بررسی فعالیت ضدمیکروبی عصاره آبی و متانولی برخی از گونه‏ های ‏سیانوباکتری‏ در شرایط آزمایشگاهی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه ایلام، ایران

2 دانشیار زیست شناسی، میکروبیولوژی، دانشگاه مازندران، بابلسر، ایران

3 دانشیار زیست شناسی، دانشگاه شهید بهشتی، تهران، ایران

چکیده

مقدمه: سیانوباکتری‏ها به عنوان منابع جدید و غنی از ترکیبات فعال زیستی شناسایی شده‏اند. توجه به خواص سیانوباکتری‏ها به عنوان منبع سرشاری از متابولیت‏های ثانویه در‏گذشته بسیار کم بوده است اما امروزه نشان داده شده که این میکروارگانیسم‏ها دارای کاربردهای فراوانی در زمینه پزشکی و داروسازی هستند‏‏. ‏‏‏
مواد و روش ‏‏ها: در این مطالعه تجربی، سویه‏های سیانوباکتری Fischerella ambigua ISC67،Synechococcus elangatus ISC106و Schizothrix vaginata ISC108از کلکسیون ریز جلبک‏ها در پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی تهیه شد‏. عصاره‏گیری با آغشته کردن بیومس سیانوباکتری با حلال و سپس، صاف و خشک کردن مخلوط حاصل انجام شد. به منظور بررسی اثر ضدمیکروبی از روش انتشار در دیسک و برای تعیین حداقل غلظت مهارکننده از روش براث میکرودیلوشناستفاده شد. ‏‏‏
نتایج: نتایج نشان داد که عصاره متانولی گونه‏ Synechococcus elangatusبر روی باکتری‏ها اثر در خور توجهی نداشت، اما عصاره متانولی گونهFischerella ambiguaفعالیت ضدباکتریایی نشان داد. عصاره آبی Fischerella ambiguaاثر چشمگیری بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت داشت، به طوری که بیش‏ترین تأثیر را بر روی باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) با قطر هاله 33/33 میلی‏متر داشت. از بین عصاره‏های مورد آزمایش تنها عصاره متانولی Fischerella ambiguaبرروی هر‏چهارگونه قارچ فوزاریوم سولانی، راینکوسپوریوم سکالیس، بوتریتیس سینره‏آ و فوزاریوم اوکسیسپوروم اثر مهاری داشت. تأثیر عصاره‏آبی ‏Fischerella ambiguaبر ‏روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC1114) از تمام آنتی‏بیوتیک‏های مؤثر بر آن‏ها بیشتر بود. بیش‏ترین اثر ضدباکتریایی سیانوباکتری‏ها مربوط به عصاره آبی Synechococcus elangatusو بیش‏ترین اثر ضد قارچی مربوط به عصاره متانولی Fischerella ambiguaبود. ‏‏‏
بحث و نتیجه‏ گیری: از میان سه گونه سیانو باکتری مورد بررسی، دو گونه Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatus دارای فعالیت ضدمیکروبی بودند. بنابراین، می‏توانند یک کاندیدای خوب برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی ‏باشند و می‏توان از ترکیبات موجود در عصاره آن‏ها به عنوان دارو در کنترل و مهار بسیاری از بیماری‏ها استفاده کرد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

In Vitro Assessment of Antimicrobial Activity from Aqueous and Methanolic Extracts of Some Species of Cyanobacteria

نویسندگان [English]

  • Moein Safari 1
  • Salman Ahmady-Asbchin 2
  • Neda Soltani 3
1 M.Sc. of Microbiology, Ilam University, Iran
2 Associate Professor of Biology-Microbiology, University of Mazandaran, Babolsar, Iran
3 Associate Professor of Biology, Research Institute of applied science, ACECR, Shahid Beheshti University, Tehran, Iran
چکیده [English]

Introduction:Cyanobacteria have been identified as a new and rich source of bioactive compounds. Attention to the properties of cyanobacteria as a good source of secondary metabolites in the past was very low but today has been shown that these microorganisms have many applications in the medical field and pharmaceutical products.
Materials and methods: In this experimental study, the cyanobacteria of Synechococcus elangatus ISC 106, Fischerella ambigua ‎ ISC67 and Schizothrix vaginata ISC108‎were obtained from the algal culture collection of research institute of applied science, ACECR, Tehran, Iran. Extraction was performed by adding the solvent to cyanibacteria biomass and then filtering and drying the mixture. Disk diffusion method was used to study the effect of antimicrobial and broth microdilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration.
Results: The results showed that the methanol extract of Synechococcus elangatus had no significant effect on the bacteria, but the methanol extract of Fischerella ambigua showed antibacterial activity. Aqueous extract of Fischerella ambigua had significant effect on Gram-positive bacteria, so that maximum antibacterial activity was against Staphylococcus aureus (PTCC 1112) which the average zone diameter around it was 33.33 mm. Among tested extracts, only methanol extract of Fischerella ambigua ‎had inhibitory effects against four plant pathogenic fungi. The effect of aqueous extract Fischerella ambigua on Staphylococcus aureus (PTCC1112) and Staphylococcus epidermidis (PTCC1114) was more effective than all of the affecting antibiotics. The highest antibacterial activity of cyanobacteria was related to aqueous extract of Synechococcus elangatus and maximum effect of antifungal activity was related to methanol extract of Fischerella ambigua.
Discussion and conclusion: Among the three species of cyanobacteria, two species of cyanobacteria Fischerella ambigua, and Synechococcus elangatus had antimicrobial activity, thus it can be a good candidate for the extraction of antimicrobial compounds and many compounds found in these extracts can be used to monitor and inhibit many diseases.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Secondary metabolites
  • Antimicrobial
  • Cyanobacteria
  • Methanol extract
  • Broth microdilution

مقدمه.

سیانوباکتری‏ها[1] قدیمی‏ترین پروکاریوت‏های فتوسنتز‏کننده روی زمین هستند (1). این میکروارگانیسم‏ها به‏طور گسترده‏ در خاک‏های طبیعی، آب‏های شیرین و زیستگاه‏های دریایی توزیع شده‏اند و دارای تنوع ریخت شناسی قابل ملاحظه‏ای هستند (2). تاریخچه تکاملی طولانی این میکروارگانیسم‏ها به شکل در خور توجهی گواهی بر موفقیت سیانوباکتری‏ها برای زنده ماندن در زیستگاه‏های متعدد و قدرت تحمل اکولوژیکی بالای آنهاست (3). علاوه‏ بر این، سیانوباکتری‏ها با قدرت تحمل اکولوژیکی بالا با دما، نور، شوری، رطوبت و شرایط قلیایی توسعه یافته‏اند و دارای بسیاری از ویژگی‏ها و سازگاری‏ها هستند که توزیع گسترده و موفقیت آن‏ها در بقا را توضیح می‏دهد (4‎). اصطلاح "متابولیسم سیال یا لغزنده"، کوتاه ترین و در عین حال گویاترین توجیهی است که برای این گستردگی به کار می‏‏رود. نوعی انعطاف‏پذیری ‏متابولیک که شاید منحصر به فرد باشد و تنها در مورد زیستگاه‏ها ‏صدق نمی‏کند (5). هنوز ‏مکانیسم خوگیری و سازگاری‏های ‏خاص سیانوباکتری‏ها ‏به شرایط محیطی و سیالیت‏هایی ‏که برای مثال در تغییر آرایش سیستم‏های ‏فتوسنتزی و رنگیزه‏های ‏این موجودات در مواجهه با تغییرات سریع شرایط محیطی به وقوع می‏پیوندد، برای صاحبنظران روشن ‏نیست.‏ طبقه‏بندی ‏تاکسونومیک سیانوباکتری‏ها بسیار پیچیده است. سیانوباکتری‏ها در گذشته تنها بر‏اساس صفات ریخت‏شناسی‏ و بر طبق کدهای بین المللی‏ نام‏گذاری‏گیاهی[2] طبقه‏بندی می‏شدند. این طبقه‏بندی که تنها بر اساس ویژگی‏های ریخت‏شناسی است، با وجود این واقعیت که ریخت‏شناسی سیانوباکتری‏ها در مقایسه با بسیاری از میکروب‏های پروکاریوتی پیچیده است و صفات ریخت‏شناسی در پاسخ به شرایط زیست محیطی مختلف تغییر پذیرند، لزوما نمی‏تواند یک طبقه‏بندی ‏فیلوژنتیکی معتبر باشد (6). از سوی دیگر سیانوباکتری‏ها بر‏اساس کدهای بین‏المللی نام‏گذاری پروکاریوتی[3] نیز طبقه‏بندی ‏شده‏اند. امروزه این طبقه‏بندی ‏براساس روش‏های ‏مولکولی و ویژگی‏های‏ فنوتیپی، شموتیپی و ژنوتیپی یک کشت‏ خالص از سیانوباکتری‏هاست که به اصطلاح ‏روش‏پلی‏فازیک[4]‏ نامیده می‏شود (7). ترکیب طبقه‏بندی ریخت‏شناسی‏ گذشته و طبقه‏بندی بر ‏اساس روش‏های مولکولی به منظور دستیابی به کلیدهای شناسایی معتبر، یک چالش مهم برای زیست‏شناسان محسوب می‏شود، با ‏این ‏حال، کوشش برای متحد ساختن این دو سیستم طبقه‏بندی همچنان ادامه دارد. درحال حاضر سیستم نام‏گذاری باکتریولوژیکی سیانوباکتری‏ها به طور گسترده‏ای پذیرفته شده است. در ایران نیز پژوهش‏های فراوانی در زمینه شناسایی سیانوباکتری‏ها ‏بر اساس کلیدهای ریخت‏شناسی‏ و مولکولی انجام شده که از جمله مهم‏ترین آنها می‏توان به گزارش سلطانی[5] و همکاران در سال 1378 در منطقه فیروزکوه اشاره کرد. آن‏ها 20 گونه سیانوباکتری را در خاک‏های ‏منطقه فیروزکوه در شرق تهران شناسایی کردند (8). گزارش‏های ‏مربوط به سیانوباکتری‏های ‏ایران بیشتر مربوط به نمونه‏های ‏آبزی بوده است، برای مثال گونه‏های ‏کروکوکوس[6]، لینجبیا[7]، آنابنا[8]، سینکوکوس[9] و اوسیلاتوریا[10] که از دریاچه ارومیه جداسازی و شناسایی شده‏اند (9)، از سوی دیگر نمونه‏های ‏خاکزی که شناسایی شده‏اند بیشتر به خاک شالیزارها متعلق بوده‏اند مانند: گونه‏های ‏استیگونما[11]، آنابائنوپسیس[12]، نوستوک[13] و کالوتریکس[14] که در مزارع شمال کشور شناسایی شده‏اند (10).

