بررسی شرایط بهینه رشد و ارزش غذایی دو ریزجلبک بومی، هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس در محیط‏ های کشت مختلف

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد تکثیر و پرورش آبزیان، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه ارومیه، ایران

2 استادیار بهداشت و بیماری‏های آبزیان، دانشکده منابع طبیعی، دانشگاه ارومیه، ایران

3 استادیار بیوتکنولوژی آبزیان، پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیه، دانشگاه ارومیه، ایران

چکیده

مقدمه: تعیین بهینه شرایط کشت یک جلبک تک سلولی با استفاده از محیط‏های کشت ضروری از مهم‏ترین ملزومات کشت صنعتی یک جلبک است. دو ریزجلبک هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس جزو ریزجلبک‏های مهم آب شیرین با کاربرد صنعتی بالا هستند که به تازگی از آب‏های داخلی استان آذربایجان غربی جداسازی شدند. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: به منظور تعیین بهترین محیط کشت برای این دو گونه تأثیر پنج محیط کشت مختلف (BM، RM، OHM، BBM و CHU) بر رشد، محتوای اسید چرب و پروتئین این دو گونه در یک دوره 12 روزه بررسی شد. برای تعیین نرخ رشد، تراکم سلولی و زمان دو برابر شدن جمعیت ریزجلبکی، شمارش جلبک‏ها به شکل روزانه و با استفاده از لام هموسیتومتری انجام گرفت. در مرحله سکون ریزجلبک‏ها به منظور تعیین میزان اسیدهای چرب و پروتئین برداشت شدند. ‏‏‏
نتایج: نتایج این ‏پژوهش بالاترین میزان تراکم سلولی (105×68/0 ± 9/18 سلول در میلی‏لیتر) و میزان رشد ویژه (06/0 ± 16/0 در روز) را در ریزجلبک هماتوکوکوس در محیط کشت OHM نشان داد. این بررسی نشان داد بیشینه تراکم سلولی (105×11/1 ± 31/21 سلول در میلی‏لیتر) و بالاترین میزان رشد ویژه (06/0 ± 17/0 در روز) دسمودسموس کوناتئوس در محیط کشت RM حاصل می‏شود. علاوه بر این بیش‏ترین میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع و n−3/ n−6 در هر دو ریز جلبک در محیط کشت BBM به دست آمد. ‏‏‏
بحث و نتیجه ‏گیری: بر اساس نتایج به دست آمده، بین ارزش غذایی ریز‏جلبک از نظر محتوای اسیدهای چرب و میزان رشد ارتباط چندانی مشاهده نشد و به نظر می‏رسد مسیر مکانیسم رشد جلبک‏ها در تعادل با ارزش غذایی آن‏ها نیست و مطالعات بیشتری در این زمینه لازم است. هرچند با استفاده از محیط کشت BBM برای این دو ریز جلبک می‏‏توان به نرخ رشد کمابیش مناسب و ارزش غذایی کافی دست پیدا کرد. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Study of Optimum growth conditions and nutrition value of the two endemic microalgae, Haematococcus sp. and Desmodesmus cunaetus, in different culture media

نویسندگان [English]

  • Mehdi Naderi 1
  • Saeed Meshkiniy 2
  • Ramin Manaffar 3
1 M.Sc. of Aquatic Cultivation and Propagation, Urmia University, Iran,
2 Assistant professor of Fish higen, Urmia University, Iran
3 Assistant profess of Biotechnology, Urmia University, Iran
چکیده [English]

Introduction:Identification of the optimum culture conditions of unicellular algae in different culture media is one of the most important steps required for industrial cultivation requirements of algae. Two microalgae Haematococcus sp. and Desmodesmus cunaetus, as valuable microalgae families, were newly isolated from inland of West Azerbaijan Province.
Materials and methods: In order to determine the best medium for these algae five different media (BM, RM, OHM, BBM and CHU) were studied for their growth rate and fatty acid content in a period of 12 days. To determine the growth rate, cell density and doubling time, counted daily done by Neubauer haemocytometer. The cells were harvested in the stationary phase to determine the fatty acid and protein content.
Results: The results of present study revealed the highest density (18.9 ± 0.68 ×105 cell.mL-1) and maximum specific growth rate (0.16 ± 0.06 day-1) in the microalgae Haematococcus sp. while using in OHM medium. The current study also depicted the maximum cell density (21.31 ± 1.11×105 cell.mL-1) and growth rate (0.17±0.06 day-1) of D.cunaetus in RM medium. In addition, the maximum content of PUFA (polyunsaturated fatty acid) and n-3/n-6 of both microalgae was found in the culture medium of BBM.
Discussion and conclusion: On the basis of our experimental results, we conclude that no clear parallel could be established between good nutritional characteristics of the biomass and mechanism of algae growth hence further research is demanded in this area. However, a compromise between the nutritional properties and growth of both microalgae could be achieved by the use of BBM medium, which provides good fatty-acid composition and adequate protein content as well as relatively high specific growth rate.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Desmodesmus cunaetus
  • Fatty Acids
  • Growth rate
  • Haematococcus sp
  • Protein

