اثر تغییر ترکیبات محیط کشت و عامل‏های محیطی در الگوی رشد و تشکیل بیوفیلم توسط Mycobacterium marinum CCUG 20998

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ایران.

2 استادیار میکروبیولوژی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان، ایران.

چکیده

مقدمه: مایکوباکتریوم مارینوم، مایکوباکتریومی غیر توبرکلوزیس است که به کندی رشد می‏کند. این ارگانیسم در ماهی‏ها، گرانولومای منتشره را به وجود می آوردکه سل ماهی نامیده می‏شود. تغییر در ترکیبات محیط کشتو شرایط محیطیموجب تغییر الگوی رشد و تشکیل بیوفیلم در این باکتری می‏شود. هدف از این مطالعه، ارزیابی تغییرات در ترکیبات محیط کشت و عامل‏های محیطی بر الگوی رشد و تشکیل بیوفیلم توسطمایکوباکتریوم مارینومCCUG20998 است‏‏. ‏
مواد و روش‏‏ها: مایکوباکتریوم مارینومدر محیط کشت میدلبروک 7H9 با غلظت‏های مختلف ترکیبات محیط کشت داده شد. این محیط کشت شامل توئین 80 (‏1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0 و 6/0 درصد حجمی/ حجمی)، اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز (‏4، 8، 12 و 16 درصد حجمی/ حجمی) و گلیسرول (‏30، 35، 40، 45 و 50 درصد حجمی/ حجمی) است. تغییر در الگوی رشد و تشکیل میزان بیوفیلم ارزیابی شد. ‏
نتایج: نتایج نشان دادند که بیش‏ترین میزان رشد در غلظت 4/0 درصد توئین 80 رخ می‏دهد. تغییر غلظت اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز تأثیر چندانی بر روی رشد این باکتری ندارد. کاهش گلیسرول به میزان در خور توجهی موجب کاهش رشد می‏شود. بیش‏ترین میزان تشکیل بیوفیلم هنگامی است که در محیط کشت توئین 80 و اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز وجود نداشته باشد و غلظت گلیسرول 35 درصد باشد. ‏
بحث و نتیجه‏ گیری: بر اساس نتایج به دست آمده، توئین 80 و گلیسرول در ترکیبات محیط میدلبروک 7H9 بر رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG20998 بهترین اثر را دارند؛ اما در مقایسه اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز اثر مهمی بر روی رشد نمی‏گذارد و از آن‏جا که این ترکیب گران است، می‏توان آن را از ترکیبات محیط کشت حذف کرد. ‏

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

The effect of changes in nutritional components and environmental factors on growth pattern and biofilm formation by Mycobacterium marinum CCUG 20998

نویسندگان [English]

  • Azam Sheidadost 1
  • Mohammad Faezi Ghasemi 2
  • Khosro Issazadeh 2
1 M.Sc. of Microbiology, Young Researchers Club, Islamic Azad University-Lahijan Branch, Lahijan, Iran.
2 Assistant Professor of Microbiology, Islamic Azad University-Lahijan Branch, Lahijan, Iran.
چکیده [English]

Introduction:Mycobacterium marinum is a slow growing nontuberculosis mycobacterium. This organism can cause disseminated granulomatous infections in fish, called ‘fish tuberculosis’. Changes in nutritional components in culture medium and environmental conditions may lead to some changes in growth patterns and biofilm formation having new characteristics. The aim of this study was the evaluation of changes in medium components and environmental factors on the growth pattern and biofilm formation of M. marinum CCUG 20998.
Materials and methods: M. marinum CCUG 20998 was grown in 7H9 broth medium containing different concentrations of Tween 80 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 and 0.6 % v/v), Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement (OADC), (4, 8, 12, and 16 % v/v) and glycerol (30, 35, 40, 45, and 50 % v/v). The changes in growth patterns and biofilm formation were determined by using measurement of optical density and staining by crystal violet.
Results: The obtained results showed that maximum growth was at 0.4 % of Tween 80. Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement at different concentrations did not show any significant effect on the growth pattern. Decreasing the glycerol concentration significantly decreased the growth rate. The maximum biofilm formation was obtained in 35 % glycerol without Tween 80 and OADC in culture medium.
Discussion and conclusion: According to the obtained results, Tween 80 and glycerol in the formulation of Middlebrook 7H9 Broth are very critical for M. marinum CCUG 20998 growth. In contrast, Oleic Albumin Dextrose Catalase supplement can be omitted from the medium formulation due to showing no significant effect on the growth pattern.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Mycobacterium marinum CCUG 20998
  • Environmental conditions
  • Growth pattern
  • Biofilm

