بررسی امکان ایجاد تغییر در جوامع باکتریایی دستگاه گوارش ماهی سفید (Rutilus frisii kutum) با استفاده از پربیوتیک مخمری

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد تغذیه و غذای زنده، پژوهشکده آبزی پروری آب‏های داخلی، بندرانزلی، ایران

2 استادیار شیلات، دانشگاه علوم کشاورزی و مناطبع طبیعی گرگان، ایران

3 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، پژوهشکده آبزی پروری آب‏های داخلی، بندرانزلی، ایران

چکیده

مقدمه: باکتری‏های موجود در میکروبیوتای روده‏ای به جنس‏ها و گونه‏های مختلفی متعلق هستند که بخش زیادی از آن‏ها از دسته باکتری‏های گرم منفی هستند. با این حال در برخی از ماهی‏ها باکتری‏های گرم مثبتی مانند لاکتوباسیلوس‏ها به‏عنوان بخش کوچکی از میکروبیوتای روده‏ای مشاهده می‏شوند که اهمیت بسیاری به عنوان پروبیوتیک دارند. هدف از این مطالعه، بررسی امکان تغییر در ترکیب میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید و افزایش سطوح باکتری‏های اسیدلاکتیک با استفاده از پربیوتیک مخمری بود‏‏.
مواد و روش‏‏ها: این مطالعه در قالب یک طرح کاملاً تصادفی، در 5 تیمار و 3 تکرار انجام شد که در آن‏ها بچه ماهی‏های سفید با سطوح صفر، 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد پربیوتیک مخمری در جیره به مدت 60 روز تیمار شدند. در انتهای دوره تغییرات ایجاد شده در میکروبیوتای روده‏ای شامل سطوح باکتری‏های اسید لاکتیک، تعداد کل باکتری‏های هوازی، نسبت باکتری‏های اسید لاکتیک به تعداد کل باکتری‏ها و تعداد کل باکتری‏های بی‏هوازی اجباری از طریق کشت روی محیط‏های MRS، TSA، SPS بررسی شد‏. همچنین برای‏ تشخیص گونه‏ای لاکتوباسیلوس‏ها از آزمون‏‏‏های تشخیصی بیوشیمیایی استفاده شد.
نتایج: بیش‏ترین‏‏ تعداد باکتری‏های اسیدلاکتیک در تیمار 5/0 درصد و کم‏ترین‏‏ میزان در تیمار شاهد مشاهده شد (05/0>P value). همچنین، تیمار بچه‏ماهی‏های ‏‏سفید با 5/0درصد پربیوتیک مخمری به‏طور‏‏ معنا‏داری تعداد کل باکتری‏ها را افزایش داد (05/0>P value). بیش‏ترین‏‏ میزان باکتری‏های بی‏هوازی اجباری در تیمار شاهد و کم‏ترین‏‏ میزان در تیمار 5/0 و 1 درصد مشاهده شد‏ (05/0>valueP). بررسی‏های تشخیصی حاکی از وجود گونه‏های Lactobacillus plantarum،L. caseiوL. acidophilous در میکروبیوتای روده ای پس از مصرف پربیوتیک مخمری در جیره بود.
بحث و نتیجه‏ گیری: نتایج این مطالعه نشان داد استفاده از 5/0 درصد پربیوتیک مخمری در جیره ماهی سفید سبب تغییرات معنا‏داری در میکروبیوتای روده‏ای به سمت جوامع میکروبی بالقوه مفید و افزایش تعداد باکتری‏های ‏‏اسید لاکتیک می‏شود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The study of modulation of gut microbiota of Caspian white fish (Rutilus frisii kutum) through administration of yeast based prebiotic

نویسندگان [English]

  • Rudabeh Rufcahei 1
  • Seyed Hossein Hoseinifar 2
  • Monireh Faeed 3
1 M.Sc. of Fish Nutrition, Inland Water Aquaculture Research Center, Bandar Anzali. Iran
2 Assistant Professor of Fisheries, Gorgan University of Agricultural Sciences and Natural Resources, Iran
3 Ph.D. Student of Microbiology, Inland Water Aquaculture Research Center, Bandar Anzali. Iran
چکیده [English]

Introduction:The intestinal microbiota of fish belongs to different species compare to terrestrial animals, mainly Gram-negative bacteria are predominant. Despite importance as probiotic, gram-positive bacteria like Lactobacillus Sp. are minor constitutes of gut microbiota. The aim of this study was to investigate the possibility of modulation of Kutum intestinal microbiota and elevation of lactic acid bacteria (LAB) levels through administration of yeast based prebiotic.
Materials and methods: The study was performed as randomized design with 5 treatments and 3 replications in which kutum were fed different levels, 0, 0.5, 1, 1.5 and 2 % of yeast based prebiotic for 60 days. At the end of the trial, culture based analysis of intestinal microbiota include lactic acid bacteria levels, total bacteria and obligatory anaerobic bacteria were performed by using MRS, TSA, SPS media. Also, the isolated lactic acid bacteria species were determined by biochemical test.
Results: The highest and lowest lactic acid bacteria levels observed in 0.5 % treatment and control treatment, respectively (P value > 0.05). Also, administration of 0.5 % yeast based prebiotic significantly increased total viable bacteria (P value > 0.05). The highest and lowest obligatory anaerobic bacteria were recorded in control and 0.5 and 1 % treatment (P value>  0.05). The biochemical test revealed isolation of three species Lactobacillus plantarum, L. caseie, L. acidophilous in the intestinal microbiota after administration of yeast based prebiotic.
Discussion and conclusion: The results of this study determined that administration of 0.5 % yeast based prebiotic significantly modulates the intestinal microbiota of kutum fry toward potentially beneficial communities (i.e LAB).