مقدمه

‏ریزجلبک‏ها موجودات میکروسکوپی هستند که به طور گسترده در آب‏های شیرین و شور یافت می‏شوند (1 و 2). تعدادی از این میکرواگارنیسم‏ها به علت دارا بودن ترکیبات بدنی ارزشمند همانند: اسیدهای چرب، پروتئین، ویتامین و آنتی‏اکسیدان‏ها به طور گسترده مطالعه و کشت صنعتی می‏شوند (3 و 4). این موجودات در آبزی‏پروری و در سال‏های اخیر در صنایع غذایی (بیسکویت، ماکارونی و رنگدانه‏های غذایی)، دارویی (اسیدهای چرب ضروری و آنتی‏اکسیدان‏ها) و انرژی (تولید سوخت زیستی) کاربرد فراوانی یافته‏اند (5 و 6). رشد، فیزیولوژی و ارزش غذایی ریز جلبک‏ها تحت تأثیر عامل‏‏‏های متفاوت بیوتیک و غیر بیوتیک از جمله محیط کشت قرار دارد. اختلاف در تعیین ریز و درشت مغذی‏های محیط‏های کشت، تفاوت در میزان رشد، وضعیت بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی ریزجلبک‏ها را به همراه دارد (7). پژوهشگران زیادی گزارش داده‏اند که ارتباط زیادی بین مواد مغذی مورد استفاده در محیط‏های کشت و ارزش غذایی ریزجلبک‏ها وجود دارد (8 و 9). از این‏رو در مقیاس تجاری به منظور دست‏یابی به بالاترین میزان بیومس و بهبود ارزش غذایی، استفاده از محیط‏های کشت با ترکیبات مناسب ضروری است. در سال‏های اخیر مطالعات گسترده‏ای به منظور بهبود محیط‏های کشت برای پرورش ریز‏جلبک‏ها انجام شده است (7، 8 و 10). تأمین این ریز‏مغذی‏‏ها در محیط‏های کشت بیشتر بر اساس نیازمندی‏های جلبک‏ها و تحلیل‏‏‏ زیستگاه طبیعی آن‏ها انجام می‏شود. هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس دوگونه مورد مطالعه از جمله جلبک‏های بسیار مهم و کاربردی در آبزی‏پروری و صنایع مختلف هستند که پتانسیل خوبی برای پرورش با اهداف یاد شده دارند. اگرچه پرورش این جلبک‏ها با معایب و مشکلاتی نیز همراه است. یکی از مشکلات اصلی پرورش این دو ریزجلبک به ویژه هماتوکوکوس نرخ رشد پایین آن است که در سال‏های اخیر چندین مطالعه در این زمینه انجام شده است که می‏‏توان به مطالعات فابرگاس[1] و همکاران در سال 2000 (8) و گوکسان[2] و همکاران در سال 2011 اشاره کرد (10). هماتوکوکوس[3] یک ریزجلبک تک‏سلولی تاژک‏دار متحرک و ساکن آب‏های شیرین است. این ریزجلبک به علت تولید بالای آستاگزانتین از مشهورترین جلبک‏های تجاری محسوب می‏شود و به عنوان رنگدانه‏های غذایی در جیره غذایی آبزیان استفاده می‏شود (11).

ریزجلبک دسمودسموس[4]از شاخه کلروفیتا[5] و معمولا به شکل یک کلونی‏‏‏ مسطح (8- 2 سلول و گاهی بیشتر) درآب‏های شیرین دیده می‏شود. این ریزجلبک در زنجیره‏‏ غذایی و در تغذیه زئوپلانکتون‏ها و ماهی‏ها اهمیت دارد همچنین از این ریز‏جلبک به عنوان شاخص زیستی در خود پالایی سیستم‏های آبی استفاده می‏شود (12 و 13). هدف از این ‏پژوهش، تأثیر پنج محیط کشت مختلف: RM, BM, CHU, BBM ,OHM بر رشد و وضعیت اسیدهای چرب دو گونه از ریزجلبک‏های آب شیرین هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس و در نهایت، انتخاب بهترین محیط کشت برای پرورش این ریز جلبک‏هاست.

 

‏‏.مواد و روش ‏ها

دو ریزجلبک هماتوکوکوس و دسمودسموس از بانک جلبکی بخش آرتمیا و آبزیان پژوهشکده مطالعات دریاچه ارومیه دانشگاه ارومیه تهیه شد. این دو ریز جلبک به تازگی از منابع آبی استان جدا‏سازی و به شکل خالص کشت داده شده بود. نمونه‏های جلبکی در ارلن مایرهای 500 میلی‏لیتری و در شرایط استریل در دمای 22 درجه سانتی‏‏‏‏گراد و شدت نور مداوم 100 میکرومول فوتون بر متر مربع در ثانیه، که توسط لامپ فلورسنت ایجاد شده بود در اسیدیته برابر 5/7 در محیط کشت BM کشت داده شد. سلول‏ها در مرحله رشد تصاعدی سانتریفیوژ شده و با تراکم اولیه 105×2/3 سلول در هر میلی‏لیتر به محیط‏های کشت مورد نظر انتقال یافت. دوره آزمایش 12 روز در نظر گرفته شد. شمارش جلبک‏ها به شکل روزانه و با استفاده از لام هموسیتومتری و با روش پیشنهادی مارتینز[6] و همکاران در سال 1975 انجام شد (14). میزان رشد ویژه[7] و زمان دو برابر شدن جمعیت جلبک‏ها[8] با استفاده از رابطه‏های ذیل محاسبه شد:

(15) 1- SGR = ln (N (t) / N0) ∆t

(16)  SGR/DT = loge2

که در آن، N تعداد جلبک در انتهای آزمایش، N0 تعداد جلبک در شروع آزمایش و t∆ مدت زمان انجام آزمایش است. ارزش غذایی و مواد مغذی محیط‏های کشت مورد آزمایش در این مطالعه شامل: (17)BBM، (18)BM، (8) OHM،(19)  CHUو (7) RM وضعیت هریک از محیط‏های کشت در جدول 1 نشان داده شده است. برای ساخت هر محیط‏ کشت به این شکل عمل شد که ابتدا یک محلول ذخیره از نمک‏های زیر برای هر محیط کشت تهیه شد؛ به این ترتیب که مقادیر مندرج در جدول زیر، پس از توزین در 400 میلی‏لیتر آب مقطر حل شده، سپس، 10 میلی‏لیتر از محلول تهیه شده به 440 میلی‏لیتر آب مقطر انتقال داده شد تا محیط کشت نهایی آماده شود ( در محیط‏های کشتی که حاوی ویتامین بودند، ویتامین بعد از اتوکلاو به محیط کشت اضافه شد).

