مطالعه‏ لایه‏ سطحی و پارا اسپورال ‏بادی ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏Bacillus thuringiensis Israelensis و پیش‏بینی پایدارسازی ‏‏‏(‏‏‏Cry4Ba) ‏‏‏با ایجاد جهش نقطه ‏ای بر اساس یافته‏ های بیوانفورماتیک

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبیولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران

2 استاد میکروبیولوژی، ‏‏‏دانشگاه اصفهان، ‏‏‏ایران

چکیده

مقدمه: باسیلوس تورنجینسیس مهم‏ترین‏‏‏ عامل زیستی است که با تولید پارا اسپورال بادی، ‏‏‏نقش مهمی در مقابله با آفات کشاورزی دارد. ‏‏‏همچنین، لایه‏ سطحی تولید می‏کند که ساختاری کریستالی از جنس پروتئین یا گلیکوپروتئین است و کاربرد وسیعی در نانوبیوتکنولوژی دارد. ‏‏‏بنابراین، ‏‏‏مطالعه آن دارای اهمیت است‏‏. ‏‏‏
مواد و روش‏‏ها: در این مطالعه، پارا اسپورال بادی خالص‏سازی ‏‏‏شده، مخلوط کریستال/ اسپور با کوماسی‏بلو G250 رنگ‏آمیزی و با میکروسکوپ نوری مشاهده شدند. ‏‏‏با ایجاد جهش نقطه‏ای، ‏‏‏افزایش پایداری در پروتئین CRY4Ba پیش‏بینی شد و جایگاه حفره‏ها در این پروتئین توسط نرم افزار molegro پیش‏بینی‏شد. در نهایت، لایه ‏سطحی استخراج و شکل و وزن مولکولی آن بررسی شد. ‏‏‏به منظور مقایسه لایه ‏سطحی و پاراسپورال‏بادی، ‏‏‏برخی ویژگی‏های پروتئین آن‏ها توسط پایگاه Protparam تعیین شد. ‏‏‏
نتایج: یافته‏ها گویای‏‏‏ وجود کریستال‏های پروتئینی چند وجهی بود که پس از آزاد شدن از اسپور مجتمع می‏شوند و کریستال‏های درشت‏تر تشکیل می‏دهند. ‏‏‏همچنین، در این پژوهش‏‏‏ پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که با جایگزینی اسید آمینه‏ آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 با ایزولوسین، ‏‏‏پروتئین مقاوم‏تر کشنده حشرات CRY4Ba ایجاد می‏شود‏‏‏. ‏‏‏این پروتئین سه زیر واحدی حاوی 59 حفره است و همانند لایه‏سطحی از همین سویه، ‏‏‏درصد حضور اسیدهای آمینه‏ متیونین، ‏‏‏هیستیدین، ‏‏‏سیستئین و تریپتوفان درآن بسیار پایین است. ‏‏‏
بحث و نتیجه ‏گیری: باسیلوس تورنجینسیس در فاز اسپورزایی، کریستال‏های کشنده حشرات تولید می‏کند که این کریستال‏ها پس از رها شدن از اسپور مجتمع می‏شوند و کریستال‏های درشت‏تر را تشکیل می‏دهند. ‏‏‏پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 با ایزولوسین، ‏‏‏موجب افزایش پایداری پروتئین CRY4Ba می‏شود. ‏‏‏این باکتری در فاز رویشی پروتئین سطحی KD100 تولید می‏کند که از لحاظ ریخت‏شناسی و درصد برخی اسید‏های آمینه به پارا اسپورال‏بادی شباهت بسیاری دارد. ‏‏‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Study of the surface layer and parasporal body of Bacillus thuringiensis Israelensis) MH14) and prediction of Cry4Ba stabilization by point mutation method based on bioinformatics findings

نویسندگان [English]

  • Ghazal Babolmorad 1
  • Giti Emtiza 2
1 M.Sc. of Microbiology, University of Isfahan, Iran
2 Professor of Microbiology, University of Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction:Bacillus thuringiensis is the most important biological agent and by producing parasporal body it acts as a key role against agricultural pests. Furthermore, it produces Surface layer (S-layer) which is a protein or glycoprotein crystalline structure and has wide applications in nanobiotechnology. Accordingly it is significant to study more about this surface layer and toxin.
Materials and methods: In this study, purified parasporal body and mixed crystal/ spore were stained with coomasie blue G250 and were observed with light microscope. With a point mutation in CRY4Ba, protein stabilization was predicted and the location of protein cavities were predicted by Molegro software. Finally, the surface layer was extracted and its molecular weight and morphology were determined. To compare the surface layer and parasporal body, some features of them were estimated by the Protparam server.
Results: The results confirm the presence of polyhedral crystal proteins which were accumulated to form larger crystals after releasing spores. Also, it is predicted that in this research replacing the aspartic acid position- 451 with isoleucine, a more stable CRY4Ba pesticide protein is probably produced. This protein with three subunits contains 59 cavities and like the surface layer in this strain, it comprises low percent of methionine, histidine, cysteine and tryptophan.
Discussion and conclusion: In sporulation phase, Bacillus thuringiensis produces insecticidal crystals that integrate to form larger crystals. It is predicted that replacing the aspartic­ acid position- 451 with isoleucine would ameliorate the stability of CRY4Ba pesticide protein. This bacterium in vegetative phase produces a surface 100 KD protein which is similar to parasporal body in a shape and the percentage of some of amino acid.

کلیدواژه‌ها [English]

  • S-layer
  • Parasporal body
  • CRY4Ba
  • Bacillus thuringiensis Israelensis (MH14)

مقدمه

لایه ‏سطحی [1] ساختار کریستالی منظمی است که سطح بسیاری از باکتری‏ها و آرکئاها را به طور کامل می‏پوشاند، ‏‏‏ساختار پروتئینی دارد و بالغ بر 15 درصد کل پروتئین سلول را شامل می‏شود‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏1)‏‏‏. ‏‏‏توالی‏های ژن‏های لایه سطحی گویای‏‏‏ آن است که آن‏ها شباهت کمی با هم دارند مگر در S-layer homology domain ‏‏‏(‏‏‏slh) ‏‏‏که عامل اتصال این پروتئین به پپتید و گلیکان است ‏‏‏(‏‏‏2).‏‏‏ ‏‏‏