تنوع بسیار زیاد در این گروه از میکروارگانیسم‏ها، جدا از تنوع ریخت‏شناسی‏ و دامنه وسیعی از زیستگاه‏ها، در میزان سنتز محصولات طبیعی توسط آن‏ها نیز منعکس شده است. سیانوباکتری‏ها برای تولید مجموعه متنوعی از متابولیت‏های ثانویه تکامل یافته‏اند که به بقای گونه‏ها ‏در این نیچ‏های اکولوژیکی گوناگون و بسیار رقابتی کمک کرده است (11).

امروزه ترکیبات‏طبیعی (متابولیت‏های ثانویه) منبع مهمی از داروهای جدید و ترکیبات دارویی مؤثر هستند (12). فرآورده‏های طبیعی نه تنها به عنوان دارو در مسیر درست خود به‏کار گرفته می‏شوند، بلکه ممکن است به عنوان مدل‏های ساختاری برای ایجاد آنالوگ‏های مصنوعی و نیز به عنوان مدل‏هایی در مطالعات ساختار فعالیت به‏کار روند (13). فرآورده‏های ‏طبیعی از طیف گسترده‏ای از گونه‏های متنوع جداسازی و برای فعالیت‏های مختلف زیستی آزمایش شده است. بیشتر این فرآورده‏های ‏طبیعی از منابعی همچون استرپتومیسس‏ها، باکتری‏ها، قارچ‏ها ‏و گیاهان مشتق شده‏اند. مشکل اصلی در تمرکز بر این منابع برای دستیابی به مولکول‏های فعال زیستی جدید، کشف مجدد محصولاتی است که قبلا از منابع دیگری شناخته شده‏اند. یک راه برای به حداقل رساندن این مشکل، توسعه روش‏های ‏زیستی شناسایی فرآورده‏های ‏طبیعی و بررسی قابلیت درمانی جدید آن‏هاست. رویکرد دیگر این است که به منابع جدید و مختلف از محصولات طبیعی توجه شود. در میان این میکروارگانیسم ها، سیانوباکتری‏ها نشان دهنده چنین منابعی هستند. مطالعات ریچار موور[15] در دانشگاه هاوایی نشان داد که سیانوباکتری‏ها می‏توانند منبع غنی از متابولیت‏های ثانویه باشند (14). متابولیت‏های سیانوباکتری‏ها طیف قابل توجه و باورنکردنی از فعالیت‏های زیستی را نشان می‏دهند. برای مثال فعالیت‏های ضد میکروبی، ضد سرطان، ضد ویروس، مهارکننده سیستم ایمنی، حشره‏کشی و ضد التهابی با مهار فعالیت پروتئیناز که از اهداف قابل توجه پژوهش‏های پزشکی هستند (15- 17). توجه به خواص سیانوباکتری‏ها به عنوان منبع سرشار از متابولیت‏های ثانویه، در گذشته بسیار کم بوده است اما امروزه نشان داده شده که این میکروارگانیسم‏ها دارای کاربردهای فراوانی در زمینه پزشکی، تولید سوخت زیستی، تولید متانول و همچنین، پاک‏سازی زیستی هستند و از نظر مصارف غذایی نیز کاربرد دارند (18). تنوع بسیار زیاد فعالیت‏های زیستی و شیمیایی متابولیت‏های ثانویه سیانوباکتری‏ها، این میکروارگانیسم‏ها را به عنوان یک منبع قابل توجه از داروهای جدید برای استفاده در مناطق درمانی گوناگون توصیه می‏کند. با وجود زیستگاه‏ها ‏و منابع فراوان سیانوباکتری‏ها در ایران در مقایسه با سایر کشورها، مطالعات اندکی در مورد خواص ضدمیکروبی عصاره سیانوباکتری‏ها انجام شده است. از جمله مهمترین پژوهش‏های انجام شده در این زمینه در ایران می‏توان به گزارش‏های زرینی [16] و همکاران در سال 1390 و قاسمی [17] و همکاران در سال 2003 اشاره کرد (10 و 19). با توجه به مقاومت روز افزون باکتری‏های بیماری‏زا به آنتی‏بیوتیک‏ها و گرایش عمومی به ترکیبات طبیعی، شناسایی سیانوباکتری‏های توانمند برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی و ‏بررسی اثرات ضد میکروبی اهمیت خاصی دارد. هدف اصلی این پژوهش، بررسی اثرات ضدمیکروبی برخی از گونه‏های سیانوباکتری‏ها علیه باکتری‏ها ‏و قارچ‏های ‏بیماری‏زا در شرایط آزمایشگاهی است.

‏‏مواد و روش‏ها.

کشت و نگهداری از نمونه‏ها: در این مطالعه تجربی، سویه‏های سیانوباکتری Fischerella ambigua ISC67، Synechococcus elangatus ISC106و Schizothrix vaginata ISC108از کلکسیون ریزجلبک‏ها در پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی، دانشگاه شهید بهشتی تهران تهیه شد‏. ابتدا برای اطمینان از خالص بودن نمونه‏ها ‏خالص‏سازی سیانوباکتری‏ها به روش پلیت آگار بر روی محیط کشت جامد BG11انجام شد (20). به این صورت که ابتدا محیط مایع BG11 تهیه شد. ترکیب محیط کشت BG11 مورد استفاده برای سیانوباکتری‏ها در هر لیتر 150 میلی‏گرم NaNO3‎، 75 میلی‏گرم MgSO4.7H2O، 36 میلی‏گرم CaCl2.2H2O، 6 میلی‏گرم Citric Acid، 6 میلی‏گرم Ferric ammonium citrate، 1 میلی‏گرم EDTA (TriplexIII)، 20 میلی‏گرم Na2CO3 و یک میلی‏لیتر محلول trace metal mix شامل 86/2 میلی‏گرم در لیتر H3Bo3، 81/1 میلی‏گرم در لیتر MnCl2.4H2O، 222/0 میلی‏گرم در لیتر ZnSO4.7H2O، 39/0 میلی‏گرم در لیتر Na2MoO4.2H2O، 079/0 میلی‏گرم در لیتر CuSO4.5H2O، 049/0 میلی‏گرم در لیتر Co(NO3).6H2O دارا می‏باشد (21). سپس برای تهیه‏ محیط‏کشت جامد، 15‏گرم آگار به محیط کشت مایع BG11 اضافه، 20 دقیقه در دمای 120 درجه‏ سانتی‏گراد اتوکلاو و پس از اندکی خنک شدن به ظروف پتری منتقل شد. پس از سرد شدن محیط کشت جامد، کلونی‏های سیانوباکتری‏ها توسط لوپ به شکل زیگزاگی روی آن کشت داده شد. این کار برای به دست آوردن کلونی‏های خالص سیانوباکتری‏ها چندین بار تکرار شد و هر بار کلونی‏هایی که باید دوباره کشت داده می‏شدند، توسط تهیه‏ی اسلاید و بررسی میکروسکوپی انتخاب شدند. بعد از اطمینان از خالص بودن کلونی‏های موجود در کشت جامد، کلونی‏ها به محیط کشت مایع BG11 منتقل و در اتاقک رشد تحت هوادهی و تابش نور مداوم و همچنین دمای 2±28 درجه سانتی‏گراد نگهداری شدند.

عصاره‏گیری از سیانوباکتری‏ها: عصاره‏گیری به روش وال[18] و همکاران انجام شد. برای این منظور 500 میلی‏لیتر از کشت مایع BG11 رشد‏یافته نمونه‏های سیانوباکتریایی 30 روزه در دمای 2±28 درجه سانتی‏گراد، برای 15دقیقه در5000 دور سانتریفوژ شد. مایع رویی حاصل پس از خشک شدن در دمای40 درجه سانتی‏گراد در آون، به عنوان عصاره آبی نگهداری شد. بیومس به دست آمده ابتدا در 60 درجه سانتی‏گراد کاملاً خشک شد. برای تهیه عصاره‏های متانولی بر روی بیومس حاصل به مقدار 30 میلی‏لیتر متانول اضافه شد. سپس، مخلوط حاصل به مدت 20 دقیقه روی شیکر با سرعت 150دور در دقیقه قرار داده شد. عصاره‏های حاصل به وسیله کاغذ صافی واتمن شماره یک صاف وسپس در دمای 40 درجه سانتی‏گراد در آون کاملاً خشک شد. بدین‏ترتیب عصاره متانولی تهیه شد. تمام عصاره‏های خشک شده در فالکون‏های استریل جمع آوری و تا زمان انجام آزمایش‏های بعدی در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد (22).