بررسی اسیدهای چرب نمونه‏های ‏‏‏‏جلبکی: برای آماده‏سازی ‏‏‏‏نمونه‏ها برای‏‏‏‏ تحلیل‏‏‏ اسیدهای چرب از روش متیل استریفیکاسیون مستقیم استفاده شد (20). در این روش از هر نمونه جلبک در مرحله رشد تصاعدی مقداری برداشت و با سرعت 5000 دور به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. نمونه‏ها به منظور به حداقل رساندن تغییرات تا زمان استفاده، در منفی 80 درجه سانتی‏‏‏‏گراد نگهداری شد. سپس، 5/0گرم از بیومس تر از نمونه جلبکی در لوله‏های شیشه‏ای درب‏دار مخصوص ریخته، به هر کدام از آن‏ها پنج میلی‏لیتر محلول متانول/‏ تولوئن (با نسبت حجمی 2:3) و 1/0 میلی‏لیتر محلول استاندارد داخلی (حاوی اسید‏ چرب (6n- )‌22:2 حل‌ شده‌ در ایزواکتان) اضافه شد. سپس، پنج میلی‏لیتر مخلوط تازه تهیه شده استیل‏کلراید/ متانول (با نسبت حجمی20:1) به عنوان عامل استریفیکاسیون اضافه شد. درب ظروف محکم بسته و مواد مخلوط شد و در حمام آبی100 درجه سانتی‏گراد به مدت 60 دقیقه جوشانده و هر 10 دقیقه یک‏بار تکان داده شد. بعد از اینکه لوله‏ها سرد شدند به هر یک پنج میلی‏لیتر آب دو بار تقطیر شده و پنج میلی‏لیتر هگزان اضافه شد. لوله‏ها به مدت پنج دقیقه با دور g3000 سانتریفیوژ شده و فاز بالایی به لوله‏های جدید منتقل شد. در نهایت، از طریق فیلتر سولفات سدیم آب‏گیری و به بالن‏های گلابی ‏شکل انتقال داده و توسط روتاتور در دمای 35 درجه سانتی‏گراد تغلیظ شد. سپس، در 5/0میلی لیتر ایزواکتان حل، به شیشه‏های کوچکی انتقال داده و تا زمان تزریق در فریزر نگهداری شد.

 

جدول 1- وضعیت مواد مغذی در محیط‏های ‏‏‏‏کشت مختلف

OHM

BBM

CHU

BM

RM

مواد تشکیل دهنده (میلی‏گرم در لیتر)

410

 

 

100

 

KNO3

 

 

6/12

 

 

NaHCO3

 

250

5/8

 

300

NaNO3

30

 

 

 

 

Na2HPO4

 

75

7/8

 

20

K2HPO4

 

175

 

 

 

KH2PO4

5/246

75

9/36

40

10

MgSO4 .7H2O

9/110

25

7/36

 

5/58

Cl2Ca .2H2O

62/2

 

5/33

 

 

FeC6H5O7 .5H2O

 

98/4

 

 

 

FeSO4 .7H2O

011/0

 

02/0

0110/

 

Cl2Co .6H2O

 

49/0

 

 

26/0

Co(NO3)2 .6H2O

012/0

57/1

02/0

 

08/0

CuSO4 .5H2O

076/0

 

 

 

 

Cr2O3

989/0

44/1

0126/0

108/0

 

MnCl2 .4H2O

12/0

 

0126/0

0075/0

 

Na2MoO4 .2H2O

 

71/0

 

 

 

MoO3

005/0

 

 

 

 

SeO2

 

42/11

62/0

 

3/0

H3BO3

 

82/8

044/0

066/0

1/0

ZnSO4 .7H2O

 

 

4/28

 

 

Na2SiO3.9H2O

 

31

 

 

 

KOH

 

 

 

 

5/1

MnSO4.H2O

 

25

 

 

20

NaCl

 

 

 

 

3/0

(NH4)6MO7O24.4H2O

 

 

 

 

17

C6H8O7.7H20

 

 

 

88/5

 

FeCl3.6H2O

 

 

 

150

 

Ca(NO3)24H2O

 

 

 

50

 

β-Na2 glycerophosphate

 

 

 

27/2

 

EDTA-Na2

 

 

 

 

5/7

EDTA

025/0

 

 

1/0

 

Biotin

175/0

 

 

 

 

Thiamine

015/0

 

 

 

 

B12

 

 

 

01/0

 

Thiamine-HCL

 

 

 

5/0

 

Trisaminomethane


بررسی و شناسایی اسیدهای چرب موجود در نمونه با استفاده از دستگاه گاز کروماتوگرافی مدل 7890 Agilent- ساخت آمریکا مجهز به دتکتور FID و ستون کاپیلاری [9] انجام شد. نیم میکرولیتر از نمونه استری با استفاده ازسرنگ میکرولیتری به دستگاه گاز کروماتوگرافی تزریق شد (دمای شروع 100 درجه سانتی‏‏‏‏گراد، دمای پایانی 220 درجه سانتی‏‏‏‏گراد و سرعت 3 درجه سانتی‏‏‏‏گراد بر دقیقه) شناسایی اسیدهای چرب در نمونه‏ها با تزریق محلول استاندارد اسیدهای چرب و مقایسه منحنی‏های ‏‏‏‏رسم شده برای هر اسید چرب بر اساس زمان بازداری آن‏ها انجام گرفت. در نهایت‌، مقادیر اسید چرب به شکل درصد سطح زیر پیک از کل بیان شد.

استخراج پروتئین: استخراج پروتئین کل بر اساس روش مجیر و ویجفلس[10] در سال 1998 انجام شد(21). بدین منظور 100 میلی‏گرم از جلبک‏های پرورش یافته وزن، به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏‏‏‏گراد با سرعت 500 دور سانتریفیوژ، با 25 میلی‏لیتر بافر فسفات شستشو و سپس به 10 میلی‏لیتر بافر فسفات با 1 درصد SDS منتقل شد. تخریب سلول‏ها نیز با استفاده از سونیکاتور بر روی یخ به مدت 120 انجام شد. تعیین میزان پروتئین‏ها به روش برادفورد[11] در سال 1976و با استفاده از سرم آلبومن بووین [12] انجام شد (22).