کلیدواژه‌ها [English]

  • Yeast based prebiotic
  • Intestine microbiota
  • Rutilus frisii kutum
  • Lactic acid bacteria

مقدمه

طیف گسترده‏ای از میکروب‏هایی که در محیط‏های آبی، خاکی، رسوبات و غذا یافت می‏شوند در دستگاه گوارش ماهیان نیز متمرکز شده و میکروبیوتای روده‏ای را تشکیل می‏دهند. اگرچه حضور باکتری‏های بومی در دستگاه گوارش ماهیان شناخته شده است، اما اطلاعات محدودی در زمینه جوامع میکروبی، استقرار، تنوع و مهم‏تر از همه امکان تغییر آن به سمت جوامع باکتریایی مفید وجود دارد (1). ترکیب و ساختار میکروبیوتای روده ای ماهی به گونه‏ای است که تحت تأثیر محیط پیرامون قرارگرفته و گونه‏های مختلف میکروبی بر سر جایگاه‏های محدود اتصال، مواد مغذی و انرژی قابل دسترس با هم رقابت می‏کنند. اگر چه ترکیب میکروبیوتای روده به عواملی چون ژنتیک، تغذیه و محیط بستگی دارد ولی به‏طور‏‏ کلی دستگاه گوارش ماهی دارای جمعیتی معادل 108 تا 107 باکتری به ازای هر گرم وزن روده است (2). حضور طبیعی میکروبیوتای بومی و حفاظتی در دستگاه گوارش از طریق مکانیسم حذف رقابتی، گسترش و تکامل سیستم ایمنی را به همراه داشته و به منزله‏ کلید برای‏ حفظ سلامت ماهی عمل می‏کند (3).

پربیوتیک‏ها، ترکیبات غذایی غیر قابل هضمی هستند که باعث تحریک رشد و تکثیر یک یا تعداد محدودی از باکتری‏های روده شده و بدین ترتیب سلامت میزبان را بهبود می‏بخشند (4). این ترکیبات غذایی که قابل تخمیر هستند، بستر مناسبی را برای رشد باکتری‏های پروبیوتیکی بخصوص لاکتوباسیلوس‏ها و بیفیدوباکتر‏ها فراهم کرده و سبب افزایش تعداد و غالبیت آن‏ها می‏شوند (5). گزارش‏های محدودی درباره امکان تغییر میکروبیوتای روده ای آبزیان از طریق به کارگیری پربیوتیک‏ها در جیره غذایی وجود دارد (6) ‏و هنوز بسیاری از جنبه‏های ‏‏آن ناشناخته مانده است (7). از جمله مطالعات انجام شده در این زمینه می‏توان به بررسی آثار پربیوتیک الیگوفروکتوز و اینولین بر میکروبیوتای روده‏ای ماهی توربوت (8)، فیل ماهی (9)، ماهی چار قطبی (10) و تاس ماهی سیبری (11) اشاره کرد. با وجود این اطلاعات محدود، امکان ایجاد تغییر در میکروبیوتای روده‏ای ماهی سفید به سمت جوامع بالقوه مفید (لاکتوباسیلوس‏ها) با استفاده از پربیوتیک تاکنون بررسی نشده است.

بنابراین مطالعه حاضر با هدف تعیین پتانسیل تغییر میکروبیوتای روده ای و سوق دادن آن به سمت جوامع بالقوه مفید با استفاده از سطوح مختلف پربیوتیک مخمری در جیره غذایی انجام شد.

 

.مواد و روش‏ها

این مطالعه در ایستگاه تغذیه و غذای زنده شمال کشور واقع در ساحل بندر انزلی انجام شد. تعداد 25 عدد بچه ماهی سفید بازای هر تانک فایبرگلاس با میانگین وزن اولیه 06/0 ± 15/1 گرم تأمین شده و به شکل تصادفی در 15 تانک فایبرگلاس100 لیتری که تا 80 لیتر آب‏گیری شده بود توزیع شد‏ند. بچه ماهی‏ها با سطوح مختلف پربیوتیک مخمری (صفر (شاهد)، 5/0، 1، 5/1 و 2 درصد به ازای کیلوگرم جیره) به مدت 60 روز تغذیه شدند. پربیوتیک مورد استفاده در این مطالعه یک محصول تجاری تولید شده از مخمر خشک بود‏.