میکروارگانیسم‏های مورد بررسی: در این پژوهش، 5 گونه باکتری گرم مثبت بیماری‏زا شامل: استافیلوکوکوس اورئوس[19] (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس اپیدرمیس[20] (PTCC 1114)، باسیلوس سرئوس[21] (PTCC 1247)، انتروکوکوس فیکالیس[22] (PTCC 1237) و استرپتوکوکوس پایوژنز[23] (PTCC 1447) و 5 گونه باکتری گرم منفی شامل: اشریشیا کلی[24] (PTCC 1338)، پروتئوس ولگاریس[25] (PTCC 1312)، سودموناس آئروژینوزا[26] (PTCC 1430)، سالمونلا تیفی[27] (PTCC 1609) و یرسینا پستیس[28] از مرکز کلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های سازمان پژوهش‏های علمی و صنعتی ایران و بانک میکروبی آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه علوم پزشکی ایلام تهیه شد. همچنین، 4 گونه قارچ بیماری‏زای گیاهی شامل: فوزاریوم سولانی[29]، راینکوسپوریوم سکالیس[30]، بوتریتیس سینره آ[31] و فوزاریوم اوکسیسپوروم[32] از آزمایشگاه بیماری‏های گیاهی دانشگاه ایلام تهیه شد.

.تهیه‏ سوسپانسیون نیم مک فارلندی از باکتری‏ها و قارچ‏ها: برای تهیه سوسپانسیون نیم مک فارلندی از باکتری‏ها (108×1 واحد سارنده کلونی در میلی‏لیتر) و قارچ‏ها (106×1 واحد سارنده کلونی در میلی‏لیتر)، ابتدا باکتری‏ها و قارچ‏ها را به طور جداگانه، به ترتیب روی محیط کشت‏های مولر هینتون‏آگار و سابوردکستروز آگار کشت و به مدت 24 ساعت (برای باکتری‏ها) و 48 ساعت (برای قارچ‏ها) در انکوباتور قرار داده شد. سپس، به اندازه تعداد میکروارگانیسم‏ها لوله استریل تهیه و داخل هر لوله به مقدار 10 میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی ریخته شد. به وسیله آنس حلقوی از کلونی‏های باکتری‏ها و قارچ‏ها برداشته و داخل لوله‏ها انتقال داده شد و به مدت 10 دقیقه ورتکس شد. برای به دست آوردن غلظت نیم مک‏فارلندی از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد. دستگاه روی طول موج 620 نانومتر تنظیم و با سرم فیزیولوژی صفر شد. سپس، از سوسپانسیون ورتکس شده در کوئیت‏های شیشه‏ای مخصوص دستگاه ریخته و جذب نوری آن‏ها تعیین شد. به منظور تهیه کدورت نیم مک فارلندی باید مقدار جذب نوری در طول موج 620 نانومتر برابر 08/0 تا 1/0 شود. در نهایت از تمام باکتری‏ها ‏و قارچ‏ها ‏غلظت نیم مک فارلندی تهیه شد (23).

بررسی اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی: به منظور بررسی اثر ضدباکتریایی و ضدقارچی عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری‏ها از روش انتشار در دیسک (کربی-بائر[33]) استفاده شد، زیرا این روش یکی از متداول‏ترین و مقرون به صرفه‏ترین روش‏های زیستی برای ارزیابی خواص ضدمیکروبی است (24) به این شکل که ابتدا از عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری‏ها، به وسیله دی‏متیل سولفوکساید10 درصد، رقت‏های 125، 250، 500 و 1000 میلی‏گرم بر میلی‏‏لیتر تهیه شد. به تعداد باکتری‏ها (10 گونه باکتری) و قارچ‏ها (4 گونه قارچ) دیسک کاغذی بلانک 6 میلی‏متری تهیه شده از شرکت پاتن طب (ایران) در داخل رقت‏های مختلف از هر عصاره ریخته شد. پس از 10 دقیقه که حداقل زمان لازم برای جذب است، دیسک‏های کاملاً آغشته شده به عصاره از داخل عصاره‏ها خارج و به طور جداگانه در آون 40 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد تا حلال آن بخار و دیسک‏ها خشک شود. دیسک‏ها قبل و بعد از ترکیب با عصاره‏ها وزن شد و اختلاف وزن آن دو، مقدار عصاره‏ای بود که دیسک‏ها در رقت‏های مختلف هر عصاره جذب کرده بودند. مقدار عصاره جذب شده توسط هر دیسک در رقت‏های مختلف عصاره‏های ‏فعال در جدول 1 آمده است. به این ترتیب دیسک‏ها برای بررسی خواص ضد باکتریایی و ضد قارچی آماده شد (25). با استفاده از سوآب استریل از سوسپانسیون نیم مک‏فارلندی باکتری‏ها برداشته و در محیط کشت مولر هینتون آگار (مرک آلمان) به صورت چمنی کشت داده شد.

جدول 1- مقدار عصاره جذب شده توسط دیسک‏ها در غلظت‏های مختلف از عصاره‏های فعال متانولی و آبی سیانوباکتری‏ها

سیانوباکتری‏ها

 

غلظت عصاره‏ها*

 

125

250

500

1000

عصاره متانولی

Synechococcus elangatus

8/4

1/10

1/19

4/28

عصاره متانولی

Fischerella ambigua

5

8/9

19

3/31

عصاره آبی

Synechococcus elangatus

3/4

4/9

5/18

2/29

عصاره آبی

Fischerella ambigua

1/4

2/9

6/19

5/29

* تمام اعداد در جدول بر حسب میلی‏گرم بر میلی‏لیتر است.

 

بر اساس روش استاندارد انتشار دیسک، دیسک‏های آغشته به عصاره در فاصله استاندارد (5/1 سانتی‏متری) از یکدیگر در محیط کشت‏ها قرار داده شدند (24). محیط کشت‏ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه‏سانتی‏گراد در انکوباتور قرار داده و بعد از 24 ساعت قطر هاله‏ها با استفاده از خط‏کش معمولی اندازه‏گیری شد. از سوسپانسیون نیم مک فارلندی قارچ‏های ‏خالص شده روی محیط سابورودکستروزآگار کشت داده شد. سپس، دیسک‏های آغشته به عصاره در فاصله استاندارد (5/1 سانتی‏متری) از یکدیگر روی محیط کشت‏ها قرار داده شد. محیط کشت‏ها به مدت 48 ساعت در دمای 24 درجه سانتی ‏گراد در انکوباتور قرار داده و پس از 24 ساعت قطر هاله‏ها با استفاده از خط‏کش معمولی اندازه‏گیری شد. تمام آزمایش‏ها سه بار تکرار شد (26). در این پژوهش از دی‏متیل‏سولفوکساید 10 درصد به علت اینکه تأثیری بر روی باکتری‏های ‏مورد بررسی ندارد به عنوان کنترل منفی استفاده شد. همچنین، از آنتی‏بیوتیک‏های ‏جنتامایسین، استرپتومایسین، نالیدیکسیک اسید، کلرامفنیکل و پنی‏سیلین به عنوان کنترل مثبت برای باکتری‏ها ‏و از آنتی‏بیوتیک نیستاتین به عنوان کنترل مثبت برای قارچ‏ها ‏استفاده شد. تمامی آنتی‏بیوتیک‏ها از شرکت پاتن طب (ایران) تهیه شد.

تعیین مقدار MIC و MBC: حداقل غلظت مهارکننده (MIC) عصاره‏های سیانوباکتری‏هایی که دارای اثر ضدباکتریایی بودند، با استفاده از پلیت‏های 96 خانه‏ای استریل و روش براث میکرودیلوشن[34] طبق دستورالعمل [35]CLSI تعیین شد (27). به این ترتیب که ابتدا به هر یک از چاهک‏ها 50 میکرولیتر محیط نوترینت براث به اضافه50 میکرولیتر از رقت‏‏های تهیه شده عصاره (125 تا 1000 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) اضافه شد. سپس، مقدار 50 میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده باکتری به چاهک‏ها اضافه شد. سپس، پلیت‏ها به مدت 24 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شد و بعد از این مدت کف پلیت زیر نور در آینه مشاهده و وجود کدورت را که نشان دهنده رشد یا عدم رشد باکتری است، در جدول یادداشت شد. با مقایسه‏ کدورت چاهک‏های تحت تیمار با چاهک‏های شاهد میزان حداقل غلظت مهارکننده مشخص شد. نخستین چاهک بدون کدورت به عنوان حداقل غلظت مهارکننده به شکل میلی‏گرم بر میلی‏لیترگزارش شد (23). حداقل غلظت کشندگی‏ (MBC) عصاره‏ها با توجه به نتایج حداقل غلظت مهارکننده تعیین شد. از چاهک‏هایی که رشد باکتری در آن‏ها کاملا متوقف شده بود با سوآپ استریل نمونه‏برداری و روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد گرمخانه‏گذاری شد. پس از 24 ساعت کم‏ترین غلظتی از عصاره که باکتری‏ها در آن رشد نکرده بودند به عنوان مقادیر حداقل غلظت کشندگی‏ گزارش شد (28). نتایج آزمایش‏های بدست آمده از نظر آماری به شکل توصیفی با یکدیگر مقایسه شد. تمام آزمایش‏ها سه بار تکرار شدند.

