بهینه‏ سازی فرآیند حذف زیستی کافئین توسط سلول‏ های رویشی سویه بومی مخمری ساکارومایسس سرویزیه با استفاده از روش تحلیلی تاگوچی

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

2 استادیار فیزیولوژی گیاهی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

3 دانشجوی کارشناسی ارشد زیست شناسی سلولی مولکولی، دانشگاه کردستان، سنندج، ایران

چکیده

مقدمه: در سال‏های اخیر استفاده از ریزسازواره‏ها به عنوان زیست واکنشگرهای مبتنی بر شیمی سبز برای حذف کافئین سمی از پساب‏های صنعتی و محصولات غذایی بسیار مورد توجه قرار گرفته‏ است. در این پژوهش بهینه‏سازی فرآیند حذف زیستی کافئین توسط سلول‏های رویشی سویه بومی مخمری ساکارومایسس سرویزیه با استفاده از رویکرد تحلیلی تاگوچی بررسی شده است‏‏.
مواد و روش ‏‏ها: متغیرهایی که در فرآیند تجزیه کافئین به عنوان تأثیرگذار در نظر گرفته شده‏اند عبارتند از: غلظت کافئین، زمان واکنش، غلظت یون روی، غلظت گلوکز به عنوان منبع کربن کمکی و غلظت پپتون به عنوان منبع ازت کمکی. برای موارد متغیر یاد شده آرایه متعامد L16 (13×44) طراحی شد. درصد حذف کافئین با استفاده از روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) تخمین زده شد.
نتایج: دستیابی به ترکیب بهینه عوامل یاد شده با استفاده از عملکرد تاگوچی نشان داد که در شرایط بهینه (میزان کافئین در غلظت 5 گرم در لیتر، پپتون در غلظت 3 گرم در لیتر، یون روی در غلظت 5 میلی‏مولار و زمان گرماگذاری برای مدت 48 ساعت)، میزان حذف زیستی کافئین توسط سویه بومی یاد شده، با درجه اطمینان 95 درصد، 8/82 درصد بوده است. در حالی که قبل از آزمایش‏های بهینه‏سازی، سویه مخمری TFS9 تنها قادر به حذف 5/25 درصد از کافئین با غلظت اولیه 5 گرم در لیتر بعد از 48 ساعت گرماگذاری بوده است که با توجه به افزایش 2/3 برابری کارآیی بالای روش طراحی تاگوچی را به خوبی اثبات می‏‏کند.
بحث و نتیجه‏ گیری: مطالعه پیش‏رو نخستین‏ گزارش از کاربرد موفقیت آمیز روش بهینه‏سازی تاگوچی برای حذف زیستی کافئین است‏. براساس تحلیل آماری نتایج، این پژوهش پیشنهاد رویکرد تاگوچی در بهبود تجزیه زیستی کافئین توسط سویه بومی ساکارومایسس سرویزیه را پیشنهاد می‏‏کند. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Optimization of caffeine bioremoval by growing cells of Saccharomyces cerevisiae using Taguchi analysis methodology

نویسندگان [English]

  • Morahem Ashengroph 1
  • Masoud Haidarizadeh 2
  • Maryam Borchaluei 3
1 Assistant Professor of Microbiology, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran
2 Assistant Professor of Plant Physiology, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran
3 M.Sc. Student of Molecular Cell Biology, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran
چکیده [English]

Introduction: In the recent years, application of microorganisms as green biocatalysts for removing caffeine pollution from industrial wastes and food caffeinated have been extensively considered. This investigation reports on optimization of bio-decaffeination process under growing cells of Saccharomyces cerevisiae by using the Taguchi statistical approach.
Materials and methods: Five variables, i.e. caffeine, Zn+2, glucose, peptone concentrations and time incubation, which have significant effects on bio-decaffeination process, were selected and L16 (44× 13) orthogonal array was determined for experimental trials. Caffeine degradation was estimated by HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis.
Results: Use of Taguchi approach for optimization of design parameters resulted in about 82.8 % reduction of caffeine in 48 h incubation when 3g/l peptone, 5mM Zn+2 ion and 5 g/l of caffeine are present in the designed media. Under the optimized conditions, the yield of degradation of caffeine (5 g/l) by the growing cells of yeast strain TFS9 has been increased from 25.5 to 82.8 % which is 3.2 fold higher than the normal yield. The improvement of caffeine removal after best conditions were made shows the efficiency of Taguchi experimental design in such studies.
Discussion and conclusion: The current investigation is the first report for successful application of the Taguchi experimental approach to the bio-decaffeination process.  According to the analysis of experimental results, the present study proposes the potentiality of the Taguchi approach to enhance the bio-decaffeination performance with the native strain of Saccharomyces cerevisiae.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Bio-removal
  • Caffeine
  • Optimization
  • Saccharomyces cerevisiae
  • Taguchi approach

