف دوم مارکر، ردیف سوم تا هفتم نمونه‏ها‏ی حاصل از بیان

 

.بحث و نتیجه ‏‏گیری

در این پژوهش نشان داده شد که پروتئین نوترکیب بیان شده در ‏اشریشیاکلی را می‏توان با روش ساده‏ انجماد و ذوب به خوبی استخراج کرد. از آنجا که طیف وسیعی از پروتئین‏ها‏ی نوترکیب تولید‏شده در ‏اشریشیاکلی داخل سلولی هستند و به خارج ترشح نمی‏شوند، روش انجماد و ذوب یک جایگزین ساده و ارزان برای روش‏ها‏ی پر هزینه جداسازی پروتئین از باکتری است (12). برای استخراج پروتئین نوترکیب تولید شده از باکتری چندین روش وجود دارد که نوع و میزان پروتئین استخراج شده بستگی به آسیب وارد شده به دیواره‏‏ سلول دارد. در برخی روش‏ها دیواره کامل تخریب می‏شود و پروتئین سیتوپلاسمی و پروتئین پری‏پلاسمی خارج می‏شوند. در تعدادی از روش‏ها غشا خارجی از غشا داخلی جدا می‏شود و فقط پروتئین پری‏پلاسمی استخراج می‏شوذ. در روش انجماد و ذوب دیواره تخریب می‏شود و به خارج شدن هر دو پروتئین، سیتوپلاسمی و پری‏پلاسمی منجر می‏شود (12، 15 و 16). همان‏طور که گفته شد برای استخراج پروتئین از باکتری روش‏ها‏ی زیادی وجود دارد اما بیشتر آن‏ها نیاز به تجهیزات خاص دارد؛ این در حالی است که برای انجام برخی از پژوهش‏های آزمایشگاهی به ویژه آزمایش‏ها‏ی بهینه‏سازی که در آن تعداد آزمایش‏ها زیاد است، امکان استفاده از این تجهیزات را نداریم. یکی از روش‏ها‏یی که بیشتر استفاده می‏شود روش اولتراسونیک است که علاوه‏‏ بر ‏این که به تجهیزات گران ‏قیمت نیاز دارد، امواج صوتی در این روش نیز ممکن است به دناتوره‏شدن و غیر‏فعال شدن پروتئین منجر شود که این مشکل در روش انجماد و ذوب وجود ندارد (12، 17 و 18). در این پژوهش میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب با روش اولتراسونیک در سطح آزمایشگاهی مقایسه شد. در این آزمایش هورمون رشد انسانی نوترکیب تولید شده در سویه اوریگامی، که با انجام وسترن‏بلات و دات‏بلات تولید آن تایید شد، با سه روش اولتراسونیک، انجماد و ذوب سریع و انجماد و ذوب آهسته استخراج و میزان پروتئین استخراج ‏شده با روش الایزا و معرف برادفورد اندازه‏گیری شد. نتایج به دست آمده نشان داده است که در روش انجماد و ذوب سریع پس از انجام 5 بار سیکل و در روش انجماد و ذوب آهسته پس از 3 بار انجام سیکل میزان بیشتری پروتئین استخراج شده است. با مقایسه نتابج بدست آمده از الایزا و برادفورد مشخص شده است که میزان پروتئین استخراج شده در روش انجماد و ذوب آهسته کمابیش دو برابر روش انجماد و ذوب سریع بوده است. از طرفی میزان پروتئین استخراج شده از روش انجماد و ذوب آهسته تقریبا مشابه میزان پروتئین استخراج شده از روش اولتراسونیک بوده است. این در حالی است که ماریج[xxiii] و همکاران با استفاده از روش انجماد و ذوب توانستند پروتئین گیرنده‏ رتینوئید[xxiv] را که به شکل نوترکیب در ‏اشریشیاکلی تولید کرده بودند، با غلطت دو برابر نسبت به پروتئین استخراج شده با روش اولتراسونیک، استخراج کنند. این نتایج نشان می‏دهد که می‏توان در مواردی که به علت‏های مختلف امکان استفاده از روش اولتراسونیک ویا دیگر تجهیزات لازم برای تخریب سلول باکتریایی وجود ندارد، می‏توان از روش انجماد وذوب آهسته که روشی ساده و ارزان است، استفاده کرد. البته این روش محدودیت‏ها‏یی هم دارد از جمله این که بیشتر برای استخراج پروتئین‏ها‏یی با وزن بین 8 تا 29 کیلودالتون ودارای بیان بالا قابل استفاده است (18).