در انتهای دوره به منظور بررسی آثار احتمالی پربیوتیک مخمری بر جوامع باکتریایی میکروبیوتای روده‏ای، تعداد باکتری‏های اسید لاکتیک، تعداد کل باکتری‏های بی‏‏‏‏هوازی و نیز تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر در روده بچه ماهی سفید تعیین شد‏. بدین ترتیب که در انتهای دوره به‏طور‏‏ تصادفی نمونه‏برداری از ماهیان انجام شد و برای‏ از بین بردن کامل باکتری‏های موجود در سطح خارجی بدن بچه ماهی‏ها، به مدت 60 ثانیه در محلول بنزالکونیوم کلراید 1/0 درصد شسته شده و پس از آن دوباره با آب استریل شستشو داده شد (12).

نمونه‏های روده پس از تخلیه کامل محتویات، توزین و برای‏ هموژن نمودن به هاون چینی استریل منتقل شد‏. پس از هموژن کردن نمونه‏های روده با استفاده از سرم فیزیولوژی استریل رقت‏های 1-10 تا 7-10 تهیه شد‏. از رقت‏های تهیه شده، تحت شرایط کاملاً ضد عفونی حجمی معادل 1/0 میلی‏‏‏لیتر برداشته شد و به محیط‏های کشت Tryptic Soy Agar یا TSA (به منظور تعیین تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر موجود در میکروبیوتای روده)، محیط کشتDeMan, Rogosa and Sharpe یا MRS (برای‏ تعیین تعداد باکتری‏های اسید لاکتیک) و محیط کشت Sulfite Polymyxin Sulfadiazine (برای‏ تعیین تعداد کل باکتر‏های بی‏هوازی) منتقل و در سطح پلیت پخش شد (10). انکوباسیون پلیت‏ها برای‏ بررسی تعداد باکتری‏های اسید لاکتیک در دمای اتاق و به مدت 5 روز انجام شد (13). برای‏ کشت باکتری‏های بی‏هوازی اجباری با استفاده از جار بی‏‏‏‏هوازی و کل باکتری‏های زیست‏پذیر ‏‏‏‏در دمای 30 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد انکوباسیون انجام شد. پس از سپری شدن زمان انکوباسیون، باکتری‏های هر پلیت توسط دستگاه جدایه شمار[1] شمارش و برحسب لگاریتم واحد جدایه[2] در وزن روده محاسبه شد (9).

.تعیین جنس و گونه از طریق آزمون‏‏‏های ‏‏.بیوشیمیایی: با توجه به اهمیت باکتری‏های ‏‏اسید لاکتیک به عنوان پروبیوتیک، هریک از جدایه‏های ‏‏به دست آمده در پلیت‏های MRS آگار پس از شمارش، بر‏اساس رنگ، شفافیت، اندازه و ظاهر آن‏ها در پلیت‏های MRS آگار کشت مجدد داده شده و در جار بی‏هوازی در انکوباتور 37 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد به مدت 24 ساعت قرار گرفت. پس از رشد، هر کدام به طور جداگانه در MRS مایع تلقیح، روی آن‏ها پارافین مایع استریل ریخته و در انکوباتور 30 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد به مدت 24 ساعت نگهداری شد. سپس، در هر یک از لوله‏ها 2/0 میلی‏‏‏لیتر گلیسرول 30 درصد ریخته شد. محتویات لوله در ویال‏های اپندورف استریل 5/1 میلی‏‏‏لیتری ریخته شده و در فریزر منفی 80 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد برای مطالعات تشخیص گونه‏ای نگهداری شد.

آزمون‏‏‏های کاتالاز، KOH، حرکت و رنگ‏آمیزی به روش گرم روی جدایه‏ها انجام شد. به منظور مشاهده رشد باکتری‏های اسید لاکتیک در اسیدیته‏‏های ‏‏متفاوت، محیط کشت MRS مایع تهیه شده و قبل از استریل کردن به آن قطره قطره HCL یک نرمال تا رسیدن به ‏اسیدیته ‏4/4 اضافه شد. برای‏ ‏اسیدیته‏ قلیایی هم از هیدروکسید پتاسیم استفاده شد تا زمانی که ‏اسیدیته‏ به 6/9 رسید (10). همچنین، محیط کشت MRS مایع با 5/6 درصد NaCl تهیه و در آن کشت انجام شد. نمونه‏ها در دمای 30 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد قرار گرفته و تا 7 روز رشدشان با لوله شاهد مقایسه و بررسی شد. به‏علاوه رشد جدایه‏ها در دماهای 10، 15 و 45 درجه تا مدت یک هفته بررسی شد (14 و 15). برای‏ انجام آزمایش تخمیر قند از ترکیبات محیط MRS مایع استفاده شد و به جای گلوکز و عصاره گوشت هر بار به آن یک درصد از هر یک از قند‏های مورد بررسی اضافه شد‏. پس از تلقیح، روی محیط‏ها پارافین مایع استریل ریخته شده و در انکوباتور با دمای 30 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد قرار گرفت و نتیجه تا 7 روز بررسی شد‏ (16- 18). ‏

.تجزیه و تحلیل داده‏ها: با توجه به نرمال بودن داده‏ها برای‏ بررسی وجود یا عدم وجود اختلاف از تحلیل واریانس یک‏طرفه[3] و آزمون توکی استفاده شد‏. برای رسم نمودار‏ها از برنامه اکسل (2003) و برای تجزیه و تحلیل دادهاد از نرم افزار SPSS (ویرایش 13) استفاده شد‏.