تحلیل‏های آماری: به منظور تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها از نرم افزار اس پی اس اس[36] نسخه 20 استفاده شد. تجزیه واریانس داده‌ها با استفاده ازآزمون یک طرفه آنووا[37] و مقایسه میانگین‌ها با استفاده از آزمون دانکن[38] در سطح یک درصد انجام شد. همچنین، برای توصیف متغیرهای پژوهش از آمار توصیفی مانند میانگین و انحراف معیار استفاده شد.

 

نتایج.

نتایج به دست آمده نشان داد که هیچ یک از عصاره‏های ‏آبی و متانولی سیانوباکتری Schizothrix vaginataدارای فعالیت ضد باکتریایی و ضدقارچی نبودند. نتایج حاصل از تأثیر عصاره آبی و متانولی دو گونه سیانوباکتریFischerella ambigua ، Synechococcus elangatusبر روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی در جدول 2 نشان داده شده است. نتایج نشان داد که عصاره متانولی گونه‏ Synechococcus elangatusبر روی باکتری‏ها اثر در خور توجهی نداشت، اما عصاره متانولی گونه Fischerella ambiguaفعالیت ضدباکتریایی نشان داد. همچنین، نتایج بدست آمده از تأثیر عصاره‏های آبی سیانوباکتری‏ها نشان داد که عصاره آبی سیانوباکتری‏های Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusفعالیت ضدباکتریایی معناداری علیه باکتری‏های ‏مورد بررسی داشتند. تجزیه و تحلیل داده‏ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده تقریباً برابر صفر است (01/0 P value ). با توجه به میانگین قطر هاله‏های عدم رشد حاصل از تأثیر غلظت‏های 125 تا 1000 میلی‏گرم بر‏ میلی لیتر عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaعلیه باکتری‏های گرم مثبت، می‏توان گفت که از بین باکتری‏های ‏گرم مثبت تنها باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) و باکتری انتروکوکوس فیکالیس‏ (PTCC 1237) و از بین گرم منفی‏ها ‏تنها باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 11312) به عصاره متانولی این سیانوباکتری حساس بودند و سایر باکتری‏های گرم منفی و گرم مثبت نسبت به این عصاره مقاومت نشان دادند. نتایج حاصل از تأثیر عصاره‏آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaبر‏ روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که این عصاره بر روی بر روی هر دو گروه باکتری‏هایگرم‏مثبت و گرم منفی اثر ضدباکتریایی داشت. نتایج نشان داد که عصاره آبی این سیانوباکتری اثر چشمگیری بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت داشت، به طوری که بیش‏ترین تأثیر را بر روی باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) با قطر هاله 33/33 میلی‏متر داشت (شکل 1). از بین 5 گونه باکتری گرم مثبت مورد بررسی تنها باکتری استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447) نسبت به عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaمقاوم بود. این عصاره بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1431) و استافیلوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) تقریباً اثر یکسان داشت. با این وجود، از بین باکتری‏های ‏گرم منفی مورد بررسی عصاره آبی Fischerella ambiguaتنها بر روی باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر ضدباکتریایی داشت و سایر باکتری‏های ‏گرم منفی نسبت به این عصاره مقاوم بودند. تحلیل آماری داده‏ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده برابر صفر است بنابراین، فعالیت ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaعلیه باکتری‏های گرم مثبت به طور معنا‏داری بیشتر از باکتری‏های گرم‏منفی بود.

نتابج به دست آمده پس ار تأثیر عصاره‏‏آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusبر ‏روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که عصاره آبی این سیانوباکتر دارای اثر ضدباکتریایی در خور توجهی علیه باکتری‏های ‏مورد بررسی بود. بیش‏ترین قطر هاله عدم رشد حاصل از تأثیر این عصاره بر روی باکتری‏های گرم مثبت مربوط به باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) به اندازه 33/26 میلی‏متر بود، در صورتی که بیش‏ترین قطر هاله عدم رشد در بین باکتری‏های گرم‏منفی مربوط به باکتری سودموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) با قطر هاله 33/22 میلی‏متر بوده است (شکل 1). در بین باکتری‏های گرم مثبت تنها باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247)، و در بین باکتری‏های ‏گرم منفی تنها باکتری سالمونلا تیفی (PTCC 1609) نسبت به این عصاره مقاوم بودند. تأثیر این عصاره بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی تقریبا یکسان بود به طوری که تحلیل آماری داده‏ها در سطح یک درصد، خطای محاسبه شده برابر 02/0 بود، بنابراین، اختلاف معناداری بین تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی مشاهده نشد.

 

 

 

شکل 1- تأثیر غلظت‏های ‏مختلف (گرم بر لیتر) عصاره آبی سیانوباکتری‏های ‏Fischerella ambigua و Synechococcus elangatusبر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس

 

 

 

 

 

جدول 2- میانگین قطر هاله‏های عدم رشد (برحسب میلی‏متر) و انحراف معیار حاصل از تأثیر عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaو عصاره آبیSynechococcus elangatus‏ ‏ علیه باکتری‏های گرم‏منفی و گرم مثبت

 

*: مقدار عصاره جذب شده (میلی گرم بر میلی‏لیتر)

 

نتایج حاصل از اثر ضدقارچی عصاره‏ها ‏بعد از 48 ساعت گرمخانه‏گذاری نشان داد که عصاره متانولی گونه‏های Fischerella ambiguaو Synechococcus elangatusو عصاره آبی Synechococcus elangatusفعالیت ضدقارچی نشان دادند (جدول 3).

تجزیه و تحلیل داده‏ها در سطح یک درصد نشان داد که خطای محاسبه شده تقریباً برابر صفر است
(01/0 P value ). بنابراین، اثر غلظت‏های مختلف عصاره متانولی گونه‏های Fischerella ambiguaو Synechococcus elangatusو عصاره آبی Synechococcus elangatusبر روی قارچ‏های ‏بیماری‏زای گیاهی معنادار است. نتایج به دست آمده نشان داد که از بین عصاره‏های مورد آزمایش تنها عصاره متانولی Fischerella ambiguaبر روی هر 4 گونه قارچ بیماری‏زای گیاهی اثر مهاری داشت (شکل 2). این عصاره بیش‏ترین تأثیر را بر روی قارچ راینکوسپوریوم سکالیس داشت به طوری که قطر هاله حاصل از تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری اطراف آن 67/30 میلی‏متر بود. عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی قارچ‏های ‏فوزاریوم سولانی و فوزاریوم اوکسیسپوروم تأثیر تقریباً یکسانی داشت. همچنین، نتایج نشان داد که عصاره متانولی سیانوباکتری Synechococcus elangatusتنها بر روی قارچ فوزاریوم سولانی تأثیر داشت. به طوری که این قارچ به دیسک‏های ‏حاوی 4/28 و 1/19 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر عصاره این سیانوباکتری حساسیت نشان داد. عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی قارچ راینکوسپوریوم سکالیس، بوتریتیس سینره‏آ و فوزاریوم اوکسیسپوروم هیچ تأثیری نداشت.

 

شکل 2- تأثیر غلظت‏های ‏مختلف (گرم بر لیتر) عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua برروی قارچ بوتریتیس سینره‏آ

 

نتایج حاصل از تأثیر کنترل‏های ‏مثبت (آنتی‏بیوتیک‏های ‏رایج) و مقایسه تأثیر آن‏ها با عصاره‏های ‏سیانوباکتریایی بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی نشان داد که تمام باکتری‏های گرم منفی به آنتی‏بیوتیک‏های جنتامیسن، استرپتومایسین و کلرامفنیکل حساس بودند. مؤثرترین عصاره بر روی باکتری‏های گرم منفی عصاره آبی Synechococcus elangatusو مؤثرترین عصاره بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت عصاره آبی Fischerella ambiguaبود.کم‏اثرترین آنتی‏بیوتیک‏ها علیه باکتری‏های گرم‏منفی مربوط به آنتی‏بیوتیک‏ پنی سیلین بود. تأثیر عصاره متانولی Fischerella ambigua(19 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) بر روی باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) از تمام آنتی‏بیوتیک‏های مؤثر بر روی این باکتری بیشتر بود.

 

 

جدول‏3- میانگین قطر هاله‏های عدم رشد (برحسب میلی‏متر) و انحراف معیار حاصل از تأثیر عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaو عصاره متانولیSynechococcus elangatusعلیه ‏4 گونه قارچ بیماری‏زای گیاهی.