مقدمه

کافئین ترکیب تجاری مهمی است‏ که به خانواده آلکالوئیدهای پورینی ساخته شده در گیاهان تعلق دارد (1). خاصیت محرک بودن کافئین باعث شده است که این ترکیب در ساخت نوشیدنی‏هایی مانند چای، قهوه و تعداد زیادی نوشیدنی غیر الکلی و سایر محصولات غذایی مصرف گسترده‏ای داشته باشد (2). مکانسیم عمل کافئین به شکلی است‏ که به عنوان آنتاگونیست رسپتور آدنوزین در مغز عمل کرده و در نتیجه آثار‏‏ مهاری بر روی سیستم عصبی مرکزی دارد (3). آدنوزین به عنوان یک کاهنده اضطراب عمل می‏کند و چون مولکول کافئین مشابه آن است‏ می‏تواند با این آلکالوئید جایگزین شده و سبب افزایش اضطراب ‏شود. مصرف طولانی مدت کافئین آثار‏‏ جانبی مانند سر‏درد، کوفتگی، پوکی ‏استخوان، تحریکات فوق‏کلیوی، فعالیت کلیوی، ماهیچه‏ای و قلبی نامنظم، تپش قلب، ناراحتی‏های معده‏ای، اضطراب، افزایش سطح هموسیستئین پلاسما، افزایش فشار خون، بی‏خوابی و بیشتر بیماری‏های حاد قلبی را ایجاد می‏کند (2، 4 و 5). کافئین از سدهای خونی- مغزی عبور کرده و باعث ناهنجاری در جنین شده و احتمال سقط‏های خود به ‏خودی را افزایش می‏دهد (6). از طرف دیگر فرآیند تولید کافئین از دانه‏های قهوه دارای محصولات جانبی و فاضلاب‏هایی است‏ که بخش اصلی ضایعات کشت و صنعت را در فرآیند تولید قهوه در کشورها تشکیل می‏دهد (7 و 8). اگرچه بخشی از این ضایعات به عنوان کمپوست در مزارع کشاورزی قهوه استفاده می‏شود اما بیشتر آن در طبیعت رها می‏‏شود. وجود کافئین در خاک بر زایایی خاک تأثیر گذاشته و مانع جوانه زنی و رشد سایر دانه‏ها می‏شود (9). رها شدن ضایعات حاصل از کارخانه‏های قهوه و چای به درون دریاچه‏ها و رودخانه‏ها بر اکوسیستم آبی تأثیر نامطلوبی می‏گذارد (10). از طرف دیگر به علت وجود کافئین و دیگر ترکیبات سمی، با وجود غنی بودن این ضایعات از کربوهیدرات و پروتئین، برای تغذیه حیوانات قابل استفاده نیستند‏ (8 و 11). از آنجا که حذف کافئین به روش‏های مرسوم به علت استفاده از حلال‏های سمی و گران، مناسب نیست و همچنین، این روش‏ها برای کافئین اختصاصی نیستند و باعث حذف سایر طعم دهنده‏ها و ترکیبات معطر نیز می‏شوند، در نتیجه محصولات غذایی تولید شده دارای کیفیت پایینی هستند. بنابراین، توسعه روش‏های میکروبی و آنزیمی برای برداشت کافئین به علت داشتن صرفه اقتصادی، سازگاری با محیط زیست و اختصاصی بودن برای کافئین، مطلوب است‏ (2). از جمله باکتری ها و قارچ‏های تجزیه‏کننده کافئین می‏توان به سویه‏هایی از جنس سراشیا[1] (11)، کلبسیلا[2] و رودوکوکوس[3] (12)، آسپرژیلوس[4] (13)، پنی سیلیوم[5] (7 و 14)، بروی باکتریوم[6] (15)، سودوموناس[7] (16- 18) و مخمر تریکوسپورون[8] (19) اشاره کرد. موفقیت در آزمایش‏ها اساساً به طراحی مناسب فرآیندها و محصولات وابسته است‏. روش سنتی بهینه‏سازی فرآیند شامل بررسی یک عامل در یک زمان است‏ که به زمان، هزینه و کار فشرده نیاز است‏. در میان روش‏های مختلف آماری، روش تحلیلی تاگوچی برتری متمایزی نسبت به سایر روش‏های آماری دارد زیرا روش تاگوچی در طراحی آزمایش‏ها، روش ساده‏ای بوده که شامل سیستم طراحی آرایه‏هاست‏ که امکان بررسی حداکثر تعداد عوامل مؤثر‏ بر فرآیند و میان کنش میان عوامل مختلف را با انجام تعداد کمی آزمایش تجربی فراهم می‏کند (20) و در نهایت، عامل‏های مؤثر‏ی که دارای آثار‏‏ اصلی بر فرآیند واکنش هستند را شناسایی می‏کند (21). روش تاگوچی در تخمیر میکروبی، داروسازی، زیست تبدیلی میکروبی، فرآیندهای تغذیه‏ای و پالایش فاضلاب‏های آلوده کارآمد است‏ (21- 25). با وجود اینکه گزارش‏های زیادی درباره بهینه‏سازی فرآیندهای زیستی توسط روش آماری تاگوچی وجود دارد، مطالعه پیش‏رو نخستین‏ گزارش از کاربرد روش بهینه‏سازی تاگوچی برای حذف زیستی کافئین است‏. در این پژوهش از روش تاگوچی برای بهینه‏سازی فرآیند برای دستیابی به میزان بیشتری از حذف کافئین توسط سویه بومی مخمری ساکارومایسس سرویزیه استفاده شده است.

 

.مواد و روش‏ها

.مواد شیمیایی و سویه مخمری: کافئین با خلوص بالای 99 درصد از شرکت سیگما[9] خریداری شد. گلوکز و پپتون از شرکت دیفکو[10] تهیه شد. سولفات روی از شرکت مرک[11] خریداری شد‏. استونیتریل و متانول با خلوص بالا به عنوان حلال‏های HPLC از شرکت مرک آلمان خریداری شدند. سایر مواد شیمیایی استفاده شده با درجه ‏خلوص بالا[12] بودند. سویه‏ بومی مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 با قابلیت تجزیه‏کنندگی کافئین پیش‏تر توسط آشنگرف و برچلویی[13] از خاک زیر کشت چای در مناطق شمالی ایران جداسازی و شناسایی فنوتیپی و مولکولی شده بود (26). برای نگهداری سویه بومی TFS9 از محیط جامدAgar YPD (گلوکز 20 گرم در لیتر، پپتون 20 گرم در لیتر، عصاره مخمر 10 گرم در لیتر و آگار 20 گرم در لیتر) استفاده شد.