لایه ‏سطحی باسیلوس‏ها معمولا دارای ساختار P4 یا P2 است، ‏‏‏اگر چه لایه سطحی برخی‏‏‏ سویه‏های باسیلوس‏آنتراسیس[2]، ‏‏‏باسیلوس‏کواگولانس[3] و باسیلوس‏استئاروترموفیلوس[4] ساختار خطی یا مورب دارد ‏‏‏(‏‏‏3).‏‏‏ ‏‏‏سطح باسیلوس‏تورنجینسیس[5] دارای لایه سطحی با تقارن P2 است که سطح خارجی آن صاف و سطح داخلی آن موج‏دار است ‏‏‏(‏‏‏4).‏‏‏ ‏‏‏وزن مولکولی لایه سطحی در باسیلوس‏ها بین 66 تا 255 KD است. ‏‏‏باسیلوس آنتراسیس دو نوع Slp ‏‏‏(‏‏‏Sap وEA1) ‏‏‏دارد که در طی رشد سنتز می‏شوند به این ترتیب که Sap قبل از EA1 سنتز می‏شود‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏5).‏‏‏ ‏‏‏در باسیلوس‏تورنجینسیس پروتئین لایه‏ ‏‏‏سطحی، ‏‏‏Slp A نامیده می‏شود‏‏‏‏‏‏ که بسیار به Sap شباهت دارد ‏‏‏(‏‏‏6).‏‏‏ ‏‏‏باسیلوس تورنجینسیس باکتری است که در فاز اسپور‏زایی، ‏‏‏سمی از جنس پروتئین تولید می‏کند که کشنده حشرات است، ‏‏‏مجتمع می‏شود‏‏‏‏‏‏ و پارا اسپورال‏بادی[6] تشکیل می‏دهد. ‏‏‏پارا اسپورال بادی‏ها معمولا به خاطر شکل کریستالی خود با نام Cry ‏‏‏(‏‏‏از کلمه کریستال آمده است) ‏‏‏پروتئین/توکسین[7] شناخته می‏شود ‏‏‏(‏‏‏7).‏‏‏ ‏‏‏عامل کشنده حشرات در Bacillus thuringiensis israelensisدلتا توکسین است که زمانی که میکروارگانیسم در حالت مرگ است تولید می‏شود‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏8). ‏‏‏Cry پروتئین‏ها ویژگی‏های شیمیایی بسیار خاصی دارند وزن مولکولی آن‏ها بالاست، در برابر پروتئولیز مقاوم هستند و در اسیدیته‏ قلیایی محلول می‏شوند ‏‏‏(‏‏‏9).‏‏‏ ‏‏‏Cry توکسین‏ها در سطح اسپور قرار دارند و توسط اگزوسپوریوم[8] محافظت می‏شود‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏(‏‏‏10).‏‏‏ ‏‏‏به این انکلوژن بادی‏ها[9] کریستال‏های پروتئینی کشنده حشرات می‏گویند. ‏‏‏چهار کلاس اصلی از ژن‏های Cry و پروتئین‏های Cry بر اساس اختصاصیت میزبان و درجه تشابه توالی آمینو اسیدشان شناخته شده است: Cry I، ‏‏‏Cry II، ‏‏‏Cry III و Cry IV ‏‏‏(‏‏‏11).‏‏‏ ‏‏‏از آنجا که باسیلوس‏تورنجینسیس با تولید کریستال‏های پروتئینی خود مهم‏ترین‏‏‏ عامل زیستی کنترل آفات در سراسر جهان است ‏‏‏(‏‏‏12) ‏‏‏و از طرفی تولید کننده لایه سطحی است که لایه S با زیر واحد‏هایی در مقیاس نانو و خاصیت خود آرایه‏اش کاربرد وسیعی در نانوبیوتکنولوژی دارد ‏‏‏(‏‏‏13)، ‏‏‏‏‏‏استخراج و خالص‏سازی ‏‏‏لایه سطحی و
پارا اسپورال‏بادی و مطالعه‏ ‏‏‏ویژگی‏های آن‏ها دارای اهمیت است. ‏‏‏از آنجا که پروتئین Cry به عنوان سم کشنده حشرات استفاده می‏شود‏‏‏‏‏‏ افزایش مقاومت و پایداری آن در بیوتکنولوژی و کشاورزی با اهمیت است.

در این مطالعه، از دو سرور CUPSAT و MaStab برای پیش‏بینی افزایش پایداری پروتئین Cry4Ba بر اساس جهش نقطه‏ای در یک اسید‏آمینه این پروتئین استفاده شد. ‏‏‏[10]CUPSAT یک ابزار تحت وب برای تجزیه تحلیل و پیش‏بینی تغییرات پایدار پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای ‏‏‏(‏‏‏جهش تک اسید‏آمینه‏ای) ‏‏‏است. ‏‏‏این برنامه از پتانسیل محیط ساختاری اتم خاص و توان زاویه‏ ‏‏‏پیچش برای پیش‏بینی Delta Delta G، ‏‏‏تفاوت در انرژی آزاد آشکار بین پروتئین‏های وحشی و جهش‏یافته استفاده می‏کند و نیازمند ساختار پروتئین با فرمت Protein Data Bank و جایگاه اسیدآمینه‏ای که قرار است در آن جهش رخ دهد، است. ‏‏‏نتایج شامل اطلاعاتی در مورد جایگاه جهش، ‏‏‏ویژگی‏های ساختاری ‏‏‏(‏‏‏دسترسی حلال، ‏‏‏ساختار دوم و زاویه ‏‏‏چرخش) ‏‏‏و اطلاعات جامع در مورد تغییرات در ثبات پروتئین در شرایط 19 تعویض ممکن در یک جهش خاص اسید‏آمینه است و نتایج را بر اساس 1538 جهش از دناتوراسیون حرارتی و 1603 جهش از دناتورسیون شیمیایی آزمایش می‏کند. ‏‏‏در انتها چندین آزمایش اعتبار سنجی برای اطمینان از قابل اعتماد بودن و دقت کار انجام می‏دهد. بر این اساس بیش از 80 درصد دقت در پیش‏بینی را به همراه دارد ‏‏‏(‏‏‏14).‏‏‏ ‏‏‏MuStab نیز برای پیش‏بینی تغییرات پایداری پروتئین بر اساس جایگزینی اسید‏های آمینه طراحی شده‏است. ‏‏‏

در این مطالعه برای نخستین‏‏‏ بار لایه سطحی
Bacillus thuringiensis israelensis ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏استخراج، وزن مولکولی آن تعیین و با میکروسکوپ نوری ارزیابی شد. ‏‏‏همچنین، برای نخستین‏‏‏ بار
پارا اسپورال بادی از اسپور‏های این باکتری استخراج و با میکروسکوپ نوری بررسی شد و با ایجاد جهش نقطه‏ای در توالی پروتئین CRY4Ba با استفاده از دو سرور CUPSAT و MaStab افزایش پایداری پروتئین پیش‏بینی شد و برخی ویژگی‏های Slp و CRY4Ba از Bacillus thuringiensis israelensis ‏‏‏(‏‏‏MH14) ‏‏‏توسط سرور protparam بررسی شد. ‏‏‏


.مواد و روش‏ها

.سویه باکتری و شرایط کشت: باسیلوس‏تورنجینسیس MH14از آزمایشگاه میکروب‏شناسی دانشگاه اصفهان تهیه و در دمای30 درجه سانتی‏گراد در محیط BHIB [11]‏‏‏‏‏‏ ‏‏‏کشت داده شد. ‏‏‏سویه یاد شده پس از کشت در محیط NA به شکل اسپور در دمای منفی 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد. ‏‏‏