مقدمه

مایکوباکتریوم‏ها بر اساس طبقه‏بندی کتاب برجی جزو باکتری‏های گرم مثبت با درصد گوانین و سیتوزین بالا هستند. دو ویژگی فیزیولوژیکی مایکوباکتریوم‏ها عبارت است از رشد آهسته (‏حتی مایکوباکتریوم‏های با رشد سریع، در عرض 3 تا 4 روز رشد می‏کنند) و ساختمان پوشش سلولی و متابولیسم مایکوباکتریوم‏ها که در بین پروکاریوت‏ها منحصر به فرد است. مایکوباکتریوم‏ها هوازی اجباری هستند؛ اما در شرایط داخل سلولی، متابولیسم آن‏ها با محدودیت اکسیژن نیز انجام می‏شود (‏1)‏. نمونه‏های محیطی مشکل پسند و اگزوتروف نیستند و برای رشد به اسیدهای چرب نیاز دارند. کشت آن‏ها در محیط‏های حاوی اولئیک اسید (‏میدلبروک) و یا تخم مرغ (‏لوون اشتاین جانسون) باید انجام شود. زمانی که محیط‏ حداقل باشد، اسیدهای چرب (‏مانند پالمتیک) به همراه آلبومین و یک دترجنت (‏مانند توئین80) به محیط اضافه می‏شود (‏2)‏. مایکوباکتریوم مارینوم[1]، مایکوباکتریومی غیر توبرکلوزیس[2] است که به کندی رشد می‏کند و دمای بهینه‏ رشد آن 30 تا 32 درجه سانتی‏گراد است؛ اما این ارگانیسم به رشد در دماهای پایین نیز سازگار است و عامل عفونت گرانولومایی مشابه به توبرکلوزیس در ماهی و قورباغه می‏باشد. عفونت در ماهی با نام توبرکلوزیس (‏سل) ماهی شناخته می‏شود و در انسان به ندرت اتفاق می‏افتد. ماهی آلوده به این ارگانیسم می‏تواند به زخم یا نودول‏های پوستی منجر شود؛ اما خوردن ماهی آلوده پخته شده یا آب شور یا شیرین آلوده تاکنون در انسان هیچ نوع بیماری ایجاد نکرده است (‏3)‏. مایکوباکتریوم‏ها قادرند در انواع محیط‏ها بیوفیلم تولید کنند؛ بنابراین، مطالعه آن‏ها اهمیت فوق العاده‏ای دارد، با توجه به این‏که پاتوژن‏های مهمی مانند مایکوباکتریوم توبرکلوزیس[3] و مایکوباکتریوم لپرا[4] در این جنس قرار دارند (‏4)‏ باکتری‏های مستقر در بیوفیلم می‏توانند بیشتر از 1000 برابر به درمان با آنتی‏بیوتیک نسبت به ارگانیسم‏های مشابه رشد یافته به شکل پلانکتونی مقاوم باشند. همچنین، تشکیل بیوفیلم موجب حفاظت در برابر محیط می‏شود، مواد غذایی و متابولیکی را در دسترس قرار می‏دهد و ویژگی‏های ژنتیکی جدیدی را برای ارگانیسم کسب می‏کند (‏5)‏. شولتز[5] و همکاران در سال 1995 نشان دادند که به غیر از منابع محیطی، مایکوباکتریوم‏های غیر توبرکلوزیس در بیوفیلم‏های تشکیل شده در انواع محیط‏ها مانند: سیستم‏های تهیه آب خانگی و دستگاه‏های دندان‏پزشکی نیز یافت می‏شوند (‏3)‏. ‏