 

.نتایج

یافته‏های این ‏پژوهش نشان داد که میزان رشد دو ریزجلبک دسمودسموس کوناتئوس و هماتوکوکوس در پنج محیط کشت مختلف در یک دوره 12 روزه اختلاف معنا‏داری را نشان می‏دهند (05/0P value>).

ریزجلبک هماتوکوکوس بیش‏ترین میزان بیشینه (105×68/0±  90/18 سلول در هر میلی‏لیتر) و کم‏ترین میزان بیشینه تراکم سلولی (92/0±90/10 سلول در هر میلی‏لیتر) را به ترتیب در محیط کشت OHM و CHU نشان داد (شکل 1). از سوی دیگر بیش‏ترین میزان رشد ویژه (06/0± 16/0 در روز) و کوتاه‏ترین زمان دو برابر شدن (66/0± 33/4 در روز) جمعیت در روز، در محیط کشت OHM به دست آمد (جدول 2). برای ریز جلبک دسمودسموس کوناتئوس بیشینه میانگین تراکم سلولی (105×11/1 ± 31/21 سلول در هر میلی‏لیتر) و بیش‏ترین نرخ رشد ویژه (061/0 ±17/0 در روز) در محیط کشت RM و بیش‏ترین زمان دو برابر شدن جمعیت جلبکی در محیط‏ کشت CHU (61/0±50/5 در روز) مشاهده شد (جدول 3 و شکل 2).

 

 

جدول 2- میانگین تراکم سلولی، میزان رشد ویژه و زمان دو برابر شدن جمعیت ریزجلبک هماتوکوکوس کشت داده شده در محیط‏های کشت مختلف

زمان دو برابر شدن (در روز)

نرخ رشد ویژه (در روز)

حداکثر تراکم سلولی (تعداد سلول در هر میلی‏لیتر×105)

محیط‏های ‏‏‏‏کشت

33/4 ± 66/0c

16/0 ± 06/0a

9/18± 68/0 a

OHM

77/5 ± 31/0ab

12/0 ± 09/0c

91/12 ± 01/1c

BM

93/6 ± 97/0a

10/0 ± 05/0d

90/10 ± 92/0 d

CHU

95/4± 57/0bc

14/0 ± 07/0b

6/16  ± 86/0b

BBM

62/4± 61/0bc

15/0±  06/0ab

00/15  ± 47/0 b

RM

حروف یکسان در هر ستون بیانگر عدم اختلاف معنادار است (05/0P value >).

جدول 3- میانگین تراکم سلولی، میزان رشد ویژه و زمان دو برابر شدن جمعیت ریزجلبک دسمودسموس کوناتئوس کشت داده شده در محیط‏های کشت مختلف

زمان دو برابر شدن (در روز)

نرخ رشد ویژه (در روز)

حداکثر تراکم سلولی (تعداد سلول در هر میلی‏لیتر×105)

محیط‏های ‏‏‏‏کشت

72/0 ± 22/4ab

16/0 ± 09/0a

12/50/18 ± 71/0b

OHM

33/0 ± 21 /5ab

13/0 ± 06/0b

50/14 ± 78/0 c

BM

61/0 ± 50/5a

12/0 ± 05/0b

17/12 ± 75/0 c

CHU

5/0 ± 56/4ab

15/0 ± 07/0ab

41/18  ± 86/0b

BBM

89/3 ± 45/0b

17/0 ± 06/0a

31/21  ± 11/1 a

RM

حروف یکسان در هر ستون بیانگر عدم اختلاف معنادار است (05/0P value >).

 

 

شکل 1- تأثیر محیط‏های کشت مختلف بر تراکم سلولی هماتوکوکوس در روزهای مختلف

 

 

شکل 2- تأثیر محیط‏های کشت مختلف بر تراکم سلولی دسمودسموس کوناتئوس در روزهای مختلف

 

نتایج مربوط به تأثیر تیمارهای مختلف محیط کشت بر محتوای اسیدهای چرب ریزجلبک هماتوکوکوس نشان داد که محیط‏های ‏‏‏‏کشت مختلف موجب اختلاف معناداری در محتوای اسیدهای چرب اشباع[13]، اسیدهای چرب تک غیراشباع[14] و اسیدهای چرب چند غیراشباع[15] می‏شود. بالاترین میزان اسیدهای چرب اشباع (97/0±40/29) در محیط کشت CHU، کم‏ترین میزان در تیمارهای OHM (76/0±21/ 22 درصد) و BBM (66/0 ± 47/22 درصد) بود (جدول 4). علاوه بر این، بالاترین درصد اسیدهای چرب تک غیراشباع (46/0 ± 78/23 درصد) و اسیدهای چرب چند غیراشباع (12/1 ± 73/28 درصد) زمانی حاصل شد که به ترتیب محیط‏های کشت BM و BBM استفاده شد. همچنین محیط‏ کشت BBM بالاترین نرخ n−3/ n−6(49/0 ± 21/2) را نشان داد (جدول 4).

 

 

جدول 4- درصد کل اسیدهای چرب جلبک تک سلولی هماتوکوکوس در محیط‏های ‏‏‏‏کشت مختلف

OHM

BM

CHU

RM

BBM

Fatty acid

47/0 ± 12/0b

14/1 ± 01/0a

48/0 ± 14/0b

51/0± 03/0b

71/0 ± 18/0ab

C14:0

8/17± 21/0d

51/24 ± 42/0a

4/26 ± 39/0a

11/22 ± 22/0c

3/18 ± 39/1d

C16:0

68/1±04/0a

91/1± 06/0a

86/1± 14/0a

18/2 ± 40/0a

12/1 ± 23/0a

C18:0

72/0 ± 06/0a

1/0 ± 02/0c

15/0 ± .03/0b

15/0 ± 04/0b

71/0 ± 04/0a

C20:0

88/0 ±51/0a

23/0 ± 07/0c

14/0± 14/0d

16/0 ± 03/0d

48/0 ± 07/0b

C22:0

66/0 ± 27/0b

12/0 ± 07/0d

37/0 ± 03/0c

43/0 ± 17/0c

15/1 ± 42/0a

C24:0

86/0± 36/0b

38/2 ± 52/0a

22/1 ± 17/0b

14/1 ± 16/0b

61/1 ± 62/0b

C14:1(n-5)