.طراحی آزمایش به روش تاگوچی: در این پژوهش، طراحی آزمایش به روش آماری تاگوچی انجام شده است‏. قبل از طراحی آزمایش، عامل‏های مؤثر بر میزان تجزیه کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9با استفاده از روش تک عاملی شناسایی و سطوح مورد نظر آن‏ها تعیین شد. برای این منظور در بخش اول این پژوهش اثر منابع کربن مختلف شامل گلوکز، فروکتوز، گالاکتوز، سوکروز و گلیسرول با غلظت نهایی یک گرم در لیتر، اثر منابع ازتی مختلف شامل کلرید‏آمونیوم، پپتون، تریپتون، اوره، عصاره مخمر و کازئین با غلظت نهایی یک گرم در لیتر و همچنین، اثر یون‏های روی، منگنز، مس، آهن وکبالت در غلظت نهایی 5/0 میلی‏مولار بر حذف کافئین (با غلظت اولیه 5/3 گرم در لیتر) بر روی حذف کافئین در محیط بافر نمکی M9 (27) پس از 48 ساعت گرماگذاری بررسی شد. در مرحله دوم بهینه‎سازی طراحی آزمایش به روش آماری تاگوچی انجام شد. متغیرهایی که در فرآیند تجزیه کافئین توسط سویه مخمریTFS9 به عنوان عوامل تأثیرگذار در نظر گرفته شدند عبارتند از: کافئین، پپتون به عنوان منبع ازت کمکی، گلوکز به عنوان منبع کربن کمکی، یون‏ فلزی روی و زمان گرماگذاری. برای موارد متغیر یاد شده آرایه متعامد L16 طراحی شد. برای انجام آزمایش‏های پیش‏بینی شده توسط نرم افزار، 50 میلی‏لیتر از محیط‏های بافر نمکی M9 را که حاوی 5/0 گرم در لیتر سولفات منیزیم هفت آبه، 015/0 گرم در لیتر کلرید کلسیم، 5/0 گرم در لیتر نمک سدیم کلراید و بافر فسفات نمکی (K2HPO4/KH2PO4) 100 میلی‏مولار بود را در ارلن‏های 250 میلی‏لیتری ریخته و سپس، سوسپانسیون مخمری معادل 5/0 مک فارلند تهیه شد و به میزان 5 درصد حجمی/ حجمی به منظور تلقیح به محیط‏های یاد شده استفاده شد. تمام ارلن ها تحت شرایط دمایی 28 درجه سانتی گراد با دور شیکر rpm 150 گرماگذاری شد. آزمایش‏ها سه بار تکرار، تجزیه و تحلیل تمامی نتایج با استفاده از نرم‏افزار [14]Qualitek-4 انجام و شرایط بهینه مشخص شد‏.

.سنجش تجزیه کافئین در مخلوط واکنش با استفاده از HPLC: سنجش میزان حذف کافئین با استفاده از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا[15]، مجهز به آشکارساز جذب UV انجام شد. در دستگاه HPLC از ستون نوع C18 (اندازه قطر ذرات فاز ثابت 5 میکرون) به طول 25 سانتی‏متر و قطر داخلی 6/4 میلی‏متر استفاده شد. نوع فاز متحرک به کار گرفته شده مخلوطی از آب و استونیتریل به نسبت 85 به 15 بود که به شکل ایزوکراتیک با سرعت 1 میلی‏لیتر در دقیقه روی ستون فرستاده شد. طول موج استفاده شده 278 نانومتر و حجم تزریق شده 20 میکرولیتر بود. همه مراحل آزمایش در دمای اتاق انجام گرفت. تحت شرایط کروماتوگرافی یاد شده، زمان بازداری برای کافئین در زمان 4/7 دقیقه به دست آمد.

 

.نتایج

.بهینه‏سازی ‏شرایط حذف کافئین با کمک رویکرد تاگوچی: با توجه به اینکه در روش تاگوچی، گام نخست تعیین عوامل تأثیرگذار و سطوح آن‏هاست، بنابراین، در ابتدا با استفاده از روش تک عاملی متغیرهای مؤثر‏ بر حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 تشخیص داده شد. بر این اساس اثر چندین عامل شامل منابع کربن (گلوکز، سوکروز، فروکتوز، گالاکتوز و گلیسرول)، منابع ازت (عصاره مخمر، تریپتون، اوره، کازئین و کلرید آمونیوم) و یون‏های فلزی (آهن، مس، روی، کبالت و منگنز) بر روی تجزیه کافئین بررسی شد (شکل 1). براساس نتایج به دست آمده بهترین ترکیب عوامل برای حذف کافئین در سویه بومی TFS9 عبارتند از: گلوکز، پپتون و یون فلزی روی.

 

 

 

 

 

 

شکل 1- اثر منابع کربن، منابع ازت و یون‏های فلزی بر روی حذف زیستی کافئین توسط سلول‏های رویشی مخمر ساکارومایسس سرویزیه سویه TFS9

 

پس از انتخاب بهترین ترکیب عوامل، بهینه‏سازی با روش آماری تاگوچی انجام شد. هدف از طراحی آزمایش به روش تحلیلی تاگوچی، دست‏یابی به اهدافی از جمله تشخیص تأثیر هر یک از عوامل فردی بر روی حذف زیستی کافئین، بررسی تأثیر جفت عامل روی حذف کافئین، تعیین شرایط بهینه و در نهایت، ارزیابی میزان حذف کافئین تحت شرایط بهینه پیش‏بینی شده است. در این راستا پنج عامل غلظت گلوکز، غلظت پپتون، غلظت یون دو ظرفیتی روی، غلظت کافئین و زمان گرماگذاری در نظر گرفته شد. در جدول 1 عوامل و سطوح مورد بررسی نشان داده شده است.

 

جدول 1 - عوامل مؤثر‏ و سطوح مورد بررسی در طراحی آزمایش‏ها به روش آماری تاگوچی

عامل

سطح 1

سطح 2

سطح 3

سطح 4

گلوکز (گرم در لیتر)

0

1

3

5

پپتون (گرم در لیتر)

0

1

3

5

یون فلزی روی (میلی مولار)

0

1

3

5

کافئین (گرم در لیتر)

1

3

5

7

زمان گرماگذرای (ساعت)

28

38

48

-

 

با توجه به تعداد عامل‏ها، سطوح و تأثیر‏ جفت عامل، درجه آزادی برابر 15 است که لزوم انتخاب آرایه متعامد L16 (انجام 16 آزمایش مختلف) را به عنوان یک آرایه استاندارد ایجاب می‏کند (جدول 2).

