بررسی تولید آنزیم پروتئاز قلیایی توسط مخمر یاروویا لیپولیتیکا با استفاده از محیط کشت‏ های مختلف

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

2 استادیار میکروبیولوژی، گروه میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

3 استادیار بیوشیمی، گروه بیوشیمی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: پروتئاز‏های قلیایی از مهم‏ترین آنزیم‏های صنعتی محسوب می‏شوند و با توجه به کاربرد‏های فراوانی که در حذف آلاینده‏های محیطی و پیشبرد فرآیند‏های صنعتی دارند، مورد توجه پژوهشگران‏ بسیاری قرار گرفته‏اند. هدف از این پژوهش، جداسازی و شناسایی مخمر بومی مولد آنزیم پروتئاز قلیایی و تعیین فعالیت آنزیم در این جدایه است. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: نمونه‏گیری ‏از خاک، آب و پساب کارخانه‏های مختلف انجام شد. به منظور غربال‏گری ‏گونه‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی در ابتدا از محیط کشت پپتون آگار با اسیدیته قلیایی و محیط کشت میلک آگار استفاده شد. در مرحله بعد سنجش آنزیم با روش لوری انجام و اثر محیط کشت‏های مختلف در تولید آنزیم پروتئاز قلیایی بررسی شد. برای شناسایی بهترین گونه مولد، DNA جدایه استخراج و PCR انجام شد. ‏‏‏
نتایج: از بین تمام جدایه‏ها، 27 جدایه مولد آنزیم پروتئاز قلیایی بودند و جدایه‏ای که بیش‏ترین تولید آنزیم پروتئاز قلیایی معادل 525 ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر) را داشت برای مراحل بعدی انتخاب شد. بیشینه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط کشت YPG براث مشاهده شد. مقایسه توالی 18s rDNA مخمر جدا شده با توالی‏های موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی حداکثر شباهت جدایه را با گونه یاروویا لیپولیتیکا نشان داد. ‏‏‏
بحث و نتیجه گیری: با توجه به کاربرد‏های فراوان این آنزیم در صنعت و تولید نشدن آن در کشور، به نظر می‏رسد استفاده از سویه‏های محلی می‏تواند در دستیابی به تولید بالای آنزیم پروتئاز قلیایی مفید واقع شود. همچنین، با توجه به غیر بیماری‏زا بودن سویه معرفی شده و تولید بالای آنزیم می‏توان این سویه را به عنوان سویه صنعتی مناسب معرفی کرد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Evaluation of alkaline protease production and optimization of culture medium by Yarrowia lipolytica

نویسندگان [English]

  • Mandana Lotfi 1
  • Keivan Beheshti Maal 2
  • Hashem nayeri 3
1 M.Sc. of Microbiology, Department of Microbiology Falavarjan Islamic Azad University, Isfahan, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Department of Microbiology Falavarjan Islamic Azad University, Isfahan, Iran
3 Assistant Professor of Biochemistry, Department of Microbiology Falavarjan Islamic Azad University, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Proteases are the most important industrial enzymes. These enzymes have gained much attention due to their industrial applications in eliminating the environmental pollutions and improving the industrial processes. The aims of this research were the isolation and identification of native yeasts that were able to produce the alkaline protease.
Materials and methods: Several samples of soil, water and wastewater were collected from various places. The culture media used for screening of yeast spp. with potential of alkaline protease production were alkaline peptone agar and alkaline milk agar. The alkaline protease activity in potential spp. was measured using Lowry method. The effects of different culture media on the production of alkaline protease by selected yeast isolates were determined. For molecular identification of the best isolate, the DNA extraction was performed and the PCR followed using universal 18s rDNA primers.
Results: Among 27 isolates with the capability of alkaline protease production, one isolate with the most enzyme activity, 525 u/ ml, was selected for further processing. The best culture medium for alkaline protease production was YPG broth. The comparison of 18s rDNA sequence from isolated yeast with the highest enzyme activity, with the genomic database available in Gen Bank, using BLAST software showed that our yeast isolate had the highest similarity with Yarrowia lipolytica.
Discussion and conclusion: According to numerous applications of alkaline proteases industrially and the lack of their production in our country, the native strains could be beneficial for their production. Regarding to non-pathogenicity and high productivity of alkaline protease by our isolated yeast, Yarrowia lipolytica, this isolate could be introduced as an amenable strain for industrial production of alkaline protease.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Alkaline protease
  • Milk Agar
  • Peptone agar
  • Yarrowia Lipolytica
  • Yeast

مقدمه.