.آماده‏سازی ‏‏‏نمونه کریستال/ اسپور برای بررسی با میکروسکوپ نوری: اسمیری از مخلوط اسپور/ باکتری/ کریستال به روی لام قرار داده شده با حرارت تثبیت و با محلول کوماسی‏بلو G250 به مدت 3 دقیقه رنگ آمیزی شد. ‏‏‏سپس با آب مقطر شسته، ‏‏‏خشک و با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی X 100 مشاهده شد. ‏‏‏

.جداسازی و خالص‏سازی ‏‏‏پارا اسپورال‏بادی: مخلوط اسپور/ کریستال از محیط NA در 5 میلی‏لیتر آب مقطر استریل جمع‏آوری و به مدت 10 دقیقه دور rpm 10000 برای نشست اسپورها سانتریفیوژ[12] و مایع رویی حاوی کریستال‏های پروتئینی برای زدودن کامل اسپورها، 5 بار دیگر سانتریفیوژ شد. ‏‏‏در نهایت، کریستال‏های پروتئینی با سانتریفیوژ در دور rpm 19000 به مدت 30 دقیقه حاصل شدند ‏‏‏(‏‏‏15) ‏‏‏سپس، دو نمونه برای مشاهده میکروسکوپی تهیه شد: نمونه اول به طور مستقیم روی لام قرار داده، ‏‏‏لامل‏گذاری و با میکروسکوپ مشاهده شد. ‏‏‏نمونه دوم ابتدا با کوماسی‏بلو G250 رنگ آمیزی و پس از آن بامیکروسکوپ بررسی شد.

.تعیین غلظت پروتئین با معرف برد‏فورد [13]: برای تعیین غلظت پروتئین از روش برادفورد و از ‏‏‏(‏‏‏BSA) ‏‏‏Bovine serum albumin به عنوان استاندارد استفاده شد ‏‏‏(‏‏‏16).‏‏‏ ‏‏‏

.مطالعات بیوانفورماتیکی [14]: توالی و ساختارسه بعدی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به‏دست آمد. با استفاده از سرور CUPSAT افزایش پایداری پروتئین با جهش نقطه‏ای تصادفی بر اساس دناتوراسیون حرارتی و دناتوراسیون شیمیایی در ASP موقعیت 451 پیش‏بینی شد. ‏‏‏جهش‏های یکسان برپایه ‏‏‏هر دو نوع دناتوراسیون انتخاب و با سرور MaStab نیز در رنجی از دما و اسیدیته‏ بررسی و بهترین جهشی که پایداری را افزایش می‏داد پیش‏بینی شد. ‏‏‏همچنین، جایگاه حفره در این پروتئین با استفاده از نرم افزار Molegro پیش‏بینی و جایگاه اتصال فلزات به این پروتئین بر اساس یافته‏های NCBI شناسایی شد. ‏‏‏توالی پروتئین Slp از Bacillus thuringiensis israelensis از NCBI و توالی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به دست آمد و با استفاده از سرور protparam برخی ویژگی‏های آن‏ها بررسی شد.

.جداسازی لایه سطحی‏‏‏‏: هنگامی که جذب نوری سوسپانسیون حاوی باکتری در طول موج 600 نانومتر به 9/0 رسید سلول‏ها سانتریفیوژ11 و دو بار توسط آب دو بار تقطیر شسته شدند و تحت تیمار 5 مولار گوانیدین هیدروکلراید به مدت 60 دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند. ‏‏‏سپس به مدت 10 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفیوژ ‏‏‏(‏‏‏15) ‏‏‏و مایع‏رویی که حاوی پروتئین لایه سطحی است علیه 10میلی‏مولار CaCl2 دیالیز[15] شد ‏‏‏(‏‏‏17).

.تحلیل‏‏‏ پروتئین لایه ‏‏‏سطحی توسط SDS page: برای انجام این تحلیل‏‏‏ 10 میکرو‏لیتر نمونه پروتئین با 10 میکرو‏لیتر بافر نمونه مخلوط شده و به مدت 10 دقیقه در 100 درجه سانتی‏گراد جوشانده شد. آنگاه روی ژل پلی آکریل آمید 10 درصد جریان یافت؛ ‏‏‏سپس، ژل با کوماسی‏بلو G250 رنگ آمیزی و برای حذف رنگ‏های اضافی رنگ بری شد. ‏‏‏

.بررسی میکروسکوپی لایه ‏سطحی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14: برای بررسی ریخت شناسی لایه سطحی مقداری از لایه سطحی خالص بر روی لام قرار گرفت. پس از خشک شدن در دمای اتاق ساختار آن توسط میکروسکوپ نوری مشاهده شد. ‏‏‏

 

.نتایج

با توجه به این‏که باسیلوس‏تورنجینسیس می‏تواند سم ضد حشرات تولید کند، ‏‏‏غربال‏گری سویه‏های تولیدکننده ‏‏‏کریستال پارااسپوررال‏بادی و مطالعه ‏‏‏ساختار آن‏ها از اهمیت خاصی برخوردار است. ‏‏‏برای بررسی اطلاعات بیشتر در مورد Cry toxin با استفاده از سرورهای موجود اطلاعاتی در مورد این سم حاصل شد. ‏‏‏در این پژوهش‏‏‏ ساختار و ویژگی‏های سم Cry4Ba از Bacillus Thuringiensis Israelensis با یافته‏های بیوانفورماتیکی بررسی شد‏ه است. ‏‏‏بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از NCBI دلتا اندو توکسین سم حشره‏کش است که در طی اسپور‏زایی تولید می‏شود‏‏‏. ‏‏‏اندوتوکسین تولید شده به اپیتلیوم روده متصل می‏شود‏‏‏ و با لیز‏ سلول‏ها به مرگ منجر می‏شود‏‏‏. ‏‏‏همان گونه که در شکل 1 نشان داده شده، ‏‏‏دلتا اندوتوکسین فعال شامل سه دومین[16] ساختاری است: دومین N انتهایی یا هلیکال یا دومین I، ‏‏‏که در قرار گرفتن سم در غشا و ایجاد سوراخ نقش دارد؛ در حالی که دومین شماره II و III در اتصال به گیرنده نقش دارند. ‏‏‏دومین شماره III یا دومین C انتهایی از لحاظ ساختاری به دومین متصل شونده به کربوهیدرات 6 ‏‏‏(‏‏‏CBM6) ‏‏‏شباهت دارد و امکان دارد که حشره به طور اختصاصی از واکنش پروتئین- پروتئین و یا پروتئین-کربوهیدرات توسط دومین شماره II و III تشخیص داده شود. ‏‏‏

 

 

شکل 1- موقعیت قرارگیری سه دومین پروتئین CRY4Ba بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از NCBI. ‏‏‏‏‏‏

اندوتوکسین تولید شده به اپیتلیوم روده حشرات متصل می‏شود‏‏‏ و با لیز‏ سلول‏ها به مرگ منجر می‏شود. ‏‏‏