43/0 ± 17/0b

99/1 ± 69/0a

64/0 ± 02/0b

65/0 ± 10/0b

76/0 ± 17/0b

C16:1(n-7)

86/4 ± 81/0b

51/7±1/1a

16/8 ± 08/0a

35/8 ± 14/3a

32/7±08/1 a

C18:1(n-9)

12/14 ±56/2a

59/11 ± 77/1b

85/12 ± 47/1ab

07/9 ± 19/1c

69/9 ± 24/1c

C18:1(n-7)

24/1 ±.09/0a

21/0 ± 05/0b

1/0 ± 04/0b

16/0 ± 06/0b

23/0 ± 02/0b

C20:1(n-9)

nd

nd

nd

nd

nd

C22:1(n-9)

33/0 ± 03/0a

1/0 ± 05/0c

08/0± 02/0c

24/0 ±77/0b

3/0 ± 04/0a

C24:1(n-9)

2/14 ± 3/1a

5/7 ± 46/0c

12/7 ± 08/0c

06/11 ± 26/1c

90/8 ± 74/0b

C18:2(n-6)

83/10 ± 54/1c

21/11± 3/0c

85/10 ± 23/0c

83/12± 86/2b

04/16 ± 6/0a

C18:3(n-3)

nd

nd

nd

nd

nd

C20:2(n-6)

nd

nd

nd

nd

nd

C20:4(n-6)

86/0 ± 34/0ab

28/0 ± 09/0b

13/0 ± 07/0b

19/0 ± 04/0b

25/1 ±07/0a

C20:3(n-3)

66/0 ± 28/0ab

09/0± 09/0b

31/0 ±07/0b

25/1 ± 36/0a

50/1 ± 07/0a

C20:5(n-3)

18/0 ± 09/0c

13/0 ± 05/0d

16/0 ± 02/0cd

82/0 ± 01/0b

04/1 ±06/0a

C22:6(n-3)

21/22 ± 76/0d

01/28 ± 06/1b

40/29± 97/0a

54/25± 22/1c

47/22 ± 66/0d

SAF

84/21 ± 66/0b

78/23 ± 46/0a

05/23 ± 33/0ab

61/19 ± 82/0c

91/19 ± 11/1c

MUFA

73/26 ± 29/0b

21/19 ± 96/0c

57/18 ± 53/0d

15/26 ± 76/0b

73/28 ± 12/1a

PUFA

88/0± 11/0b

56/1±75/0 ab

60/1 ± 33/0 ab

36/1 ± 11/1ab

21/2 ± 49/0a

n3-/n6-

حروف یکسان در هر ردیف بیانگر عدم اختلاف معنادار است (05/0P value >).

 

بیشینه میانگین اسیدهای چرب اشباع (06/1 ± 02/27 درصد) در جلبک دسمودسموس کوناتئوس در تیمار BM مشاهده شد. این در حالی است که تیمار CHU (53/0 ± 71/21 درصد) و BM (96/0 ± 32/21 درصد) کم‏ترین میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع را نشان دادند. از سوی دیگر بالاترین میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع (76/0 ± 51/26 درصد) در محیط کشت BBM مشاهده شد. کم‏ترین و بیش‏ترین‏‏‏‏ میزان اسیدهای چرب تک غیراشباع به ترتیب در تیمارهای OHM (66/0 ± 33/19 درصد) و CHU (33/0 ± 34/22 درصد) مشاهده شد. همچنین بالاترین نرخ n−3/ n−6 (55/0 ± 49/2 درصد) در تیمار BBM ثبت شد (جدول 5).

 

 

جدول 5- درصد کل اسیدهای چرب جلبک تک سلولی دسمودسموس کوناتئوس در محیط‏های کشت مختلف

OHM

BM

CHU

RM

BBM

Fatty acid

26/0 ± 08/0c

32/0 ± 09/0bc

48/0 ± 06/0a

36/0± 18/0abc

45/0 ± 11/0ab

C14:0

59/19± 20/0b

81/22 ± 33/0a

74/23 ± 90/0a

12/19 ± 22/1b

89/18 ± 42/1b

C16:0

98/0±09/0a

16/1± 16/0a

51/0± 06/0a

92/0 ± 03/1a

14/1 ± 12/0a

C18:0

35/1 ± 37/0ab

92/0 ± 07/0ab

24/0 ± 04/0b

68/1 ± 68/0a

48/1 ± 61/0a

C20:0

21/1 ±15/2b

64/1 ± 13/0b

41/1± 02/0b

12/3 ± 14/1a

66/1 ± 39/1b

C22:0

24/1 ± 14/0a

17/0 ± 01/0c

22/0 ± 22/0c

64/0 ± 39/0b

77/0 ± 34/0b

C24:0

41/1± 71/0b

71/2 ± 06/0a

10/2 ± 01/0ab

40/1 ± 58/0b

79/1 ± 52/0ab

C14:1(n-5)

17/0 ± 03/0b

51/0 ± 01/0b

15/1 ± 03/0a

36/0 ± 12/0b

18/0 ± 06/0b

C16:1(n-7)

76/6 ± 58/0c

90/7±42/2bc

34/8 ± 40/0b

99/9 ± 58/0a

64/8±02/0 b

C18:1(n-9)

12/10 ±79/0a

75/9 ± 10/1a

45/9 ± 11/0a

40/7 ± 71/0b

99/7 ± 79/0b

C18:1(n-7)

64/0 ±.03/0bc

43/0 ± 03/0d

79/0 ± 04/0a

52/0± 15/0cd

74/0 ± 13/0ab

C20:1(n-9)

nd

nd

nd

nd

nd

C22:1(n-9)