‏امروزه آنزیم‏های میکروبی کاربرد‏های فراوانی در صنایع مختلف دارند. متوسط رشد سالانه بازار جهانی آنزیم‏های صنعتی 3/3 درصد افزایش داشته است ‏(‏1). در این میان پروتئاز‏ها یکی از مهم‏ترین آنزیم‏های صنعتی هستندکه کمابیش 60 درصد فروش آنزیم دنیا به آن‏ها اختصاص دارد. پروتئازها بر اساس جایگاه کاتالیتیکی به دو دسته پروتئازهای خارج سلولی و پروتئازهای داخل سلولی تقسیم می‏شوند. حداکثر فعالیت پروتئاز‏های اسیدی در اسیدیته 2 تا 6، پروتئازهای خنثی در اسیدیته 5/6 تا 5/7، پروتئازهای قلیایی در اسیدیته 8 تا 11 است ‏(‏2 و 3). سرین پروتئاز‏های قلیایی به طور اختصاصی به فرمول شوینده‏ها اضافه می‏شوند. از لحاظ تجاری سرین پروتئاز‏های قلیایی بیشترین کاربرد را دارند. مهم‏ترین سرین پروتئاز‏هایی که هم اکنون استفاده می‏شوند سابتیلیزین کارلزبرگ جدا شده از باسیلوس لیکنی فورمیس، سابتیلیزین بی پی ان از باسیلوس آمیلو لیکنی فورمیس، سابتیلیزین ای و سابتیلیزینان ای تی از باسیلوس سابتیلیس هستند ‏(‏4 و 5). آنزیم پروتئاز قلیایی کاربردهای فراوانی در صنعت دارد که شامل صنایع غذایی، صنایع تخمیری، شوینده‏ها و دترجنت‏ها، چرم‏سازی و دباغی، مکمل غذایی دام طیور، صنعت روغن کشی، صنعت الکل‏سازی، صنایع نساجی، داروسازی و ... است. مهم‏ترین میکروارگانیسم‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی، مخمر‏ها، قارچ‏ها و باکتری‏ها هستند. مهم‏ترین مخمرهای مولد آنزیم پروتئاز قلیایی گزارش شده، یاروویا لیپولیتیکا، کاندیدا اوله آ و آئروبازیدیوم پلولانس و ... هستند. مهم‏ترین قارچ‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی، آسپرژیلوس نایجر، آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نیدولانس هستند. مهم‏ترین باکتری‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی، باسیلوس لیکنی فورمیس، باسیلوس آلکالوفیلوس و باسیلوس سابتیلیس هستند ‏(‏6- 13). با توجه به نیاز روز افزون به این آنزیم در کشور و کاربردهای وسیعی که آنزیم پروتئاز قلیایی در صنایع مختلف دارد و مزایایی که مخمر‏ها نسبت به سایر میکروارگانیسم‏های تولید کننده آنزیم پروتئاز قلیایی دارند، به نظر می‏رسد که برای تکمیل این پژوهش‏ها و شناسایی مخمر‏های بومی مولد آنزیم ادامه این پژوهش‏ها امری ضروری است. اهداف اصلی در این پژوهش جداسازی، شناسایی و معرفی سویه‏های مخمری بومی برتر مولد آنزیم پروتئاز قلیایی و استخراج این آنزیم است.

 

‏‏مواد و روش‏ها.

جداسازی سویه‏های مختلف مخمر: به منظور جداسازی سویه‏های مختلف مخمر، نمونه‏های خاک از مناطق باغ بهادران، فلاورجان، حاشیه زاینده رود و ...، نمونه‏های آب از رودخانه زاینده رود اصفهان، دریای مازندران و خلیج فارس و نمونه‏های پساب از کارخانه‏های رب گوجه فرنگی و مربا، قند، کیک و نوشابه، شیر و لبنیات و ... در ظروف استریل جمع‏آوری و به آزمایشگاه تحقیقاتی منتقل شد. پس از تهیه سری رقت میزان 100 میکرولیتر از رقت های3-10 و 4-10 برداشته و به پلیت‏های حاوی محیط کشت YPG آگار ]عصاره مخمر 10 ‏(‏گرم/ لیتر)، گلوکز 20 ‏(‏گرم/ لیتر)، پپتون 20 ‏(‏گرم/ لیتر)، آگار 15 (‏گرم/ لیتر)، تکمیل شده با 05/0 درصد کلرامفنیکل[ اضافه و با استفاده از میله شیشه‏ای سرکج استریل به روش اسپرید پلیت کشت داده و پس از آن به مدت 3 تا 7 روز در دمای30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد ‏(‏8 و 14).

