"مقاله کوتاه" مطالعه‌ سرمی و مولکولی بروسلوز شتر در نجف آباد

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استاد میکروبیولوژی، دانشکده دامپزشکی و پژوهشکده‌ بیماری‎های مشترک انسان و دام، دانشگاه شهرکرد، ایران

2 دانشجوی دکتری دامپزشکی، پژوهشکده‌ بیماری‎های مشترک انسان و دام، دانشگاه شهرکرد، ایران

چکیده

مقدمه: بروسلوز ‌یکی از مهم‏ترین بیماری‌های زئونوز است که در کشورمان یافت می‏شود. شتر از جمله حیواناتی است که به فراوانی به ایران وارد می‏شود و هیچ برنامه نظارتی برای بیماری بروسلوز آن وجود ندارد. هدف از انجام این پژوهش، تعیین میزان آلودگی فعال و غیر فعال با استفاده از روش‎های جستجوی سرولورژی و ژنومی بروسلا در شتران کشتار شده در مرکز ایران در سال‏های 1391 تا 1392 است. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: از تعداد 150 نفر شتر که در کشتارگاه نجف آباد کشتار شده بودند نمونه خون تهیه و در ظرف یخ به آزمایشگاه منتقل شد. ابتدا نمونه‏ها به وسیله آزمایش‏های سرولوژی شامل: آزمون رزبنگال، رایت لوله ای و 2ME ارزیابی شدند. نمونه‌هایی که تیتر آنتی بادی ضد بروسلا را برابر یا بیشتر از1:80 در آزمون رایت و تیتر ‏برابر یا بیشتر از 1:40 را در آزمون 2-ME نشان دادند، مثبت تلقی شدند. سپس، اسید نوکلئیک نمونه‌ها استخراج و به وسیله واکنش زنجیره ای پلیمراز آزمون شد. ‏‏‏
نتایج: نتایج نشان داد میزان آلودگی در روش‎های سرولوژی رزبنگال، رایت و 2-ME، به ترتیب 12، 8 و 6 درصد بود. اگر چه 3/1 درصد نمونه‌ها در آزمون PCR مثبت بودند. ‏‏‏
بحث و نتیجه‏ گیری: با توجه به تیتر 2ME، نتایج مطالعه سرولوژی گویای مزمن بودن عفونت در این حیوانات است. در این مطالعه قطه‏ای از ژن pb26 ردیابی شد که در بیشتر گونه‌ها مشترک است. پژوهش حاضر نشان داد که شتر بالقوه می‏تواند حامل باکتری باشد و از این رو ورود شتر به کشور، یکی از راه‏های ‏گسترش ‏باکتری به بخش‌های مرکزی ایران است. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

“Short article” Serological and molecular survey on camel brucellosis in Najaf Abad

نویسندگان [English]

  • Mohamadreza Mahzounieh 1
  • Mahdi Salimi 2
1 Associate Professor of Microbiology, Member of Research Institute of Zoonotic Diseases, University of Shahrekord, Iran
2 D.V.M. Student, Member of Research Institute of Zoonotic Diseases, University of Shahrekord, Iran
چکیده [English]

Introduction:Brucellosis which is an important zoonotic disease, exists in our country. Camel is an animal that is frequently imported to Iran and doesn't have any inspection for its brucellosis. The objective of this study was determination of active and passive infection by serologic and genomic detection of brucellosis in one-humped camel that was slaughtered in central part of Iran during 2012- 2013.
Materials and methods: For this purpose, 150 blood samples were collected from camels that were slaughtered in Najaf-Abad abattoir and they transported to laboratory in cool box. Initially, Samples were tested by serological methods include: Rose Bengal plat test, tube agglutination test and 2-mercaptoethanol test. Samples which showed anti-brucella antibodies titer equal or more than 1/80 in Wright test and equal or more than 1/40 in 2-ME test were considered as positive. Nucleic acid of samples were extracted and tested by polymerase chain reaction.
Results: Results showed that the infection rates were12, 8 and 6 % in RBPT, tube agglutination and 2-ME tests respectively. However 1.3 % of samples were positive in PCR test.
Discussion and conclusion: According to 2ME titers, results of serological tests indicated that animals were chronically infected. In present study sequence of pb26 gene was detected, that is common in most brucella species. Present study shows that camel can be a potential carrier; therefore importing camel to the country is a way of bacterial spread to central part of Iran.