 

 

جدول 2- عوامل و سطوح مورد بررسی در آرایه متعامد L16 و نتایج حاصل از حذف کافئین به شکل میانگین سه تکرار

شماره آزمایش

گلوکز

پپتون

یون Zn+2

کافئین

زمان گرماگذاری

درصد حذف کافئین

1

1

1

1

1

1

5/29

2

1

2

2

2

2

2/50

3

1

3

3

3

3

8/88

4

1

4

4

4

1

3/51

5

2

1

2

3

1

2/33

6

2

2

1

4

3

7/36

7

2

3

4

1

2

6/66

8

2

4

3

2

1

3/49

9

3

1

3

4

2

7/47

10

3

2

4

3

1

9/38

11

3

3

1

2

1

2/41

12

3

4

2

1

3

3/51

13

4

1

4

2

3

1/61

14

4

2

3

1

1

1/22

15

4

3

2

4

1

7/39

16

4

4

1

3

2

5/55

 

 

همان گونه که در جدول 2 مشاهده می‏‏شود، درصد حذف کافئین براساس اثر ترکیبی عامل‏های انتخاب شده در محدوده بین 1/22 تا 8/88 است. در ادامه، اثر تغییر سطح هر یک از عوامل بر روند حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 بررسی شده است. همان گونه که در شکل 2 نشان داده شده است مقادیر بالاتر درصد حذف کافئین در سطح چهار یون روی یعنی 5 میلی‏مولار، سطح سه پپتون یعنی 3 گرم در لیتر، سطح سه کافئین یعنی 5 گرم در لیتر و سطح زمان گرماگذاری یعنی 48 ساعت و همچنین، در سطح یک گلوکز مشاهده شده است. در واقع با بررسی آثار‏‏ اصلی هر کدام از عامل‏های مورد مطالعه می‏توان روند کلی تأثیر عامل‏ها را بر روی حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری یاد شده، تشخیص داد.

به کمک روش تاگوچی می‏توان آثار متقابل بین دو عامل مختلف را بررسی کرد‏ که نتایج در جدول 3 نشان داده شده است. در واقع با مطالعه آثار‏ متقابل بین جفت عامل می‏توان نتیجه گرفت که اثر یک عامل در فرآیندهای بهینه‏سازی ‏بسته به شرایط عامل‏های دیگر دارد (28). همان‏گونه که در جدول 3 مشاهده می‏شود در مجموع 10 میان‏کنش مشاهده شده که بالاترین میزان میان‏کنش (48/28 درصد) بین گلوکز و کافئین است. عامل گلوکز دارای کم‏ترین تأثیر بر روی حذف زیستی کافئین به شکل فردی است در حالی که کم‏ترین میان‏کنش (62/2) بین پپتون و کافئین بوده است. جالب است که پپتون به شکل فردی تأثیر‏گذاری بسیار بالایی در حذف زیستی کافئین داشته است که خود بیانگر این مطلب است که اثر یک عامل روی حذف کافئین کاملاً وابسته به شرایط عامل‏های دیگر در فرآیند بهینه‏سازی حذف زیستی کافئین توسط سویه بومی ساکارومایسس سرویزیه TFS9 است.

 

جدول 3- ارزیابی آثار‏ متقابل بین جفت عامل‏های مختلف بر میزان حذف زیستی کافئین توسط مخمر ساکارومایسس سرویزیه سویه TFS9

تأثیر جفت عامل

شدت تأثیر متقابل (درصد)

شرایط بهینه (سطوح)

کافئین × گلوکز

48/28

 (1 و 3)

زمان گرماگذاری × کافئین

45/28

 (3 و 3)

یون روی × گلوکز

14/18

 (1 و 3)

زمان گرماگذاری × گلوکز

42/13

 (1 و 3)

پپتون × گلوکز

89/12

 (1 و 3)

کافئین × یون روی

59/9

 (3 و 3)

یون روی × پپتون

34/7

 (3 و 3)

زمان گرماگذاری × یون روی

98/5

 (3 و 3)

زمان گرماگذاری × پپتون

87/2

 (3 و 3)

کافئین × پپتون

62/2

 (3 و 3)

 

رویکرد تحلیلی تاگوچی دارای ابزار قدرتمند دیگری به نام تحلیل واریانس (ANOVA) است که از این جدول به منظور تحلیل آرایه‏های متعامد و همچنین، با هدف تعیین واریانس خطا و اهمیت نسبی هر یک از عوامل تأثیرگذار استفاده می‏‏شود. در جدول 4 تحلیل واریانس نتایج حاصل از حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 با 95 درصد اطمینان و پس از عمل روش آماری ادغام خطاها[16] ارایه شد‏ه است.

 

 

 

 

شکل 2- اثر تغییر سطح هر یک از عوامل بر روند حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9

 

 

جدول 4- تحلیل واریانس نتایج حاصل از حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 با 95 درصد اطمینان
و پس از عمل POOLING

ستون عامل

درجه آزادی

مجموع مربعات

واریانس

نسبت واریانس

مجموع مربعات خالص

درصد تأثیر هر عامل

گلوکز

 3

62/289

 

POOLED

CL=85/69

000/0

پپتون

3

675/1139

891/379

960/32

097/1105

905/28

یون روی

3

545/51

848/172

996/14

968/483

659/12

کافئین

3

799/366

266/122

608/10

221/332

689/8

زمان گرماگذاری

2

381/1497

690/748

957/64

330/1474

563/38

عوامل دیگر/ خطاها

4

687/300

171/75

 

 

184/11

کل

15

089/3823

 

 

 

000/100

 

 