.بررسی کلونی‏‏های رشد کرده و خالص‏سازی ‏هر نمونه به طور جداگانه: پس از طی شدن زمان انکوباسیون برای نمونه‏های رشد کرده رنگ آمیزی ساده با استفاده از رنگ متیلن بلو انجام شد و هرکدام از کلونی‏‏های متفاوت با استفاده از روش کشت خطی بر روی محیط‏های YPG آگار دیگر خالص شدند.

.غربال‏گری ‏اولیه جدایه‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی: در ابتدا از محیط کشت پپتون آگار با اسیدیته‏های 9، 10 و 11 ]پپتون 20 ‏(‏گرم/ لیتر‏) و آگار 2 درصد[ استفاده شد. جدایه‏های مخمر جداسازی شده را در ابتدا با کشت در محیط‏های مایع YPG(که قبلاً در لوله‏های آزمایش و به میزان 10 میلی‏لیتر ‏تهیه شده و استریل شده بودند) به مدت 48 ساعت، فعال کرده و از هر لوله YPG که حاوی یکی از جدایه‏های جدا شده بود به طریق کشت خطی بر روی محیط‏های پپتون آگار ]پپتون 20 ‏(‏گرم/ لیتر‏)، آگار 15 ‏(‏‏گرم/ لیتر‏)[ با اسیدیته‏های مختلف کشت داده و برای مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏قرار داده شد. در مرحله بعدی از محیط کشت میلک آگار]شیر بدون چربی 50 درصد،‏ آگار 15 ‏(‏گرم/ لیتر)[ استفاده شد. پس از تهیه محیط‏های میلک آگار، جدایه‏هایی ‏که بر روی پپتون آگار قلیایی رشد خوبی داشتند روی محیط میلک آگار کشت داده و به مدت 3 تا 7 روز در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏انکوبه شد. جدایه‏های دارای هاله بزرگ‏تر برای مرحله بعد انتخاب شدن ‏(‏6).

.روش اندازه‏گیری ‏و سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی: بررسی فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی بر اساس روش‏ رنگ‏سنجی ‏پروتئین‏ها به روش لوری انجام شد. ابتدا مقدار 5 میلی‏لیتر ‏از محیط کشت مایع میکروبی با استفاده از پی پت استریل برداشته و به لوله آزمایش تمیز منتقل شد. سپس، به مدت 20 دقیقه و با سرعت 2500 دور بر دقیقه سانتریفیوژ شد و با استفاده از یک پی پت تمیز مقدار 1 میلی‏لیتر ‏از محلول رویی حاوی آنزیم برداشته و به لوله تمیز دیگری منتقل شد. به این محلول آنزیمی مقدار 1 میلی‏لیتر ‏سوبسترا یا همان محلول کازئین 2 درصد با اسیدیته قلیایی 11 اضافه و به مدت 10 دقیقه در بن ماری 40 درجه سانتی‏گراد ‏قرار داده شد. پس از تمام شدن مدت 10 دقیقه بلافاصله به مخلوط آنزیم و سوبسترا مقدار 2 میلی‏لیتر ‏محلول 4/0 مولار تری کلرواستیک اسید اضافه شد و محتویات لوله برای مدت 10 دقیقه با سرعت 12000 دور بر دقیقه و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد ‏سانتریفیوژ شد. سپس، به 1 میلی‏لیتر ‏از محلول رویی مقدار 5 میلی‏لیتر ‏محلول کربنات سدیم 4/0 مولار و 1 میلی‏لیتر ‏معرف فولین سیو کالتوس فنل با رقت 1/0 اضافه و لوله یاد شده برای انجام واکنش به مدت 20 دقیقه در حمام آبی 40 درجه سانتی‏گراد ‏و در شرایط تاریکی قرار داده شد. پس از اتمام زمان 20 دقیقه لوله آزمایش از بن ماری40 درجه سانتی‏گراد ‏خارج و جذب یا دانسیته نوری ‏(‏OD) محلول در طول موج 660 نانومتر خوانده شد. سپس،از روی منحنی استاندارد، مقدار ال- تیروزین آزاد شده بر حسب میکروگرم اندازه‏گیری ‏ و فعالیت آنزیم محاسبه شد. بر اساس تعریف، یک واحد فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی مقدار آنزیمی است که بتواند از سوبسترای کازئین یک میکروگرم ال- تیروزین در مدت واکنش ‏(‏10 دقیقه) و با شرایط آزمایش ‏(‏دمای40 درجه سانتی‏گراد) آزاد کند و واحد آن در میلی‏لیتر ‏و در زمان 10 دقیقه محاسبه می‏شود ‏(‏13).