کلیدواژه‌ها [English]

  • PCR
  • Serology
  • Brucella
  • Camel
  • Iran

مقدمه

‏بیماری بروسلوز از جمله بیماری‎های انتروپوزئونوز [i] است که به ‎وسیله‎ باکتری میله‌ای گرم منفی و درون سلولی اختیاری از جنس بروسلا به وجود می‌آید. این بیماری در حیوانات باعث کاهش تولید شیر، افزایش زمان بین دو زایش، و تداخل در برنامه‎ تولید مثل می‌شود و یکی از مسأله‏سازترین مشکلات بهداشتی جهان، به ویژه در مناطقی از جمله ایران، ترکیه، شبه جزیره ‏عربستان و حتی قسمتی از آمریکای مرکزی و جنوبی است‏ (1).

این باکتری می‌تواند از راه‎های مختلفی همچون تماس مستقیم با ترشحات تناسلی (به ویژه هنگام سقط)، خون، بافت و شیر منتقل شود. همچنین، احتمال انتقال بیماری از راه گوارشی (مصرف مواد لبنی آلوده)، تنفسی و گاهی از راه عمودی وجود دارد (2).

پس از ورود باکتری و تهاجم اولیه، جرم در عقده‎های لنفاوی ناحیه جایگزین شده و از طریق لنف و خون گسترش می‌یابد و به اندام‎های دیگر از جمله کبد، طحال، مغز استخوان و سایر قسمت ها‎ی سیستم رتیکولواندوتلیال انتقال می‌یابد. باکتریمی موقت موجب انتشار و موضعی شدن باکتری در اندام‏ها و غدد ضمیمه‎ تناسلی حیوانات بالغ می‌شود (3).

سرم حیوان حساس حاوی گلوبولین است که از رشد سویه‎های خشن یا غیر حاد ممانعت می‌کند ولی سویه‎های حاد به خوبی رشد می‌کنند. دام مقاوم دارای گلوبولین در سرم است بنابراین، فرم صاف به ‎سرعت تبدیل به فرم خشن می‌شود (4).

در حیوانات در مناطق معتدل بروسلوز حاد بیشتر در فصل‏های بهار و تابستان رخ می‌دهد، زمانی که بیش‏ترین موارد سقط و ‎زایمان اتفاق می‌افتد. علت آن می‌تواند به برخورد بیشتر حیوانات با ترشحات تناسلی و شیر مربوط باشد (5).

بروسلوز شتر برای نخستین بار در سال 1931 توسط سولونی‌تسین [ii] ‏گزارش شد (6). اگر چه علایم کمتری نسبت به گاو نشان می‌دهد. آلودگی تجربی شترهای یک کوهانه غیر آبستن با سوش‏های ‏فیلدی بروسلا ابورتوس، علایم خفیف و گذرای کاهش اشتها، لنگش خفیف و ترشح دوطرفه اشک را در پی داشت. اورکیت، التهاب اپیدیدیم، التهاب جفت، جفت ماندگی، عفونت ادرای، مرگ جنین و مومیایی شدن، به تأخیر افتادن بلوغ و ناباروری، ارتریت، هیگروما و سقط نیز از علایم قابل مشاهده در موارد بروسلوز شتران است (7).

بر اساس آمار منتشر شده توسط سازمان خوار و با جهانی کمابیش 24 میلیون نفر شتر در جهان وجود دارد که از این میزان 152 هزار نفر در ایران هستند. بیش‏ترین جمعیت شتر در ایران به ترتیب مربوط به استان‎های سیستان و بلوچستان، خراسان، کرمان، یزد و هرمزگان است. شتر در ایران بیشتر به منظور تولید گوشت و در مرتبه‎ بعد برای تولید شیر، پشم و مو نگهداری می‌شود، به ‌نحوی که در سال 1382 در استان سمنان 6344 کیلوگرم پشم و مو از این حیوان تولید شده است (5).

