اثر روغن زیتون با خلوص متفاوت بر روی تولید لیپاز مخمر یارروویا لیپولیتیکا

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشیار میکروبیولوژی، دانشگاه مراغه، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد بیوتکنولوژی میکروبی، دانشگاه مراغه، ایران

چکیده

مقدمه: لیپازها دسته‏ای از هیدرولازها هستند که سبب تسریع هیدرولیز تری‏گلیسیریدها به گلیسرول و اسیدهای چرب آزاد می‏شوند. لیپازها به بخش جدایی‏ناپذیر از صنایع غذایی، شوینده‏ها، مواد آرایشی و دارویی مدرن تبدیل شده‏اند. هدف این پژوهش بررسی اثر روغن زیتون با خلوص متفاوت به عنوان سوبسترای ارزان قیمت بر تولید لیپاز توسط مخمر یارروویا لیپولیتیکا است.
مواد و روش‏‏ها: یک درصد (حجمی/حجمی) روغن زیتون با سه خلوص تجاری مختلف فوق بکر، بکر و معمولی به عنوان سوبسترا برای تولید لیپاز با سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286 و سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 استفاده شد.
نتایج: بیشینه فعالیت لیپازی پس از 72 ساعت از تلقیح مشاهده شد‏. سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286 لیپاز با 56 واحد در میلی‏‏لیتر در محیط روغن زیتون بکر تولید کرد، اما سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 لیپاز با 300 واحد در میلی‏‏لیتر در محیط روغن زیتون معمولی تولید کرد.
بحث و نتیجه‏ گیری: سویه مخمر جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 حدود 4/5 برابر لیپاز بیش از سویه وحشی بر روی محیط روغن زیتون معمولی تولید کرد‏‏. برخلاف سایر انواع گران ‏قیمت روغن زیتون، روغن زیتون معمولی می‏تواند به عنوان یک روغن ارزان قیمت برای تولید و بهینه‏سازی ‏‏لیپاز به کار رود. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Effect of olive oil with different purity grades on Yarrowia lipolytica lipase production

نویسندگان [English]

  • Farshad Darvishi 1
  • Barumand Hosseini 2
1 Associate Professor of Microbiology, University of Maragheh, Iran
2 M.Sc. of Microbial Biotechnology, University of Maragheh, Iran
چکیده [English]

Introduction: Lipases are a class of hydrolases which catalyze the hydrolysis of triglycerides to glycerol and free fatty acids. Lipases have become an integral part of the modern food, detergents, cosmetics and pharmaceutical industries. The aim of this study was investigation of the effect of olive oil with different commercial purity as a substrate on lipase production by Yarrowia lipolytica.
Materials and methods: One percentage of olive oil with three different commercial grades Extra-virgin, Virgin and Ordinary was used as cheap substrate to produce lipase by wild-type strain Y. lipolytica DSM3286 and mutant strain Y. lipolytica FDY139.
Results: Maximum lipase activity was observed 72 hours after inoculation. The wild-type strain Y. lipolytica DSM3286 produced lipase with 56 U/ml activity on Virgin olive oil, but mutant strain Y. lipolytica FDY1390 produced lipase with 300 U/ml activity on Ordinary olive oil.
Discussion and conclusion: The Y. lipolytica FDY1390 produced lipase about 5.4-fold higher than the wild-type strain on Ordinary olive oil. Whereas other expensive type of olive oil, Ordinary olive oil is a cheap oil which could be used to lipase production and optimization.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lipase
  • Olive oil
  • Purity
  • Yarrowia Lipolytica

مقدمه.

لیپاز (تری آسیل گلیسرول آسیل هیدرولاز
 EC 3.1.1.3) سبب تسریع هیدرولیز تری‏گلیسیریدها به گلیسرول و اسیدهای چرب آزاد می‏شود (1) . لیپاز طیف گسترده‏ای ‏‏از واکنش‏های ‏‏مختلف از جمله هیدرولیز، استریفیکاسیون درونی[i]، الکل لیز، اسیدولیز، استریفیکاسیون و آمینولیز را کاتالیز می‏کند (2).

