ارزیابی آثار مهاری عصاره‏ های گیاه گز (Tamarix hispida) بر فرم منفرد و بیوفیلمی 6 باکتری پاتوژن

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه شهید باهنر کرمان، دانشکده علوم، گروه زیست‌شناسی

چکیده

مقدمه: بیوفیلم‏های میکروبی از میکروارگانیسم‏های محصور در ماتریکسی از پلیمر‏های خارج سلولی تشکیل شده‏اند. سازمان‏یابی سلول‏ها در ساختار یک بیوفیلم موجب کاهش اثر‏بخشی ترکیبات ضد‏میکروبی شده و مهار میکروارگانیسم‏ها را دشوار‏تر می‏کند. با توجه به مشکلات ناشی از تشکیل بیوفیلم‏ها در صنعت و پزشکی و همچنین گسترش مقاومت‏های دارویی، دستیابی به شیوه‏های نوین، به منظور مهار میکروارگانیسم‏های مقاوم به ویژه در شکل بیوفیلمی الزامی است. از این‏رو در این پژوهش، قابلیت مهاری عصاره‏های Tamarix hispidaبر فرم منفرد و بیوفیلمی 6 باکتری پاتوژن بررسی شد‏‏.
مواد و روش ها: اثر‏بخشی عصاره‏ها بر فرم منفرد با آزمون انتشار دیسک تعیین و مقادیر MICو MBC به روش ماکروبراث دایلوشن به دست آمد. آثار ضد ‏بیوفیلمی عصاره‏های T. hispida نیز با روش میکروتیتر پلیت بررسی شد.
نتایج: در این پژوهش، قابلیت عصاره‏های گیاه گز در مهار فرم منفرد و بیوفیلمی باکتری‏های پاتوژن تایید و مشخص شد که نوع اتانولی عصاره در مهار میکروارگانیسم‏ها کارآمدتر از نوع متانولی است. اثر مهاری عصاره‏ها بر ساختار‏های بیوفیلمی هر باکتری به نوع حلال و غلظت عصاره وابسته بوده و بیش‏ترین اثر مهاری بر پدیده‏ تشکیل بیوفیلم باکتری استافیلوکوکوس اورئوس (35/87 درصد) مشاهده شد. بیش‏ترین تخریب ساختار‏های بیوفیلمی در تیمار با عصاره‏های T. hispida در باکتری استرپتوکوکوس پنومونیه (71/62 درصد) مشاهده شد. عصاره‏های یاد شده موجب کاهش درخور توجهی در فعالیت متابولیکی بیوفیلم‏ها نیز بودند که باسیلوس سرئوس بیش‏ترین کاهش (34/88 درصد) را در این سنجش نشان داد.
بحث و نتیجه ‏گیری: بر اساس نتایج این مطالعه قابلیت بالای عصاره‏های T. hispidaدر مقابله با باکتری‏های انتخابی تایید و این عصاره‏ها به عنوان گزینه‏ مناسبی در مقابله با سویه‏های یاد شده پیشنهاد شدند.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Inhibitory effects of Tamarix hispida extracts on planktonic form and biofilm formation of six pathogenic bacteria

نویسندگان [English]

  • Zianab Mohsenipour 1
  • Mehdi Hassanshahian 2
1 M.Sc. of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
2 Assistant Professor of Microbiology, Shahid Bahonar University of Kerman, Iran
چکیده [English]

Introduction: Biofilms are communities of microorganisms embedded in a self-produced extracellular polymeric matrix. Bacterial cells are protected from antimicrobial agents in biofilm structure. Biofilms formation cause many problems in industry, medicine and microbial drug resistance; thus it is essential to find new techniques for removing and inhibiting biofilms. This study aimed to examine the antimicrobial effect of Tamarix hispida alcoholic extracts against six pathogenic bacteria in planktonic and biofim forms.
Materials and methods: Antimicrobial activities of the plant extracts against the planktonic form of bacteria were evaluated by using the disc diffusion method. MIC and MBC values were determined by a macrobroth dilution technique. Anti-biofilm effects were assessed by microtiter plate method.
Results: The results of this study confirmed high ability of T. hispida extracts against the biofilm of tested bacteria and their free-living forms. Methanolic extracts better inhibited bacterial growth and biofilm formation than ethanolic extracts. Anti-biofilm effects of plant extracts were depended on the solvent and extract concentration. The maximum inhibitory effects of T. hispida extracts on biofilm formation, demolish of biofilm structure and inhibition of metabolic activity of bacteria in the biofilm were observed for S. aureus (87/35 %), S. pneumonia (74/49 %) and B. ceruse (88/34 %) respectively.
Discussion and conclusion: In this study the capacity of herbal extracts to encountering whit biofilm was demonstrated and it was confirmed that these extracts have interesting potentiality to become active agents of new drugs.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Biofilm
  • Tamarix hispida
  • Drug resistant
  • Pathogenic bacteria
  • Antimicrobial effect

مقدمه.

بیوفیلم‏ها اجتماعات میکروبی سازمان‏یافته‏ای هستند که درون ماتریکسی از پلیمر‏های آب‏دار خارج سلولی محصور شده و بر سطوح جان‏دار و یا بی‏جان تشکیل می‏شوند (1). علاوه بر سطوح طبیعی، بر سطح تجهیزات صنعتی مانند سطوح درگیر در تهیه‏ مواد غذایی، سیستم‏های توزیع و مخازن نگهداری آب، سیستم‏های تهویه هوا و مخازن نفتی نیز می‏توان ساختار‏های بیوفیلمی را مشاهده کرد. تشکیل این ساختار‏ها توسط ارگانیسم‏های پاتوژن بر سطوح تجهیزات پزشکی، ابزار‏های کاشتنی و اعضای مصنوعی نیز مشکلات بالینی بسیاری را ایجاد کرده است (2). افزون بر این، مقاومت یک میکروارگانیسم نسبت به عوامل ضد‏میکروبی زمانی‏که این سلول در ساختاریک بیوفیلم وارد می‏شود، هزاران بار بیشتر از فرم منفرد خود شده و از این‏رو بیوفیلم‏ها یکی از علت‏های مهم بروز و گسترش مقاومت‏های دارویی محسوب می‏شوند (3).