از آنجا که شتر رابطه ‏نزدیکی با اجتماع انسانی به ویژه در کشور‎های جهان سوم دارد، می‌تواند بسیاری از عومل پاتوژن را به انسان منتقل کند. شتر به فراوانی از مرز‎های شرقی به کشورمان وارد می‌شود و به نقاط مختلف کشور برده می‌شود، بنابراین، احتمال گسترش بیماری از این راه وجود دارد. در مطالعات منتشر شده، وجود پاتوژن‎های ویروسی، باکتریایی و انگلی مشترک در شتر اثبات شده است (8). از آنجا که از روش‎های مولکولی برای شناسایی این باکتری در شتر در منطقه‎ مورد مطالعه استفاده نشده بود، نگارندگان لازم دیدند طی یک مطالعه ‏مقطعی به جستجوی ژنومی این باکتری در خون شتر بپردازند.

 

‏‏. مواد و روش‏ها

نمونه:به منظور ردیابی گونه‎های باکتری بروسلا در خون شتر در سال 1391 و 1392 از تعداد150 نفر شتر کشتار شده در کشتارگاه نجف آباد خون‏گیری انجام شد. به منظور جلوگیری از انعقاد خون به نمونه‌ها، هپارین اضافه و در کنار یخ به آزمایشگاه پژوهشکده ‏بیماری‎های مشترک انسان و دام دانشگاه شهرکرد منتقل شد. شایان ذکر است که بیشتر شتران یاد شده، وارداتی بودند.

آزمون‏های سرولوژی

آزمون‏ رزبنگال: به منظور ردیابی آنتی بادی‎های ضد گونه‌ها بروسلا از نمونه‌ها، سرم تهیه شد و به وسیله‎ آزمون‏ رزبنگال آزمون شد: 30 میکرولیتر از سرم با 30 میکرولیتر آنتی ژن رزبنگال تهیه شده از مؤسسه‎ واکسن و سرم سازی رازی روی لام مجاور و گسترده شد. پس از 3 دقیقه نتایج زیر نور خوانده شد و موارد ++ به‎عنوان مثبت در نظر گرفته شد.

آزمون‏ رایت لوله‏ای: ابتدا 2/0 میلی‏‏لیتر از سرم با 8/0میلی لیتر آب مقطر فنوله مخلوط شد و سپس از لوله‎های اول 5/0 میلی‏‏لیتر به لوله ها‎ی دوم حاوی 5/0 میلی‏‏لیترآب مقطر فنوله برده شد. سپس، 5/0 میلی‏‏لیتر آنتی ژن تهیه شده از شرکت بهینه پرور پارسیان (سویه‎ بروسلا ابورتوس ویبریج [iii] S99) اضافه شد. پس ازگرم‎خانه‏گذاری موارد تیتر بیشتر از 1:80 برابر با 120 واحد بین المللی به عنوان مثبت در نظر گرفته شد.

آزمون‏ 2ME: ابتدا 2/0 میلی‏‏لیتر از سرم با 8/0 میلی‏‏لیتر بافر 2- مرکاپتو اتانول مخلوط و به مدت 60 دقیقه در گرم‏خانه گذاشته و به روش آزمایش رایت عمل شد. تیتر‎های بیشتر از 40:1 برابر با 60 واحد بین‏المللی در میلی‏‏لیتر مثبت تلقی شد.

استخراج DNA: ‏به منظور استخراج اسیدنوکلئیک باکتری گرم منفی از خون کامل، کیت اختصاصی شرکت سیناکلون بر اساس دستورالعمل سازنده استفاده شد. به این منظور نمونه‌ها در دمای اتاق مدتی نگه داشته و مراحل استخراج به ترتیب زیر انجام شد:100 میکرولیتر نمونه با 700 میکرولیتر از محلول لیزکننده مخلوط و به مدت 15 تا 20 ثانیه ورتکس شد.500 میکرولیتر از محلول پرسیپیتاسیون [iv] اضافه و به مدت 5 ثانیه ورتکس و در 12000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شد. محلول رویی به آهستگی خارج شد. یک میلی‏‏لیتر از محلول شستشو به پلیت اضافه و 3 تا 5 ثانیه ورتکس و به مدت 5 دقیقه در 12000 دور سانتریفوژ شد. این عمل دوبار تکرار شد. پس از خارج کردن محلول بافر رویی، درب میکروتیوب‌ها باز و رسوب در 65 درجه سانتی‌گراد خشک شد. در ادامه پلیت در 50 میکرولیتر از بافرسولونت [v] معلق و به آرامی به‎هم زده شد و 5 دقیقه در 65 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.