.منحنی استاندارد فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی: محلول‏هایی حاوی 10، 20، 30، 40، 50، 100 و 150 میکروگرم بر میلی‏لیتر ‏ال-تیروزین تهیه شد. سپس، به 1 میلی‏لیتر ‏از محلول‏های یاد شده مقدار 5 میلی‏لیتر ‏محلول کربنات سدیم 4/0 مولار و 1 میلی‏لیتر ‏محلول فولین سیو کالتوس فنل با رقت 1/0 اضافه و برای انجام واکنش و تغییر رنگ به مدت 20 دقیقه در دمای 40 درجه سانتی‏گراد ‏و در شرایط تاریکی قرار داده شد. پس از اتمام این مدت جذب نوری محلول‏ها در طول موج 660 نانومتر خوانده شد. بنابراین، جذب محلول‏های حاوی ال- تیروزین با میزان مشخص بر حسب میکروگرم مشخص شد. برای رسم منحنی استاندارد OD بر حسب مقدار ال- تیروزین ‏(‏میکروگرم) از نرم افزار آماری SPSS استفاده شد. با توجه به مقادیر ثابت و متغیر داده شده از رایانه معادله خط هم بستگی محاسبه شد. تبدیل مقادیر OD به مقدار ال- تیروزین بر حسب میکروگرم در تمامی آزمایش‏های آینده با استفاده از معادله خط همبستگی آن [Y=0.0071X+0.0448] انجام شده است ‏(‏15).

.تعیین جدایه برتر مخمری مولد آنزیم پروتئاز قلیایی: در این مرحله از آزمایش جدایه‏هایی ‏که بهترین رشد را در محیط کشت پپتون آگار قلیایی داشتند و قطر هاله شفاف دور کلونی‏‏های آن‏ها از سایر ایزوله‏ها بیشتر بود به منظور اندازه‏گیری ‏و سنجش فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی انتخاب شد. به همین علت از محیط کشت YPG براث استفاده شد. از هر کدام از جدایه‏ها کدورتی معادل نیم مک فارلند تهیه و تعداد 108× 5/1 عدد مخمر به ارلن‏های حاوی 100 میلی‏لیتر ‏محیط کشت YPG براث منتقل شد. ارلن‏ها به مدت 72 ساعت در انکوباتور شیکردار با دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و با سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه قرار گرفتند. سپس، فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی در آن با استفاده از روش رنگ‏سنجی لوری اندازه‏گیری و جدایه مخمری که بیشترین فعالیت آنزیمی را داشت برای شناسایی مولکولی‏ انتخاب شد.

.بررسی اثر محیط کشت‏های مختلف در تولید آنزیم پروتئاز قلیایی: اثر القایی مواد اولیه در تولید آنزیم پروتئاز قلیایی بررسی شد. محیط کشت‏هایی ‏که مورد آزمایش قرار گرفتند شامل: YPG براث، محلول پپتون ]پودر پپتون 20 ‏(‏گرم/ لیتر‏)،‏ 100 میلی‏لیتر ‏آب مقطر[،‏ محلول نشاسته ]نشاسته محلول 25 ‏(‏گرم/ لیتر‏)، نیترات سدیم20 ‏(‏گرم/ لیتر‏)،‏ آب مقطر100 میلی‏لیتر‏[ و ملاس چغندر ]ملاس چغندر30 میلی‏لیتر‏، آب مقطر70 میلی‏لیتر‏[ بود. پس از تلقیح، همه ارلن‏ها در انکوباتور شیکردار در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و با سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه قرار گرفتند.

استخراج DNA از مخمر: برای استخراج DNA بافر استخراج ] Tris-HCl100 میلی‏مولار، NaCl 4/1 مولار، EDTA 500 میلی‏مولار، مرکاپتواتانول 2 میکرولیتر[ ساخته شد. 1 میلی‏لیتر ‏از بافر با 500 میکرولیتر از محیط کشت مایع حاوی مخمر ترکیب شد و به مدت 1 ساعت در دمای 65 درجه سانتی‏گراد ‏قرار گرفت. نمونه‏ها به مدت 1 دقیقه با سرعت 8000 دور بر دقیقه سانتریفیوژ و محلول رویی به لوله جدیدی منتقل شد. 600 میکرولیتر مخلوط ایزوآمیل الکل و کلروفرم با نسبت 1:24 به مخلوط افزوده و به مدت 1 دقیقه لوله به آرامی تکان داده شد. سپس، مخلوط به مدت 8 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. پس از سانتریفیوژ دو لایه در مخلوط ایجاد شد. لایه رویی به لوله دیگری منتقل و به اندازه هم حجم آن ایزوپروپانول سرد افزوده شد. مخلوط به آرامی تکان داده شد و به مدت 60 دقیقه در فریزر با دمای منفی 20درجه سانتی‏گراد ‏قرار گرفت. سپس، به مدت 5 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. مولکول‏‏های DNA دو مرتبه با الکل اتانول 70 درصد شستشو داده و هر دو بار به مدت 1 دقیقه با سرعت 12000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. رسوبات در دمای 37 درجه سانتی‏گراد ‏به مدت 2 ساعت قرار داده شد تا خشک شوند. DNA حاصل در 100 میکرولیتر آب مقطر حل و در فریزر با دمای منفی 20 درجه سانتی‏گراد ‏نگهداری شد ‏(‏16).