واریانس خطا باید پس از تشکیل جدول ANOVA و انجام آزمون معناداری انجام بگیرد که این عمل در روش تاگوچی با استفاده از روش آماری ادغام خطاها انجام می‏شود. در واقع به کمک این روش‏ عامل‏هایی که دارای تأثیر‏ ناچیز بوده‏اند را به عنوان منبع خطا در نظر گرفته و حذف می‏‏شوند. بدین ترتیب عامل‏هایی که pool نشده باشند به عنوان عوامل با تأثیر‏ معناداری معرفی می‏شوند. در ارتباط با آزمایش بالا، به دنبال عمل ادغام و حذف عامل گلوکز که دارای کم‏ترین تأثیر‏پذیری بود، فاصله اطمینان برای عامل‏های زمان انکوباسیون، پپتون، یون فلزی روی و کافئین به ترتیب به 90/99، 70/99، 76/98 و 74/97 درصد افزایش یافته است. ستون آخر جدول 4 سهم هر یک از عوامل را در حذف کافئین مشخص کرده است. عامل زمان انکوباسیون مؤثر‏ترین عامل و پس از آن غلظت پپتون و یون روی و در پایان غلظت کافئین بیش‏ترین اهمیت را داشته‏اند.

تعیین شرایط بهینه پیش بینی شده توسط روش آماری تاگوچی: برای تعیین شرایط بهینه از تحلیل آماری "هرچه بزرگتر بهتر"[17] استفاده شد. به طور کلی برای تحلیل نتایج حاصل از بهینه‏سازی با کمک نرم افزار تاگوچی سه روش آماری "هر چه بزرگتر بهتر"، "هر چه کمتر بهتر"[18] و "هر چه به مقدار اسمی تر نزدیک، بهتر"[19] وجود دارد که اگرچه از هر سه روش می‏‏توان استفاده کرد‏ اما در این پژوهش با توجه به این‏که از میانگین سه تکرار برای تحلیل نتایج در نرم افزار تاگوچی استفاده شد‏ه است، از روش "هرچه بزرگتر بهتر" استفاده شده است. سطح بهینه، میزان تأثیر‏پذیری و همچنین، بیش‏ترین میزان حذف زیستی کافئین پیش‏بینی شده تحت شرایط بهینه در جدول 5 ارایه شده است. همان گونه که در جدول مشاهده می‏شود عامل‏هایی مانند زمان انکوباسیون و غلطتپپتون نسبت به غلظت یون روی دارای تأثیر‏پذیری بیشتری در بهبود تجزیه زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9 بوده‏اند. براساس شرایط پیش‏بینی شده توسط روش تاگوچی انتظار می‏رود که میزان پاسخ پیش‏بینی شده (درصد حذف زیستی کافئین) براساس ترکیب بهینه عامل‏های مورد آزمایش 042/84 درصد باشد.

 

 

جدول 5- شرایط بهینه پیش‏بینی شده برای دستیابی به حداکثر حذف زیستی کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9

عامل

بهترین سطح

مقدار بهینه

میزان سهم در بهبود پاسخ (درصد)

پپتون

3

3 گرم در لیتر

381/11

یون روی

4

5 میلی‏مولار

781/6

کافئین

3

5 گرم در لیتر

406/6

زمان گرماگذاری

3

48 ساعت

781/11

سهم کل عوامل در بهبود پاسخ

 

 

348/36

متوسط پاسخ‏های فعلی در آزمایش انجام شده

 

 

693/47

پاسخ پیش بینی شده در شرایط بهینه

 

 

042/84

پاسخ مشاهده شده در شرایط بهینه

 

 

80/82

 


.انجام آزمایش تاییدی: در این مرحله میزان حذف کافئین پیش‏بینی شده تحت شرایط بهینه، با میزان حذف کافئین به‏دست آمده در همین شرایط با یکدیگر مقایسه می‏شود و چنانچه در فاصله مطلوب قرار گیرد طراحی آزمایش درست و بهینه‏سازی به پایان می‏رسد. به همین علت آزمایشی بر مبنای ترکیب بهینه عامل‏های بدست آمده در جدول 5 انجام و درصد حذف کافئین به دست آمده تخمین زده شد. همان‏گونه که در جدول مشخص است درصد حذف کافئین به‏دست آمده (80/82) با درصد حذف کافئین پیش‏بینی شده (042/84) در فاصله مطلوب قرار گرفته است. شایان ذکر است که درصد حذف کافئین با استفاده از دستگاه HPLC و طبق فرمول زیر محاسبه شده است:

 

درصد حذف کافئین= غلظت اولیه کافئین- غلظت کافئین باقیمانده/ غلظت اولیه کافئین×100 (16).

 

کروماتوگرام‏های HPLC حاصل از تجزیه کافئین تحت سلول‏های رویشی سویه TFS9 در محیط بهینه به‏دست آمده توسط روش تاگوچی در شکل 3 نشان داده شده است.

 

 

 

شکل 3- کروماتوگرام هایHPLC به دست آمده از تجزیه کافئین توسط سویه مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9. خطوط توپر مربوط به ساعت صفرم از تلقیح و نقطه چین مربوط به ساعت 48 ام بعد از تلقیح سوسپانسیون مخمری در محیط کشت بهینه شد.