واکنش تکثیری: تکثیر ژنوم باکتری حاصل از مرحله ‏قبل در حجم 12 میکرولیتر از مواد شامل: 6 میکرولیتر مستر رد [vi]، 1 میکرولیتر از هر پرایمر [vii]، 4 میکرولیتر آب مقطر و 1 میکرولیتر از اسیدنوکلئیک باکتری انجام شد. از واکسن‎های Rev1/S19 به عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد. برنامه ‏دمایی در این آزمایش به ترتیب 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه (یک بار قبل شروع چرخه‎های دمایی) و 40 چرخه شامل: 95 درجه سانتی‌گراد به مدت45 ثانیه، ‏55 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و در نهایت، به مدت 7 دقیقه در 72 درجه سانتی‌گراد نگه داری شد. این سیکل دمایی در دستگاه ترموسایکلر [viii] انجام شد. در پژوهش حاضر قطه‌ای از ژن pb26 ردیابی شد که بیشتر گونه‌های بروسلا از جمله دو گونه ملی تنسیس و ابورتوس که در ایران اندمیک هستند، مشترک است.

 

.‏نتایج

12 درصد موارد آزمایش شده در آزمون‏ رزبنگال نتیجه مثبت نشان دادند. با این‎حال، ‏‏3/1درصد موارد نمونه‎های خون شتران یک کوهانه ‏کشتار شده در کشتارگاه نجف آباد واکنش مثبت PCR نشان دادند و حاوی ژنوم گونه‎های باکتری بروسلا بودند (شکل 1). همان‏طور که در تصویر مشاهده می‌شود از واکسن‎های Rev1/S19 به عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد. اطلاعات بیشتر در جدول 1 آورده شده است.

 

جدول 1- تعداد و درصد موارد مثبت

آزمون

تعداد

درصد

رز بنگال

18

12

رایت

12

8

2-ME

9

6

PCR

2

3/1

 

جدول 2- پرایمر‏های مورد استفاده

Ref

Amplicon size (bp)

Sequence 3' 5'

Primers

8

450

GCT TCG CATTTTCAC TGT AGC

BMEI0997r

GCGCATTCTTCGGTT TG AA

BMEI0535f

 

 

شکل 1- رنگ آمیزی محصولات PCR، ‏‏

 S باند 450 جفت بازی ازنمونه‌های مورد آزمون، P کنترل مثبت، ‏‏N ‏کنترل منفی، مارکر 100 جفت بازی

 

. بحث و نتیجه ‏‏گیری

بروسلوز از جمله بیماری‎های مهم و قابل گزارش است‏ که تشخیص آن در انسان با توجه به علایم کلینیکی قابل اعتماد نیست و می‌تواند با بیماری‎های همچون مالاریا، تیفوئید و لپتوسپیروز اشتباه شود (9). در حیوانات نیز علایم بیماری اختصاصی [ix] نیست و بیشتر به شکل مزمن است‏ و پس از یک تب خفیف باکتری در رحم، بیضه و غدد پستانی جایگزین شده و به کرات دفع می‌شود (10). از این رو کنترل بیماری در جوامع انسانی ارتباط مستقیم با کنترل و ریشه‎کنی بیماری در حیوانات دارد.

برای تشخیص بیماری در دام و انسان نیاز به انجام آزمایش‏های پاراکلینیکی از جمله آزمایش‏های آگلوتینایسون [x] مانند رز بنگال [xi] و رایت، ثبوت عناصر مکمل، الایزا، آزمایش کومبس، کشت باکتری و جستجوی ژنومی باکتری است. در حیوانات بر خلاف موارد انسانی وجود IgM در سرم حیوان مشکوک می‌تواند بیانگر تیتر ناشی از واکسیناسیون باشد. ولی در مورد شتر چون هیچ‌گونه واکسیناسیونی علیه بیماری بروسلوز انجام نمی شود بنابراین، وجود IgM را فرم حاد بیماری در نظر گرفتیم.