 

 

از آنجاکه یافتن جایگاه اتصال به فلزات و مناطق حفاظت شده دارای اهمیت هستند و از طرفی ایجاد موتاسیون در این مناطق مطلوب نیست بنابراین، ‏‏‏به کمک پایگاه اطلاعات NCBI جایگاه این مناطق مشخص شد. ‏‏‏جایگاه اتصال به فلزات در همه ‏‏‏Cry toxin‏ها شامل: سه اسید آمینه بسیار حفاظت شده ‏‏‏پرولین، ‏‏‏والین و آسپارتیک اسید است. ‏‏‏این سه اسید‏آمینه جایگاه اتصال به فلزات هستند و می‏توانند به Ca2+ و Na+ متصل شوند. ‏‏‏

در مقایسه دومین شماره سه Cry4Ba با نه توالی مشابه ‏‏‏(‏‏‏پروتئین‏های کریستالی کشنده حشرات، ‏‏‏هیپوتتیکال پروتئین و دلتا اندو توکسین) ‏‏‏مشخص شد که سه اسید‏آمینه حفاظت شده که در جایگاه‏های مشخصی از پروتئین قرار دارند و جایگاه اتصال به فلزات هستند‍‍ در تمامی این نه توالی در سویه‏های مختلف باسیلوس تورنجینسیس بسیار حفاظت شده هستند. ‏‏‏به‏علاوه توالی همه‏ دلتا‏ اندوتوکسین‏ها شباهت بالایی به یکدیگر دارند. ‏‏‏

در این پژوهش‏‏‏ پارا اسپورال‏بادی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14برای بررسی بیشتر و تعیین شکل کریستال‏های آن با روش ساده رنگ آمیزی کوماسی بلو G250 بررسی شد. ‏‏‏

در مشاهدات میکروسکوپ نوری از لام تهیه شده از کریستال/ اسپور/ باکتری رنگ‏آمیزی شده با کوماسی‏بلوG250 مطابق شکل 2 کریستال‏های آزاد شده از اسپورها قابل تشخیص است. ‏‏‏آبی رنگ بودن کریستال‏ها تایید کننده ‏‏‏ساختار پروتئینی آن‏هاست. ساختار لوزی شکل آن‏ها نشان‏دهنده آن است که
پارا اسپورال بادی این سویه به ‏شکل کریستال‏های لوزی شکل است. ‏‏‏اسپور‏ها سفید رنگ و بیضی شکل هستند و سلول‏های رویشی به شکل باسیل‏های آبی دیده می‏شوند، ‏‏‏کریستال/ اسپور‏ها هم به شکل اجسام سفید رنگ در سلول‏های آبی قابل مشاهده هستند که در واقع پارا اسپورال‏بادی‏های ترشح شده از اسپور، ‏‏‏اسپور را در برگرفته است که هم نشان‏دهنده آزاد شدن این کریستال‏های پروتئینی از اسپور است و هم نشان‏دهنده ‏‏‏تولید بالای این کریستال‏ها از اسپور است به شکلی که اطراف اسپور سازنده‏اش را در برگرفته‏است ‏‏‏(‏‏‏شکل 2).‏‏‏

 

‏‏‏

 

 

 

شکل 2- تصویر میکروسکوپ نوری از لام تهیه شده از کشت کهنه‏ باسیلوس‏تورنجینسیس MH14. ‏‏‏کریستال‏های آزاد شده از اسپورها قابل تشخیص است، ‏‏‏آبی رنگ بودن کریستال‏ها تایید کننده ‏‏‏ساختار پروتئینی آن‏هاست. ساختار لوزی شکل آن‏ها نشان‏دهنده آن است که پارا اسپورال بادی این سویه به‏ شکل کریستال‏های لوزی شکل است. ‏‏‏اسپور‏ها سفید رنگ و بیضی شکل هستند. سلول‏های رویشی به شکل باسیل‏های آبی دیده می‏شوند. ‏‏‏کریستال/ اسپور‏ها هم به شکل اجسام سفید رنگ در سلول‏های آبی قابل مشاهده هستند. ‏‏‏بار نشان دهنده 1000 نانومتر است. ‏‏‏

 

 

سپس نمونه‏خالص از پارا اسپورال‏بادی تهیه‏شد به این شکل که مخلوط اسپور/ کریستال از محیط NA در آب مقطر استریل جمع آوری و با دور rpm 10000 برای نشست اسپورها سانتریفیوژ و مایع رویی حاوی کریستال‏های پروتئینی برای زدودن کامل اسپورها 5 بار دیگر سانتریفیوژ شد. ‏‏‏در نهایت، کریستال‏های پروتئینی با سانتریفیوژ در دور rpm 19000 به مدت 30 دقیقه حاصل شد. ‏‏‏از پارا اسپورال‏بادی‏ها‏ی جداسازی شده دو لام تهیه‏شد یکی بدون رنگ‏آمیزی و یکی رنگ شده با کوماسی‏بلو G250، ‏‏‏همان گونه که در شکل 3 نشان داده شده، ‏‏‏نمونه خالص پارا اسپورال بادی رنگ آمیزی نشده به شکل کریستال‏های درشت چند وجهی ‏‏‏(‏‏‏شکل 3-الف) ‏‏‏و نمونه رنگ آمیزی شده با کوماسی بلو G250 به شکل کریستال‏های آبی رنگ مشاهده می‏شود‏‏‏ که تایید کننده جنس پروتئینی آن‏هاست ‏‏‏(‏‏‏شکل3- ب).‏‏‏ ‏‏‏در شکل 3 کریستا‏ل‏های درشت پارا اسپورال بادی مشاهده می‏شود‏‏‏ اما همان‏گونه که در شکل 2 نشان‏داده‏شده این کریستال‏ها هنگامی که از اسپور رها می‏شوند به شکل کریستال‏های کوچک لوزی شکل هستند اما پس از خالص شدن به شکل کریستال‏های درشت مجتمع شده‏اند که نشان‏دهنده ‏‏‏تمایل این کریستال‏ها برای مجتمع‏شدن پس از رهایی از اسپور است. ‏‏‏شایان ذکر است که پس از استخراج پارا اسپورال بادی میزان پروتئین نمونه با معرف برادفورد انداره‏گیری شد که بر اساس منحنی استاندارد میزان پروتئین 29 میکروگرم در 1 میلی‏لیتر بوده است. ‏‏‏

شکل 3- ‏‏‏(‏‏‏الف) ‏‏‏و ‏‏‏(‏‏‏ب) ‏‏‏- تصویر میکروسکوپ نوری از پارا اسپورال‏بادی‏های جداسازی شده از اسپور است. ‏‏‏

این تصویر نشان دهنده تجمع کریستال‏های پروتئینی و تشکیل کریستال درشت پارا اسپورال بادی است. ‏‏‏بزرگ نمایی X40. ‏‏‏

 

 