 

Botrytis cinerea

Fusarium solani

Rhynchosporium secalis

Fusarium oxysporum

کنترل مثبت

نیستاتین

28±1

17±0

67/35±57/0

67/22±15/1

عصاره متانولی

Fischerella ambigua

*3/31

20±1

33/14±57/0

33/32±57/0

33/15±57/0

19

33/18 ±57/0

67/12±57/0

67/25±57/0

67/14±15/1

8/9

67/15 ±57/0

67/11±15/1

67/22±57/0

33/13±57/0

5

33/14±57/0

33/9±57/0

67/18±57/0

33/11±57/0

عصاره آبی

Fischerella ambigua

5/29

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

67/10±57/0

6/19

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

67/9±57/0

2/9

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

33/8±57/0

1/4

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عصاره متانولی

Synechococcus elangatus

4/28

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

33/11±57/0

1/19

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

33/10±57/0

1/10

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

33/7±57/0

8/4

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

67/6±57/0

*: مقدار عصاره جذب شده (میلی گرم بر میلی‏لیتر)

 

 

از بین عصاره‏ها و آنتی‏بیوتیک‏های مؤثر بر روی باکتری سودوموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) بیش‏ترین تأثیر را عصاره آبی Synechococcus elangatus(2/29 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) داشت. مؤثرترین آنتی‏بیوتیک‏ها علیه باکتری‏های ‏گرم مثبت، آنتی‏بیوتیک کلرامفنیکل و مؤثرترین عصاره علیه باکتری‏های گرم مثبت عصاره آبیFischerella ambiguaبود. تأثیر عصاره آبی Fischerella ambigua(5/29 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) بر روی باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC1114) از تمام آنتی‏بیوتیک‏های ‏مؤثر بر آن‏ها بیشتر بود. کم‏اثرترین آنتی‏بیوتیک مؤثر بر روی باکتری‏های گرم مثبت، آنتی‏یبوتیک پنی سیلین بود. نتایج بررسی قطر هاله حاصل از تأثیر آنتی‏بیوتیک‏ها ‏علیه باکتری باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) نشان داد که مؤثرترین آنتی‏بیوتیک بر روی این باکتری، آنتی‏بیوتیک کلرامفنیکل و مؤثرترین عصاره بر روی این باکتری عصاره آبی Fischerella ambigua(5/29 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر) بود. نتایج همچنین نشان داد که دی متیل سولفوکساید به عنوان کنترل منفی هیچ گونه اثر ضدباکتریایی نداشت.

مقادیر مربوط به حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره آبی و متانولی سیانوباکتری های Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusبر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی بیماری زا در جدول 4 مشخص شده است. این نتایج نیز نشان می دهندکه عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaدر غلظت 125 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی باکتری‏های پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) و باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) اثر کشندگی و بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس ‏(‏PTCC 1237‎‏)‏ اثر بازدارندگی داشت. عصاره متانولی این سیانوباکتری در غلظت 250 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس ‏(‏PTCC 1237‎‏)‏ اثر کشندگی داشت. تحلیل‏های آماری در سطح یک درصد نشان داد که اختلاف معنا‏داری بین اثر این عصاره بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی وجود ندارد. همچنین، مشخص شد که عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambiguaدر غلظت 125 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112)، استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114)، انتروکوکوس فیکالیس ‏(‏PTCC 1237‎‏) و باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) اثر کشندگی و بر روی پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر بازدارندگی داشت. این عصاره در غلظت 250 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی باکتری‏های پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) اثر کشندگی داشت. تحیلی داده‏ها در سطح یک درصد نشان داد که اثر این عصاره بر روی باکتری‏های گرم مثبت به طور معنا‏داری بیشتر از باکتری‏های گرم منفی بود (01/0 P value ). عصاره آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusدر غلظت 125 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر بر روی باکتری سودوموناس آئروژینوزا (PTCC 1430) اثر کشندگی و بر روی باکتری‏های اشریشیاکلی (PTCC 1338)، استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447)، یرسینا پستیس، پروتئوس ولگاریس(PTCC 1312)، استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) اثر بازدارندگی داشت. غلظت 250 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر این عصاره بر روی باکتری‏های استرپتوکوکوس پایوژنز (PTCC 1447)، پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312)، استافیلوکوکوس اورئوس (PTCC 1112) و استافیلوکوکوس اپیدرمیس (PTCC 1114) اثر کشندگی و بر روی باکتری انتروکوکوس فیکالیس ‏(‏PTCC 1237‎‏)‏ اثر بازدارندگی داشت.

 

 

جدول 4- مقادیر حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری Fischerella ambigua و آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatus‏ ‏ علیه باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی بیماری‏زا (میلی‏گرم بر میلی‏لیتر)

عصاره متانولی Fischerella ambigua

عصاره آبی

Fischerella ambigua

عصاره آبی

Synechococcus elangatus

باکتری ها

حداقل غلظت مهارکنندگی

حداقل غلظت کشندگی

حداقل غلظت مهارکنندگی

حداقل غلظت کشندگی

حداقل غلظت مهارکنندگی

حداقل غلظت کشندگی

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

125

125

250

Staphylococcus aureus PTCC 1112

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

125

125

250

Staphylococcus epidermidis PTCC 1114

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

125

250

500

Enterococcus faecalis PTCC PTCC 1237

125

125

125

125

عدم تأثیر

عدم تأثیر

Bacillus cereus

PTCC 1247

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

250

Streptococcus pyogenes

PTCC 1447

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

500

Escherichia coli

PTCC 1338

500

1000

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

125

Pseudomonas aeruginosa

PTCC 1430

125

125

125

250

125

250

Proteus vulgaris

PTCC 1312

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

Salmonella typhi

PTCC 1609

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

عدم تأثیر

125

500

Yersinia pestsi


بحث و نتیجه‏‏ گیری.

با توجه به مقاومت روز افزون میکروارگانیسم‏ها به آنتی‏بیوتیک‏ها و گرایش عمومی به ترکیبات طبیعی در نواحی متعددی از دنیا، شناسایی میکروارگانیسم‏های ‏توانمند و ‏بررسی اثرات ضد میکروبی آن‏ها اهمیت خاصی دارد. در طی دهه اخیر سیانوباکتر‏ها به عنوان منبع غنی از ترکیبات آنتی‏بیوتیکی، ویتامین‏ها، سوخت و تولیدات دارویی‏ مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته‏اند (18). با این حال، تا‏کنون درکشور ایران‏ در مقایسه با سایر کشورها در زمینه شناخت ترکیبات آنتی‏بیوتیکی و بررسی خواص دارویی سیانوباکتری‏ها مطالعات کاربردی اندکی انجام شده است.

نتایج حاصل از بررسی خواص ضدباکتریایی عصاره‏های متانولی 3 گونه سیانوباکتری Fischerella ambigua ISC67، Synechococcus elangatus ISC106و Schizothrix vaginata ISC108 در این پژوهش نشان داد که تنها عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua دارای فعالیت ضدباکتریایی است و عصاره متانولی گونه‏های دیگر دارای اثر ضدباکتریایی معناداری نیست. ساکتیول[xxxix] و همکاران نیز ضمن بررسی خواص ضدباکتریایی سیانوباکتری‏ها نشان دادندکه متانول بهترین حلال برای استخراج متابولیت‏های ‏ثانویه ضدمیکروبی از سیانوباکتری‏هاست (15). آن‏ها همچنین نشان دادند که متانول برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی برخی از سیانوباکتری‏ها سینکوکوس الانگاتوس[xl] و اوسیلاتوریا ویلیه[xli] حلال مناسبی نیست. با بررسی خواص ضدباکتریایی سیانوباکتری Fischerella ambigua مشخص شد که این سیانوباکتری از بین باکتری‏های گرم‏مثبت بر روی باکتری‏های باسیلوس سرئوس (PTCC 1247) و انتروکوس فیکالیس (PTCC 1237) اثر داشته و سایر باکتری‏های گرم مثبت نسبت به این عصاره مقاوم بودند. همچنین، مشخص شد که عصاره متانولی این سیانوباکتری از بین باکتری‏های گرم منفی بیش‏ترین تأثیر را بر روی پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) داشته است. قاسمی و همکاران نیز در پژوهش خود نشان دادند که عصاره متانولی سیانوباکتری‏ها ‏دارای در خور قابل توجهی علیه باکتری‏های ‏پاتوژن است و بیش‏ترین تأثیر را بر وری باکتری استافیلوکوکوس اورئوس و پروتئوس ولگاریس دارد. آن‏ها در نتیجه پژوهش خود، با توجه به مطالعات و تحقیقات زیادی که در این زمینه توسط پژوهشگران در سراسر ‏دنیا انجام شده بود، گزارش کردند که، ترکیبات زیادی، از جمله، فیشرلین[xlii] و آمبیگوئین[xliii] از این سیانوباکتری تولید می‏شود که این ترکیبات دارای فعالیت ضد میکروبی هستند (10).

اگرچه در بیشتر مطالعات عصاره‏های ‏به دست آمده از سیانوباکتری‏ها علیه باکتری‏های گرم منفی مانند اشریشیاکلی و پروتئوس ولگاریس مؤثر هستند، اما در این پژوهش مشخص شدکه عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambiguaبر روی باکتری اشریشیاکلی هیچ اثری ندارد. این نتیجه با با نتایج زندی و همکاران و قاسمی و همکاران مطابقت دارد ولی با یافته‏های تیواری[xliv] ‏و شارما مطابقت ندارد (10، 29 و 30)، آن‏ها گزارش دادند که ترکیبات فعال موجود در عصاره متانولی سیانوباکتری فیشرلا[xlv] علیه باکتری اشریشیاکلی مؤثر است. نتایج نشان داد که عصاره متانولی Fischerella ambiguaبر روی هر دو گروه باکتری‏های گرم منفی و مثبت مورد بررسی به یک اندازه تأثیر داشت به طوری که اختلاف معنا‏داری بین تأثیر این عصاره بر روی باکتری‏های گرم مثبت با گرم منفی دیده نشد (01/0 P value ≥). در مطالعات مشابه، قاسمی و همکاران وهمچنین سلطانی و همکاران نشان دادند که بین تأثیر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی اختلاف معنا‏داری وجود ندارد (10 و 31).