.نتایج

همان‏طور که در جدول 1 نشان داده شده است، گونه‏های L. plantarum، casei Lو L. acidophilus به ترتیب در 16، 7 و 3 کلونی جدا شده تشخیص داده شد؛ و همان‏طور که جدول 2 ملاحظه می‏شود در تیمارهای 5/0 و 1 درصد بیش‏ترین‏‏ تنوع گونه‏ای جدا شده تشخیص داده شد.

آثار سطوح مختلف پربیوتیک مخمری بر سطوح باکتری‏های اسید لاکتیک (برحسب لگاریتم واحد کلونی در گرم وزن روده) در میکروبیوتای روده‏‏ای بچه ماهی سفید در شکل 1 نشان داده شده است. استفاده از سطح 5/0درصد از پربیوتیک مخمری به‏طور‏‏ معناداری سبب افزایش باکتری‏های لاکتو باسیلوس در میکروبیوتای روده‏ای شد‏ (05/0 >P value). تعداد باکتری‏های لاکتیک در تیمار شاهد کمتر از حد قابل شمارش از نظر آماری (بین 30 تا 300 جدایه در پلیت) بود. در تیمارهای تغذیه شده با پربیوتیک مخمری سطوح مختلف باکتری‏های لاکتوباسیلوس مشاهده شد که بیش‏ترین‏‏ میزان آن در تیمار 5/0 درصد و کم‏ترین‏‏ میزان در تیمارهای 5/1 و 2 درصد به‏دست آمد. از نظر آماری اختلاف معناداری بین تیمارهای 5/1 و 2 درصد از نظر سطوح باکتری‏های اسید لاکتیک مشاهده نشد (05/0 <P value).

 

 

شکل 1- آثار تغذیه با جیره کنترل و جیره‏های ‏‏حاوی مقادیر مختلف پربیوتیک مخمری بر سطوح باکتری‏های اسید لاکتیک (بر حسب لگاریتم واحد کلونی در گرم وزن روده) در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید. ستون‏های (میانگین ± انحراف معیار) با حروف متفاوت دارای اختلاف معنادار هستند (05/0 >P value).

 

 

 

جدول 1- تقسیم بندی بیوشیمیایی گونه‏های لاکتوباسیلوس جدا شده از روده بچه ماهی سفید

گونه‏های ‏‏احتمالی جنس لاکتوباسیلوس

L. acidophilus

L. casei

L. plantarum

تعداد کلونی جدا شده

3

7

16

حضور دی آمینوپیملیک اسید

+

+

+

تولید دی اکسید کربن از گلوکز

-

-

-

تولید آمونیاک از آرژنین

-

-

-

رشد در دمای 10 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد

+

+

+

رشد در دمای 15 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد

+

+

+

رشد در دمای 45 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد

-

+

-

گلیسرول

+

-

+

ال - آرابینوز

-

-

+

ریبوز

+

+

-

دی - گزیلوز

-

-

-

گالاکتوز

+

+

-

رامنوز

+

+

-

اینوزیتول

+

+

+

مانیتول

+

+

+

سوربیتول

+

+

+

1- متیل – دی- مانوزید

-

-

+

1- متیل – دی- گلوکوزید

-

-

+

ان – استیل - گلوکوزآمین

+

+

+

آمیگدالین

+

+

+

آربوتین

+

+

+

ایزولین

+

+

+

سالیسین

+

+

+

سلوبیوز

+

+

+

مالتوز

+

+

+

لاکتوز

+

+

+

ملیبیوز

-

-

+

سوکروز

+

+

+

تری هالوز

+

+

+

ملیزیتوز

+

+

+

دی- رافینوز

-

-

-

نشاسته

+

+

-

گزیلیتول

-

-

-

2- جنتیبیوز

+

+

+

دی- تورانوز

-

-

-

دی- تاگاتوز

+

+

-

دی- ارابیتول

-

-

+

گلوکونات

+

+

-

2- کتو - گاوکونات

-

-

-

5- کتو - گلوکونات





+

+

-

 

جدول 2- گونه‏‏های ‏‏لاکتوباسیلوس‏ جدا شده از میکروبیوتای روده ای بچه ماهی‏ سفید تغذیه شده با جیره کنترل و جیره‏های ‏‏حاوی مقادیر مختلف پربیوتیک مخمری

تیمار

درصد پربیوتیک مخمری

L.plantarum

L .casei

L. acidophilus

1

صفر

_

_

_

2

5/0

+

+

+

3

1

+

+

_

4

5/1

+

_

_

5

2

+

_

_

 

 