تعیین کیفیت و غلظت DNA: هر نمونه DNA با 5 میکرولیتر مخلوط بافر به نسبت 3:1 ترکیب و به شکل جداگانه‏ای در یک چاهک روی ژل آگاروز 1 درصد بارگذاری شد. برای تخمین غلظت DNA از نشانگر اندازه با اندازه 1500 جفت باز استفاده شد. الکتروفورز با ولتاژ 100 ولت به مدت 20 دقیقه انجام و سپس، ژل توسط نور ماورا بنفش مشاهده شد. غلظت نمونه‏های DNA از طریق مقایسه موقعیت و شدت باند حاصل از DNA با الگوی نوار بندی حاصل از نشانگر مورد استفاده تعیین شد و سپس، به منظور رقیق‏سازی ‏DNA از آب مقطر استریل استفاده شد و نمونه‏های آماده شده برای انجام آزمایش‏های بعدی در فریزر نگهداری شد.

انجام PCR: در این پژوهش از آغازگرهای عمومی ITS4 و ITS5 به ترتیب به عنوان آغازگرهای سنس و آنتی‏سنس استفاده شد. توالی آغازگر عمومی برای ITS4 ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3' -5' و برای ITS5 به شکل GATCCTTCCGCAGGTTCAC-3'5'- است.

مراحل زمانی PCR شامل دمای واسرشت ابتدایی 94 درجه سانتی‏گراد ‏2 دقیقه، دمای واسرشت 94 درجه سانتی‏گراد ‏45 ثانیه، دمای اتصال 56 درجه سانتی‏گراد ‏30 ثانیه، دمای گسترش 72 درجه سانتی‏گراد ‏70 ثانیه و دمای گسترش نهایی 72 درجه سانتی‏گراد ‏8 دقیقهبود. به منظور تعیین توالی، به 10 میکرولیتر از محصول PCR 15 میکرولیتر آب مقطر اضافه و برای شرکت تکاپوزیست ارسال شد. توالی با توالی‏های موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی ژن بانک و با استفاده از نرم افزار بلاست با یکدیگر مقایسه شد و نوع مخمر در سطح جنس و گونه مشخص شد.

 

نتایج.

.غربالگری اولیه جدایه‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی: از بین جدایه‏های جداسازی شده، تعداد 27 جدایه رشد خوبی را در محیط کشت پپتون آگار با اسیدیته قلیایی نشان دادند که از این میان 10 جدایه در محیط میلک آگار هاله شفاف وسیعی در اطراف کلونی‏‏های تکشان مشاهده شد و به عنوان جدایه‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی انتخاب شدند.

تعیین برترین مخمر مولد آنزیم پروتئاز قلیایی: تولید آنزیم پروتئاز قلیایی توسط 10 جدایه مشخص شده در مرحله قبل که در محیط شیر بهترین تولید آنزیم پروتئاز قلیایی را از خود نشان داده بودند بررسی شد. جدایه 38 با فعالیت آنزیمی معادل 460 ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر‏) بیشترین فعالیت آنزیمی را نشان داد و برای مرحله بعدی آزمایش انتخاب شد ‏(‏شکل 1).

 

شکل 1- تصویر میکروسکوپی جدایه 38 با رنگ آمیزی آبی متیلن

.بررسی اثر محیط کشت‏های مختلف در تولید آنزیم پروتئاز قلیایی: در این آزمایش محیط کشت‏های YPG براث، محلول پپتون، محلول نشاسته و ملاس چغندر در تولید آنزیم پروتئاز قلیایی استفاده شد. نتایج در شکل‏های 2، 3، 4 و 5 آورده شده است.

فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط ملاس چغندر در زمان‏های 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت به ترتیب معادل 20، 30، 32، 20 و صفر ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر‏) اندازه‏گیری ‏شد که حداکثر فعالیت آنزیم تولید شده پس از 72 ساعت به دستآمد ‏(‏شکل 2).

فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط محلول پپتون در زمان‏های 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت به ترتیب معادل 110، 115، 115، 100 و 90 ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر‏) اندازه‏گیری ‏شد که حداکثر فعالیت آنزیم تولید شده پس از 72 ساعت به دست آمد ‏(‏شکل 3).

فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط محلول نشاسته در زمان‏های 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت به ترتیب معادل 80، 90، 100، 90 و 80 ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر‏) اندازه‏گیری ‏شد که حداکثر فعالیت آنزیمتولید شده پس از 72 ساعت به دست آمد ‏(‏شکل 4).

 

شکل 2- مقایسه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط کشت ملاس چغندر در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه

 

 

شکل 3- مقایسه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط کشت محلول پپتون در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه

 

 

شکل 4- مقایسه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط کشت محلول نشاسته در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه

 

شکل 5- مقایسه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط کشت YPG براث در دمای 30 درجه سانتی‏گراد ‏و سرعت هوادهی 100 دور بر دقیقه

فعالیت آنزیم پروتئاز قلیایی در محیط YPG براث در زمان‏های 24، 48، 72، 96 و 120 ساعت به ترتیب معادل 350، 370، 450، 430 و 400 ‏(‏واحد/ میلی‏لیتر‏) اندازه‏گیری ‏شد که حداکثر فعالیت آنزیم تولید شده پس از 72 ساعت به دست آمد ‏(‏شکل 5).

شناسایی مولکولی‏ مخمر مولد آنزیم پروتئاز قلیایی: مقایسه توالی 18s rDNA مخمر جدا شده با توالی‏های موجود در پایگاه اطلاعات ژنومی با استفاده از نرم افزار بلاست انجام شد و مخمر مورد نظر براساس تحلیل توالی ژنومی 18s rDNA شناسایی شد. جدایه 38 جداسازی شده از پساب کارخانه رب گوجه فرنگی و مربا حداکثر تشابه را به میزان 99 درصد با یاروویا لیپولیتیکا نشان داد.

 

بحث و نتیجه ‏‏گیری.

بیشتر آزمایش‏ها و پژوهش‏هایی که در زمینه تولید آنزیم پروتئاز قلیایی انجام گرفته با استفاده از سویه‏های استاندارد و آماده بوده است. برای مثال نلسون و یانگ[i] در سال 1987 تولید آنزیم خارج سلولی پروتئاز قلیایی توسط مخمر کاندیدا اوله آ را بررسی کردند ‏(‏11). کلودیا و همکاران[ii] در سال 2001 کنترل ژنتیکی تولید آنزیم پروتئاز قلیایی را در سویه‏های موتانت یاروویا لیپولیتیکا[iii] ارزیابی کردند ‏(‏17). چی و همکاران[iv] در سال 2007 توانستند مخمر دریایی آئروبازیدیوم پلولانس مولد آنزیم پروتئاز قلیایی را از رسوبات کارخانه نمک در اطراف خط ساحلی دریا کینگ دائو[v] چین جداسازی کنند ‏(‏8). آکپینار و همکاران[vi] در سال 2011 موفق به جداسازی یاروویا لیپولیتیکا مولد آنزیم پروتئاز قلیایی از پنیر شدند ‏(‏6). یاروویا لیپولیتیکا از پساب کارخانه‏های شهر اصفهان جداسازی شد. از آن جا که در پژوهش‏های مختلف از سویه‏های آماده استفاده شده است، روش‏های غربال‏گری ‏در این زمینه کمتر به چشم می‏خورد. برای مثال چی و همکاران در سال 2007 به محیط کشت پایه YPG آگار 2/0 درصد کازئین اضافه کردند که این امر قطعاً تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در جدایه‏ها را مشخص نمی‏کند. بهشتی مآل و همکاران[vii] در سال 2009 از محیط کشت کازئین آگار با اسیدیته‏های قلیایی 9، 10 و 11 استفاده کردند و نتایج خوبی را به دست آوردند ‏(‏14). در این پژوهش در ابتدا از محیط پپتون آگار قلیایی با اسیدیته‏های 9، 10 و 11 استفاده شد، با توجه به کم هزینه و ساده بودن این روش، روش مناسبی برای جداسازی اولیه سویه‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی بوده و نتایج رضایت بخشی نیز داشته است. شایان ذکر است در مقالات و پژوهش‏های گوناگون به این روش اشاره‏ای نشده است.