نتایج به دست آمده از بررسی خواص ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتریFischerella ambigua نشان داد که این عصاره دارای اثر در خور توجهی بر روی اکثر باکتری‏های گرم مثبت است واز بین باکتری‏های گرم منفی تنها باکتری پروتئوس ولگاریس (PTCC 1312) نسبت به این عصاره حساس بود. دافی و پاور[xlvi] گزارش کردند که، یک توضیح احتمالی برای این مشاهدات ممکن است به تفاوت‏های قابل توجهی که در لایه‏های بیرونی باکتری‏های گرم منفی و مثبت وجود دارد، نسبت داده ‏شود.آن‏ها بیان کردند که باکتری‏های گرم منفی دارای یک غشای خارجی و فضای پری‏پلاسمیک منحصر به فردی هستند که در باکتری‏های گرم مثبت وجود ندارند (32). سلطانی و همکاران و قاسمی و همکاران نیز با بررسی خواص ضدباکتریایی عصاره آبی سیانوباکتری Fischerella ambigua دریافتند که این عصاره دارای فعالیت ضدباکتریایی علیه باکتری‏های ‏گرم مثبت و گرم منفی است، طوری که تأثیر این عصاره از آنتی‏بیوتیک‏های مؤثر بر این باکتری بیشتر بود (10 و 31). این در حالی است که تیواری‏ و شارما نشان دادن که بر خلاف نتایج به دست آمده در این مطالعه، عصاره آبی سیانوباکتری‏ها ‏فاقد اثر ضدباکتریایی است (30). همچنین، نتایج حاصل از تأثیر عصاره آبی سیانوباکتری Synechococcus elangatusبر روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی نشان دادکه این عصاره دارای اثر در خور توجهی بر روی باکتری‏های گرم‏مثبت و گرم منفی است. با این حال، اثر این عصاره علیه باکتری‏های ‏گرم مثبت کمتر یا تقریباً یکسان با باکتری‏های گرم منفی بود. نتایج حاصل از تأثیر این عصاره با یافته‏های مارتینز‏[xlvii] و همکاران مطابقت دارد، آن‏ها در پژوهش خود ‏ضمن بررسی فعالیت ضدباکتریایی سیانوباکتری‏های جنس سینکوسیستیس[xlviii] ‏و ‏سینکوکوس علیه باکتری‏‏های بیماری‏زای انسان، نشان دادند که عصاره‏های به دست آمده از سیانوباکتری‎‏‎ها دارای فعالیت ضدباکتریایی معنا‏داری علیه باکتری‏های گرم ‏مثبت و گرم منفی است‏ (33).‏ همچنین، در این پژوهش نشان داده شد که عصاره‏های آبی و متانولی سیانوباکتری Schizothrix vaginataفاقد اثرات ضدباکتریایی و ضد قارچی است. تاکنون پژوهشی مبنی بر اثرات ضدمیکروبی عصاره آبی و متانولی این سیانوباکتری گزارش نشده است.

نتایج حاصل از اثر ضدباکتریایی عصاره‏های حاصل از سیانوباکتری‏های ‏مورد مطالعه در این پژوهش بر روی باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی بیماری‏زا نشان داد که اثر این عصاره‏ها بر روی باکتری‏های گرم مثبت بیشتر از باکتری‏های گرم منفی است. نتایج پژوهش‏های زیادی نشان داد که اثرات عصاره‏های به دست آمده از سیانوباکتری‏ها بر روی باکتری‏های ‏گرم مثبت بیشتر از باکتری‏های ‏گرم منفی است. برای مثال سلطانی و همکاران در بررسی خواص ضدمیکروبی سیانوباکتری فیشرلا[xlix]‏ تحت تأثیر تنش‏های شوری نشان دادند که اثر عصاره متانولی این سیانوباکتری بر روی باکتری‏های گرم‏ مثبت استافیلوکوکوس اپیدرمیس و باسیلوس سرئوس بیشتر از اثر این عصاره بر روی باکتری‏های گرم منفی مانند اشریشیاکلی و انتروکوکوس فیکالیس ‏(‏PTCC 1237‎‏)‏ است (31). شان[l] و همکاران گزارش کردند که مقاومت باکتری‏های گرم منفی نسبت به مواد ضد باکتریایی مربوط به سطح آب دوست غشای خارجی آنهاست که غنی از مولکول‏های لیپو‏پلی‏ساکارید است، که یک مانع برای نفوذ مولکول‏های متعددی از آنتی‏بیوتیک‏ها و ترکیبات ضدباکتریایی تشکیل می‏دهند. از سوی دیگر غشا نیز با آنزیم‏ها موجود در فضای پری پلاسمیک، که قادر به شکستن مولکول‏های وارد شده از خارج سلول‏اند، در ارتباط است (34). با این حال، کالمبا و کونیکا[li] بیان کردند که باکتری‏های گرم مثبت بر خلاف باکتری‏های گرم منفی فاقد غشای خارجی و ساختار دیواره سلولی هستند. آن‏ها نیز گزارش کردند که اثر عصاره سیانوباکتری‏ها ‏بر روی باکتری‏های گرم مثبت بیشتر از باکتری‏های گرم منفی است و آن را با اختلاف ساختار دیواره‏سلولی باکتری‏های گرم مثبت با گرم منفی مرتبط دانستند (35). همچنین، در این پژوهش مشخص شد که حساسیت قارچ‏های مورد بررسی به عصاره متانولی بیشتر از عصاره آبی است. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت که متانول بهترین حلال برای استخراج ترکیبات ضدقارچی از سیانوباکتری‏هاست این یافته‏ها با نتایج پریادهارشینی[lii] و همکاران نیز مطابقت دارد. آن‏ها نشان دادند که عصاره متانولی سیانوباکتری‏ها دارای فعالیت ضدقارچی بیشتری نسبت به عصاره آبی و استونی هستند (36). این در حالی است که این نتایج با پژوهش قاسمی و همکاران مطابقت ندارد، آن‏ها نشان دادند که فعالیت ضد قارچی عصاره آبی فیشرلا نسبت به عصاره متانولی آن بیشتر است (10). پژوهش‏‏های زیادی در زمینه شناسایی و جداسازی ترکیبات ضد قارچی سیانوباکتری‏ها انجام شده است. در نخستین مطالعات انجام شده، اسمیتکا[liii] و همکاران نشان دادند که ترکیب آمبیگوئین تولید شده توسط سیانوباکتری فیشرلا دارای فعالیت ضدقارچی مطلوبی برروی قارچ‏های ‏آسپرژیلوس فلاووس، آسپرژیلوس نایجر، کاندیدا آلبیکنز، پنی سیلیوم نوتاتوم و ساکارومایسس سرویزیه است (37).

طبق نتایج به دست آمده مشخص شد که در تمام عصاره‏های ‏مؤثر بر روی باکتری‏ها و قارچ‏های ‏بیماری‏زا، با افزایش غلظت عصاره‏ها میزان قطر هاله مهاری و در نتیجه میزان فعالیت ضدباکتریایی و ضدقارچی عصاره‏ها ‏افزایش می‏یابد. در مطالعه‏ای مشابه متیوانان[liv] و همکاران نشان دادند که بین قطرهاله عدم رشد و غلظت عصاره سیانوباکتری‏های لینجبیا ماجوسکولا[lv] و اوسیلاتوریا پرینسپس[lvi] رابطه مستقیمی وجود دارد (38).