در دهه‏های اخیر گسترش مقاومت‏های دارویی در‏میان میکروارگانیسم‏های پاتوژن از یک سو و آثار زیان‏بار ناشی از مصرف آنتی‏بیوتیک‏ها از سوی دیگر، موجب شده تا پژوهش‏های بسیاری به منظور دستیابی به ترکیبات ضد‏میکروبی جدید انجام شود (4). در این راستا ترکیبات زیستی و به ویژه، گیاهان دارویی بسیار مورد توجه پژوهشگران بوده‏اند. سابقه طولانی کاربرد گیاهان دارویی در طب سنتی و شناسایی بسیاری از خواص درمانی‏شان طی سال‏های متمادی، همچنین مقبولیت عام، دسترسی آسان، هزینه پایین تولید و عدم بروز مشکلات زیست محیطی همه از مزایایی هستند که این گروه از مشتقات زیستی را به یکی از گزینه‏های مناسب برای مهار سویه‏های میکروبی مقاوم تبدیل کرده است (5).

گیاه گز با نام علمی hispida Tamarixو به خانواده Tamaricaceae متعلق است. گز درختچه‏ای کوتاه با انشعابات زیاد و سخت بوده که گاه به علت جست‏های پاجوش به شکل درختچه در‏ می‏آید. این گیاه بیشتر در اراضی شوره‏زار و مناطق خشک و نیمه خشک جهان و به ویژه ایران می‏روید. پوست درخت گز دارای مقادیری از تانن و اسید گالیک بوده و در برگ‏های آن اسکولین یافت می‏شود. پلی ساکارید گزنگبین نیز از این گیاه استخراج می‏شود. افزون بر برگ‏های گیاه یاد شده، صمغ گزانگبین نیز خواص درمانی دارد. از برگ‏های گز برای درمان اسهال، زخم‏های سوختگی، قطع خونریزی و التیام جوش‏های صورت استفاده می‏شود. گزانگبین نیز برای تسکین دل درد کودکان، رفع تنگی نفس و سر درد مفید است (6 و 7). در مطالعات بسیاری خواص ضد‏میکروبی گونه‏های مختلف گیاه گز بررسی شده است. پژوهش‏های یاد شده بیشتر با تکیه بر فرم منفرد میکروارگانیسم‏ها انجام شده و به ساختار‏های بیوفیلمی توجه کمتری شده است. برای مثال مشخص شده که عصاره‏ی گیاه T. diocia اثر مهاری مناسبی بر قارچ‏های آسپرژیلوس فلاووس، کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا گلبراتا داشته (8) و عصاره‏های گیاه T. macrocapra نیز باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و کاندیدا آلبیکنس را به خوبی مهار می‏کند (9). برای مثال قابلیت مهاری عصاره‏ T. diociaبر قارچ‏های آسپرژیلوس فلاووس، کاندیدا آلبیکنس و کاندیدا گلبراتا تایید (8) و همچنین، مشخص شده که گونه‏ T. macrocapra قادر است باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس و کاندیدا آلبیکنس را به خوبی مهار کند (9).

این پژوهش به منظور ارزیابی خواص ضد میکروبی عصاره‏های اتانولی و متانولی گونه‏ جدیدی از گیاه گز (T. hispida) بر فرم منفرد و ساختار‏های بیوفیلمی 6 باکتری پاتوژن در آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه شهید باهنر کرمان انجام شد. میکروارگانیسم‏های یاد شده شامل 3 باکتری گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و استرپتوکوکوس پنومونیه و 3 باکتری گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا، اشرشیاکلی و کلبسیلا پنومونیه بودند. باکتری‏های یاد شده همگی از پاتوژن‏های مهم انسانی محسوب می‏شوند که در دهه‏های اخیر با کسب مقاومت‏های دارویی مشکلات بسیاری را ایجاد کرده‏اند.

 

.مواد و روش‏ها.

جمع‏آوری، شناسایی و تهیه عصاره‏های گیاهی: گیاه گز از درختچه‏های حومه‏ شهر رفسنجان جمع‏آوری و در هرباریوم دانشکده‏ علوم دانشگاه شهید باهنر از نظر علمی شناسایی شد. ساقه‏های نازک و برگ‏های گیاه گز در سایه خشک و سپس، به کمک آسیاب برقی و الک تا حد ممکن پودر شد. 50 گرم از پودر گیاه گز به ترتیب به ارلن‏های حاوی 500 میلی‏لیتر اتانول 80 درصد و 500 میلی‏لیتر متانول 96 درصد افزوده و درب ارلن‏ها با ورقه‏ آلومینیومی، کامل بسته شد. به منظور استخراج ترکیبات موثر گیاه گز، ارلن‏ها به مدت 24 ساعت به دستگاه شیکر با سرعت 180 دور در دقیقه و دمای 38 درجه سانتی‏گراد منتقل و سپس، برای حذف قطعات اضافی، محلول از کاغذ صافی عبور داده شد. محلول فیلتر شده برای تبخیر حلال اضافی در دستگاه روتاری وارد و سپس، در آون 40 درجه سانتی‏گراد به پودر خشک عصاره تبدیل شد. مقدار 100 میلی‏گرم از پودر خشک هر عصاره‏ در حجم مناسبی از دی متیل سولفوکساید حل و سپس، با عبور از فیلتر میلی‏پور استریل شد. پس از این محلول یاد شده با افزودن آب مقطر استریل به حجم یک میلی‏لیتر رسانده شده و این محلول به عنوان محلول ذخیره‏ عصاره (100 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) تا زمان مصرف در ظروف شیشه‏ای استریل و تیره در دمای 4 درجه‏ سانتی‏گراد نگهداری شد (10).