24/0 ± 09/0b

03/1 ± 44/0a

51/0± 02/0b

33/0 ±02/0b

70/0 ± 05/0ab

C24:1(n-9)

2/12 ± 26/0a

21/8 ± 86/0b

50/7 ± 82/0b

51/8 ± 23/0b

59/7 ± 46/0b

C18:2(n-6)

95/10 ± 74/0c

51/11± 02/0b

52/13 ± 23/0b

12/14± 03/0a

73/15 ± 46/0a

C18:3(n-3)

nd

nd

nd

nd

nd

C20:2(n-6)

nd

nd

nd

nd

nd

C20:4(n-6)

32/2 ± 10/0a

29/1 ± 74/0bc

28/0 ± 02/0c

48/1 ± 86/0b

03/2 ±78/0a

C20:3(n-3)

78/0 ± 08/0ab

14/0± 02/0b

31/0 ± 07/0b

34/0 ± 03/0b

82/0 ± 19/0a

C20:5(n-3)

16/0 ± 32/0b

17/0 ± 07/0b

1/0 ± 02/0b

81/0 ± 01/0a

34/0 ±16/0b

C22:6(n-3)

63/24 ± 76/0b

02/27 ± 06/1a

59/26± 97/0a

84/25± 22/1b

39/24 ± 66/0b

SAF

33/19 ± 66/0b

33/22 ± 46/0a

34/22 ± 33/0a

00/20 ± 82/0b

04/20 ± 10/1b

MUFA

41/26 ± 29/0ab

32/21 ± 96/0c

71/21± 53/0c

26/25 ± 76/0b

51/26 ± 12/1a

PUFA

16/1± 69/0a

56/1 ± 55/0a

89/1 ± 78/0a

96/1± 49/0a

49/2± 75/0a

n 3-/n6-

حروف یکسان در هر ردیف بیانگر عدم اختلاف معنادار است (05/0P value >).

 

 

همان‏طور که در جدول 6 مشاهده می‏‏شود میزان پروتئین دو ریز جلبک هماتوکوکوس و دسمودسموس در محیط‏های کشت مختلف اختلاف معنا‏داری را نشان داد (05/0P value <). بیش‏ترین‏‏‏‏ میزان پروتئین استخراج شده در هماتوکوکوس و دسمودسموس به ترتیب درمحیط کشت OHM (02/0 ± 21/35 درصد) و BBM (12/0±23/27 درصد) بود. این در حالی است که محیط کشت CHU کم‏ترین میزان پروتئین را در هر هماتوکوکوس (01/0±15/20 درصد) و دسمودسموس (03/0±30/14 درصد) نشان داد.

 

 

جدول 6- میزان پروتئین محلول استخراج شده ( بر حسب درصد) در ریز جلبک دسمودسموس کوناتئوس در هماتوکوکوس در محیط‏های کشت مختلف(Mean ± SD)

هماتوکوکوس (درصد پروتئین)

(درصد پروتئین) دسمودسموس کوناتئوس

محیط‏های کشت

02/0 ± 21/35 a

11/0 ± 09/22c

OHM

06/0 ± 09/21 d

07/0 ± 16/18 d

BM

01/0 ± 15/20 d

03/0 ± 30/14 e

CHU

04/0 ± 40/32 b

12/0 ± 23/27 a

BBM

06/0 ± 21/30 c

02/0 ± 17/24 b

RM

 