تاکنون متابولیت‏های ‏ثانویه فراوانی با فعالیت ضدمیکروبی از سیانوباکتری‏ها جداسازی و شناسایی شده‏اند، برای مثال چاندرا[lvii] و راجاشخار[lviii] با بررسی فیتوشیمیایی عصاره‏های ‏اتانولی، متانولی، کلروفرمی، دی اتیل اتری و آبی چند گونه از سیانوباکتری‏ها نشان دادند که فنول، فلاونوئید و کارتنوئید در تمام عصاره‏های به‏دست آمده وجود دارند، درحالی که آلکالوئیدها و استروئیدها/ تریترپن‏ها در همه عصاره‏ها به جز عصاره آبی سیانوباکتری‏ها وجود داشتند. همچنین، به طور مشابه فیکوسیانین‏ها در تمام عصاره‏ها ‏به استثنای عصاره کلروفرمی موجود بودند. تانین‏ها در تمام عصاره‏ها به جزء عصاره آبی و کلروفرمی وجود داشتند اما ساپونین‏ها و کومارین‏ها در هیچ کدام از عصاره‏ها موجود نبودند. آن‏ها نشان دادند که این ترکیبات دارای فعالیت‏های ضدمیکروبی هستند (39). چو[lix] و همکاران نشان دادند که ترکیبات فنولی و ترپنوئیدها دارای فعالیت ضدباکتریایی هستند و قادرند از طریق تخریب غشا از رشد میکروارگانیسم‏ها جلوگیری کنند (40). در مطالعه دیگری کوشینی[lx] و همکاران گزارش کردند که فعالیت ضدمیکروبی فلاونوئیدها احتمالاً ناشی از توانایی آنها برای تشکیل کمپلکسی با پروتئین‏های ‏خارج سلولی و محلول و در نهایت، با دیواره سلولی باکتری‏هاست(41). همچنین، توییت[lxi] در سال 2010 در پژوهش خود در زمینه شناسایی متابولیت‏های ‏ثانویه تولید شده توسط سیانوباکتری‏ها، با بررسی عصاره متانولی سیانوباکتری Fischerella ambigua6 ترکیب تولید شده توسط این سیانوباکتری را جداسازی و شناسایی کرد. این ترکیبات شامل آمبیگوئین D ایزونیتریل[lxii]، آمبیگوئین B ایزونیتریل[lxiii]، دی‏کلرو آمبیگوئین B ایزونیتریل، فیشیرلین‏A[lxiv]، همچنین هیدروکسی- ایکوساتترائنوئیک اسید[lxv] و متوکسی- نانادکادنوئیک اسید[lxvi] بودند. توئیت بیان کرد که این ترکیبات دارای فعالیت‏های ‏زیستی هستند (42). راوح و کارملی[lxvii] در پژوهش خود نشان دادند که آمبیگوئین D ایزونیتریل و آمبیگوئین B ایزونیتریل دارای اثرات ضد باکتری و ضدقارچی متوسطی هستند (43).

به نظر می‏رسد با توجه به تولید مواد ضدمیکروبی فراوان توسط سیانوباکتری‏ها، احتمالاً سنتز این متابولیت‏ها نتیجه دفاع سیانوباکتری‏ها در محیط علیه ارگانیسم‏های دیگر مثل: باکتری، قارچ، ویروس و ریزجلبک‏های ‏یوکاریوتی است که می‏تواند یک مزیت برای بقای این میکروارگانیسم‏ها ‏در محیط طبیعی باشد (44). در این زمینه زرینی و همکاران گزارش کردند که تولید ترکیات ضدباکتریایی و ضدقارچی توسط سیانوباکتری‏ها می‏تواند بازتابی از شرایط محیطی و نیز هویت سیانوباکتری‏ها باشد. استعداد سیانوباکتری‏ها به عنوان منبع ترکیبات آنتی‏بیوتیکی نشانگر اهمیت این میکروارگانیسم‏ها به عنوان عوامل دارویی بالقوه است (19).

در ایران در سال‌های اخیر، رویکرد پژوهش‌های جدید به سمت مسائل زیست محیطی و استفاده از میکروارگانیسم‏ها در صنعت داروسازی و پزشکی بوده است. با این حال، بیشتر پژوهش‏ها ‏متمرکز بر میکروارگانیسم‌های خاصی بوده و سیانوباکتری‏ها با وجود تنوع فراوان در فعالیت‏های زیستی به جهت شناخت کمی که نسبت به این میکروارگانیسم‏ها ‏وجود دارد، همچنین دشواری مراحل کشت خالص آنها کمتر مورد توجه قرارگرفته‏اند. از سوی دیگر، مطالعات در زمینه استفاده از سیانوباکتری‏ها به عنوان منبعی از ترکیبات ضدمیکروبی و منابع طبیعی برای مقابله با بیماری‏های عفونی و باکتریایی نسبتاً کم بوده است. یکی از مهم‏ترین علت‏های استفاده کمتر از این میکروارگانیسم‏ها ممکن است اثرت جانبی ناشی از سموم بسیار قوی باشد که توسط برخی از گونه‏های سیانوباکتری‏ها تولید می‏شود. این سموم حیات بسیاری از موجودات زنده از جمله آبزیان و دام‏های ‏اهلی که از آب رودخانه‏ها ‏و برکه‏ها ‏استفاده می‏کنند را به خطر می‏اندازد. از این رو شناسایی سیانوباکتری‏های مفید و پژوهش در زمینه استفاده کاربردی از آن‏ها در صنعت و پزشکی امری ضروری به نظر می‏رسد. مطالعه حاضر، جزو پژوهش‏های انجام گرفته در زمینه کاربردهای پزشکی این میکروارگانیسم‏ها ‏در ایران است. در این مطالعه بررسی فعالیت ضدمیکروبی گونهSchizothrix vaginataبرای نخستین بار در کشور انجام شده است.

بر اساس نتایج به دست آمده از این مطالعه، از میان سیانوباکتری‏های مورد بررسی، تنها سیانوباکتری Fischerella ambiguaبود که هر دو عصاره‏ به دست آمده از آن (متانولی و آبی) دارای فعالیت ضدباکتریایی بود و هیچ یک از عصاره‏های آبی و متانولی Schizothrix vaginataو عصاره متانولی Synechococcus elangatusاثرات ضدباکتریایی نداشتند. بیش‏ترین اثرات ضدباکتریایی سیانوباکتری‏ها مربوط به عصاره آبی Synechococcus elangatusبود. همچنین، در این مطالعه مشخص شد که بیش‏ترین اثر ضد قارچی مربوط به عصاره متانولی سیانوباکتریFischerella ambigua است. با توجه به نتایج این پژوهش می‏توان بیان کرد که عصاره آبی Synechococcus elangatusبهترین عصاره برای جداسازی ترکیبات ضدباکتریایی و متانول نیز بهترین حلال برای استخراج ترکیات ضدقارچی از این سیانوباکتری است. همچنین، مشخص شد هیچ کدام از حلال‏های مورد استفاده در این پژوهش برای استخراج متابولیت‏های ضدمیکروبی Schizothrix vaginataمناسب نیست و از این رو پژوهش‏های بیشتری بر روی این گونه با سایر حلال‏ها پیشنهاد می‏شود. بنابراین، می‏توان نتیجه گرفت که از میان سیانوباکتری‏های مورد بررسی، دو گونه سیانوباکتری Fischerella ambiguaوSynechococcus elangatusدارای فعالیت ضدمیکروبی بوده و می‏توانند یک کاندیدای خوب برای استخراج ترکیبات ضدمیکروبی ‏باشند و به نظر می‏رسد می‏توان از ترکیبات موجود در عصاره آن‏ها به عنوان دارو در کنترل و مهار بسیاری از بیماری‏ها استفاده کرد که بررسی بیشتر اثرات آن مستلزم مطالعات بیشتر است.

تشکر و قدردانی

این مقاله برگرفته از پایان نامه مقطع کارشناسی ارشد با عنوان «بررسی اثرات ضدمیکروبی و تجزیه زیستی نفت خام توسط سیانوباکتری‏ها» مصوب سال 1390 با کد 1065839 است که با حمایت دانشگاه ایلام و همکاری گروه میکروبیولوژی نفت پژوهشکده علوم پایه کاربردی جهاد دانشگاهی دانشگاه شهید بهشتی تهران اجرا شده است.



[1]- Cyanobacteria

[2]- International Code of Botanical Nomenclature

[3]- International Code of Nomenclature of Prokaryots

[4]- polyphasic approach

[5]- Soltani

[6]- Chroococcus

[7]- Lyngbya

[8]- Anabaena

[9]- Synechococcus

[10]- Oscillatoria

[11]- Stigonema

[12]- Anabaenopsis

[13]- Nostoc

[14]- Calothrix

[15]- Richard Moore ‎

[16]- Zarrini

[17]- Soltani

[18]- Val

[19]- Staphylococcus aureus‎

[20]- Staphylococcus epidermidis

[21]- Bacillus cereus

[22]- Enterococcus faecalis

[23]- Streptococcus pyogenes

[24]- Escherichia coli

[25]- Proteus vulgaris

[26]- Pseudomonas aeruginosa

[27]- Salmonella typhi

[28]- Yersinia pestsi

[29]- Fusarium Solani

[30]- Rhynchosporium secalis

[31]- Botrytis cinerea

[32]- Fusarium oxysporum

[33]- Kirby-bauer

[34]- Broth microdilution

[35]- Clinical and Laboratory Standards Institute

[36]- SPSS

[37]- ANOVA

[38]- Duncan

[xxxix]- Sakthivel

[xl]- Synechococcus elangatus

[xli]- Oscillatoria willei

[xlii]- Fischerellin

[xliii]- Ambiguine

[xliv]- Tiwari

[xlv]- Fischerella

[xlvi]- Duffy and Power‎

[xlvii]- Martins

[xlviii]- Synechoccystis‏

[xlix]- Fischerella sp.

[l]- Shan

[li]- Kalemba and Kunicka

[lii]- Priyadharshini

[liii]- Smitka

[liv]- Mathivanan

[lv]- Lyngbiya maguscula

[lvi]- Oscillatoria princeps

[lvii]- Chandra

[lviii]- Rajashekhar

[lix]- Cho

[lx]- Cushinie

[lxi]- Tuyet

[lxii]- ambiguine D isonitrile

[lxiii]- ambiguine B isonitrile

[lxiv]- fischerellin A

[lxv]- hydroxy-eicosatetraenoic acid

[lxvi]- methoxy-nonadecadienoic acid

[lxvii]- Raveh and Carmeli

(1)               Lopes V.R., Ramos V., Martins A., Sousa M., Welker M., Antunes A., et al. Phylogenetic, chemical and morphological diversity of cyanobacteria from Portuguese temperate estuaries. Marine Environmental Research 2012; 73: 7- 16.