مقادیر تعداد کل باکتری‏های زیست پذیر[4] (بر حسب لگاریتم واحد کلونی در گرم وزن روده) در میکروبیوتای روده ای بچه ماهی سفید در اثر تغذیه با سطوح مختلف پربیوتیک مخمری در شکل 2 نمایش داده شده است. همان‏طور که در شکل مشخص است تیمارهای 5/0، 1 و 5/1 درصد پربیوتیک مخمری سبب افزایش معناداری تعداد کل باکتری‏ها در میکروبیوتای روده ای شدند (05/0 >P value). از نظر آماری اختلاف معناداری بین تیمارهای یاد شده و تیمارهای شاهد و 2 درصد پربیوتیک مخمری مشاهده شد
(05/0 >P value). بیش‏ترین‏‏ میزان تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر ‏‏‏‏مربوط به تیمارهای 5/0 و 1 درصد پربیوتیک مخمری بود که بین آن‏ها اختلاف معناداری وجود نداشت (05/0 <P value). به همین ترتیب کم‏ترین‏‏ میزان تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر مربوط به تیمارهای شاهد و 2 درصد پربیوتیک مخمری بود که اختلاف معناداری بین این دو تیمار مشاهده نشد‏ (05/0 <P value).

تعداد کل باکتری‏های ‏‏بی هوازی اجباری نیز در اثر تغذیه با پربیوتیک مخمری تغییراتی نشان داد (شکل 3). بیش‏ترین‏‏ میزان باکتری‏های بی‏‏‏‏هوازی اجباری در تیمار شاهد مشاهده شد‏ که اختلاف معنا‏داری با سایر تیمارها داشت (05/0 >P value). کم‏ترین‏‏ میزان باکتری‏های بی‏هوازی اجباری مربوط به تیمارهای 5/0 و 1 درصد بود که اختلاف معنا‏داری بین آن‏ها وجود نداشت
(05/0 <P value). اگرچه تعداد کل باکتری‏های بی‏هوازی در تیمارهای 5/1 و 2 درصد بیشتر از دو تیمار فوق بود ولی کاهش معنا‏داری نسبت به تیمار شاهد در این دو تیمار مشاهده شد‏ (05/0 >P value).

نتایج مربوط به محاسبه سهم باکتری‏های اسید لاکتیک (باکتری‏های ‏‏بالقوه مفید پروبیوتیکی) در میکروبیوتای روده‏ای در جدول 3 آمده است. همان‏طور که در شکل‏های ‏‏1 و 2 مشاهده شد‏ نسبت باکتری‏های اسید‏لاکتیک به تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر ‏‏‏‏در تیمار 5/0 درصد به‏طور‏‏ معناداری بیشتر از سایر تیمارها بود (05/0 >P value). با توجه به این‏که هیچ باکتری لاکتوباسیلوسی در تیمار شاهد مشاهده نشد سهم آن‏ها در میکروبیوتای روده‏ای صفر بود. کم‏ترین‏‏ سهم باکتری‏های ‏‏اسید لاکتیک در میکروبیوتای روده‏ای مربوط به تیمار 2 درصد بود که اختلاف معناداری با سایر تیمارها داشت (05/0 >P value).

 

 

شکل 2- آثار تغذیه با جیره کنترل و جیره‏های ‏‏حاوی مقادیر مختلف پربیوتیک مخمری بر تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر (بر‏حسب لگاریتم واحد کلونی در گرم وزن روده) در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید. ستون‏ها (میانگین ± انحراف معیار) با حروف متفاوت دارای اختلاف معنا‏دار هستند
(05/0 >P value).

 

شکل 3- آثار تغذیه با جیره کنترل و جیره‏های ‏‏حاوی مقادیر مختلف پربیوتیک مخمری بر تعداد کل باکتری‏های بی‏هوازی اجباری (بر حسب لگاریتم واحد کلونی در گرم وزن روده) در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید. ستون‏های (میانگین ± انحراف معیار) ‏با حروف متفاوت دارای اختلاف معنا‏دار هستند (05/0 >P value).

 

 

 

جدول 3- نسبت (درصد) باکتری‏های لاکتوباسیل به تعداد کل باکتری‏های زیست‏پذیر میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید در اثر تغذیه با جیره کنترل و جیره‏های ‏‏حاوی مقادیر مختلف پربیوتیک مخمری

 

شاهد

5/0 درصد

1 درصد

5/1 درصد

2 درصد

نسبت LAB به TVC

d 00/0 ± 000/0

a 24/0 ± 106/1

b 09/0 ± 10/0

ab30/0 ± 11/0

c 07/0 ± 04/0

اعداد (میانگین ± انحراف معیار) در یک ردیف با حروف متفاوت دارای اختلاف معنادار هستند (05/0 >P value).