مخمر Yarrowia lipolytica جزو گروه مخمرهای غیر معمول است که از سه دهه گذشته این مخمرها از لحاظ پژوهش‏های بنیادی و بیوتکنولوژی مورد توجه قرار گرفتند. این مخمر برای انسان غیر بیماری‏زا و برای چند فرآیند صنعتی ایمن شناخته شده[ii] است (3). در سال 1948 ترشح لیپاز در Y. lipolyticaگزارش شد، لیپاز در این مخمر به سه شکل درون سلولی، متصل به دیواره و خارج سلولی است که ژن LIP2 مسؤول تنظیم و تولید همه لیپازهای خارج سلولی است (4 و 5).

آنزیم لیپاز Y. lipolytica با ایجاد آرایش فضایی اختصاصی و دارا بودن فعالیت آنزیمی بالا برای آبکافت، ساخت و ترانس- استریفیکاسیون، دامنه وسیعی از استر و روغن‌ها به حساب می‏آید. به همین علت می‌توان از آن برای انجام تبدیل زیستی[iii] مواد لیپیدی در صنایع دارویی، غذایی، چرم‏سازی و شوینده‌ها استفاده کرد (2 و 6). این آنزیم به خاطر پایداری بالا، عدم نیاز به کوفاکتور، فعالیت سنتزی در حلال‌های آلی و طیف گسترده سوبسترا می‌تواند برای تبدیل مخلوط راسمیک به ترکیبات دارویی تک انانتیومری به کار رود (7 و 8) .

با توجه به کاربردهای فراوان این آنزیم در صنایع مختلف، تخمیر و تولید ارزان قیمت این آنزیم از لحاظ بیوتکنولوژی مورد توجه بوده است. اسید چرب اولیئک یکی از عوامل مهم در القا و تولید لیپاز خارج سلولی مخمر Y. lipolytica است (9). روغن زیتون سرشار از اسید اولئیک است ولی در ‏پژوهش‏های پیش از این، از روغن زیتون فوق بکر که نسبت به دیگر انواع روغن‏های ‏‏زیتون خالص و گران‏تر است استفاده شد‏ه است (10 و 11).

هدف از این پژوهش،‏‏ بررسی اثر روغن زیتون با خلوص متفاوت بر رشد و تولید لیپاز توسط مخمر یارروویا لیپولیتیکا است تا بهترین و ارزان‏ترین نوع روغن زیتون به عنوان سوبسترا مشخص شود.

 

مواد و روش‏ها

سویه ‏های ‏‏میکروبی و شرایط نگهداری:  در این پژوهش‏‏، از سویه وحشیY. lipolytica DSM3286 خریداری شده از کلکسیون میکروبی DSMZ آلمان و سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 حاصل از جهش‏زایی UV سویه وحشیY. lipolytica DSM3286 استفاده شد. از محیط کشت YPD حاوی 20 گرم در لیتر گلوکز، 20 گرم در لیتر پپتون و 10 گرم در لیتر عصاره مخمر و همچنین، 17 گرم در لیتر آگار برای کشت در دمای 29 درجه سانتی‏گراد‏‏ استفاده شد‏‏. سویه‏های ‏‏مخمر پس از رشد، در دمای 4 درجه سانتی‏گراد‏‏ نگهداری شدند (12).

 

.آماده‏سازی ‏‏مایع تلقیح: ابتدا سویه‏ها ‏‏بر روی محیط YPD کشت داده شدند. پس از انکوبه کرد‏‏ن در دمای 29 درجه سانتی‏گراد‏‏ به مدت 24 ساعت، یک کلونی به ارلن 100 میلی‏‏لیتری حاوی 20 میلی‏‏لیتر محیط YPD مایع و فاقد آگار به عنوان مایع تلقیح انتقال داده شد. سپس، ارلن در انکوباتور شیکر‏دار ‏‏با دمای 29 درجه‏سانتی‏‏‏گراد ‏‏با سرعت چرخش 200 دور در دقیقه به مدت 18 ساعت انکوبه شد‏ (13).