میکروارگانیسم‏های مورد بررسی: بررسی خواص ضد‏میکروبی T. hispida بر باکتری‏های گرم مثبت استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سرئوس و استرپتوکوکوس پنومونیه و همچنین، باکتری‏های گرم منفی سودوموناس آئروژینوزا، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه انجام شد. استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه سویه‏های جداسازی شده از بیماران بوده و از آزمایشگاه میکروب‏شناسی دانشگاه علوم پزشکی کرمان تهیه شدند. باسیلوس سرئوس سویه‏ جداسازی شده از دام بوده و از دانشکده دامپزشکی دانشگاه باهنر تهیه شد. سودوموناس آئروژینوزا نیز سویه جداشده از خاک بوده و از دانشکده علوم دانشگاه باهنر تهیه شد. از هر میکروارگانیسم یک سویه انتخاب و کشت مرجع آن در یخچال نگهداری شده و هر ماه در نوترینت آگار تجدید کشت شد. در مورد استرپتوکوک پنومونیه از محیط بلاد آگار استفاده شد.

.بررسی اثر ضد‏میکروبی عصاره‏ها بر فرم منفرد به روش انتشار دیسک: تعیین قابلیت مهاری عصاره‏های الکلی T. hispida بر باکتری‏های انتخابی در ابتدا به کمک آزمون انتشار دیسک انجام شد. برای این منظور 5 عدد دیسک بلانک استریل در شرایط آسپتیک به محلول ذخیره‏ عصاره (100 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) وارد و به مدت 2 ساعت در آن باقی ماند. سپس، دیسک‏ها به یک پلیت استریل منتقل و حلال اضافه هر دیسک در آون 40 درجه تبخیر شد (11). در این بررسی دیسک آنتی‏بیوتیک کلرامفنیکل (30 میکروگرم / دیسک) شاهد مثبت بود. برای اطمینان از عدم تأثیر هر‏یک از حلال‏های به کار‏رفته در عصاره‏گیری و حل کردن مجدد عصاره‏ها، دیسک‏های آغشته به اتانول، متانول و دی متیل سولفوکساید به عنوان شاهد منفی آزمایش انتخاب شدند.

برای انجام آزمون انتشار دیسک، از محیط مرجع هر باکتری در محیط نوترینت براث[1]کشت 24 ساعته تهیه و سپس، هر سوسپانسیون تا رسیدن به کدورتی معادل 5/0 مک فارلند[2]رقیق شد. از سوسپانسیون‏های یاد شده کمک سوآب استریل در محیط مولر هینتون آگار[3] کشت سفره‏ای انجام شد. پس از این دیسک‏های آغشته به عصاره، حلال و آنتی‏بیوتیک در شرایط آسپتیک و با فاصله‏های منظم بر سطح پلیت قرار گرفته و پلیت‏ها به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه‏ی سانتی‏گراد انکوبه شدند. قطر هاله‏های مهاری هر دیسک پس از انکوباسیون با خط‏کش میلی‏متری اندازه‏گیری شد (12).

.تعیین حداقل غلظت مهار‏کنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره‏های گیاهی: به منظور دستیابی به حداقل غلظت مهار‏کننده[4]عصاره‏های گیاه گزاز روش ماکروبراث دایلوشن و طبق پروتکلCLSI [5] استفاده شد (10). بدین جهت 10 غلظت 50 تا 02/0 میلی‏گرم / میلی‏لیتر از محلول ذخیره‏ عصاره و به شیوه‏ رقیق سازی متوالی (13) تهیه شد. 10 لوله‏ آزمایش استریل انتخاب و به هریک مقدار یک میلی‏لیتر محیط نوترینت براث استریل افزوده شد. سپس، به لوله‏ اول یک میلی‏لیتر از محلول ذخیره‏ عصاره وارد و به خوبی مخلوط شد تا غلظت نهایی عصاره در لوله‏ اول50 میلی‏گرم / میلی‏لیتر به دست آید. یک میلی‏لیتر از این محلول در شرایط آسپتیک به لوله‏ دوم منتقل و به خوبی مخلوط شد تا غلظت عصاره نصف لوله‏ اول و 25 میلی‏گرم / میلی‏لیتر شود. به همین ترتیب غلظت‏های سوم تا دهم عصاره در لوله‏های بعدی تهیه شد.

سپس، به هر غلظت مقدار یک میلی‏لیتر از کشت 24 ساعته باکتری در محیط نوترینت براث که به کدورتی معادل 5/0 مک فارلند رسانده شده بود، افزوده شد. در این آزمون، لوله‏های کنترل مثبت حاوی سوسپانسیون میکروبی و آنتی‏بیوتیک سیپروفلوکساسین (2 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) (ثامن دارو، مشهد، ایران)، لوله‏های کنترل منفی حاوی سوسپانسیون میکروبی و آب مقطر استریل و در نهایت، لوله‏های شاهد عصاره حاوی غلظت مورد نظر از عصاره و محیط نوترینت براث بودند. تمامی مراحل یاد شده در شرایط آسپتیک انجام و لوله‏ها به مدت 18 ساعت در دمای 37 درجه‏ی سانتی‏گراد انکوبه شدند. پس از انکوباسیون کدورت ایجاد شده در لوله‏های آزمون با کدورت کنترل منفی و شاهد عصاره مقایسه و کم‏ترین غلظتی که رشد باکتری در آن مهار شده بود به عنوان MIC انتخاب شد.