در مرحله دوم غربال‏گری ‏از محیط کشت میلک آگار استفاده شد. این روش برای غربال‏گری ‏میکروارگانیسم‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی بسیار مرسوم است. برای مثال شافعی و همکاران[viii] در سال 2010، آکپینار در سال 2011، ابراهیم و همکاران[ix] در سال 2007، ونتوسا و همکاران[x] در سال 1982، داویدو و همکاران[xi] در سال 1987 از این روش برای غربال‏گری ‏ایزوله‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی استفاده کردند ‏(‏13، 6، 18 و 19). رشد بر روی چنین محیطی حکایت از ترشح آنزیم پروتئاز خارج سلولی دارد. با توجه به این که استفاده از محیط پپتون آگار مقیاسی از مقدار ترشح آنزیم پروتئاز در اختیار ما نمی‏گذاشت از محیط‏های میلک آگار استفاده شد که در اثر هیدرولیز کازئین محیط کدر و سفید رنگ به شفاف تبدیل می‏شود. بنابراین، استفاده از این دو روش برای غربال‏گری ‏میکروارگانیسم‏های مولد آنزیم پروتئاز قلیایی مناسب است که برای جداسازی اکثر جنس‏های مولد این آنزیم قابل انجام است. در این پژوهش نیز بیشتر بودن فعالیت آنزیمی جدایه‏هایی ‏که هاله شفاف وسیع‏تری ایجاد کرده بودند با سنجش به روش لوری تایید شد. محیط کشت‏های YPG براث، محلول نشاسته، محلول پپتون و ملاس چغندر برای تولید آنزیم پروتئاز قلیایی آزمایش شد. از میان این محیط کشت‏ها، محیط کشت YPG براث بهترین تولید آنزیم پروتئاز قلیایی را داشت. این محیط کشت یک محیط کشت غنی کننده است که استفاده از آن باعث افزایش بیومس سلولی به مقدار مناسب می‏شود در حقیقت تعداد سلول‏ها به میزانی رسیده است که بتوانند در فاز تولیدی در محیط اصلی مقدار بالایی آنزیم پروتئاز قلیایی تولید کنند. دوی و همکاران[xii] در سال 2009، چی و همکاران در سال 2007 از محیط کشت محلول نشاسته به عنوان محیط القا کننده تولید آنزیم پروتئاز قلیایی به ترتیب توسطآسپرژیلوس نایجر و آئروبازیدیوم پلولانس استفاده کردند. در این پژوهش هم استفاده از محیط محلول نشاسته باعث القا تولید آنزیم قلیایی توسط یاروویا لیپولیتیکا شد.محیط کشتی که برای نخستین بار برای تولید آنزیم پروتئاز قلیایی توسط مخمرها در این پژوهش استفاده شد، محیط ملاس چغندر بود ولی متأسفانه نسبت به محیط YPG براث که بالاترین تولید این آنزیم را داشت این محیط کشت، محیط تولیدی مناسبی نبود که به نظر می‏رسد کاهش تولید آنزیم به علت کاهش بیوماس سلولی که ناشی از غلیظ بودن محیط کشت و وجود مقادیر زیاد ترکیبات قندی است و همچنین، به علت نبود ترکیبات پروتئینی به عنوان القا کننده و وجود بیش از حد ترکبیات قندی که احتمالا نقش مهار کنندگی دارند، باشد. پس از محیط کشت YPG براث بیشترین تولید در محیط پپتون مشاهده شد. البته قبلاً این محیط توسط رانی و همکاران[xiii] در سال 2012، شافعی و همکاران در سال 2010 و چی و همکاران در سال 2007 به عنوان یک محیط کشت القا کننده تولید آنزیم پروتئاز قلیایی به ترتیب توسط باسیلوس آلکالوفیلوس[xiv]، استرپتومایسس آلبیدوفلاووس[xv] و آئروبازیدیوم پلولانس گزارش شده بود و با توجه به بالا بودن میزان پروتئین و نبود ترکبیات قندی در محیط، القای تولید آنزیم پروتئاز قلیایی در این محیط امری بدیهی است.با توجه به این که جدایه مربوطه یعنی یاروویا لیپولیتیکا از پساب کارخانه‏های شهر اصفهان جدا شد، به نظر می‏رسد استفاده از سویه محلی می‏تواند در دستیابی به تولید بالای آنزیم پروتئاز قلیایی مفید واقع شود. همچنین، با توجه به غیر بیماری‏زا بودن سویه معرفی شده و تولید بالای آنزیم در این سویه می‏توان این سویه را به عنوان سویه صنعتی مناسب معرفی کرد.

 

تشکر و قدردانی

نگارندگان این مقاله از معاونت محترم پژوهش و فناوری و مدیریت تحصیلات تکمیلی واحد فلاورجان، دانشگاه آزاداسلامی برای حمایت‏های فنی و اجرایی تشکر و قدردانی می‏کنند.



[i]- Nelson and Young

[ii]- Claudia et al.

[iii]- Yarrowia lipolytica

[iv]- Chi et al.

[v]- Qingdao

[vi]- Akpinar et al.

[vii]- Beheshti Maal et al.

[viii]- Shafei et al.

[ix]- Ibrahim et al.

[x]- Ventosa et al.