مطالعاتی در زمینه اثر سطوح فیزیکی مختلف (‏شامل سطوح سیلیکونی، پلی کربنات، پلی اتیلن با دانسیته بالا و پلی وینیل کلراید) بر روی رشد و تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم‏ها انجام شده است (‏3، 6- 8)‏. فالکینهام[6]و همکاران در سال 2001 مایکوباکتریوم مارینوم را از سیستم‏های توزیع آب جداسازی کردند. رشد بیوفیلم این ارگانیسم با و بدون قرار گرفتن در معرض عوامل ضد میکروبی اندازه‏گیری، تعیین و با سایر مایکوباکتریوم‏های غیر توبرکلوزیس شامل مایکوباکتریوم اولسرانس[7] روی بافت گیاهی مقایسه شد. مطالعاتی نیز بر روی شاخص‏های مولکولی و بیوشیمیایی تشکیل بیوفیلم مایکوباکتریوم مارینوم با استفاده از رشد در لوله‏های سیلیکونی انجام شد (‏9)‏. ‏

امروزه مایکوباکتریوم مارینوم یک مدل آزمایشگاهی مناسب است که برای پژوهش در زمینه‏ مایکوباکتریوم‏ها استفاده می‏شود. در زمینه اثر ترکیبات مختلف محیط کشت و شرایط آن، بر رشد مایکوباکتریوم مارینوم مطالعه زیادی انجام نشده است. همچنین، به علت ارتباط مایکوباکتریوم مارینوم با منابع آبی و شباهت این ارگانیسم با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس، ضرورت مطالعه بر اثر ترکیبات مختلف محیط کشت و عامل‏های محیطی بر تغییر الگوی رشد و تشکیل بیوفیلم احساس می‏شود. در این پژوهش اثر ترکیبات مختلف محیط کشت بر روی رشد و تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998[8] بررسی شد. ‏

 

.مواد و روش‏ها

کشت زنده مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998[9] از مرکز کلکسیون دانشگاه گوتنبرگ ‏[10] تهیه شد. محیط مورد استفاده در این پژوهش میدلبروک 7H9[11] بود. ترکیبات به ازای 900 میلی‏لیتر شامل: آمونیوم سولفات (‏5/0 گرم)، L- گلوتامیک اسید (‏5/0 گرم)،
سدیم سیترات (‏1/0 گرم)، پیرودوکسین (‏1 گرم)، بیوتین (‏5/0 میلی‏گرم)، دی‏سدیم فسفات (‏5/2 گرم)، مونوپتاسیم فسفات (‏1 گرم)، فریک آمونیوم سیترات (‏04/0 گرم)، منیزیم سولفات (‏05/0 گرم)، کلسیم کلرید (‏5/0 میلی‏گرم)، سولفات روی (‏1 میلی‏‏گرم) و سولفات مس (‏1 میلی‏‏گرم) بود. ‏ابتدا کشت خالص از مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در محیط کشت میدلبروک 7H9 دارای آگار تهیه شد. کشت به مدت 7 تا 10 روز در انکوباتور 30 درجه سانتی‏گراد قرارگرفت. ‏