.تهیه محیط‏های ‏‏روغن‏دار ‏‏برای تولید لیپاز: در ارلن‏های ‏‏250 میلی‏‏لیتری، 50 میلی‏‏لیتر محیط کشت تولید حاوی 10 گرم در لیتر از عصاره مخمر،10 گرم در لیتر تریپتون و 10 میلی‏‏لیتر در لیتر از روغن زیتون با درجه خلوص متفاوت از سه نوع روغن زیتون معمولی[iv]، بکر[v]و فوق بکر[vi] تهیه و اتوکلاو شد.

به سه محیط یاد شده یک درصد (حجمی/حجمی) مایع تلقیح از دو سویه مخمر در شرایط استریل اضافه شد‏. بلافاصله پس از تلقیح، ارلن‏ها ‏‏به خوبی هم‏زده شده و برای شمارش مخمرها از آن‏ها نمونه‏برداری شد. سپس، ارلن‏ها ‏‏به منظور انکوبه کرد‏‏ن به انکوباتور شیکر‏دار ‏‏با دمای 29 درجه‏سانتی‏‏‏گراد ‏‏و با سرعت چرخش 200 دور در دقیقه منتقل شد. در ادامه هر 24 ساعت از ارلن‏ها ‏‏در شرایط استریل نمونه‏برداری ‏‏و رشد مخمرها و فعالیت لیپاز بررسی شد.

.اندازگیری رشد و فعالیت آنزیمی: برای بررسی رشد و شمارش تعداد سلول‏های ‏‏مخمر از لام نئوبار استفاده شد. روش تیتراسیون برای سنجش فعالیت لیپاز به کار رفت. پس از هر بار نمونه‏برداری، نمونه‏ها ‏‏با سرعت چرخش 13000 دور در دقیقه به مدت 3 دقیقه سانتریفوژ شدند و از محلول رویی برای سنجش فعالیت آنزیمی استفاده شد. یک میلی‏‏لیتر از محلول رویی به طور مستقیم و یا رقیق شده به 5 میلی‏‏لیتر از سوبسترای سنجش فعالیت لیپاز (مخلوطی از روغن زیتون با هیدروکسید سدیم یک دهم مولار و پلی وینیل الکل دو درصد) به همراه 4 میلی‏‏لیتر بافر فسفات یک دهم مولار با اسیدیته حدود 7 اضافه شد‏. برای نمونه شاهد یک میلی‏‏لیتر بافر فسفات به جای محلول رویی استفاده شد‏. سپس، به مدت 15 دقیقه در بن ماری شیکر‏دار ‏‏با دمای 37 درجه‏سانتی‏‏‏گراد ‏‏قرار داده شد. پس از این مرحله برای متوقف کردن واکنش، 5 میلی‏‏لیتر از محلول متوقف کننده (ترکیبی از الکل و استون به نسبت یک به یک حجمی/ حجمی) اضافه شد. در ادامه 3 تا 5 قطره از محلول فنل فتالئین دو درصد افزوده شد و با محلول هیدروکسید سدیم 50 میلی‏‏مولار تیتر شد‏. فعالیت لیپاز به شکل واحد در میلی‏‏لیتر گزارش می‏شود که یک واحد فعالیت آنزیمی، معادل مقدار آنزیمی است که یک میکرومول اسید چرب را در یک دقیقه تحت شرایط سنجش، آزاد سازد (14). همه آزمایش‏ها ‏‏حداقل با سه تکرار انجام شد.

 

.نتایج.

روند رشد سویه‏های ‏‏مخمر در محیط‏های ‏‏کشت روغن‏دار ‏‏و میزان تولید لیپاز با فواصل زمانی 24 ساعته اندازه‏گیری ‏‏شد. نتایج مربوط به تولید لیپاز و میزان رشد سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286 در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی به ترتیب در شکل‏های ‏‏1 و 2 نشان داده شده است.