برای پیش‏بینی جایگاه حفره ساختار سه بعدی پروتئین Cry4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏با PDB ID: 1W99 گرفته شد و با نرم افزار Molegro جایگاه حفره‏هایش پیش‏بینی شد. ‏‏‏هر زیر واحد این پروتئین 11 حفره دارد در حالی که مجموع این سه زیر واحد در کنار هم حاوی 59 حفره است. ‏‏‏جایگاه اتصال به فلزات که شامل سه اسید آمینه ‏‏‏حفاظت‏شده ‏‏‏آسپارتیک‏اسید موقعیت 626، ‏‏‏پرولین موقعیت 484 و والین موقعیت 486 است با استفاده از نرم افزار Molegro در ساختار سه بعدی پروتئین Cry4Ba تعیین و مشخص شد که جایگاه حفاظت شده اتصال فلزات در ناحیه حفره‏های پروتئین قرار ندارند. ‏‏‏

از آنجا که Cry4Ba یک سم کشنده حشرات است افزایش مقاومت این پروتئن مطلوب است. بر این اساس کوشش شد که افزایش پایداری این پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای در یک اسید‏آمینه آن پیش‏بینی شود. ‏‏‏برای این کار از دو سرور CUPSAT و MuStab استفاده شد. ‏‏‏CUPSAT یک ابزار تحت وب برای پیش‏بینی تغییرات پایدار پروتئین بر اساس جهش نقطه‏ای ‏‏‏(‏‏‏جهش تک اسید‏آمینه‏ای) ‏‏‏است. ‏‏‏این برنامه از پتانسیل محیط ساختاری اتم خاص و توان زاویه ‏‏‏پیچش برای پیش‏بینی Delta Delta G، ‏‏‏تفاوت در انرژی آزاد آشکار بین پروتئین‏های وحشی و جهش‏یافته استفاده می‏کند و نیازمند ساختار پروتئین با فرمت Protein Data Bank و جایگاه اسیدآمینه‏ای که قرار است در آن جهش رخ دهد می‏باشد. ‏‏‏نتایج شامل: اطلاعاتی در مورد جایگاه جهش، ‏‏‏ویژگی‏های ساختاری ‏‏‏(‏‏‏دسترسی حلال، ‏‏‏ساختار دوم و زاویه ‏‏‏چرخش) ‏‏‏و اطلاعات جامع در مورد تغییرات در ثبات پروتئین در شرایط 19 تعویض ممکن در یک جهش خاص اسید‏آمینه است و نتایج را بر اساس 1538 جهش از دناتوراسیون حرارتی و 1603 جهش از دناتورسیون شیمیایی آزمایش می‏کند. ‏‏‏در انتها چندین آزمایش اعتبار سنجی برای اطمینان از قابل اعتماد بودن و دقت کار انجام می‏دهد. بر این اساس بیش از 80 درصد دقت در پیش‏بینی را به همراه دارد ‏‏‏(‏‏‏14) ‏‏‏و MuStab نیز برای پیش‏بینی تغییرات پایداری پروتئین بر اساس جایگزینی اسید‏های آمینه طراحی شده‏است. ‏‏‏

توالی و ساختارسه بعدی پروتئین CRY4Ba از بانک اطلاعات پروتئین ‏‏‏(‏‏‏PDB) ‏‏‏به‏دست آمد. با استفاده از سرور CUPSAT افزایش پایداری پروتئین با جهش نقطه‏ای تصادفی بر اساس دناتوراسیون حرارتی و دناتوراسیون شیمیایی در ASP موقعیت 451 پیش‏بینی شد. ‏‏‏جدول‏های 1 و 2 نشان‏دهنده نتایج پیش‏بینی پایداری Cry4Ba با جهش نقطه‏ای بر اساس دناتوراسیون حرارتی و شیمیایی با استفاده از سرور CUPSAT در آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 هستند. ‏‏‏از بین جهش‏های ایجاد شده جهش‏هایی که در هر دو مورد پایدار و دارای پیچش مطلوب و شامل: جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت 451 با اسیدهای‏آمینه ‏‏‏LEU, ILE, MET, TRP, THR, PHE, TYR و HIS بودند انتخاب و با سرور Mustab در رنجی از شرایط اسیدیته‏ و دما بررسی شدند. جایگزینی همه ‏‏‏اسید‏های ‏آمینه به ‏جز IEU موجب کاهش پایداری می‏شدند. شرایط در دو دمای 37 و 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 تا 8 بررسی شد. نتایج این پیش‏بینی برای جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در جدول 3 بیان شده‏است. ‏‏‏بر اساس نتایج سرور Mustab پیش‏بینی شد که ممکن است از بین این جهش‏ها جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته 5‏ و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین، اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با بیشترین ضریب‏‏‏ ‏اطمینان ‏‏‏(‏‏‏93/23 درصد)، ‏‏‏و پس از آن در شرایط اسیدیته‏ 6 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین، اسیدیته‏ 3 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 57/23 درصد موجب افزایش پایداری و مقاوت این سم ‏شود‏‏‏. ‏‏‏همان‏گونه که در جدول 3 مشاهده‏ می‏شود‏‏‏ جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ قلیایی در هر دو دمای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد موجب کاهش پایداری Cry4Ba می‏شود.‏‏‏ همچنین، شرایط اسیدیته‏ 1 و دمای 25 درجه سانتی‏گراد نیز باعث کاهش پایداری می‏شود‏‏‏.


جدول 1- نتایج سرور CUPSAT از ایجاد جهش نقطه ای بر اساس دناتوراسیون حرارتی در آسپارتیک‏اسید موقعیت451. ‏‏‏پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت451 با اسید‏های‏آمینه والین، ‏‏‏لوسین، ‏‏‏ایزولوسین، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏ترئونین، ‏‏‏فنیل‏آلانین، ‏‏‏تیروزین و هیستیدین دارای پیچش مطلوب و ساختار پایدار است. ‏‏‏

جایگاه جهش

جایگاه اسیدآمینه

نوع اسید آمینه وحشی

زنجیره

PDB

451

Asp

A

1W99

ویژگی‏های ساختاری

زاویه پیچش ‏‏‏(‏‏‏ΨوΦ) ‏‏‏

درجه حلالیت

نوع رشته

°1/119- °1/134-

درصد ‏04/18

شیت

اسید‏های آمینه جهش یافته

اسید آمینه

پیچش

پایداری کلی

GΔΔ پیش بینی شده ‏‏‏(‏‏‏kcal/mol) ‏‏‏

GLY

نامطلوب

ناپایدار

97/2-

ALA

نامطلوب

پایدار

9/0

VAL

مطلوب

پایدار

98/5

LEU

مطلوب

پایدار

11/4

ILE

مطلوب

پایدار

53/6

MET

مطلوب

پایدار

83/0

PRO

نامطلوب

ناپایدار

06/2-

TRP

مطلوب

پایدار

43/3

SER

نامطلوب

ناپایدار

3/2-

THR

مطلوب

پایدار

71/0

PHE

مطلوب

پایدار

99/2

GLN

نامطلوب

ناپایدار

54/1-

LYS

نامطلوب

پایدار

81/3

TYR

مطلوب

پایدار

28/3

ASN

نامطلوب

ناپایدار

49/1-

CYS

مطلوب

ناپایدار

18/3-

GLU

نامطلوب

پایدار

5/6

ARG

نامطلوب

ناپایدار

13/0-

HIS

مطلوب

پایدار

39/0

           