(2)               Baskara V, Sethubathi G, Ashok Prabu V. Antibacterial Activity of Cyanobacterial Species from Adirampattinam Coast, Southeast Coast of Palk Bay. Current Research Journal of Biological Sciences 2010; 2 (1): 24- 6.

(3)               Nieto P.J.G., Lasheras F.S., Juez F.J.C, Fernandez J.R.A. Study of cyanotoxins presence from experimental cyanobacteria concentrations using a new data mining methodology based on multivariate adaptive regression splines in Trasona reservoir (Northern Spain). Journal of Hazardous Materials 2011; 195: 414- 21.

(4)               Rikkinen J. Molecular studies on cyanobacteria diversity in lichen symbioses. MycoKeys 2013; 6: 1- 32.

(5)               Shokravi Sh., Soltani N., Baftechi L., Cyanobacteriology, 1st. ed. Gorgan: Islamic Azad University of Gorgan; 2009.

(6)               Casamatta D.A., Johansen J.R., Vis M.L., Broadwater S.T. Molecular and morphological characterization of ten polar and near-polar strains within the Oscillatoriales (Cyanobacteria). Journal of Phycology 2005; 41: 421- 38.

(7)               Mishra A.K., Shukla E., Singh S.S. Phlogenetic comparison among the heterocystous cyanobacteria based on a polyphasic approach. Protoplasma 2013; 250 (1):77- 94.

(8)               Soltani N., Dezfolian M., Shokravi Sh., Baftechi L., Shima E. Isolation and Morphological and Molecular Identification of New Species of Cyanobacteria from Firoozkooh region (Tehran Province) Using Different Culture Media. Journal of science kharazmi university 2010; 8 (4): 319- 28.

(9)               Riyahi H., Shokravi Sh., Soltani N., Study of algal flora from Uromia Lake. Pajouhesh- Va- Sazandgi 1995; 25: 23- 5.

(10)           Ghasemi Y., Tabatabaei-Yazdi M., Shokravi S., Soltani N., Zarrini G. Antifungal and antibacterial activity of paddy-fields cyanobacteria from the north of Iran. Journal of Sciences, Islamic Republic of Iran 2003; 14 (3): 203- 209.

(11)           Kalaitzis J.A., Lauro F.M., Neilan B.A. Mining cyanobacterial genomes for genes encoding complex biosynthetic pathways. Natural Product Reports 2009; 26 (11): 1447- 65.

(12)           Cragg G.M., Newman D.J. Natural products: A continuing source of novel drug leads. Biochimica et Biophysica Acta 2013; 1830 (11): 3670- 695.

(13)           Harvey A.L. Natural products in drug discovery. Drug discovery today 2008; 13: 894- 901.

(14)           Cardellina J.H., Moore B.S. Editorial: Richard E. Moore (1933- 2007). Journal of Natural Products 2010; 73 (3): 301- 2.

(15)           Sakthivel K., Kathiresan K. Antimicrobial activities of marine cyanobacteria isolated from mangrove environment of south east coast of India. Journal of Natural Products 2012; 5: 147- 56.

(16)           Oftedal L., Selheim F., Wahlsten M., Sivonen K., Døskeland S.O., Herfindal L. Marine Benthic Cyanobacteria Contain Apoptosis-Inducing Activity Synergizing with daunorubicin to Kill Leukemia Cells, but not Cardiomyocytes. Marine Drugs 2010; 8: 2659- 672.

(17)           Soltani N., Khavari-Nejad R.A., Yazdi M.T, Shokravi S., Fernández-Valiente E. Screening of soil cyanobacteria for antifungal and antibacterial activity. Pharmaceutical Biology 2005; 43 (5): 455- 59.

(18)           Abed R.M.M., Dobretsov S., Sudesh K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology 2009; 106 (1): 1- 12.

(19)           Zarrini G., Rasooli I., Abazari M., Ghasemi Y. Investigation of Antimicrobial Activity of Cyanobacteria Isolated from Urmia Lake Catchment Area. Journal of Ardabil University of Medical Sciences 2011; 11 (4): 329- 36.

(20)           Andersen R.A. Algal culturing techniques. 1st. ed. West Boothbay Harbor, ME USA: Elsevier Academic Press. 2005.

(21)           Shyam K.R., Thajuddin N., Venkateswari C. Antibacterial activity of cyanolichen and symbiotic cyanobacteria against some selected microorganisms. African Journal of Microbiology Research 2010; 4 (13): 1408- 11.

(22)           Val A.G., Platas G., Basilio A., Cabello A., Gorrochategui J. Screening of antimicrobial activities in red, green and brown macroalgae from Gran Canaria (Canary Islands, Spain). International Microbiology 2001; 4 (1): 35- 40.

(23)           Ahmady-Asbchin S., Safari M., Moradi H., Sayadi V. Antibacterial effects of methanolic and ethanolic leaf extract of Medlar (Mespilus germanica) against bacteria isolated from hospital environment. Arak Medical University Journal 2013; 16 (75): 1- 13.

(24)           Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009a, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests, 10th. ed. Approved Standard. Wayne, PA.

(25)           Valadbeygi T., Moradi H. An investigation of antibacterial effect of methanol and acetone extracts in some lichens in Ilam. Biological Journal of Microorganism 2013; 5 (1): 463- 50.

(26)           Kumar M., Kumar M.T., Srivastava A., Kumar G.J., Kumar S.R., Tilak R., et al. Cyanobacteria, Lyngbya aestuarii and Aphanothece bullosa as antifungal and antileishmanial drug resources. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2013; 3 (6): 458- 63.

(27)           Clinical and Laboratory Standards Institute, 2009b, Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. 17th. ed. Approved Standard. Wayne, PA.

(28)           Yilmaz M.T. Minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of boron compounds against several bacterial strains. Turkish Journal of Medical Sciences 2012; 42(1): 1423- 9.

(29)           Zandi F., Hossini R., Soltani N., Abolhasani Soorki A. Comparative Assay on the Antimicrobial Activity of Cyanobacterial Isolates from Oil-polluted and Non-polluted Areas of Khozestan (Iran). Environmental Sciences 2012; 9: 97- 106.

(30)           Tiwari A., Sharma D. Antibacterial Activity of Bloom forming Cyanobacteria against Clinically Isolated Human Pathogenic Microbes. Journal of Algal Biomass Utilization 2013; 4 (1):83- 9.

(31)           Soltani N., Khavari-Nejad R.A., Tabatabaei-Yazdi M., Shokravi S. Growth and Some metabolic Features of Cyanobacterium Fischerella Sp. FS18 in Different Combined Nitrogen Sources. Journal of Sciences Islamic Republic of Iran 2007; 18 (2): 123- 8.

(32)           Duffy C.F., Power R.F. Antioxidant and antimicrobial properties of Chinese plant extract. International Journal of Antimicrobial Agents 2001; 7: 191- 201.

(33)           Martins R.F., Ramos M., Herfindal L., Sousa J.A., Skarven K., Vasconcelos V.M. Antimicrobial and cytotoxic Assessment of Marine cyanobacteria- Synechocystis and Synechococcus. Marin Drugs 2008; 6: 1- 11

(34)           Shan L., He P., Sheen J. Intercepting host MAPK signaling cascades by bacterial type III effectors. Cell Host Microbe 2007; 1: 167- 74.

(35)           Kalemba D., Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils. Current Medicinal Chemistry 2003; 10 (10): 813- 29.

(36)           Priyadharshini R., Ambikapathy V., Pavai T. In vitro Antimicrobial Activity of Oscillatoria angustissima. International Journal of Advanced Research. 2013; 1 (4): 60- 8.

(37)           Smitka T.A., Bonjouklian R., Doolin L., Jones N.D., Deeter J.B., Yoshida W.Y., et al. Ambiguine isonitriles, fungicidal hapalindole-type alkaloids from three genera of blue-green algae belonging to the Stigonemataceae. Journal of Organic Chemistry 1992; 57: 857- 61.

(38)           Mathivanan K., Ramamuthy V., Rajaram R. Antimicrobial activity of Oscillatoria princeps and Lyngbya majuscule against pathogenic microbes. International jornal of Current Research 2010; 5: 97- 101.

(39)           Chandra K., Rajashekhar M. Antimicrobial activity of freshwater cyanobacteria isolated from pharmaceutical wastes. African Journal of Microbiology Research 2013; 7 (17): 1757- 65.

(40)           Cho W.I., Choi J.B., Lee K., Chung M.S., Pyun Y.R. Antimicrobial activity of Toilin Isolated from Torilis japonica Fruit against Bacillus subtilis. JFS M: Food Microbiology and Safety 2008; 1: 37- 43.

(41)           Cushinie T., Lamb A. Antimicrobial activity of flavonoids. International Journal of Antimicrobial Agents 2005; 26 (5): 343- 56.

(42)           Tuyet L.T.A. Chemical and Biological Investigations of Vietnamese Cyanobacteria [Dissertation]. Germany: Ernst-Moritz-Arndt University; 2010.

(43)           Raveh A., Carmeli S. Antimicrobial ambiguines from the cyanobacterium Fischerella sp. Collected in Israel. Journal of Natural Products 2007; 70: 196- 201.

(44)           Thajuddin N., Subramanian G. Cyanobacterial biodiversity and potential applications in biotechnology. Current Science 2005; 89: 47- 57.