 

شکل 1- تولید لیپاز توسط سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286 در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی

 

 

شکل 2- میزان رشد سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی

 

سویه وحشیY. lipolytica DSM3286 پس از 72 ساعت بیش‏ترین میزان تولید لیپاز به مقدار 56 واحد در میلی‏‏لیتر را در روغن زیتون بکر داشت. بعد از روغن بکر، این سویه بهترین تولید آنزیم را به ترتیب بر روی روغن‏های ‏‏زیتون فوق بکر و معمولی دارد. سویه وحشی در خلوص متفاوت روغن زیتون رشد مشابهی داشت. همچنین، در شکل‏های ‏‏3 و 4 به ترتیب نتایج مربوط به تولید لیپاز و میزان رشد سویه جهش یافتهY. lipolytica FDY1390 در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی نشان داده شده است.

 

 

شکل 3- تولید لیپاز توسط سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی

 

 

شکل 4- میزان رشد سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با سه خلوص تجاری متفاوت فوق بکر، بکر و معمولی

 

مشابه سویه وحشی، سویه جهش یافتهY. lipolytica FDY1390 پس از 72 ساعت بیش‏ترین میزان تولید لیپاز را دارد و همچنین، در خلوص متفاوت روغن زیتون تقریبا رشد مشابهی نشان می‏دهد. بیش‏ترین میزان تولید سویه جهش یافته به مقدار 300 واحد در میلی‏‏لیتر در روغن زیتون معمولی بود. پس از روغن معمولی این سویه در زمان اوج تولید، مقدار کمابیش مشابهی از تولید آنزیم را بر روی روغن‏های ‏‏زیتون فوق بکر و بکر نشان داد.

همان‏طور که در جدول 1 مشاهده می‏شود نتایج حاصل از فعالیت و تولید آنزیم لیپاز توسط سویه‏های ‏‏مخمر در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با خلوص متفاوت تجزیه و تحلیل شد. از جمله این تجزیه و تحلیل‌ها می‌توان به محاسبه بهره‏وری تولید لیپاز (PL) برحسب واحد آنزیمی در زمان تخمیر (U/h)، نرخ رشد ویژه (µ) بر حسب یک بر ساعت (h-1)، زمان نسل یا تولید مثل (td) بر حسب ساعت (h) اشاره کرد‏‏.

 

جدول 1- محاسبه شاخص‏‏‏های رشد و تولید لیپاز سویه‏های ‏‏مخمر در محیط‏های ‏‏مختلف حاوی روغن زیتون با خلوص متفاوت در زمان اوج تولید (72 ساعت پس از تلقیح)

زمان نسل (td)

نرخ رشد ویژه (µ)

بهروری تولید لیپاز (PL)

نوع روغن زیتون

سویه مخمر

67/2

26/0

51/0

معمولی

Y. lipolytica DSM3286

48/2

28/0

78/0

بکر

57/2

27/0

67/0

فوق بکر

48/2

28/0

39/5

معمولی

Y. lipolytica FDY1390

89/2

24/0

93/4

بکر

77/2

25/0

24/5

فوق بکر

 

بهره وری تولید لیپاز (PL): میزان فعالیت لیپاز بر زمان تخمیر است و بر حسب واحد بر ساعت (U/h) گزارش می‏شود.

نرخ رشد ویژه (µ): میزان رشد حداکثر که سلول‏های ‏‏بیش‏ترین میزان تقسیم و دو برابر شدن را دارند و بر حسب یک بر ساعت (h-1) گزارش می‏‏شود.

زمان نسل (td): مدت زمان مورد نیاز برای دو برابر شدن غلظت توده زیستی است و بر حسب ساعت (h) گزارش می‏شود.

 

.بحث و نتیجه ‏‏گیری

تولید لیپازهای میکروبی تا حد زیادی تحت تاثیر ترکیب محیط و عوامل فیزیکی- شیمیایی مانند دما، اسیدیته و اکسیژن محلول قرار دارد. منبع کربن از مهم‏ترین عوامل مؤثر در بیان و تولید لیپاز است. لیپاز از آنزیم‏های ‏‏القایی است که به طور معمول در حضور ترکیبات لیپیدی مانند روغن ‏‏و تری‏گلیسیریدها القا و تولید می‏شود. در نتیجه، انتخاب منبع کربن مناسب برای به دست آوردن بازده بالا در تولید لیپاز ضروری است (15 و 16).