برای محاسبه حداقل غلظت کشندگی[6]عصاره‏های گیاه گز از لوله‏های مورد بررسی در آزمونMIC، در محیط مولر هینتون آگار فاقد عصاره گیاهی کشت انجام شده و کم‏ترین غلظتی که باکتری در آن رشد نکرد به عنوان MBC تعیین شد.

.ارزیابی قابلیت مهاری عصاره‏های گیاهی بر پدیده‏ تشکیل بیوفیلم: قدرت مهار پدیده‏ تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصاره‏های T. hispida به کمک روش میکرو‏تیتر پلیت بررسی شد. در ابتدا یک لوپ از کشت مرجع هر باکتری در محیط تریپتیکاز سوی براث[7]منتقل و پس از 18 ساعت انکوباسیون تا رسیدن به کدورتی معادل یک مک فارلند رقیق شد. غلظت‏هایی از عصاره که در این آزمون انتخاب شد شامل سه غلظت 50 تا 5/12میلی‏گرم / میلی‏لیتر بود که به روش رقیق‏سازی متوالی و از محلول ذخیره‏ عصاره با افزودن محیط تریپتیکاز سوی براث استریل تهیه شد. مقدار 100 میکرولیتر از هر غلظت در شرایط آسپتیک به چاهک‏های آزمون میکروپلیت 96 خانه استریل وارد و سپس، به هر‏یک از این چاهک‏ها 100 میکرو‏لیتر سوسپانسیون باکتریایی اضافه شد. در این آزمون چاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و چاهک شاهد عصاره همانند آزمون تعیین MICدر نظر گرفته شدند. میکروپلیت به مدت 24 ساعت و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد، بدون حرکت انکوبه شد (14).

به منظور بررسی اثر مهاری عصاره‏ها پس از انکوباسیون از روش رنگ‏آمیزی کریستال ویوله استفاده شد. در ابتدا محتویات چاهک‏های میکروپلیت به آرامی آسپیره و هر چاهک دو مرتبه با بافر سالین فسفات شسته شد. سپس، برای تثبیت ساختار‏های بیوفیلمی 150 میکرو‏لیتر متانول به مدت 15 دقیقه به چاهک‏ها افزوده شد. پس از آسپیره‏ متانول، 200 میکرو‏لیتر کریستال ویوله (محلول یک درصد جرمی- حجمی در اتانول 90 درصد) به چاهک‏ها وارد و میکرو‏پلیت به مدت 20 دقیقه در دمای 30 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. رنگ اضافی هر چاهک با جریان آرام آب شیر شسته شده و پس از خشک شدن پلیت، جذب نوری هر چاهک با افزودن 160 میکرولیتر اسید استیک گلاسیال 33 درصد در طول موج 630 نانومتر و با دستگاه الایزا ریدر معین شد (15). درصد مهار تشکیل پدیده‏ تشکیل بیوفیلم در تیمار با عصاره‏های T. hispida به کمک فرمول زیر محاسبه شد (16):

..  100 *= percent Inhibition.

 

در این فرمول C میانگین جذب نوری چاهک‏های کنترل منفی، B میانگین جذب نوری چاهک‏های کنترل محیط، T میانگین جذب نوری چاهک‏های آزمون در غلظت مورد نظر و E میانگین جذب نوری چاهک‏های شاهد عصاره همان غلظت است.

.بررسی قابلیت عصاره‏های گیاهی در تخریب ساختار‏های بیوفیلمی: به منظور بررسی قابلیت عصاره‏های گیاه گز در تخریب ساختار‏های بیوفیلمی باکتری‏های انتخابی، ابتدا بیوفیلم هر باکتری تشکیل و سپس، غلظت‏های مختلف عصاره (50  تا 5/12 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) بر این ساختار‏ها اثر داده شد. در این آزمون نیزچاهک کنترل مثبت، کنترل منفی و چاهک شاهد عصاره همانند آزمون تعیین MIC در نظر گرفته شدند. این بررسی به روش سانداسی[8] (17) انجام و در آن برای تشکیل بیوفیلم، 100 میکرولیتر از کشت 24 ساعته باکتری‏ها در محیط تریپتیکاز سوی براثکه به کدورتی معادل یک مک فارلند رسانده شده بود به چاهک‏های آزمون و کنترل منفی میکروپلیت وارد و پلیت یاد شده به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه بدون حرکت انکوبه شد. شایان ذکر است که به چاهک‏های شاهد محیط کشت و شاهد عصاره‏ این میکروپلیت نیز 100 میکرولیتر محیط تریپتیکاز سوی براث استریل افزوده شده بود. پس از گذشت زمان انکوباسیون، محتویات چاهک‏ها به آرامی و در شرایط آسپتیک آسپیره شد. به منظور حذف سلول‏های پلانکتونیک، چاهک‏ها دو مرتبه با بافر سالین فسفات شسته شدند و سپس، به چاهک‏های آزمون و شاهد عصاره مقدار 100 میکرولیتر از هر غلظت اضافه و پلیت یاد شده برای 24 ساعت دیگر در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و بدون حرکت انکوبه شد. پس از این مدت میکروپلیت‏ با روش رنگ‏آمیزی کریستال ویوله بررسی و درصد تخریب ساختار‏های بیوفیلمی به کمک فرمولی که پیش‏تر اشاره شد محاسبه شد.

.سنجش قابلیت عصاره‏های گیاهی در مهار فعالیت متابولیکی ساختار‏های بیوفیلمی: در این بررسی نیز به همان طریق که در بخش قبل شرح داده شد، ابتدا ساختار‏های بیوفیلمی تشکیل و سپس، غلظت‏های مورد نظر از عصاره (50 تا 5/12 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) بر این ساختار‏ها اثر داده شد. پس از گذشت زمان انکوباسیون به چاهک‏های تیمار و شاهد مقدار 50 میکرو‏لیتر از رنگ TTC[9] افزوده و میکروپلیت به مدت سه ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از این مدت جذب نوری چاهک‏ها در طول موج 490 نانومتر تعیین شد (18).