.بحث و نتیجه‏‏ گیری

کافئین ترکیبی است که دارای آثار‏‏ زیان‏بار فیزیولوژیک بر روی سیستم‏های انسانی بوده و همچنین، به عنوان یک آلاینده‏ زیست محیطی شناخته می‏شود. اگرچه از نیم قرن پیش روش‏های فیزیکی و شیمیایی متنوعی از جمله استخراج به کمک حلال‏های آلی[xx] (29)، روش آب داغ[xxi] (30) و روش دی اکسیدکربن فوق بحرانی[xxii] (31) برای حذف کافئین مطرح شدند اما این روش‏ها نتوانستند راندمان کافی برای حذف کافئین را داشته باشند و مشکلاتی مانند سمیت بالا، گران بودن و حذف غیراختصاصی کافئین، همواره استفاده از این روش‏ها را با محدودیت روبرو ساخته است. با توجه به عدم کارایی مناسب روش‏های سنتی کافئین‏زدایی، حذف زیستی کافئین توسط ریزسازواره‏ها[xxiii] روشی است که لزوم آن روز به روز بیشتر احساس می‏‏شود. نخستین‏ تجزیه میکروبی کافئین با استفاده از سویه‏های قارچی پنی سیلیوم راکی فورتی[xxiv] و استمفیلیوم[xxv] گزارش شده است (14). با این حال گزارش‏ها حاکی از آن است که این سویه‏ها قادرند کافئین را در غلظت 19/0 گرم در لیتر بعد از 29 ساعت گرماگذاری حذف کنند. مزافرا[xxvi] و همکارانش فرآیند تجزیه کافئین را با استفاده از گونه باکتری سراشیا مارسه سنس[xxvii] که قادر به تجزیه کافئین در غلظت 6/0 گرم در لیتر با بازده 100 درصد بعد از 72 ساعت بود، را توسعه دادند (11). در مطالعه انجام شده دیگری، سویه‏ای از سودوموناس پوتیدا[xxviii] که نسبت به کافئین مقاوم است‏ جداسازی شده و پس از بررسی‏های انجام شده مشخص شد‏ که سویه یاد شده قادر به حذف 95 درصدی کافئین با غلظت 5 گرم در لیتر بعد از 95 ساعت گرماگذاری است (32). تجزیه زیستی کافئین همچنین، به وسیله سویه‎‏‏ای از سودوموناس استاتزری[xxix] گزارش شده است، به‏طوری که حذف 59 درصدی کافئین (غلظت اولیه کافئین 2/1 گرم در لیتر) بعد از 24 ساعت گرماگذاری مشاهده شده است (18). کوشش‏هایی برای بهبود بخشیدن به حذف زیستی کافئین از طریق فرآیندهای بهینه‎سازی و با استفاده از تغییر شاخص‏های محیطی مختلف (اسیدیته، دما، دور شیکر، زمان گرماگذاری و غیره) و تغییر شرایط تغذیه‏ای (اضافه کردن منابع کربن و نیتروژن به عنوان سوبستراهای کمکی) انجام شده است‏. مادیاستا[xxx] و اسریدهار[xxxi] بهینه‏سازی فرآیند حذف کافئین را با استفاده از سویه‏های باکتری کلبسیلا و ردوکوکوس توسعه دادند. آن‏ها نشان دادند که افزودن گلوکز به حذف 100 درصدی کافئین با غلظت اولیه 5/0 گرم در لیتر، بعد از گذشت 10 ساعت از گرماگذاری منجر می‎شود (33). در مطالعه انجام شده توسط دش[xxxii] و همکارانش شاخص‏های فیزیکی درگیر در فرآیند تجزیه زیستی کافئین توسط سویه باکتری سودوموناس NCIM 5235مانند اسیدیته، دما و دور شیکر به روش آماری پاسخ سطحی[xxxiii] بهینه‎سازی شد و به کمک این روش تجزیه کافئین از 18/0 به 29/0 گرم در لیتر در ساعت افزایش یافت (34). در تنها مطالعه انجام شده در ارتباط با بهینه‏سازی ‏حذف کافئین در مخمرها، قابلیت گونه مخمری تریکوسپورون آسای[xxxiv] با توانایی 100 درصد حذف کافئین در مدت زمان 96 ساعت و در حضور 5 گرم در لیتر سوکروز تحت شرایط بهینه گزارش شده است (19). در این پژوهش، که برای نخستین بار کاربرد روش آماری تاگوچی در بهینه‏سازی ‏تجزیه زیستی کافئین مطالعه شده است، در طی دو مرحله، آزمایش‏های بهینه‏سازی ‏با استفاده از روش‏های تک عاملی و تاگوچی بررسی شده است. در مرحله اول تأثیر عوامل مختلف شامل منابع کربن (گلوکز، سوکروز، فروکتوز، گالاکتوز و گلیسرول)، منابع ازت (عصاره مخمر، تریپتون، اوره، کازئین و کلرید آمونیوم)، یون‏های فلزی (آهن، مس، روی، کبالت و منگنز) و عواملی مانند دما، اسیدیته، دور شیکر و همچنین، میزان تلقیح[xxxv] بر روی تجزیه کافئین توسط سویه بومی مخمری ساکارومایسس سرویزیه TFS9، که پیش‏تر جداسازی و شناسایی شده بود، بررسی شد. براساس نتایج به‏دست آمده، سه شاخص غلظت گلوکز، غلظت پپتون و غلظت یون روی دارای بیش‏ترین تأثیرپذیری در حذف کافئین بودند که تأیید کننده فعالیت بیشتر آنزیم‏های احتمالی مسئول تجزیه زیستی کافئین توسط سویه بومی یاد شده در این شرایط بوده‏اند. متغیرهای یاد شده به عنوان شاخص‏های تأثیرگذار برگزیده شده و همراه با دو عامل تأثیرگذار غلظت اولیه کافئین و زمان گرماگذاری در طی مرحله دوم با استفاده از روش تاگوچی برای دستیابی به ترکیب بهینه عوامل یاد شده استفاده شد. شایان ذکر است که سایر عامل‏ها شامل اسیدیته، دور شیکر و همچنین، میزان تلقیح با وجود این‏که تأثیر معناداری بر روی رشد و دانسیته سلولی داشتند اما تأثیر معناداری بر روی حذف کافئین نداشتند و بنابراین، با وجود حذف آن‏ها به عنوان متغیرهای کمتر تأثیرپذیر در مرحله دوم بهینه‏سازی ‏با استفاده از روش تاگوچی، از دمای 28 درجه، دور شیکر 150 و اسیدیته 5/5 و همچنین، 5 درصد حجمی/ حجمی میزان تلقیح، که در مرحله اول مطلوب گزارش شدند، در آزمایش‏های بهینه‏سازی ‏استفاده شد. اما طراحی تاگوچی تنها بر مبنای عامل‏های با بیش‏ترین تأثیر‏پذیری انجام شده است‏. روش تاگوچی یکی از روش‏های کارآمد در طراحی آزمایش بوده به گونه‏ای که با این روش تعداد آزمایش‏ها کاهش یافته که این عمل باعث کاهش هزینه و زمان آزمایش‏ها می‏شود. همچنین، با استفاده از این روش می‏توان میانکش‏های احتمالی بین عامل‏های مختلف را مطالعه کرد‏ (22). تحت شرایط بهینه در سطوح انتخاب شده این متغیرها، حداکثر حذف زیستی کافئین با غلظت اولیه 5 گرم در لیتر توسط سلول‏های رویشی سویه بومی ساکارومایسس سرویزیه TFS9 در سطح معناداری 5 درصد (P value<0.05)، 82/8 درصد پس از 48 ساعت گرماگذاری تخمین زده شد. این در حالی است که قبل از آزمایش‏های بهینه‏سازی ‏سویه TFS9 تنها قادر به حذف 5/25 درصد از کافئین با غلظت اولیه 5 گرم در لیتر بعد از 48 ساعت گرماگذاری بوده است (26) که با توجه به افزایش 2/3 برابری کارآیی بالای روش‏ طراحی تاگوچی را به خوبی اثبات می‏‏کند. براساس یافته‏های حاصل از این پژوهش، چنانچه بهینه‏سازی ترکیبات محیط کشت برای دستیابی به حداکثر حذف کافئین در سویه‏های مختلف میکروبی انجام گیرد می‏توان به راندمان های قابل قبول، قبل از کاربرد سویه‏های میکروبی در مقیاس صنعتی، دست یافت. بنابراین، استفاده از روش بهینه‏سازی انجام شده در این پژوهش را می‏‏توان برای سویه‏های میکروبی مشابه نیز پیشنهاد کرد‏.