با توجه به کاربردهای فراوان لیپاز خارج سلولی مخمر Y. lipolytica در صنایع مختلف، تخمیر و تولید ارزان قیمت، این آنزیم از لحاظ بیوتکنولوژی مورد توجه بوده است (9 و 17). در پژوهش‏های قبلی منابع کربن متنوعی برای تولید لیپاز در این مخمر استفاده شده است (18 و 19). اسید چرب اولیئک یکی از عوامل مهم در القا و تولید لیپاز خارج سلولی مخمر Y. lipolytica است (20).

 

در این پژوهش،‏‏ روغن زیتون با سه خلوص تجاری مختلف فوق بکر، بکر و معمولی به عنوان سوبسترا برای تولید لیپاز با سویه وحشی Y. lipolytica DSM3286 و سویه جهش یافته Y. lipolytica FDY1390 استفاده شد. سویه وحشیبیش‏ترین میزان تولید لیپاز به مقدار 56 واحد در میلی‏‏لیتر در روغن زیتون بکر با بهروری تولید 78/0داشت. اما بیش‏ترین میزان تولید لیپاز سویه جهش یافته به مقدار 300 واحد در میلی‏‏لیتر در روغن زیتون معمولی با بهروری تولید 39/5 بود. در نتیجه سویه مخمر جهش یافته حدود 4/5 برابر لیپاز بیش از سویه وحشی بر روی محیط روغن زیتون معمولی تولید کرد‏‏. جالب است که نرخ رشد ویژه و زمان تقسیم سلول‏های ‏‏مخمر وحشی و جهش یافته در محیط روغن زیتونی که بیش‏ترین تولید را در آن داشتند یکسان بود.

روغن زیتون سرشار از اسید اولئیک است ولی در ‏پژوهش‏های ‏‏قبلی به طور معمول از روغن زیتون فوق بکر که نسبت به دیگر انواع روغن‏های ‏‏زیتون خالص‏تر و گران‏تر است استفاده شده است (10 و 11). نتایج این پژوهش‏‏ نشان داد به جای استفاده از انواع گران روغن زیتون، می‏توان از روغن زیتون معمولی به عنوان یک روغن ارزان قیمت برای تولید لیپاز در مخمر یاررویا استفاده کرد‏‏ و بر اساس این نوع روغن زیتون، فرآیند تولید لیپاز را بهینه‏سازی کرد.

تشکر و قدردانی

از مرکز رشد واحد‏های فناور مراغه وابسته به پارک علم و فناوری استان آذربایجان شرقی و ستاد توسعه زیست فناوری برای حمایت‏های مادی و معنوی تشکر و قدردانی می‏شود.



[i]- interesterification

[ii]- generally recognized as safe (GRAS)

[iii]- biotransformation

[iv]- Ordinary olive oil

[v]- Virgin olive oil

[vi]- Extra-virgin olive oil

 

 

(1)               Gupta N., Sahai V., ‏Gupta R. Alkaline lipase from a novel strain Burkholderia multivorans: Statistical medium optimization and production in a bioreactor. Process Biochemistry 2007; 42 (4):518- 26.

(2)               Vakhlu J., ‏Kour A. Yeast lipases: enzyme purification, biochemical properties and gene cloning. Electronic Journal of Biotechnology 2006;9 (1):69- 85.

(3)               Casaregola S., ‏Neuveglise C., ‏Lepingle A., ‏Bon E., ‏Feynerol C., ‏Artiguenave F., ‏et al. Genomic Exploration of the Hemiascomycetous Yeasts: 17. Yarrowia lipolytica. FEBS Letters 2000; 487 (1): 95- 100.

(4)               Pereira-Meirelles FV., ‏Rocha-Leao MHM., ‏Sant' Anna GL. Lipase location in Yarrowia lipolytica cells. Biotechnology Letters 2000; 22 (1): 71- 5.