.تحلیل آماری یافته‏ها: همه آزمون‏ها در این بررسی با سه تکرار انجام شده، اختلاف بین داده‏ها با آزمون تحلیل واریانس (آنوا[10]) و در نرم افزار اس. پی. اس. اس [11]18 مقایسه و اعداد دارای مقدار P[12] کمتر از 05/0 معنادار فرض شدند. سپس، اختلافات حقیقی بین گروه‏ها در آزمون انتشار دیسک به کمک آزمون دانکن[13]بررسی شد. در آزمون‏های انجام شده بر ساختار‏های بیوفیلمی به علت فاکتور‏های متعدد مؤثر در آزمایش و فزونی داده‏ها، از آوردن دسته‏بندی‏های آزمون یاد شده صرف نظر شده و آثار متقابل فاکتور‏های مؤثر در هر آزمایش با آزمون ال. اس. دی[14]بررسی شد.

 

نتایج

.قابلیت عصاره‏های گیاهی در مهار فرم منفرد باکتری‏های مورد بررسی: قطر هاله‏های مهاری هر‏یک از عصاره‏های اتانولی و متانولی T. hispida در شکل 1 و مقادیر MIC و MBC عصاره‏های یاد شده در جدول 1 آمده است. بر این اساس قدرت مهاری عصاره‏ اتانولی بر فرم منفرد بیشتر از نوع متانولی آن است. در آزمون انتشار دیسک عصاره‏های گیاه گز قادر به مهار باکتری‏های مورد مطالعه در سطح معنا‏داری یک درصد بودند(P value<0/01). البته شایان ذکر است که قابلیت مهاری عصاره‏های T. hispidaبر باکتری استرپتوکوکوس پنومونیه در سطح 5 درصد معنا‏دار نیست (P value=0/086). بزرگترین هاله‏ی مهاری در آزمون یاد شده بر باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس و کلبسیلا پنومونیه تشکیل شد.

در محیط مایع نیز همانند محیط جامد به کار ‏رفته در آزمون انتشار دیسک کلبسیلا پنومونیه بیش‏ترین و استرپتوکوکوس پنومونیه کم‏ترین حساسیت را به عصاره‏های گیاه گز نشان دادند.

 

 

شکل 1- مقایسه قطر هاله‏ مهاری عصاره‏های گیاه گز و آنتی‏بیوتیک شاهد (میلی‏متر). حروف مشابه a, b, c, … بر اساس آزمون دانکن با یکدیگر در سطح 5 درصد اختلاف معنا‏دار ندارند.

 

جدول 1- مقادیر MIC و MBC عصاره‏های T. hispida(میلی‏گرم / میلی‏لیتر)

باکتری

MIC عصاره

متانولی

MIC عصاره

اتانولی

MBC عصاره

متانولی

MBC عصاره

اتانولی

استافیلوکوکوس اورئوس

12/3

56/1

5/12

12/3

باسیلوس سرئوس

56/1

78/0

12/3

56/1

استرپتوکوکوس پنومونیه

25/6

12/3

25

5/12

سودوموناس آئروژینوزا

12/3

78/0

5/12

12/3

اشریشیا کلی

12/3

56/1

25/6

25/6

کلبسیلا پنومونیه

78/0

39/0

56/1

78/0

 


.قابلیت عصاره‏های گیاهی در مهار ساختار‏های بیوفیلمی باکتری‏های مورد بررسی: قدرت مهاری هریک از غلظت‏های انتخابی عصاره‏های T. hispida در مهار پدیده‏ تشکیل بیوفیلم، تخریب ساختار‏های بیوفیلمی و مهار فعالیت متابولیکی این ساختار‏ها به ترتیب در شکل‏های 2، 3 و 4 آمده است. با توجه به آزمون تحلیل واریانس انجام شده بر داده‏های آزمون‏های یاد شده، اثر مهاری عصاره‏های گیاه گزدر این آزمون‏ها در سطح یک درصد معنا‏دار است (P value <0/01). بر این اساس در آزمون‏های مهار تشکیل بیوفیلم و مهار فعالیت متابولیکی ساختار‏های یاد شده، نوع باکتری، نوع عصاره و غلظت بر قابلیت مهاری آن در سطح یک درصد نیز اثر معنا‏دار بوده (P value <0/01) و آثار متقابل هر‏یک از عوامل یاد شده نیز در سطح یک درصد معنا‏دار است (P value <0/01). در تخریب ساختار‏های بیوفیلمی تشکیل‏شده نیز تمامی عوامل یاد شده اثر معنا‏داری بر قدرت مهاری عصاره در سطح یک درصد داشتند
(P value <0/01). البته در آزمون یاد شده نوع عصاره (P value = 0/077)، اثر متقابل نوع عصاره و غلظت آن (P value = 0/144) که بر قدرت تخریبی عصاره‏ها در سطح 5 درصد اثر معنا‏داری نداشت.

 

 

شکل 2- مقایسه‏ اثر مهاری غلظت‏های متفاوت عصاره‏های الکلی گیاه گز بر تشکیل بیوفیلم باکتری‏های انتخابی
* نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و ** نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.

 

 

در بیشتر آزمون‏های انجام شده بر ساختار‏های بیوفیلمی، اثر مهاری انواع اتانولی عصاره‏های
 T. hispidaبیشتر از نوع متانولی آن بود. بر اساس میانگین قابلیت غلظت‏های مختلف عصاره در هر‏یک از آزمون انجام شده بر ساختار‏های بیوفیلمی، بیش‏ترین مهار پدیده‏ تشکیل بیوفیلم در باکتری استافیلوکوکوساورئوس (35/87 درصد) مشاهده شد. با وجود این عصاره‏ی متانولی گیاه گز در غلظت 5 میلی‏گرم / میلی‏لیتر قادر به مهار تشکیل بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا نبوده و عصاره‏ T. hispidaکم‏ترین اثر ‏بخشی خود را درآزمون یاد شده بر باکتری‏های باسیلوس سرئوس و سودوموناس آئروژینوزا نشان داد.