[1]- Serratia

[2]- Klesiella

[3]- Rhodococcus

[4]- Aspergillus

[5]- Penicillium

[6]- Brevibacterium

[7]- Pseudomonas

[8]- Trichosporon

[9]- St. Louis, Missouri, USA

[10]- Detroit, MI, USA

[11]- E. Merck, Darmstadt, Germany

[12]- Analytical grade

[13]- Ashengroph M and Borchaluei M

[14]- W32b, Nutek, Inc. , Michigan, USA

[15]- Jasco Model PU-980, UK

[16]- Pooling-up technique

[17]- Bigger to Better

[18]- Smaller to better

[19]- Nominal the best

[xx]- Organic Solvent extraction

[xxi]- subcritical water diffusion

[xxii]- super critical carbon dioxide extraction

[xxiii]- Microorganisms

[xxiv]- Penicillium roqueforti

[xxv]- Stemphylum sp.

[xxvi]- Mazzafera

[xxvii]- Serratia marcescens

[xxviii]- Pseudomonas putida

[xxix]- Pseudomonas stutzeri

[xxx]- Madyastha

[xxxi]- Sridhar

[xxxii]- Dash

[xxxiii]- Response surface methodology

[xxxiv]- Trichosporon asahii

[xxxv]- Inoculation size

 

 

 

(1)               Heckman MA.,‏ Weil J.,‏ Mejia G. Caffeine (1, 3, 7-trimethylxanthine) in foods: a comprehensive review on consumption, functionality, safety, and regulatory matters. Journal of Food Science 2010; 75 (3):‏ 77- 87.

(2)               Gokulakrishnan S.,‏ Chandraraj K.,‏ Gummadi SN. Microbial and enzymatic methods for the removal of caffeine. Enzyme and Microbial Technology 2005; 37 (2):‏ 225- 32.

(3)               Strappaghetti G.,‏ Corsano S.,‏ Barbaro R.,‏ Giannaccini G.,‏ Betti L. Structure-activity relationships in a series of 8-substituted xanthines as A1-adenosine receptor antagonists. Bioorganic and Medicinal Chemistry2001; 9(3):‏ 575- 83.

(4)               Greenberg JA.,‏ Dunbar CC.,‏ Schnoll R.,‏ Kokolis R.,‏ Kokolis S.,‏ Kassotis J. Caffeinated beverage intake and the risk of heart disease mortality in the elderly: a prospective analysis. American Journal of Clinical Nutrition 2007; 85 (2):‏ 392–8.

(5)               Dash SS.,‏ Gummadi SN. Degradation kinetics of caffeine and related methylxanthines by induced cells of Pseudomonas sp. Current Microbiology‏ 2007; 55 (1):‏ 56- 60.

(6)               Srisuphan W.,‏ Bracken MB. Caffeine consumption during pregnancy and association with late spontaneous abortion. American Journal of Obstetrics and Gynecology‏ 1986; 154 (1):‏ 14- 20.

(7)               Brand D.,‏ Pandey A.,‏ Roussos S.,‏ Soccol C R. Biological detoxification of coffee husk by filamentous fungi using a solid state fermentation system. Enzyme and Microbial Technology 2000; 27 (1-2):‏ 127-33.

(8)               Mazzafera P. Degradation of caffeine by microorganisms and potential use of decaffeinated coffee husk and pulp in animal feeding. Scientia Agricola‏ 2002; 59(4):‏ 815- 21.

(9)               Batish DR.,‏ Singh HP.,‏ Kaur M.,‏ Kohli RK.,‏ Yadav SS. Caffeine affects adventitious rooting and causes biochemical changes in the hypocotyl cuttings of mung bean (Phaseolus aureus Roxb.). Acta physiologiae plantarum 2008; 30 (3):‏ 401- 5.

(10)           Pandey A.,‏ Soccol CR.,‏ Nigam P.,‏ Brand D.,‏ Mohan R.,‏ Roussos S. Biotechnological potential of coffee pulp and coffee husk for bioprocesses. Biochemical Engineering Journal 2000; 6 (2):‏ 153- 62.

(11)           Mazzafera P.,‏ Olsson O.,‏ Sandberg G. Degradation of caffeine and related methyl xanthenes by Serratia marcescens isolated from soil under coffee cultivation. Microbial Ecol‏ogy 1996; 31 (2):‏ 199- 207.