از آنجا که 2 مرکاپتواتانول قادر به شکستن پیوندهای دی‌سولفیدی بین پنتامر IgM است‏ و بنابراین، حضور این نوع آنتی بادی در سرم شتران مورد مطالعه (کاهش تیتر از 8 درصد به 6 درصد به ترتیب درمورد آزمایشات رایت و2ME) بیان‌گر موارد حاد بیماری است، بنابراین اثبات ژنوم باکتری در 3/1 درصد موارد با نتایج آزمون‏‌های سرولوژی هم‌خوانی داشته و به نحوی موید آن ‌است. همچنین، حضور IgG در سرم حیوانات مورد مطالعه بیانگر برخورد قبلی با بیماری و مزمن بودن بیماری در بیشتر حیوانات است‏، بنابراین منفی شدن نتایج PCR در موارد تیتر ‏آزمایش رایت توجیه‏پذیر است. این مطالعه نشان داد روش‏های ‏مولکولی در ارزیابی بیماری بروسلوز شتر از دقت مناسب برخوردار است که با مطالعات قبلی هم‌خوانی دارد (11).

در این مطالعه از پرایمرهایی با تولی یاد شده در جدول 2 استفاده شد. جفت توالی یاد شده قطعه‏ای 450 جفت بازی را کد می‏کند که بر گرفته از ژن pb26است و محصول رونویسی آن آنتی‌ژن‌های سرکوب‌گر ایمنی هستند. توالی استفاده شده از Bruc-lader انتخاب شد که حاصل مطالعه ژنتیکی 625 سوش بروسلا از مناطق مختلف و حیوانات متفاوت، شامل پستانداران دریایی و انسان است. توالی یاد شده توانایی شناسی تمام گونه‌های باکتری بروسلا به جز گونه‌های بروسلا ستی و بروسلا پنی‌پدیالیس را داراست‏ (12).

جستجوی آنتی‎بادی‏ها‎ی ضد بروسلا در خون شتر یکی از آسان‌ترین روش‎های غربال‏گری بیماری است و به طور معمول انجام می‎شود (13 و 14). بنابراین، در پژوهش حاضر از روش یاد شده استفاده شد ولی از طرفی احتمال بروز واکنش‎های سرمی متقاطع بین گونه‎های بروسلا و گونه‎ یرسینیا انترو کولیتیکا سروتیپ O9 وجود دارد. بنابراین، در پژوهش حاضر از هر دو روش سرولوژی و مولکولی استفاده شد.

 برخی از پژوهشگران از جمله گویدا [xii] و همکاران معتقدند آزمون‏‎های سرولورژی تشخیص بروسلوز شتر به علت اینکه به طور مستقیم از آنتی‏ژن‎های تولید شده از گاو استفاده می‌کنند و هیچ گونه معتبر‏سازی [xiii] برای شتر انجام نمی‏شود [xiv]، نمی‏توانند دقت لازم را داشته باشند. همچنین بیان شده است که شتر نسبت به گاو میزان کمتری آنتی‏بادی ضد بروسلا تولید می‌کند (7).

شتر‎های سروپوزیتیو در کشور‎های پاکستان، عراق، عمان، کویت و عربستان سعودی و ایران مشاهده شده‎اند (15 و 16). پورجعفر [xv] و همکاران در سال 1385 میزان آلودگی را براساس آزمایش‏های رزبنگال، رایت و 2-ME در بین شتران نجف‌آباد 86/2، 65/1 درصد گزارش کردند. شایان ذکر است که در مطالعه یاد شده تیتر برابر در آزمایش‏های رایت و 2-ME بیان‌گر مزمن بودن بیماری در حیوانات مورد مطالعه بوده است (17). ابراهیمی [xvi] و همکاران این میزان را برای شتران منطقه یاد شده در سال 2006 به ترتیب 3/1، 9/3 و 6/2 درصد بیان کردند (18). اگر چه این مطالعه افزایش میزان آلودگی در منطقه و ‏موارد حاد بیماری را نشان می‌دهد.

خواجه[xvii] و همکاران در سال 1997 نشان دادند که شتران بوشهر به میزان 93/1 درصد حاوی آنتی‌بادی‌های ضد بروسلا هستند و موفق شدند بروسلا ‌ملی‌تنسیس بایوتیپ 1 را از غدد لنفاوی جدا کنند. آن‏ها بیان داشتند که شتران ‏ماده بوده و در رنج سنی 5 تا 7 سال و سابقه‌ای از سقط را دارا بودند (19).