 


.بحث و نتیجه‏ ‏گیری

یکی از مهم‏ترین ویژگی‏های میکروبیوتای دستگاه گوارش آبزیان تنوع گونه‏ای است به‏طور‏‏ی‏که گستره وسیعی از جوامع باکتریایی در آن وجود دارند (7). مطالعات انجام شده نشان داده است که عواملی چون تغذیه، محیط روده، سن، موقعیت جغرافیایی، عوامل محیطی و استرس بر تنوع و ترکیب میکروبیوتای روده‏ای اثر دارند (19 و 20). از بین موارد بیان شده، تغذیه یکی از مهم‏ترین عواملی است که می‏تواند به تغییر در میکروبیوتای روده ای منتج شود (7). ازاین رو تا به امروز آثار کاربرد مواد مختلف در جیره از جمله مکمل‏های غذایی چون پرو و پربیوتیک‏ها بر ترکیب جوامع باکتریایی در میکروبیوتای روده‏ای بررسی شده است (21). با وجود این‏که این تغییر، فرآیند‏ی پیچیده بوده که روند آن به‏طور‏‏ کامل مشخص نشده است ولی شناخت هرچه بیشتر آن می‏تواند استفاده از روش‏های ‏‏مبتنی بر دستکاری ‏میکروبیوتای دستگاه گوارش آبزیان را به عنوان یک راهبرد برای‏ جلوگیری از بروز بیماری‏های ‏‏باکتریایی و به تبع آن کاهش مصرف آنتی‏بیوتیک میسر سازد (9).

در مطالعه حاضر مشخص شد‏ که تعداد
 لاکتوباسیلوس‏ها (شکل 1) در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید تغذیه شده با جیره غذایی حاوی 5/0 درصد پربیوتیک مخمری به طور معناداری نسبت به تیمارهای شاهد، 5/1 و 2 درصد افزایش یافت. در حالی‏که در تیمار شاهد اثری از رشد باکتری‏های اسیدلاکتیک مشاهده نشد‏. نتایجی مشابهی در مطالعه حسینی فر[v] و همکاران گزارش شده است که حاکی از افزایش معنادار سطوح باکتری‏های ‏‏اسید لاکتیک در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی فیل[vi] پس از به‏کارگیری سطوح مختلف (صفر، 1 و 2 درصد) پربیوتیک مخمری به‏دست آمده از مخمر نانوایی غیرفعال[vii] بود (9). همچنین، در مطالعه دیگری روی ماهی سفید افزایش معنا‏داری در تراکم لاکتوباسیلوس‏ها در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید تغذیه شده با جیره‏های ‏‏غذایی حاوی پروبیوتیک و ویتامین ث مشاهده شد (22). ایری[viii] و همکاران نیز در بررسی تغذیه‏ای روی بچه ماهی ازون برون مشاهده کردند که فروکتوالیگوساکارید (به عنوان پربیوتیک) سبب افزایش تعداد باکتری‏های اسید لاکتیک می‏شود (23). همچنین، استفاده از گالاکتوالیگوساکارید (پربیوتیک) به‏طور‏‏ معناداری سبب افزایش تعداد باکتری‏های اسید لاکتیک در میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی نورس کلمه شد‏ (24).

همان‏طور که شکل‏های 1 تا 3 نشان می‏دهند تعداد کل باکتری‏ها به‏طور‏‏ معنا‏داری در تیمار 5/0 و 1 درصد افزایش یافته و در همین تیمارها کاهش‏ معنادار تعداد باکتری‏های بی‏‏‏‏هوازی اجباری و افزایش معنا‏دار باکتری‏های اسیدلاکتیک دیده می‏شود ‏(05/0 >P value). در تایید این نتایج رولو[ix] و همکاران کاهش تعداد باکتری‏های بی‏‏‏‏هوازی اجباری میکروبیوتای روده ای را در اثر استفاده از پروبیوتیک گزارش کرده‏اند (25).

افزایش سطوح لاکتوباسیلوس‏ها در میکروبیوتای روده‏ای پس از به‏کارگیری پربیوتیک مخمری در جیره به‏عنوان پربیوتیک احتمالاً به علت تأمین نیازهای غذایی است؛ زیرا لاکتوباسیلوس‏ها قادر نیستند آنزیم‏های ‏‏تجزیه کننده خارج سلولی تولید کنند و به همین علت برای رشد به میکروارگانیسم‏های دیگری وابسته‏اند. با توجه به این‏که پربیوتیک استفاده شده در این مطالعه محصولی مخمری است، ممکن است فراهم شدن آنزیم‏ها، RNA، نوکلئوتید‏های آزاد، متابولیت‏های ‏‏مختلف، ویتامین‏ها و آمینواسیدها بوده که بستر رشد لاکتوباسیلوس‏ها را فراهم آورده است (26).

بررسی‏های تشخیصی بیوشیمیایی انجام شده نشان داد گونه‏های غالب لاکتوباسیلوس جدا شده از میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید پس از تغذیه با پربیوتیک مخمری شامل L. plantarum،L. caseiو
L. acidophilus بودند. در مطالعه انجام شده در زمینه بررسی میکروبیوتای دستگاه گوارش کپور ماهی پرورشی نیز این گونه‏ها به‏عنوان لاکتوباسیلوس‏های غالب جدا شده اند (27). با این وجود قمی[x] و همکاران گونه‏های ‏‏L. brevis، L. plantarum، Lactococcus lactisرا به‏عنوان گونه‏های غالب لاکتوباسیلوس جدا شده از میکروبیوتای روده‏ای بچه ماهی سفید پس از مکمل‏سازی جیره غذایی با پروبیوتیک و ویتامین ث گزارش کردند (22).