(5)               Yu MR., ‏Qin SW., ‏Tan TW. Purification and characterization of the extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica. Process Biochemistry 2007;42 (3): 384- 91.

(6)               Barth G., ‏Gaillardin C. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia lipolytica. FEMS Microbiology Reviews 1997; 19 (4): 219- 37.

(7)               Guieysse D., ‏Sandoval G., ‏Faure L., ‏Nicaud J-M., ‏Monsan P., ‏Marty A. New efficient lipase from Yarrowia lipolytica for the resolution of 2-bromo-arylacetic acid esters. Tetrahedron: Asymmetry 2004; 15 (22): 3539- 43.

(8)               Yu MR., ‏Lange S., ‏Richter S., ‏Tan TW., ‏Schmid RD. High-level expression of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris and its purification and characterization. Protein Expression and Purification 2007; 53 (2): 255- 63.

 

(9)               Fickers P., ‏Marty A., ‏Nicaud JM. The lipases from Yarrowia lipolytica: Genetics, production, regulation, biochemical characterization and biotechnological applications. Biotechnology Advances 2011; 29 (6): 632- 44.

(10)           Ciafardini G., ‏Zullo BA., ‏Iride A. Lipase production by yeasts from extra virgin olive oil. Food Microbiology 2006; 23: 60- 7.

(11)           Darvishi F., ‏Nahvi I., ‏Zarkesh-Esfahani H., ‏Momenbeik F. Effect of Plant Oils upon Lipase and Citric Acid Production in Yarrowia lipolytica Yeast. Journal of Biomedicine and Biotechnology 2009; 562943: 1- 7.

(12)           Amaral PFF., ‏de Almeida APR., ‏Peixoto T., ‏Rocha-Leao MHM., ‏Coutinho JAP., ‏Coelho MAZ. Beneficial effects of enhanced aeration using perfluorodecalin in Yarrowia lipolytica cultures for lipase production. World Journal of Microbiology & Biotechnology 2007; 23 (3): 339- 44.

(13)           Mafakher L., ‏Mirbagheri M., ‏Darvishi F., ‏Nahvi I., ‏Zarkesh-Esfahani H., ‏Emtiazi G. Isolation of lipase and citric acid producing yeasts from agro-industrial wastewater. New Biotechnology 2010; 27 (4): 337- 40.

(14)           Darvishi F., ‏Destain J., ‏Nahvi I., ‏Thonart P., ‏Zarkesh-Esfahani H. High-level production of extracellular lipase by Yarrowia lipolytica mutants from methyl oleate. New Biotechnology 2011; 28 (6): 756- 60.

(15)           Sharma R., ‏Chisti Y., ‏Banerjee UC. Production, purification, characterization, and applications of lipases. Biotechnology Advances 2001; 19 (8): 27- 62.

(16)           Gupta R., ‏Gupta N., ‏Rathi P. Bacterial lipases: an overview of production, purification and biochemical properties. Applied Microbiology and Biotechnology 2004; 64 (6): 763- 81.

(17)           Fickers P., ‏Nicaud J-M. Biotechnological Applications of Yarrowia lipolytica Lipases: An Overview. In: Barth G., ‏editor. Yarrowia lipolytica. Microbiology Monographs. Berlin Heidelberg: Springer, 2013.

(18)           Corzo G., ‏Revah S. Production and characteristics of the lipase from Yarrowia lipolytica 681. Bioresource Technology 1999; 70 (2): 173- 80.

(19)           Papanikolaou S., ‏Chevalot I., ‏Galiotou-Panayotou M., ‏Komaitis M., ‏Marc I., ‏Aggelis G. Industrial derivative of tallow: a promising renewable substrate for microbial lipid, single-cell protein and lipase production by Yarrowia lipolytica. Electronic Journal of Biotechnology 2007; 10 (3): 425- 35.

(20)           Barth G., ‏Gaillardin C. Yarrowia lipolytica. Nonconventional Yeasts in Biotechnology. Berlin Heidelberg: Springer, 1996.