.بحث و نتیجه‏‏ گیری

تاکنون مطالعات گسترده‏ای به منظور بهبود میزان رشد ریزجلبک‏ها انجام گرفته شده است (23 و 24). میزان و نوع مواد مغذی جزو عواملی هستند که تأثیر زیادی بر میزان رشد دارد، با وجود این احتمالا به علت اختلافات جمعیتی و سویه‏ای گاهی نتایج مختلفی از میزان رشد و بقای یک گونه جلبک در محیط‏های کشت واحد حاصل شده است. فابرگاس و همکاران در سال 2000 گزارش داده‏ ‏اند که تراکم سلولی هماتوکوکوس پلوویالیس[xvi] در محیط کشت OHM سه برابر بیشتر از تراکم سلولی به دست آمده در محیط کشت BBM است (8). درحالی که دومینگز- بوکانگرا[xvii] و همکاران در سال 2004 بالاترین نرخ رشد هماتوکوکوس پلوویالیس را در محیط کشت BBM گزارش کردند (24). نتایج گزارش اخیر مطابق با یافته‏های ایمامگلو[xviii] و همکاران در سال 2007 است که بالاترین نرخ رشد هماتوکوکوس پلوویالیس را در محیط کشت RM گزارش کرده‏اند (7). یافته‏های ‏پژوهش حاضر نشان داد که دو ریزجلبک هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس در تیمارهای مختلف از محیط‏های کشت، دارای نرخ رشد متفاوتی هستند. مناسب‏ترین میزان تراکم سلولی، میزان رشد ویژه و کم‏ترین زمان دو برابر شدن جمعیت هماتوکوکوس ودسمودسموس کوناتئوس به ترتیب در محیط کشت OHM و RM به دست آمد. نتایج این مطالعه نشان داد که در محیط کشت CHU، کاهش تراکم سلول و میزان رشد و افزایش زمان دو برابر شدن جمعیت این دو ریزجلبک انجام می‏شود (جداول 2 و 3). بنابراین، با توجه به نتایج به دست آمده می‏توان چنین نتیجه گرفت که محیط‏های کشت OHM و RM مناسب برای رشد این دو ریزجلبک و محیط کشت CHU بازدارنده رشد محسوب می‏شود. بررسی‏های انجام شده نشان داده است که تفاوت در غلظت مواد مغذی (به ویژه ماکرونوترینت‏های همانند P و N) در محیط‏های کشت از عوامل اساسی مؤثر بر رشد ریزجلبک‏هاست. علاوه بر این، اختلاف در غلظت میکرونوترینت‏ها همانند آهنتأثیر زیادی بر رشد ریزجلبک‏ها دارد. برای مثال لیو [xix] و همکاران در سال 2008 نشان دادند که افزایش بیش از حد آهن می‏تواند اثرات سمی بر رشد جلبک‏ها داشته باشد (25). وجود مواد آلی همانند ویتامین‏ها و کلات‏ها می‏تواند رشد ریزجلبک‏ها را افزایش دهد (10). پرینگشم[xx] در سال 1996 گزارش داد که تیامین از عامل‏‏‏های اساسی رشد ریزجلبک‏ها محسوب می‏شود در حالی که وجود ویتامین B12 در محیط کشت چندان ضروری نیست (26). علاوه بر این، میزان پروتئین سنتز شده نقش مهمی را بر میزان بیومس و نرخ رشد دارد و هر گونه تغییر در سنتز پروتئین‏ها اثر مستقیمی بر میزان رشد جلبک‏های تک سلولی دارد. از سوی دیگر تغییر در میزان نوترینت‏ها به ویژه ماکرو نوترینتی همانند نیتروژن (که از عناصر اصلی تشکیل دهنده پروتئین‏ها محسوب می‏شود) تأثیر مستقیم بر سنتز پروتئین‏ها دارد (27). نتایج این پژوهش نیز نشان داد که بیش‏ترین‏‏‏‏ پروتئین استخراج شده در این دو جلبک تک سلولی از تیمارهای با غلظت بالای نیتروژن به دست آمد. بیش‏ترین‏‏‏‏ میزان پروتئین در هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس به ترتیب درمحیط کشت OHM و RM مشاهده شد. براساس گزارش تعداد زیادی از پژوهشگران کیفیت و میزان اسیدهای چرب تحت تأثیر شرایط پرورش قرار دارد (28- 30).در این مطالعه محیط کشت BBM و OHM بالاترین میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع را در هماتوکوکوس نشان دادند. در حالی که در محیط کشت CHU کم‏ترین میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع و بیش‏ترین‏‏‏‏ میزان اسیدهای چرب اشباع مشاهده شد. علاوه بر این، بالاترین میزان اسیدهای چرب تک غیراشباع در محیط کشت BM به دست آمد. در دسمودسموس کوناتئوس بیش‏ترین‏‏‏‏ میزان اسیدهای چرب چند غیراشباع در محیط کشت BBM و OHM مشاهده شد. همچنین بیش‏ترین‏‏‏‏ میزاناسیدهای چرب اشباع واسیدهای چرب تک غیراشباع در محیط کشت BM ثبت شد. بر اساس نتایج تعدادی از پژوهشگران غلظت نیتروژن یکی از عوامل مهم بر محتوای اسید چرب ریزجلبک‏ها محسوب می‏شود. هالسی[xxi] و همکاران در سال 2010 گزارش دادند که کمبود نیتروژن به افزایش اسیدهای چرب اشباع و کاهش اسیدهای چرب غیر اشباع منجر می‏شود (31). وب و چو[xxii] در سال 1986 گزارش کردند در صورتی که نسبت n−3/ n−6 بین 2 تا 5 باشد بیومس تولید شده از نظر ارزش غذایی مناسب است (32). در بین تیمارهای مختلف تنها محیط کشت BBM بهترین نسبت n−3/ n−6 را در هماتوکوکوس و دسمودسموس کوناتئوس نشان داد.

بر اساس نتایج به دست آمده، بین ارزش غذایی ریز‏جلبک از نظر محتوای اسیدهای چرب و میزان رشد ارتباط چندانی مشاهده نشد و به نظر می‏رسد مسیر مکانیسم رشد جلبک‏ها در تعادل با ارزش غذایی آن‏ها نیست و مطالعات بیشتری در این زمینه لازم است. این ‏پژوهش نشان داد که در بین محیط‏های کشت مورد مطالعه، محیط کشت BBM در هر دو ریزجلبک می‏‏تواند شرایط بهینه رشد و ارزش غذایی اسیدهای چرب (درصد بالای اسیدهای چرب چند غیراشباع) و نسبت مناسب (n−3/ n−6) را تامین کند.



[1]- Fabregas

[2]- Göksan

[3]- Haematococcus sp.

[4]- Desmodesmus cuneatus

[5]- Chlorophyta

[6]- Martinez

[7]- SGR) Specific growth rate)

[8]- DT) Doubling time)

[9]- (DB-225MS, 30  m × 0.250 mm ID × 0.25 μm Filmthickness)

[10]- Meijer and Wijffels

[11]- Bradford

[12]- Bovine serum albumen

[13]- SFA (saturated fatty acid)

[14]- MUFA (Monounsatrated fatty acid)

[15]- PUFA (Polyunsatrated fatty acid)

[xvi]- Haematococcus pluvialis

[xvii]- Domìnguez-Bocanegra

[xviii]- Imamoglu

[xix]- Liu

[xx]- Pringshem

[xxi]- Halsey

[xxii]- Chu and Webb

(1)               Meireles L.C., Catarina A., Guedes AC., Malcata FX. Lipid class composition of the microalgae Pavlova lutheri: Eicosapentaenoic and Docosahexaenoic acids. Agriculture Food Chemistry 2003; 51 (18): 2237-41.

(2)               Coelho A.A.D.C., Barros C.U.M., Bezerra J.H., Sillva J.W.A.D., Moreira R.L., Farias W.R.L. Growth of the microalgae Tetraselmis tetrathele and nitrate depletion in culture medium guillard f/2 and Conway. Acta Science and Biochemistry Science 2013; 35 (2): 163- 8.

(3)               Durmaz Y., Monteiro M., Bandarra N., Gökpinar S., Işik O. The effect of low temperature on fatty acid and tocopherols of the red microalgae, Porphyridium cruentum. Applied Phycology 2005; 19 (3): 223- 7.

(4)               Makareviciene V., Andruleviciute V., Kaspereviciene J. Cultivation of microalgae Chlorella sp. and Scenedesmus sp. as a potential biofuel feedstock. Environmental Reasearch Enginering Managment 2011; 57 (3) : 21- 7.