(12)           Madyastha KM.,‏ Sridhar GR. A novel pathway for the metabolism of caffeine by a mixed culture consortium. Biochemical and Biophysical Research Communications1998; 249 (1):‏ 178- 81.

(13)           Hakil M.,‏ Denis S.,‏ Viniegra-Gonzalez G.,‏ Augur C. Degradation and product analysis of caffeine and related dimethylxanthines by filamentous fungi. Enzyme and Microbial Technology.‏ 1998; 22: 355-9.

(14)           Schwimmer S.,‏ Kurtzman RH. Caffeine metabolism by Penicillium roqueforti. Archives of Biochemistry and Biophysics1971; 147 (1):‏ 109- 13.

(15)           Nayak S.,‏ Harshitha MJ.,‏ Sampath MC.,‏ Anilkumar HS.,‏ Rao CV. Isolation and characterization of caffeine degrading bacteria from coffee pulp. Indian Journal of Biotechnology 2012; 11 (1):‏ 86- 91.

(16)           Sayed Baker.,‏ Sahana S. .,‏ Rakshith D.,‏ Kavitha HU.,‏ Kavitha KS.,‏ Satish S. Biodecaffeination by endophytic Pseudomonas sp. isolated from Coffee arabica L. Journal of Pharmacy Research‏ 2012; 5 (7):‏ 3654-7.

(17)           Fan FY.,‏ Xu Y.,‏ Liang YR.,‏ Zheng XQ.,‏ Borthakur D.,‏ Lu JL. Isolation and characterization of high caffeine-tolerant bacterium strains from the soil of tea garden. African Journal of Microbiology Research 2011; 5 (16):‏ 2278- 86.

(18)           El-Mched F.,‏ Olama Z.,‏ Holail H. Optimization of the environmental and physiological factors affecting microbial caffeine degradation and its application in caffeinated products. Basic Research Journal of Microbiology ‏2013; 1 (3):‏ 17- 27.

(19)           LakshmiV.,‏ Das N. Caffeine degradation by yeasts isolated from caffeine contaminated samples. International Journal of Natural Sciences‏2010; 1 (1):‏ 47- 52.

(20)           Houng JY.,‏ Liao JH.,‏ Wu JY.,‏ Shen SC.,‏ Hsu HF. Enhancement of asymmetric bioreduction of ethyl 4-chloro acetoacetate by the design of composition of culture medium and reaction conditions. Process Biochemistry‏ 2006; 42 (1):‏ 1- 7.

(21)           Stone RA.,‏ Veevers A. The Taguchi influence on designed experiments. Journal of Chemometrics 1994; 8 (2):‏ 103–10.

(22)           Rao RS.,‏ Kumar GC.,‏ Prakasham SR.,‏ Hobbs PJ. The Taguchi methodology as a statistical tool for biotechnological applications: a critical appraisal. Biotechnology Journal 2008; 3 (4):‏ 510- 23.

(23)           Mohapatra PKD.,‏ Maity C.,‏ Rao RS.,‏ Pati BR.,‏ Mondal KC. Tannase production by Bacillus licheniformis KBR6: optimization of submerged culture conditions by Taguchi DOE methodology. Food Research International 2009; 42 (4):‏ 430- 5.

(24)           Ashengroph M.,‏ Nahvi I.,‏ Zarkesh- Esfahani H.,‏ Momenbeik F. Optimization of media composition for improving conversion of isoeugenol into vanillin with Pseudomonas sp. strain KOB10 using the Taguchi method. Biocatalaysis and Biotransfor‏mation 2010; 28 (5-6):‏ 339- 47.

(25)           Taran M.,‏ Froedin N. Decolorization of Remazol Black-B by Halomonas sp. PTCC1417isolated from Urmia lake: Optimization by Taguchi methodology. Biological Journal of Microorganism 2013; 2 (6):‏ 1- 10.

(26)           Ashengroph M.,‏ Borchaluei M. Saccharomyces cerevisiae TFS9, a novel isolated yeast capable of high caffeine-tolerant and its application in biodecaffeination approach. Progress in Biological Sciences‏ 2013; 3 (2):‏ 145- 56.

(27)            Sambrook J., ‏ Fritsch EF., ‏ Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989. 

(28)           Venkata Dasu V.,‏ Panda T.,‏ Chidambaram M. Determination of significant parameters for improved griseofulvin production in a batch bioreactor by Taguchi’s method. Process Biochemistry‏ 2003; 38 (6):‏ 877- 80.

(29)           Udayasankar K. .,‏ Raghavan CV.,‏ Rao PNS.,‏ Rao KL.,‏ Kuppuswamy S.,‏ Ramanathan PK. Studies on the extraction of caffeine from coffee beans. Journal of Food Science and Technol‏ogy 1983; 20 (3):‏ 64- 7.

(30)           Li B.,‏ Yang Y.,‏ Gan Y.,‏ Eaton CD.,‏ He P.,‏ Jones AD. On-line coupling of subcritical water extraction with high-performance liquid chromatography via solid-phase trapping. Journal of Chromatography A‏ 2000; 873 (2):‏ 175- 84.

(31)           Hyong SP.,‏ Nam GI.,‏ Kyoung HKim. Extraction behaviors of caffeine and chlorophylls in supercritical decaffeination of green tea leaves. LWT - Food Science and Technology‏ 2012; 45 (1):‏ 73- 8.

(32)           Woolfolk CA. Metabolism of N-methylpurines by a Pseudomonas putida strain isolated by enrichment on caffeine as the sole source of carbon and nitrogen. Journal of Bacteriol‏ogy 1975; 123 (3):‏ 1088-106.

(33)           Madyastha KM.,‏ Sridhar GR. A novel pathway for the metabolism of caffeine by a mixed culture consortium. Biochemical and Biophysical Research Communications1998; 249 (1):‏ 178- 81.

(34)           Dash SS.,‏ Gummadi N. Optimization of physical parameters for biodegradation for of caffeine by Pseudomonas sp.:‏ A statistical approach. American Journal of Food Technology 2007; 1 (2):‏ 21- 9.