.محیط کشت میدلبروک 7H9 با درصدهای متفاوت توئین80، گلیسرول و OADC: محیط مایع 7H9 با درصدهای مختلف توئین80 شامل: (‏1/0، 2/0، 3/0، 4/0، 5/0 و 6/0 درصدحجمی/ حجمی) و بدون توئین80 با درصدهای متفاوت گلیسرول (‏30، 35، 40، 45 و 50 درصد حجمی/ حجمی) و بدون گلیسرول و با درصدهای مختلف OADC (‏2، 4، 6 و 8 درصد حجمی/ حجمی) و بدون آن تهیه شد. 200 میکرولیتر از محیط‏های تهیه شده، داخل چاهک‏های میکروپلیت نانک [12] ریخته شد. سپس، 20 میکرولیتر از پیش کشت شده مایکوباکتریوم مارینوم CCUG20998
(‏با 6/0-4/0=600OD) به هر کدام از چاهک‏ها تلقیح شد. محیط‏کشت بدون تلقیح و فاقد هر ترکیب مورد بررسی در محیط کشت، به عنوان کنترل انتخاب شد. میکروپلیت در 30 درجه سانتی‏گراد به مدت 3 روز انکوبه شد. جذب در طول موج 630 نانومتر توسط دستگاه خواننده میکروپلیت[13] به مدت یک هفته هر 24 ساعت یک بار اندازه گیری و منحنی رشد با نمونه استاندارد مقایسه شد. برای هر نمونه مورد بررسی، آزمایش با 3 تکرار انجام شد. ‏

.سنجش بیوفیلم به روش رنگ‏آمیزی با کریستال ویوله: سنجش بیوفیلم به روش رنگ آمیزی کریستال ویوله انجام شد. این روش سنجش براساس ترکیب رنگ کریستال ویوله با سلول‏های چسبیده به سطوح است. ابتدا محیط کشت داخل میکروپلیت بیرون ریخته و چاهک‏ها سه مرتبه به آرامی با محلول نمکی بافر فسفات شسته شدند. پس از آن میکروپلیت به شکل واژگون به مدت 60 دقیقه خشک شد. سپس، کریستال ویوله 1 درصد (‏حجمی/ حجمی) به میکروپلیت اضافه و چاهک‏ها به مدت 45 دقیقه در دمای اتاق رنگ آمیزی شدند. پس از آن کریستال ویوله بیرون ریخته شد و چاهک‏ها سه بار با محلول نمکی بافر فسفات شسته شدند. کریستال ویوله باقیمانده با اضافه کردن 200 میکرولیتر اتیل الکل/ استون (‏حجمی/ حجمی) 80:20 خارج شد. مقدار جذب نوری چاهک‏ها در 630 نانومتر (‏630OD) با دستگاه خواننده میکروپلیت اندازه گیری شد. مقدار میانگین و انحراف استاندارد تعیین شد و میانگین داده‏های به دست آمده از 630OD بلانک ‏محیط کشت (‏200 میکرولیتر) کم شد. سنجش برای هر آزمایش سه بار تکرار شد (‏3 چاهک) (‏8 و 10) ‏

 

.نتایج

نمای میکروسکوپی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 به روش زیل‏نلسون و گرم در شکل 1 نشان داده شده است. این ارگانیسم در رنگ آمیزی زیل‏نلسون، رنگ فوشین و در رنگ آمیزی گرم، رنگ کریستال ویوله را به خود می‏گیرد. شکل 2 منحنی رشد مایکوباکتریوم مارینوم را در محیط 7H9 نشان می‏دهد. با توجه به شکل، زمان شروع فاز نمایی رشد از ساعت 48 است و رشد تا 144ساعت ادامه دارد و می‏توان اثرات ترکیبات محیط کشت در رشد و تشکیل بیو فیلم را در این محدوده زمانی بررسی کرد. شکل 3 بررسی اثر غلظت‏های مختلف توئین 80 و عدم حضور آن را بر روی رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 نشان می‏دهد. همان‏طور که در شکل دیده می‏شود رشد در غلظت‏های بالاتر این ماده بهتر انجام می‏شود. شکل 4 اثر غلظت‏های متفاوت OADC و عدم حضور آن را بر روی رشد نشان می‏دهد. با توجه به شکل غلظت‏های متفاوت این ماده تأثیر چندانی بر روی رشد نمی‏گذارد. در شکل 5، بررسی اثر غلظت‏های متفاوت گلیسرول و عدم حضور آن در رشد این باکتری مشاهده می‏شودکه نشان می‏دهد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در غلظت‏های بالاتر گلیسرول رشد بیشتری دارد. ‏