شاخص‏های ‏‏داخلی و خارجی بسیاری از جمله فرم دستگاه گوارش، دمای آب، روش پرورش، نوع جیره غذایی نوسانات فصلی و طول روز می‏توانند بر ترکیب میکروبیوتای دستگاه گوارش اثر گذار باشند (1). اطلاعات محدودی در ارتباط با آثار این عوامل وجود دارد. از جمله این بررسی‏ها می‏توان به مطالعه حاجی[xi] و همکاران در سال 2004 اشاره کرد. که مؤید اثر دمای آب بر حداکثری لاکتوباسیلوس‏های دستگاه گوارش کپور بود به‏طور‏‏ی‏که در دمای بالای 20 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد بیشتر گونه‏‏ L. lactis و در دمای 4 تا 10 درجه سانتی‏‏‏‏‏گراد بیشتر Lactococcus ranolactisمشاهده شد‏ (28). با این حال مطالعه‏ای تاکنون درخصوص تعیین اثر عوامل یاد شده بر ترکیب گونه‏ای لاکتوباسیلوس‏ها در میکروبیوتای روده ای ماهی سفید و حداکثر شدن آن‏ها انجام نشده است.

مطالعات انجام شده نشان داده است که گونه‏های ‏‏لاکتوباسیلوس تشخیص داده شده در بررسی حاضر زمانی‏که با مدیریت تغذیه‏ای در میکروبیوتای دستگاه گوارش غالب می‏شوند موجب افزایش رشد و افزایش ایمنی ماهی می‏شوند ‏(29- 31) در نتیجه استفاده از سطح 5/0 درصد پربیوتیک مخمری برای‏ تغییر ترکیب میکروبیوتای روده‏ای به‏سمت جوامع بالقوه مفید با خواص پروبیوتیکی پیشنهاد می‏شود.

.تشکر و قدردانی

از همه کارکنان محترم ایستگاه تحقیقاتی تغذیه و غذای زنده بندر انزلی و جناب آقای مهندس مهران الماسی برای حمایت مالی از این پژوهش، تشکر و قدردانی می‏شود.

 



[1]- SSGMP-671M ساخت آلمان

[2]- Log CFU/g

[3]- One-Way ANOVA

[4]- Total viable counts (TVC)

[v]- Hoseinifar

[vi]- Huso huso

[vii]- Saccharomyces cerevisiae var ellipsoideus

[viii]- Iri

[ix]- Rollo

[x]- Ghomi

[xi]- Hagi 

(1)               Nayak SK. Role of gastrointestinal microbiota in fish. Aquaculture Research 2010; 41 (11): 1553- 73.

(2)               Pérez T., Balcazar JL ., Ruiz-Zarzuela I., Halaihel N., Vendrell D., De Blas I et al. Host –microbiota interactions within the fish intestinal ecosystem. Mucosal Immunology 2010; 3 (4): 355- 60

(3)               Go´mez GD., Balca´zar JL. A review on the interactions between gut microbiota and innate Immunity of fish. FEMS Immunology and Medical Microbiology 2008; 52 (2): 145- 54.

(4)                Collins MD., Gibson GR. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut. American Society for Clinical Nutrition 1999; 69 (5): 1052- 7.

(5)               Marteau P., Flourie B. Tolerance to low-digestible carbohydrates: symptomatology and methods. British Journal of Nutrition 2001; 85: S17– 21

(6)               RingØ E., Olsen RE., Gifstad TØ., Dalmo RA., Amlund H., Hemre G et al. Prebiotics in aquaculture: a review. Aquaculture Nutrition 2010; 16 (2): 117- 36.

(7)               Bur G., Gatlin D., Rick S. Microbial ecology of the gastrointestinal tract of fish and the potential application of prebiotics and probiotics in finfish aquaculture. Journal of the World Aquaculture Society 2005; 36 (4): 425- 36.

(8)               Mahious AS., Gatesoupe FJ., Hervi M., Metailler R., Ollevier F. Effect of dietary inulin and oligosaccharides as prebiotics for weaning turbot, Psetta maxima (Linnaeus, C. 1758). Aquaculture 2006; 14 (3): 219- 29.

(9)               Hoseinifar SH., Mirvaghefi A., Mojazi Amiri B., Rostami HK., Merrifield DL. The effects of oligofructose on growth performance, survival and autochthonous intestinal microbiota of beluga (Huso huso) juveniles. Aquaculture Nutrition 2011; 17 (5): 498- 504

(10)           Ringo E., Sperstad S., Myklebust R., Mayhew TM., Olsen E. The effect of dietary inulin on bacteria associated with hindgut of Arctic charr (Salvelinus alpinus L.). Aquaculture Research 2006; 37 (9): 891- 7.

(11)           Mahious AS., Van Loo J., Ollevier F. Impact of the prebiotics, inulin and oligofructose on microbial fermentation in the spiral valve of Siberian sturgeon (Acipenser baerii). Aqua 2006; World Aquaculture Society, Florence, Italy, May 9- 13.

(12)           Olsen R., Myklebust R., Kryvi H., Mayhew T., Ringø E. Damaging effect of dietary inulin on intestinal enterocytes in Arctic charr (Salvelinus alpinus L.). Aquaculture Research 2001; 32 (11): 931- 4.