بیشر مطالعات گونه‎های ملی‎تنسیس و ابورتوس را عامل بروسلوز شتر می‌دانند (1). اگرچه پژوهش ذوقی و عبادی [xviii] نیز نشان داد که بروسلا ملیتنسیس بایوتیپ 1 عامل بروسلوز شتر در ایران بوده است (20). اگر چه المجالی [xix] و همکاران نشان دادند که بروسلا ملی‌تنسیس بایوتیپ 3 عامل سقط در گله‌های شتر در اردن بوده‌ است (21).

بررسی‎های اپیدمیولوژیک نشان می‌دهد که بیشتر موارد به ‌علت مشکلات پرورش، شتر را همراه با گوسفند و بز نگه‌داری می‌کنند و نگهداری شتر با گاو کمتر انجام می‌شود و بیان می‌شود که آلودگی آب و غذای شتر با ترشحات گوسفند و بز از علل آلودگی بیشتر شتر با گونه‎ بروسلا ملی‎تنسیس است (21). در منطقه مورد مطالعه شتر به همراه گوسفند یا بز پرورش داده نمی‌شود و می‌توان علل وجود عفونت در میان شتران را به شتر راهنما نسبت داد. زیرا شتر یاد شده به منظور راهنما برای شتران وحشی هر روز به کشتارگاه آورده می‌شود و ساعاتی در محل اجتماع حیوانات می‌ماند. بنابراین، ممکن است آلودگی را به گله منتقل کند.

انواع گونه‎های شتر به بیماری بروسلوز آلوده می‌شوند به ویژه زمانی که در ارتباط با نشخوارکنندگان کوچک و بزرگ قرار دارند. رفیعی پور و همکاران نشان دادند که میزان آلودگی شتران در شهر بافت بر اساس آزمون‏ رزبنگال و 2-ME به ترتیب 5/10 و 92/7 درصد بوده است (16).

بروسلوز دامی برای نخستین بار در سال 1323 در ایران تشخیص داده شد و از سال 1328 مبارزه با این بیماری با مایه‌کوبی گوساله‎های ماده با واکسن S19، آزمایش سرولورژی و کشتار دام‎های آلوده شروع شد (22). ولی متأسفانه پس از 64 سال هنوز موفق به ریشه‏کنی این بیماری نشده‎ایم واز جمله علت‏های آن می‌توان به ورود عامل بیماری از طریق حیوانات آلوده به کشور اشاره کرد. می‌توان گفت که واردات شتر از جمله راه‌های بالقوه انتشار باکتری به ایران است که باید در برنامه‎های کنترل وریشه‏کنی مدنظر قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

نگارندگان مقاله از جناب آقای دکتر علی پزشکی به خاطر در اختیار قرار دادن تجهیزات آزمایشگاهی و سرکار خانم مرضیه صفر پور به خاطر الطاف بی پایانشان تشکر و قدردانی می‏کنند.



[i]- Anthropozoonoses

[ii]- Solonitsuin

[iii]- Weybridge

[iv]- Precipitation

[v] -solvent

[vi]- Cat No., 180301, Amplicon, Denmark

[vii] -TAG, Copenhagen

[viii]- Applied Biosystem, USA

[ix]- pathognomic

[x]- Agglutination

[xi]- Rose Bengal

[xii]- Gwida

[xiii]- validation

[xiv]- Al-Majali

[xv]- PourJafar

[xvi]- Ebrahimi

[xvii]- Khadjeh

[xviii]- Zowghi & Ebadi

[xix]- Al-Majali

(1)               Young E.J., Corbel M.J. Brucellosis: Clinical and laboratory aspects. Zoghi E. (Translator). Tehran, Iran: Ministry of Health and Medical Education; 2004.

(2)               Sofian M., Zolfaghari F., Sarmadian H., Ramezani A., Farazi A.A. Comparison of the Clinical Manifestation and Epidemiologic and Laboratory Data in Brucella and Non-Brucella Bacterial Epididymorchitis. Scientific Journal of Zanjan University of Medical Sciences 2012; 20 (82): 101- 07.

(3)               Quinn P.J., Markey B.K., Carter M.E., Donnelly W.J.C., Leonard F.C. Veterinary Microbiology and Microbial Disease. Zahraeisalehi T., Shayegh J (Persian translator).1st. ed. Tehran: Tehran University of press; 2008: 302- 3.