 

 

 

شکل 3- مقایسه‏ قابلیت غلظت‏های متفاوت عصاره‏های الکلی گیاه گز در حذف ساختار‏های بیوفیلمی باکتری‏های انتخابی
* نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و **نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.

 

بیش‏ترین تخریب ساختار‏های بیوفیلمی در تیمار با عصاره‏های T. hispida در استرپتوکوکوس پنومونیه (71/62 درصد) مشاهده شد. این در حالی است که نوع اتانولی عصاره‏ی گیاه گز در غلظت 5 میلی‏گرم / میلی‏لیتر قادر به تخریب بیوفیلم‏های استافیلوکوکوس اورئوس نبوده و نوع متانولی غلظت یاد شده بر تخریب ساختار‏های بیوفیلمی باسیلوس سرئوس، سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه نیز بی‏اثر بود. فعالیت متابولیکی بیوفیلم‏ها نیز در تیمار با عصاره‏های
T. hispidaبه حد درخور توجهی کاهش یافت که باسیلوس سرئوس بیش‏ترین کاهش (34/88 درصد) و سودوموناس آئروژینوزا کم‏ترین کاهش (64/39 درصد) را در این آزمون نشان دادند.

 

 

 

شکل 4- مقایسه‏ اثر غلظت‏های متفاوت عصاره‏های الکلی گیاه گز در مهار فعالیت متابولیک بیوفیلم باکتری‏های انتخابی
* نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح 5 درصد و ** نشان‏دهنده‏ مهار معنا‏دار غلظت مورد بررسی در سطح یک درصد است.

 


.بحث و نتیجه‏‏ گیری.

ظهور سویه‏های میکروبی مقاوم به دارو و گسترش روز ‏افزون مقاومت‏های دارویی موجب شده تا مقابله با بیماری‏های عفونی امروزه به یکی از مشکلات اصلی حوزه‏ درمان تبدیل شود. افزون بر این عوارض ناشی از مصرف آنتی‏بیوتیک‏ها در بیماران و مشکلات زیست محیطی حاصل از این گروه دارویی همه سبب شده تا بررسی روش‏های جدید مقابله با سویه‏های میکروبی مقاوم بسیار مورد توجه پژوهشگران باشد. در این میان توجه ویژه به بیوفیلم‏های میکروبی به علت نقش مهمی که این ساختار‏ها در بروز مقاومت‏های دارویی ایفا می‏کنند، بسیار ضروری است (4 و 19). بیوفیلم‏ها اجتماعاتی از سلول‏های میکروبی سازمان‏یافته در ماتریکسی از پلیمر‏های خارج سلولی هستند که تشکیل این ساختار‏ها بر سطوح مختلف موجب بروز مشکلات بسیاری در صنعت و پزشکی شده است (1). در راستای دستیابی به ترکیبات جدید ضد‏میکروبی، مشتقات زیستی و به ویژه گیاهان دارویی با توجه به مقبولیت عام و ماهیت طبیعی خود یکی از اصلی‏ترین انتخاب‏های پژوهشگران هستند (5). از این‏رو در این مطالعه‏ خواص ضد‏میکروبی T. hispidaبر باکتری‏های انتخابی معین و مشخص شد چنانچه پس از عصاره‏گیری به روش ماسراسیون، تغلیظ انجام شود خاصیت مهاری عصاره افزایش چشمگیری خواهد داشت.