(5)               Marchetti J., Bougaran G., Jauffrais T., Lefebvre S., Rouxel C., Jean BS., et al. Effects of blue light on the biochemical composition and photosynthetic activity of Isochrysis sp. Applied Phycology 2013; 25 (1): 106- 5.

(6)               Borowitzka MA. Microalgae for aquaculture: opportunities and constraints. Applied Phycology 1997; 9 (5): 393- 401.

(7)               Imamogul E., Sukan F.V., Dalay M.C. Effect of different culture media and light intensities on growth of Haematococcus pluvialis. Natural Enginrring Science 2007; 3 (1): 05- 09.

(8)               Fabregas J., Domingue A., Regueiro M., Maseda A., Otero A. Optimazation of culture medium for the continious cultivation of the microalgae Haematococcus pluvialis. Journal of Microbiology and Biotechnology 2000; 53 (5): 530- 5.

(9)               Sanchez S., Martinez E., Espinola F. Biomass production and biochemical variability of the marine microalgae Isochrysis galbana in relation to culture medium. Biochemistry Enginering 2000; 6 (1): 13- 18.

(10)           Goksan TAkI., Kilic C. Growth characteristic of the Alga Haematococcus pluvialis flotow as Affected by nitrogen source, vitamin, light and aeration. Fish Aquatic Science 2011; 11 (3): 377- 83.

(11)           Lorentz R.T., Cysewski G.R. Commercial potential for Haematococcus microalgae as a natural source of astaxanthin. Trends Biotechnology 2000; 18 (4): 160- 7.

(12)           Hegewald E. Taxonomy and phylogeny of Scenedesmaceae. Algae 1997; 12 (3): 235- 46.

(13)           Farsani M.N., Meshkiny S., Manaffar R., Asal Pishe Z.  Response of growth, protein and fatty acid content of Desmodesmus cuneatus to the repletion and depletion of nitrogen. Biological Journal of Microorganism 2015; 3 (12): 59- 68.

(14)           Martinez M.R., Chakroff C.L., Pantastico J.F. Direct phytoplankton counting techniques using the haemacytometer. Agriculture 1975; 55 (4): 43- 50.

(15)           Guillard RD. In: Stein, editor. Handbook of phycological methods. London: Cambridge University Press; 1973; 289- 312.

(16)           Omori M., Ikeda T. Methods in marine zooplankton ecology. New York: John Wiley and Sonsin- inc; 1984.

(17)           Nichols H.W. Growth media-freshwater. In: Stein JR., editor. Handbook of phycological methods. Culture methods and measurements .London: Cambridge University Press; 1973: 7- 24.

(18)           Hata N., Ogbonna J., Hasegawa Y., Taroda H., Tanaka H. Production of astaxanthin by Haematoc occus pluvialis in a sequential heterotrophic photoautotrophic culture. Applied Phycology 2001; 13 (5): 395- 402.

(19)           Starr R.C., Zeikus J.A. The culture collection of algae at the University of Texas at Austin. Applied Phycology 1993; 29 (2): 98- 106.

(20)           Lepage G., Roy C. Improved recovery of fatty acid through direct transeterification without - prior extraction or purification. Lipid Research 1984; 25 (12): 1391- 6.

(21)           Meijer E., Wijffels R.H. Development of a fast, reproducible and effective method for the extraction and quantification of proteins of microalgae. Biotechnology Techniques 1998; 12 (5): 353- 8.

(22)           Bradford A. Rapid and sensitive method for the quantitaton of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Annual Biochemistry 1976; 722 (4): 248- 54.

(23)           Li M., Gong R., Rao X., Liu Z., Wang X. Effects of nitrate concentration on growth and fatty acid composition of the marine microalgae Pavolva viridis (Prymnesiophyceae). Annual Microbiology 2005; 55 (1): 51- 5

(24)           Domìnguez- Bocanegra A.R., Legarreta I., Jeronimo F., campocosio A. Infuence of enviromental and nutritional factors in the production of astaxanthin from Haematococcus pluvialis. Bioresource Technology 2004; 92 (2): 209- 14.

(25)           Liu Z.W., Wang G.E., Zhou BC. Effect of iron on growth and lipid accumulation in Chlorella vulgaris. Bioresource Technology 2008; 99 (11): 4717- 22.

(26)           Pringsheim E.G. Nutritional requirements ofHaematococcus pluvialis and related species. and nitrogen starvation. Applied Phycology 1966; 2 (4): 1- 7.

(27)           Ördög V., Wendy A., Bálint P., Staden JV., Lovász C. Changes in lipid, protein and pigment concentrations in nitrogen-stressed Chlorella minutissima cultures. Applied Phycology 2012; 24 (4): 907- 14.

(28)           Pratoomyot J., Srivilas P., Noiraksar T. Fatty acids composition of 10 microalgal species. The Songklanakarin. Science Technology 2005; 27 (6):1179- 87.

(29)           Solovchenko A.E., Khozin-Goldberg I., Didi-cohen S., Cohen Z., Merzlyak MN. Effects of light intensity and nitrogen starvation on growth, total fatty acids and arachidonic acid in the green microalga Parietochloris incisa. Applied Phycology 2008; 20 (3): 245- 51.

(30)           Renaud S.M., Parry D.L., Luongvan T., Kuo C., Padovan A., Sammy N. Effect of light intensity on the proximate biochemical and fatty acid composition of Isochrysis sp. and Nannochloropsis oculata for use in tropical aquaculture. Applied Phycology 1991; 3 (1): 43- 53.

(31)           Halsey K.H., Milligan A.J., Behrenfeld M.J. Physiological optimization underlies growth rate- independent chlorophyll specific gross and net primary production. Photosynthesis Research 2010; 103 (2): 125- 37.

(32)           Webb K.L., Chu F. L.E. Phytoplankton as a food source for bivalve larvae, In: Pruder GD., Langdon CJ., Conklin DE., editors. Proceedings of the 2nd International Conference on Aquaculture Nutrition. Louisiana State: University Baton Rouge; 1983: 272- 91.