 

 

 

شکل 1- رنگ‏آمیزی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 (‏a) به روش زیل‏نلسون (‏b) به روش گرم ‏

 

 

شکل 2- منحنی رشد استاندارد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در محیط 7H9 براث

 

 

شکل 3- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 درحضور درصدهای متفاوت توئین 80 و محیط بدون توئین 80. ‏

 

 

شکل 4- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در حضور درصدهای متفاوت OADC و محیط بدون OADC. ‏

 

تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در میکروپلیت با غلظت‏های مختلف ترکیبات محیط کشت با روش رنگ‏آمیزی کریستال ویوله مطالعه شد. نتایج در شکل‏های 6، 7 و 8 نشان داده شده است. مقدارهای OD نشان دهنده‏ باکتری‏های چسبیده به سطح و تشکیل بیوفیلم است. بیش‏ترین میزان بیوفیلم در عدم حضور توئین 80 و OADC و غلظت 35 درصد گلیسرول تشکیل شد. ‏

 

 

 

شکل 5- رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 در حضور درصدهای متفاوت گلیسرول و عدم حضور گلیسرول

 

 

 

شکل 6- اثر درصدهای مختلف توئین 80 و محیط بدون توئین 80 بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998. ‏

 

شکل 7- اثر درصدهای مختلف OADC و عدم حضور OADC بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998. ‏

 

 

شکل 8- اثر درصدهای مختلف گلیسرول و محیط بدون گلیسرول بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998

 


.بحث و نتیجه ‏‏گیری

مایکوباکتریوم‏ها، اکتینومیست‏های مقاوم به اسید بوده که در انسان، حیوانات و محیط‏های مختلف مانند خاک و آب یافت می‏شوند. در محیط‏های پر استرس حضور داشته و در برابر شرایط سخت توسط عامل‏های مختلف پاسخ می‏دهند. برای مثال برخی باکتری‏ها مانند باسیلوس سوبتیلیس[xiv] در پاسخ به استرس‏های محیطی اسپور تولید می‏کنند و بسیاری از گونه‏های میکروبی می‏توانند برای زنده ماندن در محیط‏های پر استرس از تجمعات سازمان‏دهی شده و متصل به ماتریکس مانند بیوفیلم استفاده کنند. مایکوباکتریوم‏ها با اینکه توانایی تولید پلی‏ساکاریدهای خارجی را ندارند، بیوفیلم‏های درخور توجهی را تولید می‏کنند که هم به سطوح جامد و آبگریز متصل می‏شوند و هم به شکل پلاک به شکل شناور بر روی محیط کشت مایع ایجاد می‏شوند (‏4)‏.

مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل مولد سل انسانی، توانایی زیادی برای زنده ماندن در برابر استرس‏های محیطی مانند آنتی‏بیوتیک‏ها دارد. این ارگانیسم قادر است بیوفیلم‏های مقاوم به دارو تولید کند. در این بررسی مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 به عنوان یک مدل بیماری‏زا برای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده شد. هدف ساخت داروهای جدید، ممانعت ازتشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم‏هاست که این روش در درمان مؤثر است و به این ترتیب می‏توان از آنتی‏بیوتیک‏ها در یک دوره درمانی کوتاه‏تر استفاده کرد (‏11)‏.