(4)               Tabatabayi A.H., Firouzi R. Diseases of animal due to bacteria. 3rd ed. Tehran: University of Tehran press; 2010: 305- 7.

(5)               Ansari Renani H.R., Baghershah H.R., Moradi S. Effect of Age on Fiber Characteristics of one-humped Female Camels of Semnan Province. Iranian Journal of Animal Science Research 2011; 3 (2): 201- 3.

(6)               Solonitsuin MO. Brucellosis in camels. Veterinarya 1949; 26: 16- 21.

(7)               Gwida M., El-Gohary A., Melzer F., Khan I., Rösler U., Neubauer H. Brucellosis in camels. Research in Veterinary Science 2012; 92 (3): 351- 5.

(8)               Mehrabiyan S., Mahzounieh M., Rabbani Khorasganiosravi M., Tahmasby H., Amiri Dehcheshmeh J., Ghorbani A., et al. Molecular detection of Trypanosoma from one-humped camels slaughtered in Najafabad slaughterhouse. Biological Journal of Microorganism 2014; 3 (10): 45- 50.

(9)               Rahmani M., Motaharinia Y., Rezai M.A., Asadzadehhoseini N., Mohsenpour B., et al. Isolation and determination species from brucellosis patient blood sample by biochemical, PCR and serological method in Kurdistan province. Scientific Journal of Kurdistan University of Medical Sciencs 2011; 16: 1- 8.

(10)           Corbel M.J. Brucellosis in humans and animals. World Health Organization 2006: 10- 17.

(11)           Ghorbani A., Rabbani Khorasgani M., Zarkesh-Esfahani H., Sharifiyazdi H., Dehghan Kashani A., Emami H., et al. Comparison of serology, culture and PCR for detection of brucellosis in camels in Iran. Comparative Clinical Pathology 2012; 166: 1- 12.

(12)           Lopez-Goni D., García-Yoldi C.M., Marín M.J., De Miguel P.M., Munoz J.M. Evaluation of a Multiplex PCR Assay (Bruce-ladder) for Molecular Typing of All Brucella Species, Including the Vaccine Strains. Journal of Clinical Microbiology 2008; 46 (10): 3484- 7.

(13)           Gwida M., El-Gohary A., Melzer F., Tomaso H., Rösler U., Wernery U., et al. Comparison of diagnostic tests for the detection of Brucella spp in camel sera. BMC Research Notes 2011; 4: 525- 32.

(14)           Kudi A., Kalla D., Kudi M., Kapio G. Brucellosis in camels. Journal of Arid Environments 1997; 37: 413- 17.

(15)           Abbas B., Agab H. A review of camel brucellosis. Preventive Veterinary Medicine 2002; 55 (1): 47- 56.

(16)           Rafieipour A., Ziaei N. Brucellosis of camels in Iran. Veterinary Science Development 2011; 1 (1): 58- 9.

(17)           PourJafar M., Mahzounieh M., Momtaz H. Serological survey on camel brucellosis in slaughtered camels in Najaf Abad abattoir. Pajohesh va Sazandegi 2007; 71: 90- 1.

(18)           Ebrahimi A., Hosseinpour F., Montazeri B. Seroprevalence of brucellosis in dromedaries in Iran. Journal of Camel Practice and Research 2007; 14 (1): 43- 44.

(19)           Khadjeh G., Zowghi E., Zarif-fard M.R. Incidence of Brucellosis in One-Humped Camels of Boushehr, Iran. Archives of Razi Institute Journal 1999; 50: 93- 86.

(20)           Zowghi E., Ebadi A. Brucellosis in camels in Iran. Revue scientifique et technique (International Office of Epizootics) 1988; 7 (2): 383- 6.

(21)           Al-Majali A.M, Al-Qudah K.M., Al-Tarazi Y.H., Al-Rawashdeh O.F. Risk factors associated with camel brucellosis in Jordan. Tropical Animal Health and Production 2008; 40 (3): 193- 200.

(22)           Mostafavi E., A-samand M. Process of brucellosis (mult fever) in Iran during 1993-2006. Iranian Journal of Epidemiology 2012; 8 (1): 94- 101.