در آزمون انتشار دیسک قابلیت عصاره‏های
 T. hispidaدر مهار فرم منفرد باکتری‏های انتخابی تایید شد. اگر‏چه در آزمون یاد شده تنها در باکتری‏های استرپتوکوکوس پنومونیه و کلبسیلا پنومونیه قدرت مهاری عصاره برابر و حتی اندکی بیشتر از آنتی‏بیوتیک شاهد بود؛ هاله‏ مهاری بسیار کوچکتری پیرامون دیسک‏های آغشته به عصاره بر کشت سایر باکتری‏ها در مقایسه با آنتی‏بیوتیک انتخابی مشاهده شد. در محیط مایع به کار‏رفته در آزمون MIC عصاره‏های T. hispidaدر غلظتی بسیار کمتر (25/6 تا 39/0 میلی‏گرم / میلی‏لیتر) از غلظت به کار‏رفته در تهیه دیسک (100میلی‏گرم/ میلی‏لیتر) رشد باکتری‏های مورد بررسی را مهار کردند و از این‏رو قابلیت مهاری عصاره‏های گیاه گز در محیط مایع چندین برابر محیط جامد است. بنابراین، می‏توان چنین نتیجه‏گیری کرد که ترکیبات موثر عصاره‏های T. hispidaهمانند بسیاری از عصاره‏های گیاهی دیگر قابلیت انتشاری اندکی در محیط جامد داشته و بر این اساس برای اثر‏گذاری مطلوب در این محیط به غلظتی بسیار بیشتر از غلظت موثر در محیط مایع نیاز است. در مقابله با ساختار‏های بیوفیلمی نیز عصاره‏های T. hispida بسیار کارآمد بوده و اثر مهاری هر عصاره‏ به غلظت و نوع حلال آن و همچنین، نوع باکتری مورد بررسی وابسته است. قابلیت عصاره‏های گیاه گزدر مهار پدیده‏ تشکیل بیوفیلم باکتری‏های انتخابی بیشتر از قدرت تخریبی آن‏ها بود. البته شایان ذکر است که در سودوموناس آئروژینوزا قابلیت عصاره‏های یاد شده در تخریب ساختار‏های بیوفیلمی بیشتر از قدرت مهاری آن‏ها در تشکیل بیوفیلم و یا سرکوب فعالیت متابولیکی این ساختار‏هاست. در این باکتری و همچنین، استرپتوکوکوس پنومونیه تفاوت محسوسی در قابلیت مهاری عصاره‏های T. hispida بر پدیده‏ تشکیل بیوفیلم و مهار فعالیت متابولیکی ساختار‏های یاد شده مشاهده نشد. در باسیلوس سرئوس عصاره‏های گز فعالیت متابولیکی ساختار‏های بیوفیلمی را بهتر از پدیده‏ تشکیل بیوفیلم مهار کردند. این در ‏حالی است که در استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی و کلبسیلا پنومونیه عکس پدیده‏ یاد شده مشاهده شد. در میان باکتری‏های یاد شده تنها در اشریشیا کلی مهار فعالیت آنزیم دهیدروژناز سلول‏ها بسیار ضعیف‏تر از تخریب ساختار‏های بیوفیلمی بوده و در دو باکتری دیگر عکس این پدیده مشاهده شد. با توجه به مکانیسم‏های متفاوت دخیل در تشکیل و گسترش بیوفیلم‏های هر‏کدام از باکتری‏های مورد مطالعه، مکانیسم‏های مهاری متفاوتی نیز از عصاره‏های
 T. hispida برای هر باکتری انتظار می‏رود. برای مثال عصاره‏های یاد شده ممکن است حاوی ترکیبات موثره‏ای باشند که با فرآیند تشکیل بیوفیلم به خوبی تداخل نموده اما قدرت تخریبی کمی بر این ساختار‏ها داشته باشد. با توجه به اینکه ترکیبات موثره عصاره‏های گیاه گز و مکانیسم اثر مهاری آن‏ها بر ساختار‏های بیوفیلمی در این مطالعه بررسی نشده و به مطالعات بعدی موکول شده است، می‏توان با شناسایی عناصر یاد شده و با توجه به مولکول‏های کلیدی متفاوت که در فرآیند تشکیل بیوفیلم باکتری‏های مورد مطالعه دخیل هستند، اختلافات مشاهده شده را تحلیل کرد.

در مطالعات دیگر نیز خواص ضد‏میکروبی گونه‏های مختلف گیاه گز تایید شده که این بررسی‏ها بیشتر بر فرم منفرد باکتری‏ها بوده و تا‏کنون مطالعه‏ای برقابلیت گیاه گز در مهار ساختار‏های بیوفیلمی انجام نشده است. برای مثال مشخص شده که فلاونوئید‏های مشتق از گونه‏
 T. gallica بر استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیا کلی، کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا و آسپرژیلوس نایجر اثر مهاری مناسبی دارد. در بررسی اشاره شده سودوموناس آئروژینوزا و کلبسیلا پنومونیه حساس‏ترین و آسپرژیلوس نایجر مقاوم‏ترین میکروارگانیسم‏ها به عصاره‏های T. gallica بوده و با افزایش غلظت عصاره قابلیت مهاری آن افزایش می‏یابد (20). در بررسی دیگری که بر همین گونه از گیاه گز انجام شده مشخص شد که عصاره‏های آبی قدرت مهاری بیشتری نسبت به عصاره‏های متانولی داشته و عصاره‏های یاد شده اثر مهاری مناسبی بر فرم منفرد باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس، اشریشیاکلی، کلبسیلا پنومونیه، سودوموناس آئروژینوزا و کاندیدا آلبیکنس دارند (21).

خواص ضد ‏میکروبی گونه‏ T. aphylla نیز بر میکروارگانیسم‏های مختلف تایید شده است. برای مثال در پژوهشی مشخص شده که عصاره‏های این گونه قابلیت مهاری مناسبی بر باکتری‏های استافیلوکوکوس اورئوس، باسیلوس سوبتیلیس، اشریشیا کلی، پروتئوس میرابیلیس و پروتئوس ولگاریس دارند اما اثر مهاری ضعیفی بر سودوموناس آئروژینوزا داشته و بر سالمونلا تیفی بی‏اثر هستند (22). در مطالعه‏ دیگری اثر ضد‏قارچی همین گونه از گیاه گز بر آلترناریا تایید شده است (23). همچنین، پتانسیل ضد ‏انگلی T. Aphyllaبر لیشمانیا تروپیکا در بررسی دیگری تایید و مشخص شده است که قدرت مهاری گیاه یاد شده با غلظت عصاره‏ به کار‏رفته و مدت زمان تیمار اثر مستقیم دارد (24).

با توجه به نتایج حاصل در این پژوهش و بررسی‏های انجام شده بر گونه‏های مختلف گیاه گز، خواص ضد‏میکروبی این گیاه تایید شده و عصاره‏های آن گزینه‏های مناسبی در مهار میکروارگانیسم‏های پاتوژن هستند. از آن‏جا که عصاره‏های الکلی T. hispida در این بررسی اثر مهاری مناسبی بر فرم منفرد و ساختار‏های بیوفیلمی باکتری‏های مورد مطالعه در شرایط آزمایشگاهی نشان دادند، مطالعات بیشتر بر خواص ضد‏بیوفیلمی گیاه گز توصیه می‏شود. به علاوه می‏توان با بررسی و تخلیص ترکیبات موثره عصاره‏هایT. hispida و همچنین، سنجش میزان اثر‏بخشی این عصاره‏ها در حیوانات آزمایشگاهی از عصاره‏های یاد شده به عنوان یک منبع ضد‏میکروبی مناسب در مقابله با میکروارگانیسم‏های پاتوژن، به ویژه در شکل بیوفیلمی بهره گرفت.