مایکوباکتریوم مارینوم بعد از 7 روز در دمای 30 درجه سانتی‏گراد روی محیط کشت میدلبروک 7H9 دارای آگار به شکل پلاک‏های کپک مانند به رنگ زرد رشد می‏کند. در شکل‏ 1 نمای میکروسکوپی مایکوباکتریوم مارینوم نشان داده شد. همان‏طور که در تصویر مشخص است سلول‏های مایکوباکتریوم مارینوم به هم چسبیده‏اند و تمایل به تشکیل توده دارند. ‏

در سال 1947 دوبوس[xv] و میدلبروک[xvi] محیط 7H9 را طراحی کردند که حاوی آلبومین و اولئیک اسید است و موجب افزایش رشد باسیل‏های سل و حفاظت آن‏ها در برابر بسیاری از عوامل سمی می‏شود. محیط میدلبروک 7H9 حاوی سدیم سیترات و فریک آمونیوم سیترات به عنوان منابع کربنی است. از آن‏جا که مایکوباکتریوم‏ها نیازهای رشد ویژه‏ای دارند به این محیط ترکیباتی برای بهتر شدن رشد اضافه می‏شود. غنی کردن محیط توسط ترکیباتی مانند گلیسرول و توئین 80، به عنوان منبع کربن، موجب تسریع در رشد می‏شود. گلیسرول یک قند الکلی است که به عنوان منبع کربن به این محیط اضافه می‏شود. با توجه به شکل 5 اگر محیط بدون گلیسرول باشد، رشد بیش از 50 درصد کاهش می‏یابد؛ اما تفاوت زیادی بین درصدهای 40 و 50 در میزان رشد توسط این باکتری دیده نمی شود. از آن‏جا که هدف در این بررسی مقرون به صرفه‏تر کردن محیط از نظر اقتصادی بود مطالعه بر روی درصدهای کم گلیسرول انجام شد. ‏

 با توجه به شکل 3 توئین 80 موجب افزایش رشد می‏شود. توئین 80 ماده کربنی سخت تجزیه‏پذیر است و به عنوان یک پاک کننده پایین آورنده کشش سطحی است. همچنین، یکی از عوامل مهم بازدارنده تشکیل توده‏های سلولی است. در محیط بدون توئین 80 رشد به شکل تشکیل توده باکتری‏ (‏کلامپ شده) است؛ اما در حضور توئین 80 رشد به شکل همگن و بدون تشکیل توده رخ می‏دهد. در حقیقت توئین 80 با پایین آوردن کشش سطحی باکتری‏ها موجب می‏شود که کمتر تمایل به تشکیل توده داشته باشند و در نتیجه راحت‏تر تقسیم شده و در نهایت، سبب افزایش رشد می‏شود. همان طور که در شکل 3 نیز مشاهده می‏شود، دانسیته جذب نوری نمونه‏ها نشان دهنده رشد سریع‏تر نمونه‏های حاوی توئین 80 است.

در محیط کشت بدون توئین 80 و گلیسرول، مشاهده شد که رشد به میزان قابل ملاحظه‏ای کاهش می‏یابد. در واقع منابع کربنی محیط میدلبروک 7H9 سدیم سیترات و فریک آمونیوم سیترات است که تأثیر چندانی بر روی رشد نمی‏گذارند و برای تسریع رشد نیاز به منابع خارجی کربن است.

محیط میدلبروک 7H9 هنگامی که با مواد غذایی مانند اولئیک اسید، آلبومین و دکستروز[xvii] غنی می‏شود، از رشد گونه‏های مایکوباکتریوم به استثنای مایکوباکتریوم بوویس[xviii] حمایت می‏کند. آلبومین و دکستروز به همراه سدیم کلرید و کاتالاز توسط میدلبروک OADC غنی شده فراهم می‏شوند. آلبومین با اتصال به اسیدهای چرب که ممکن است برای گونه‏های مایکوباکتریوم سمی باشند به عنوان یک حفاظت کننده عمل می‏کند. در محیط غنی شده، آلبومین را برای حذف لیپاز با گرما حرارت می‏دهند که ممکن است از توئین 80 اسیدهای چرب آزاد کند؛ کاتالاز پراکسیدهای سمی که ممکن است در محیط حضور داشته باشند را تجزیه می‏کند و موجب حفاظت از ارگانیسم می‏شود. دکستروز و اولئیک اسید به عنوان منابع کربنی هستند. در شکل 4 اثر OADC بر روی رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 نشان داده شد. همان طور که مشاهده می‏شود این ترکیب اثر چندانی بر روی رشد نمی‏گذارد و می‏توان از غلظت‏های کمتر (‏2 میلی‏لیتر) استفاده کرد. ‏