(13)           Azizpour K., Tokmechi A., Agh N. Charectrization of lactic acid bacteria isolated from the intestines of common carp of west Azarbaijan, Iran. Journal of Animal and Veterinary Advances 2009; 8 (6): 1162- 4.

(14)           Cai Y., Suyanandana P., Saman P., Benno Y. Classification and characterization of lactic acid bacteria isolated from the intestines of common carp and freshwater prawns. The Journal of General and Applied Microbiology 1999; 45 (4): 177- 84.

(15)           Mac Faddin JF. Biochemical tests for identification of medical bacteria. Philadelphia, USA: Lippincott Williams & Wilkins Publication; 2000.

(16)           Nair P and Surendran P. Biochemical characterization of lactic acid bacteria isolated from fish and prawn. Journal of Culture Collections 2004- 2005; 4: 48- 52.

(17)           Patil M., Pal A., Pal V., Kumariyaddula R. Isolation of bacteriocinogenic lactic acid bacreria from rat intestine. Journal of Culture Collections 2006- 2007; 5 (1): 58- 63.

(18)           Kesarcodi-Watson A., Kaspar H., Josei Lategan M., Gibson L. Probiotics in aquaculture: The need, principles and mechanisms of action and screening processes. Aquaculture 2008; 274 (1): 1- 14.

(19)           Skrodenyte-Arbaciauskiene V., Sruoga A., Butkauskas D. Assessment of microbial diversity in the river trout Salmo trutta fario L. intestinal tract identified by partial 16S rRNA gene sequence analysis. Fisheries Science 2006; 27 (3): 597- 602.

(20)           Denev S., Staykov Y., Moutafchieva R., Beev G. Microbial ecology of the gastrointestinal tract of fish and the potential application of probiotics and prebiotics in finfish aquaculture. International Aquatic Research 2009; 1 (1): 1- 29.

(21)           Romero J., Navarrete P. 16S rDNA-based analysis of dominant bacterial populations associated with early life stages of Coho salmon (Oncorhynchus kisutch). Microbial Ecology 2006; 51 (4): 422- 30.

(22)           Ghomi M., Heshmatipour R., Nazari R., Sohrabnejad M., Zarei M., Nikoo M., et al. Intestinal microflora of Rutilus Frisii kutum under dietary supplementation with probiotic and vitamin C. Bulgarian Journal of Agricultural Science 2000; 16 (5): 635- 42.

(23)           Irii Y., Khoshbavar Rostami H., Akrami R. Effect of dietary fructooligosaccharide as a prebiotic on the growth and density of Lactobacillus in intestine of stellate (Acipenser stellatus) fingerling. Fisheries Science and technology 2013; 1 (1): 1- 11.

(24)           Hoseinifar S., Khalili M., Khoshbavar Rostami H., Esteban A. Dietary galactooligosaccharide affects intestinal microbiota, stress resistance, and performance of Caspian roach (Rutilus rutilus) fry. Fish & Shellfish Immunology 2013; 35 (5): 1416- 20.

(25)           Rollo A., Sulpizio R., Nardi M., Silvi S., Orpianesi C., Caggiano M., et al. Live microbial feed supplement in aquaculture for improvement of stress tolerance. Fish Physiology Biochemistry 2006; 32 (2): 167- 77.

(26)           Rufchaie R., Hoseinifar S., Zamini A., Saiad Borani M., Maghsodie Kohan H., et al. Effects of glucan on growth performance, carcass composition and intestinal microbiota in Rutilus frisii kutum fingerling. Fisheries Science and technology 2013; 2 (1): 43- 54.

(27)           Faeed M., Ahmadnegad M., Amiri SA. The study effect of antagonism endemic lactobacillus intestinal fingerling carp. Kuala Lumpur, Malaysia: Asian pacific aquaculture; 2009.

(28)           Hagi T., Tanaka D., Iwamura Y., Hoshino T. Dietary and seasonal changes in lactic acid bacteria in the intestinal tract of cultured freshwater fish. Aquaculture, 2004; 234 (1- 4): 335- 46.

(29)           Aly SM., Ahmed YA., Gharee A., Mohamed M. Studies on Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus ,as potential probiotics, on the immune response and resistance of Tilapia nilotica (Oerochromis niloticus) to challenge infections. Fish & Shellfish Immunology 2008; 25 (1- 2): 128- 36.

(30)           Hernandez LH., Barrera TC., Mejia JC., Mejia GC., Delarmen M., Dosta M., et al. Effects of the commercial probiotic Lactobacillus casei on the growth, protein content of skin mucus and stress resistance of juveniles of the Porthole livebearer Poecilopsis gracilis (Poecilidae). Aquaculture Nutrition 2010: 16 (4): 407- 11.

(31)           Panigrahi A., Kiron V., Puangkaew J., Kobayashi T., Satoh S., Sugita H. The viability of probiotic bacteria as a factor influencing the immune response in rainbow trout Oncorhynchus mykiss. Aquaculture 2005; 243 (1- 4): 241- 54.