[1]- Nutrient broth, NB

[2]- 0.5 Mac farland

[3]- Muller Hinton Agar, MHA

[4]- Minimum Inhibitory Concentration, MIC

[5]- The Clinical and Laboratory Standards Institute

[6]- Minimum Bactericidal Concentration, MBC

[7]- Tryptic Soy Broth, TSB

[8]- Sandasi

[9]- TriphenylTetrazolium Chloride

[10]- ANOVA

[11]- SPSS

[12]- value P

[13]- Duncan

[14]- LSD

 

 

(1)               Thomas JG., Posey SP. Emergence of oral/dental microbiology. Advence Aministrationon Laboratory 2009; 18 (6): 35- 8.

(2)               Sutherland IW. Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria. International Daily Journal 2001; 11 (1): 663- 74.

(3)               Kavanaugh NL., Ribbeck K. Selected antimicrobial essential oils eradicate Pseudomonas spp. and Staphylococcus aureus Biofilms. Applied Environmental Micobiology 2012; 78 (11): 4057- 61.

(4)               Horiuchi K., Shiota S., Hatano T., Yoshida T., Kuroda T., Tsuchiya T. Antimicrobial activity of oleanolic acid from Salviaofficinalis and related compounds on vancomycin- resistant enterococci (VRE). Biological Pharmacology Bulletin 2007; 30 (6):1147- 9.

(5)               Das K., Tiwari RKS. Techniques for evaluation of medicinal plant products as antimicrobial agent: Current methods and future trends. Journal Medical Plant Research 4 (2): 104- 11.

(6)               Ahi EA. Pharmacological plant biology. 3th ed. Mashhad: Mashhad Universityof MedicalSciences; 2012. P25-45. [In Persian].

(7)               Mohammed Hassan KA., Eltayb N. Eucalyptus oil as a treatment for acne. International Journal Advence Pharmacology Science 2013; 4 (4): 557- 66.

(8)               Khan S., Khan GM., Mehsud S., Rahman A., Khan F. Antifungal activity of Tamarixdioica  an in vitro study. Gomal Journal Medical  Science 2004; 2 (2): 40- 2.

(9)               Al- Shamma AA., Kadhum EJ., Al- Hiti MA. Antimicrobial activity and phytochemical investigation of Tamarixmacrocarpa (Ehrenb.) bge wildly grown in Iraq. Medical Plants 2005; 29 (1): 99- 104.

(10)           Forbes BA., Sahm DF., Weissfeld AS., Trevino EA. Methods for testing antimicrobial effectiveness. In: Baron EJ., Peterson LR., Finegold SM., editors. Bailey  and Scott's Diagnostic Microbiology. 8th ed. Missouri: Mosby Company; 1990. p 171- 94.

(11)           Androw JM. Standardized disc susceptibility testing method. Journal Antimicrobial Chemistry 2001; 25 (1): 48- 57.

(12)           Bauer AW., Kirby WM., Sherris JC., Truck N. Antimicrobial susceptibility testing by a standardized single disk method. America Journal of Clinical Pathology 1996; 45 (4): 493- 6.

(13)           Vanden DA., Vlietinck AJ. In: Dey PM., Harborne JB., editors. Methods in plant biochemistry: Screening medthods for antibacterial and antiviral agents from higher plants. 5th ed. London: Academic press; 1991. p 47- 69.

(14)           Cramton SE., Gerke C., Cotz F. In vitro methods to study biofilm formation. Method Enzymology 2001; 336 (1): 239–55.

(15)           Jabra- Rizk MA., Meiller TF., James CE., Shirtliff ME. Effect of Farnesol on Staphylococcus aureus biofilm formation and antimicrobial susceptibility. Journal of Antimicrobial Agents 2006; 50 (4): 1463- 9.

(16)           Mahdavi M., KasraKermanshahi R., Jalali M. The assessment of disinfectants on various bacterial biofilms. Research Journal of University of Isfahan "SCI"  2006; 31 (2): 35- 46. [In Persian].

(17)           Sandasi M. The effect of plant extraction on microbial biofilm formation and development [Dissertation]. Tshwane: Univ. Technol.; 2008.

(18)           Lazarova V., Pierzo V., Fontvielle D., Manem J. Integrated approach for biofilm characterization and biomass activity control. Water Science Technology 1994; 29 (7): 345–54.

(19)           Myszka K., Czaczyk K. Bacterial biofilms on food contact surfaces – a review. Polish Journal Food Nutrient Science 2011; 61 (3): 173- 80.

(20)           Lefahal M., Benahmed M., Louaar S., Zallagui A., Duddeck H., Medjroubi K., et al. Antimicrobial activity of Tamarixgallica L. extracts and isolated flavonoids. Advence Natural Applied Science 2010; 4 (3): 289- 92.

(21)           Zaouia K., Segni L., Noureddine G., Redha OM. Antimicrobial activity of nine medicinal plants growing in the south of Algeria. Annal Biology Research 2010; 1 (4): 145- 47.

(22)           Zain ME., Awaad AS., Al- Outhman MR., El- Meligy RM. Antimicrobial activities of Saudi Arabian desert plants. Phytopharmcology 2012; 2 (1): 106- 13.

(23)           Ahmad N., Amir MK., Ayaz S., Ahmad S., Jan A., Ashraf JS., et al. Antimicrobial profile of the selected medicinal plants. Int Journal Chemistry Life Science 2012; 1 (2): 1039- 41.

(24)           Iqbal H., Khattak B., Ayaz S., Rehman A., Ishfaq M., Abbas MN., et al. Comparative efficacy of Aloevera and Tamarixaphylla against Cutaneous Leishmaniasis. International Journal Basic Medical  Science Pharmcology 2012; 2 (2): 42- 5.