 

جدول 2- نتایج سرور CUPSAT از ایجاد جهش نقطه ای بر اساس دناتوراسیون شیمیایی در آسپارتیک‏اسید موقعیت451. ‏‏‏پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی آسپارتیک‏اسید موقعیت451 با اسید‏های‏آمینه لوسین، ‏‏‏ایزولوسین، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏ترئونین، ‏‏‏فنیل‏آلانین، ‏‏‏تیروزین و هیستیدین دارای پیچش مطلوب و ساختار پایدار است. ‏‏‏

 

جایگاه جهش

جایگاه اسیدآمینه

نوع اسید آمینه وحشی

زنجیره

PDB

451

Asp

A

1W99

ویژگی‏های ساختاری

زاویه پیچش ‏‏‏(‏‏‏ΨوΦ) ‏‏‏

درجه حلالیت

نوع رشته

°1/119- °1/134-

درصد ‏04/18

شیت

اسید‏های آمینه جهش یافته

اسید آمینه

پیچش

پایداری کلی

GΔΔ پیش بینی شده ‏‏‏(‏‏‏kcal/mol) ‏‏‏

GLY

نامطلوب

پایدار

97/2-

ALA

نامطلوب

پایدار

9/0

VAL

مطلوب

ناپایدار

98/5

LEU

مطلوب

پایدار

11/4

ILE

مطلوب

پایدار

53/6

MET

مطلوب

پایدار

83/0

PRO

نامطلوب

پایدار

06/2-

TRP

مطلوب

پایدار

43/3

SER

نامطلوب

پایدار

3/2-

THR

مطلوب

پایدار

71/0

PHE

مطلوب

پایدار

99/2

GLN

نامطلوب

پایدار

54/1-

LYS

نامطلوب

پایدار

81/3

TYR

مطلوب

پایدار

28/3

ASN

نامطلوب

پایدار

49/1-

CYS

نامطلوب

ناپایدار

18/3-

GLU

نامطلوب

پایدار

5/6

ARG

نامطلوب

پایدار

13/0-

HIS

مطلوب

پایدار

39/0

           

جدول 3- نتایج پیش‏بینی جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در دو دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 تا 8 با استفاده از سرور Mustab. ‏‏‏نتایج نشان دهنده ‏‏‏آن است که جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ 5 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 93/23 درصد؛ و پس از آن در شرایط اسیدیته‏ 6 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین اسیدیته‏ 3 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 57/23 درصد موجب افزایش پایداری و مقاوت این سم می‏شود‏‏‏. ‏‏‏همچنین، این جایگزینی در شرایط اسیدیته‏ قلیایی در هر دو دمای 25 و 37 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته‏ 1 و دمای 25 درجه سانتی‏گراد نیز باعث کاهش پایداری Cry4Ba می‏شود‏‏‏. ‏‏‏

 

جایگزینیASP موقعیت 451 با IEU

ضریب‏‏‏ اطمینان

دما (درجه سانتی‏گراد)

اسیدیته‏

کاهش پایداری

37

8

کاهش پایداری

25

8

04/23

37

7

86/22

25

7

57/23

37

6

04/23

25

6

93/23

37

5

21/23

25

5

93/23

37

4

21/23

25

4

57/23

37

3

04/23

25

3

04/23

37

2

86/22

25

2

86/22

37

1

کاهش پایداری

25

1

 

از سوی دیگر باسیلوس تورنجینسیس در فاز رشد لگاریتمی، پروتئین سطحی تولید می‏کند. ‏‏‏برای مطالعه بیشتر، ‏‏‏این لایه توسط نمک گوانیدین هیدروکلراید استخراج شد. نتایج SDS page نشان دهنده حضور چند لایه پروتئینی بر روی ژل پلی آکریل آمید بود و یک باند قوی KD100 مشاهده شد ‏‏‏(‏‏‏شکل 4).‏‏‏ ‏‏‏

شکل 4- نتایج SDS page پروتئین لایه سطحی

باسیلوس‏تورنجینسیس MH14: مشاهده باند kD100

 

 برای مقایسه آرایش پارا اسپورال بادی با پروتئین لایه‏سطحی تصویر میکروسکوپ نوری از لایه‏سطحی تهیه شد. ‏‏‏همان‏طور که در شکل 5 نشان داده شده، تصویر میکروسکوپی لایه‏سطحی خالص نشان دهنده حضور کریستال‏های درشت و صفحات گسترده از پروتئین لایه سطحی است که منومرهای آن که به شکل خود آرایه به یکدیگر اتصال یافته و آرایش منظمی پیدا کرده‏اند. ‏‏‏سایز برخی از این صفحات کریستالی به بیش از 2 میکرومتر می‏رسد. ‏‏‏البته برای کریستاله کردن لایه S معمولا از سطوحی مانند میکا، لیپوزوم و سیلیکون استفاده می‏شود. مطالعات نشان می‏دهد که خودآرایه لایه S باسیلوس‏ها به روی سطوح هیدروفوب بهتر است. در پژوهشی که بر روی لایه S کالوباکتر انجام شد، شبکه کریستاله منظم در نمونه‏هایی که به روی سیلیکون هیدروفوب کریستاله شده بودند یافت شد (18).

برای آنکه پروتئین Slp که در فاز لگاریتمی رشد تولید می‏شود‏‏‏ را با پروتئین Cry4Ba مقایسه کنیم، ‏‏‏توالی آن‏ها را که از NCBI به‏دست آمده بود با سرور protparam بررسی کرده، برخی ویژگی‏های آن‏ها را با یکدیگر مقایسه کردیم. ‏‏‏مطابق جدول 4 اطلاعات به‏دست آمده از سرور protparam گویای‏‏‏ آن است که Slp از Bacillus thuringiensis israelensis فاقد اسیدآمینه سیستئین است و درصد حضور اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین و هیستیدین بسیار پایین است. ‏‏‏همچنین، اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین کم‏ترین درصد حضور را میان اسید‏های آمینه پروتئین Cry4Ba دارند.