[1]. Eshershia coli

[2]. Human growth hormone

[3]. Turner syndrome

[4]. Prader willi syndrome

[5]. Carpal tunnel syndrome

[6]. Ultrasonic

[7]. Freeze/thaw

[8]. Origami (DE3)

[9]. Trc promoters

[10]. Laco sequence

[11]. Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

[12]. Transformation

[13]. Competent cells

[14]. Luria broth

[15]. Phosphate buffered saline

[16]. Bradford assay

[17] . ELISA

[18]. Blocking

[19]. 3,3,5,5-Tetramethylbenzidine

[20]. Dot Blotting

[21]. Western Blotting

[22]- Sheep anti-mouse IgG HRP conjugate, Amersham, 1/1000 dilution

[xxiii]. Marija Mojsin

[xxiv]. Retinoid X receptors (RXRs)

 

(1)               Benov L., Al-Ibraheem J.Disrupting Escherichia coli: A comparison of methods. Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2002; 35 (4): 428- 31.

(2)               Waegeman H., De Lausnay S., Beauprez J., Maertens J., De Mey M., Soetaert W. Increasing recombinant protein production in Escherichia coli K12 through metabolic engineering. BioTechnology 2013; 30 (2): 255- 61.

(3)               Ghasemi F., Zomorodipour A., Shojai S., Ataei F., Khodabandeh M., Sanati MH. Using L-arabinose for production of human growth hormone in Escherichia coli, studying the processing of gIII: hGH precursor. Irania journa of Biotechnology 2004; 2 (4): 250- 60.

 

(4)               Sonoda H., Sugimura A. Improved solubilization of recombinant human growth hormune inclusion body produced in Escherichia coli. Bioscience, biotechnology, and biochemistry 2008; 72 (10): 2675- 80.

(5)               Vance ML., Mauras N. Growth hormone therapy in adults and children. New England Journal of Medicine 1999; 341 (16): 1206- 16.

(6)               Shin N., Kim DY., Shin CS., Hong MS., Lee J., Shin HC. High-level production of human growth hormone in Escherichia coli by a simple recombinant process. Journal of biotechnology 1998; 62 (2):143- 51.

(7)               Sanchez‐ Ortiga R., Klibanski A., Tritos NA. Effects of recombinant human growth hormone therapy in adults with Prader‐Willi syndrome: A Meta‐Analysis. Clinical endocrinology 2012; 77 (1): 86- 93.

(8)               Mehigh R. Lysis of E. coli for the purification of soluble recombinant proteins using CelLytic-B and CelLyticB II. Molecular Biology 2000- 2001; 16- 17.

(9)               Feliu JX., Cubarsi R., Villaverde A. Optimized release of recombinant proteins by ultrasonication of E. coli cells. Biotechnology and bioengineering 1998; 58 (5): 536- 40.

(10)           Rezaei M. Production of recombinant human growth hormone from eukaryotic and prokaryotic cell. Isfahan: Isfahan univ.; 2011.

(11)           Shiva SH. Production of recombinant human growth hormone in some probiotic bacteria. Isfahan: Isfahan univ.; 2013.

(12)           Johnson BH., Hecht MH. Recombinant proteins can be isolated from E. coli cells by repeated cycles of freezing and thawing. Biotechnology 1994; 12 (13): 1357- 60.

(13)           Shrestha P., Holland T.M., Bundy BC. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. Bio Techniques 2012; 53:163- 74.

(14)           Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 1976; 72; 248- 54.

(15)           Wilkinson1 IR., Ferrandis E., Artymiuk PJ., Teillot M., Soulard Ch., Touvay C., et al. A ligand-receptor fusion of growth hormone forms adimer and is a potent long-acting agonist. Nature medicine 2007; 13 (9): 1108- 13.

(16)           Quan S, Hiniker A., Collet JF., Collet A., Bardwell J.C.. Isolation of bacteria envelope proteins In: Delcour A.H. editor. Bacterial Cell Surfaces. New York: Springer Science+ Business Media, Humana Press; 2013. p 359- 66.

(17)           Okungbowa FI., Ghosh AK., Chowdhury R., Chaudhuri P., Basu A, Pal K. Mechanical lysisCandida cells for crude protein and enzymatic activity estimation: Comparison of three methods. World Journal of Medical Sciences 2007; 2 (2): 101- 4.

(18)           Mojsin M., Nikevi G., Grujicic NK., Savic T., Petrovik I., Stevanovic M. Purification and functional analysis of the recombinant protein isolated from E. coli by employing three different methods of bacterial lysis. Journal of the Serbian Chemical Society 2005; 70 (7): 943- 50.

(19)           Nouri Gharajelar S., Ahmadi M., Hosseini B. Cloning and expression of the immunogenic moiety of Pseudomonas aeruginosa exotoxin A. Bilogical Journal of Microorganism 2013; 1 (4) :7- 14.