[xi]- Davidow et al.

[xii]- Devi et al.

[xiii]- Rani et al.

[xiv]- Bacillus alcalophilus

[xv]- Streptomyces albidoflavus

(1)               Aguilar CN., Gutierrez C., Rado B., Rodriguez PA., Martinez H. Perspective of solid state fermentation for production of food enzymes. Biochemistry and Biotechnology 2008; 4 (2): 354- 66.

(2)               Akpinar O., Ucar F., Yalcin T. Screening and regulation of alkaline extracellular protease and ribonuclease production of Yarrowia lipolytica strains isolated and identified from different cheese in Turkey. Annals of Microbiology 2008; 61 (4):904- 15.

(3)               Beheshti Maal K., Emtiazi G., Nahvi I. Production of alkaline protease by Bacillus cereus and Bacillus polymixa in new industrial culture mediums and its immobilization. African Journal of Microbiology Research 2009; 3 (9): 491- 97.

(4)               Charles P., Devanathan V., Anbu P., Ponnus T., Wamy NM., Kalaichelvan TP., Hur KB. Purification characterization and crystallization of an extracellular alkaline protease from Aspergillus nidulans HA-10. Jornal of Basic Microbiology 2008; 48 (4):347- 52.

(5)               Chi Z., Ma C., Wang P., Li HF. Optimization of medium and cultivation conditions for alkaline protease production by the marine yeast Aureobasidium pullulans. Journal of Bioresource Technology 2007; 98 (5): 534- 38.

(6)               Claudia I., Gonzalez L., Roman S., Sylvie B., Claude G. Genetic control of extracellular protease synthesis in the yeast Yarrowia lipolytica. Genetic Society of America 2001; 23 (6): 417- 27.

(7)               Davidow SL., Donnell MM., Kaczmarek SF., Pereiva AD., Dezeeum RJ., Franke EA. Cloning and sequencing of the alkaline extracellular protease gene of Yarrowia lipolytica. Journal of Bacteriology 1987; 169 (1):4621- 29.

(8)               Devi MK., Banu AR., Gnanaprabhal GR., Pradeep BV., Palaniswamy M. Purification characterization of alkaline protease enzyme from native isolate Aspergillus niger and compatibility with commercial detergent. Indian Journal of Science and Technology 2008; 1 (7): 250- 9.

(9)               Gawel N.J., Jarret R.L. A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoae. Plant Molecular Biology Reporter 1991; 9 (3): 262- 6.

(10)           Gupta R., Beg QK., Lorenz P. Bacterial alkaline protease molecular approaches and industrial applications. Applied Biotechnology 2002; 59 (2): 15- 32.

(11)           Ibrahim ASS., Shayeb NMA., Mabrouk SS. Isolation and identification of alkaline protease production alkaliphilic bacteria from an Egyption soda lake. Journal of Applied Science 2007; 3 (8):1363- 8.

(12)           Jacobs I., Eliasson M., Uhlen M., Flick J.I.Cloning sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis. Nucleic acid Research 1985; 13 (7): 8913- 26.

(13)           Lowry O.H., Rosebrough N., Farr A., Rundall R. Protein measurement with folin phenol reagent. Journal of Biology and Chemistry 1951; 193 (4): 265- 75.

(14)           Nadeem M., Qazi J.I., Baij S., Syed Q.A. Effect of medium composition on commercially important alkaline protease production by Bacillus licheniformis N-2. Food Technology and Biotechnology 2008; 46 (4): 388- 94.

(15)           Nakamura T., Syukunobe Y., Sakurai T., Idota T. Enzymatic production of hypoallergenic peptides from casein. Milchwissens Chaft 1993; 48 (9): 11- 4.

(16)           Nelson G., Young W.T. Extracellular acid and alkaline protease from Candida olea. Journal of General Microbiology 1987; 133 (6):1461- 9.

(17)           Rani R., Prasad N.N., Sambasivarao RK. Optimization of conditions for the production of alkaline protease from a mutant Aspergillus flavus AS.2. Journal of Society of Applied Sciences 2012; 3 (3): 565- 76.

(18)           Rao MB., Tanksale AM., Ghatge MS., Deshpande VV. Molecular and biotechnological aspects of microbial protease. Microbial and Molecular Biology 1988; 62 (9): 597- 635.

(19)           Taylor M.M., Bailey D.G., Feairheller SH. A review of the use of enzyme in tannery. Journal of American Leather Chemistry 1987; 82 (5): 153- 65.

(20)           Ventosa A., Quesada E., Rodriguz F., Ruiz B.F., Ramos C.A. Numirical taxonomy of moderately halophylic gram negative rods. Journal of Microbiology 1982; 12 (8): 281- 6.