 

 

 

شکل 5- ساختار صفحات کریستالی پروتئین لایه سطحی باسیلوس‏تورنجینسیس MH14با بزرگ‏نمایی X 100 ‏‏‏(‏‏‏الف) ‏‏‏و X 40 ‏‏‏(‏‏‏ب).‏‏‏ ‏‏‏علامت بار نشان دهنده 1000 نانومتراست. ‏‏‏

جدول 4- درصد حضور برخی اسیدهای آمینه در پروتئینSlp و Cry4Ba از Bacillus thuringiensis israelensis بر اساس اطلاعات به‏دست آمده از prot param. ‏‏‏اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین کم‏ترین درصد حضور را میان اسیدهای آمینه در هر دو پروتئین دارند. ‏‏‏

نوع اسید آمینه

Trp ‏‏‏(‏‏‏W) ‏‏‏

Met ‏‏‏(‏‏‏M) ‏‏‏

His ‏‏‏(‏‏‏H) ‏‏‏

Cys ‏‏‏(‏‏‏C) ‏‏‏

درصد حضور در پروتئین SlpA

‏9/0

‏8/1

‏1

‏0/0

درصد حضور در پروتئین Cry4Ba

‏4/1

‏6/1

‏1/1

‏2/0

 


.بحث و نتیجه ‏‏گیری

نتایج مشاهده شده از کشت مخلوط اسپور کریستال گویای‏‏‏ آزاد شدن کریستال‏های پروتئینی از اسپورهاست. از آنجا که در رنگ‏ آمیزی با کوماسی بلوG250 پروتئین‏ها به رنگ آبی دیده می‏شوند، آبی شدن کریستال‏ها در رنگ آمیزی با این رنگ اثبات کننده جنس پروتئینی این کریستال‏هاست که با یافته‏های شریف[xvii] و همکارش در سال 1988 مطابقت دارد ‏‏‏(‏‏‏19).‏‏‏ ‏‏‏باسیلوس تورنجینسیس باکتری است که در فاز اسپورزایی سمی کریستالی تولید می‏کند که کریستال‏های تک مجتمع می‏شوند و پارا اسپورال بادی‏ها را تولید می‏کنند ‏‏‏(‏‏‏7) ‏‏‏در لام تهیه شده از کریستال‏های پروتئینی خالص کریستال‏های درشتی مشاهده می‏شود‏‏‏ که علت آن تجمع کریستال‏های تک پس از آزاد شدن از اسپور و تشکیل کریستال‏های درشت است. ‏‏‏Cry4Ba از Bacillus thuringiensis israelensiیک سم منحصر به فرد برای از بین بردن لارو Ades و پشه ‏‏‏آنوفل[xviii] است ‏‏‏(‏‏‏20).‏‏‏ ‏‏‏پیش‏بینی جایگاه و تعداد حفره‏ها در Cry4Ba با استفاده از نرم‏افزار Molegro انجام و مشخص شد در هر زیر واحد این پروتئین 11 حفره وجود دارد. ولی پس از قرار گیری سه زیر واحد در کنار هم 59 حفره در سه زیر واحد Cry4Ba توسط نرم‏افزار Molegro تشخیص داده شد که نشان‏دهنده ‏‏‏آن است که تجمع زیر واحد‏ها در کنار هم به تشکیل آرایشی منجر می‏شود‏‏‏ که تعداد زیادی حفره را در بر دارد. ‏‏‏با توجه به اهمیت پایداری این سم در محیط کوشش شد افزایش پایداری این سم بر اساس جهش نقطه‏ای پیش‏بینی شود. ‏‏‏برای آن‏که جهش در نقاط حفاطت شده مطلوب نیست این نقاط شناسایی و مشخص شد که سه اسید‏آمینه ‏‏‏والین، ‏‏‏پرولین و آسپارتیک‏اسید در جایگاه‏های خاص در تمامی
Cry toxin‏ها محل اتصال به فلزات و بسیار حفاظت شده هستند. ‏‏‏به‏ علاوه با استفاده از نرم‏افزار Molegro مشخص شد که این سه اسید‏آمینه حفاظت شده در ناحیه ‏‏‏حفره قرار ندارند. ‏‏‏برای پیش‏بینی پایداری پروتئین از دو سرور CUPSAT و MuStab استفاده و پیش‏بینی شد که از بین جهش‏های ایجاد شده بهترین جهش جایگزینی ASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ 5 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با بیش‏ترین ضریب‏‏‏ ‏اطمینان ‏‏‏(‏‏‏93/23 درصد) ‏‏‏است که موجب افزایش پایداری سم می‏شود‏‏‏. ‏‏‏

باسیلوس‏تورنجینسیس MH14که در این مطالعه استفاده شد پروتئین سطحی با وزن مولکولی KD100 را تولید کرد. ‏‏‏‏‏‏پنا[xix] و همکارانش در سال 2006 از
 Bacillus thuringiensis سویه GP1 پروتئین لایه‏سطحی KD100 را خالص‏سازی ‏‏‏کردند که با یافته‏های این پژوهش مطابقت دارد. ‏‏‏لایه سطحی GP1 ‏‏‏(‏‏‏Slp) ‏‏‏99 درصد ‏با پروتئین EA1 از باسیلوس آنتراسیس شباهت دارد. ‏‏‏EA1 پروتئینی است که در طول فاز اسپور‏زایی تولید می‏شود‏‏‏ و تولیدش تحت کنترل پروتئین Sap است که هم در فاز لگاریتمی و هم فاز اسپور‏زایی تولید می‏شود‏‏‏. ‏‏‏در مطالعه آن‏ها برای نخستین‏‏‏ بار مشاهده شد که Slp هم می‏تواند همانند پارا اسپورال بادی در بیماری‏زایی باکتری مؤثر باشد ‏‏‏(‏‏‏15).‏‏‏ ‏‏‏با توجه به این یافته‏ها می‏توان گفت Slp استخراج شده از
باسیلوس‏تورنجینسیس MH14 با وزن مولکولی KD100 شباهت بالایی به KD Slp GP1100 دارد. ‏‏‏همچنین، تصویر میکروسکوپ نوری تهیه شده از لایه سطحی خالص باسیلوس تورنجینسیس گویای‏‏‏ حضور صفحات کریستالی درشت پروتئینی است که این کریستال‏ها از لحاظ ریخت‏شناسی شباهت بالایی به کریستال‏های خالص پارا اسپورال بادی دارند. ‏‏‏برای بررسی شباهت‏های بین لایه سطحی و Cry toxin توالی Slp و Cry4Ba ازBacillus thuringiensis israelensis با استفاده از سرور Protparam بررسی شدند، ‏‏‏که مشخص شد Slp از Bacillus thuringiensis israelensis فاقد اسیدآمینه سیستئین و درصد حضور اسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین و هیستیدین بسیار پایین است. ‏‏‏همچنین، اسید‏های آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین کم‏ترین درصد حضور را میان اسید‏های آمینه پروتئین Cry4Ba دارند. ‏‏‏لوکرویچ[xx] و همکارش در سال 1989 اعلام کردند پروتئین لایه ‏‏‏سطحی باسیلوس تورنجینسیس ساختار کمابیش هیدروفوبی است که فاقد اسید‏های آمینه ‏‏‏سیستئین، ‏‏‏متیونین و تریپتوفان است ‏‏‏(‏‏‏5) ‏‏‏این داده‏ها با اطلاعات به‏دست آمده از بررسی‏های بیوانفورماتیکی پروتئین Slp از
 
Bacillus thuringiensis israelensis مطابقت دارد. ‏‏‏

بنابراین، می‏توان گفت پروتئین سطحی باسیلوس تورنجینسیس که منومرهای آن به شکل کریستال‏های درشت و صفحات گسترده خود آرایه می‏شوند، ‏‏‏پروتئینی با وزن مولکولی KD100 است که با پروتئین Sap از باسیلوس آنتراسیس شباهت دارد. ‏‏‏همچنین، این باکتری در فاز اسپورزایی کریستال‏های چند وجهی کوچکی ترشح می‏کند که این کریستال‏ها پس از آزاد شدن از اسپور، مجتمع می‏شوند وکریستال‏های درشت‏ترکه همان سم کشنده حشرات است را تشکیل می‏دهند. ‏‏‏شباهت‏هایی از لحاظ درصد حضور اسیدهای آمینه بین پروتئین Slp و پروتئین Cry4Ba وجود دارد. به این شکل که درصد حضوراسیدهای آمینه ‏‏‏تریپتوفان، ‏‏‏متیونین، ‏‏‏هیستیدین و سیستئین در هر دو پروتئین بسیار پایین است. ‏‏‏با توجه به این مسأله و شباهت ساختاری کریستال‏های این دو پروتئین و یافته‏های پنا و همکارانش می‏توان گفت ممکن است لایه سطحی باسیلوس تورنجینسیس که در سلول رویشی تولید می‏شود و
پارا اسپورال بادی، از لحاظ ساختار کلی و درصد حضور برخی اسیدهای آمینه شباهت دارند. ‏‏‏همچنین، پیش‏بینی می‏شود‏‏‏ که جایگزینی ASP موقعیت 451 با IEU در شرایط اسیدیته‏ 5 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد، همچنین، اسیدیته‏ 4 و دمای 37 درجه سانتی‏گراد با ضریب‏‏‏ ‏اطمینان 93/23 درصد موجب افزایش پایداری سم می‏شود‏‏‏.



[1]- S- layer

[2]- Bacillus anthracis

[3]- Bacillus coagulans

[4]- Bacillus stearothermophilus

[5]-Bacillus thuringiensis

[6]- Parasporal body

[7]- Toxin

[8]- Exosporium

[9]- Inclusion body

[10]- Cologne University Protein Stability Analysis Tool

[11]- Brain heart infusion broth

[12]- Centrifuge

[13]- Bradford

[14]- Bioinformatics

[15]- Dialysis

[16]- Domain

[xvii]- Sharif

[xviii]- Anophele

[xix]- Pen˜a

[xx]- Luckevich

(1)               Beveridge TJ., Pouwels PH., Sára M., Kotiranta A., Lounatmaa K., Kari K., et al. functions of s-layers. FEMS microbiology reviews 1997; 20 (1- 2): 99- 149.

(2)               Schnepf E., Crickmore N., Van Rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J., et al. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins. Microbiology and molecular biology reviews 1998; 62 (3): 775- 806.‏‏‏ ‏‏‏

(3)               Sleytr UB., Messner P. Crystalline surface layers on bacteria. Annual Reviews in Microbiology 1983; 37 (1): 311- 39.

(4)               Luckevich MD., Beveridge TJ. Characterization of a dynamic S layer on Bacillus thuringiensis. Journal of bacteriology 1989; 171 (12): 6656- 67.

(5)               Mignot T., Mesnage S., Couture- Tosi E., Mock M., Fouet A. Developmental switch of S- layer protein synthesis in Bacillus anthracis. Molecular microbiology 2002; 43 (6): 1615- 27.

(6)               Ming S., Chenguang v., Ziniu Y. Cloning of parasporal body protein gen resembling to s-layer protein genes from Bacillus thuringiensis CTC strain [J]. Acta Microbiologica Sinica 2001; 2: 002.

(7)               Ammons DR., Reyna A., Granados JC., Samlal MS., Rampersad JN. An investigation of Bacillus thuringiensis in rectal-collected fecal samples of cows. Current microbiology 2009; 59 (5): 532- 36.

(8)               Moazami D. Composition for treatment against mosquito larvae and process for its preparation 2003; EP Patent 1, 306, 008.

(9)               Vázquez-Padróna RI., Gonzáles-Cabreraa J., Garcia- Tovar C., Neri-Bazanc L., Lopéz-Revillac R., Hernándezc M., et al. Cry1Ac Protoxin from Bacillus thuringiensis sp. kurstaki HD73 Binds to Surface Proteins in the Mouse Small Intestine. Biochemical and Biophysical Research Communications 2000; 271 (1) 54- 8.

(10)           Du C., Nickerson KW. Bacillus thuringiensis HD-73 Spores Have Surface-Localized Cry1Ac Toxin: Physiological and Pathogenic Consequences. Appl Environ Microbiol 1996; 62 (10): 3722- 6.

(11)           Höfte H., Whiteley HR.Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis. Microbiological reviews 1989; 53 (2) 242-55.

(12)           Ammouneh H., Harba M., Idris E., Makke H. Isolation and characterization of native Bacillus thuringiensis isolates from Syrian soil and testing of their insecticidal activities against some insect pests. Turkish journal of agriculture and forestry2011; 35: 421- 31.

(13)           Schuster B., Pum D., Sara M., Sleytr UB. ‏‏‏S-layer proteins as key components of a versatile molecular construction kit for biomedical nanotechnology. Mini reviews in medicinal chemistry 2006; 6 ‏‏‏(‏‏‏8)‏‏‏: 909- 20.

(14)           Parthiban V., Gromiha M M., Schomburg D. CUPSAT: prediction of protein stability upon point mutations. Nucleic Acids Research 2006; 34 (suppl 2): W239- 242.

(15)           Pen˜a G., Miranda-Rios J., de la Riva G., Pardo- Lo´pez L., Sobero´n M., Bravo A. A Bacillus thuringiensis S- layer protein involved in toxicity against Epilachna varivestis (Coleoptera: Coccinellidae). Applied and environmental microbiology 2006; 72 (1): 353- 60.

(16)           Bradford MM. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry1976; 72: 248- 54.

(17)           Pum D., Sára M., Sleytr UB. Structure. surface charge., and self-assembly of the S-layer lattice from Bacillus coagulans E38-66. Journal of bacteriology 1989; 171 (10): 5296- 303.

(18)           Habibi N., Zohrabi T. Isolation of S-Layer from Caulobacter and re-crystallization on planar supports. Biological Journal of Microorganism 2015; 4 (13): 57-66.

(19)           Sharif FA., Alaeddinoĝlu NG. A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis. Journal of industrial microbiology 1988; 3 (4): 227- 29.

(20)           Boonserm P., Davis P., Ellar D J., & Li J. Crystal structure of the mosquito-larvicidal toxin Cry4Ba and its biological implications. Journal of molecular biology 2005; 348 (2): 368- 82.