برای تشکیل بیوفیلم ابتدا باکتری‏های پلانکتونی به سطح متصل شده؛ بیوفیلم به شکل میکروکلونی و بعد به شکل ماکروکلونی تشکیل می‏شود. این سازمان‏دهی سلول‏های باکتریایی، ارتباط‏شان قابل تنظیم است. داخل بیوفیلم مواد غذایی بهینه و رقابت برای کسب این مواد کاهش می‏یابد. این سازمان‏دهی می‏تواند به حفاظت از باکتری‏ها در برابر شکار شدن و آسیب توسط مواد موجود در محیط مانند ضد عفونی کننده‏های شیمیایی و آنتی‏بیوتیک‏ها نیز کمک کند. مطالعات مولکولی و سلولی بر روی تشکیل بیوفیلم در چندین گونه مایکوباکتریوم انجام شده است (‏3 و 12)‏.

کارتر[xix]و همکارانش در سال 2003 اثر سطوح پلی‏وینیل‏کلراید[xx]، یون‏ها (‏منیزیم، کلسیم، آهن و روی)، منابع کربنی (‏آب، گلوکز، پپتون و هیومیک اسید)، سوپرناتانت کشت و حشره‏کش‏ها را بر روی تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم آویوم[xxi] ارزیابی و از روش رنگ‏آمیزی با کریستال ویوله و میکروسکوپ کانونی برای سنجش و مشاهده بیوفیلم استفاده کردند. نتایج نشان داد در حضور کلسیم، منیزیم یا روی، بیوفیلم بیشتری در مقایسه با رشد در آب به تنهایی تشکیل می‏شود. تولید بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم آویوم در آب همراه با گلوکز و پپتون نسبت به هیومیک اسید بیشتر است (‏13)‏.

در این پژوهش، اثر ترکیبات مختلف محیط کشت بر تشکیل بیوفیلم توسط مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 مطالعه شد. بر اساس نتایج، مشخص شد که اثر ترکیبات محیط کشت بر تشکیل بیوفیلم با تأثیر این ترکیبات‏ بر رشد این ارگانیسم تفاوت دارد. شکل 6 اثر توئین 80 را بر تشکیل بیوفیلم نشان می‏دهد. مایکوباکتریوم مارینوم در محیط فاقد توئین 80 بیوفیلم بیشتری تولید می‏کند. بدین معنا که در فقدان این ماده که به کاهش کشش سطحی منجر می‏شود، سلول‏ها به هم می‏چسبند و تمایل به تشکیل بیوفیلم دارند. هنگامی که میزان توئین 80 در محیط کشت بیشتر می‏شود، بیوفیلم به میزان کمتری تولید می‏شود. ‏

همان‏طور که در شکل 7 مشاهده می‏شود فقدان OADC در محیط کشت موجب افزایش تشکیل بیوفیلم می‏شود. این ترکیب حاوی اسیدهای چرب غیر اشباع است که مانع تشکیل بیوفیلم می‏شود. کم‏ترین میزان تشکیل بیوفیلم در غلظت 2 درصد OADC مشاهده می‏شود که متفاوت با الگوی رشد آن در این میزان است. گلیسرول یک منبع کربنی است که افزایش آن موجب افزایش رشد می‏شود (‏شکل 5)‏. در فقدان گلیسرول بیوفیلم کم و با افزایش غلظت آن بیوفیلم به میزان بیشتری تشکیل می‏شود. البته با توجه به شکل 8، در غلظت‏های بالاتر میزان تشکیل بیوفیلم کاهش می‏یابد که متفاوت با الگوی رشد ارگانیسم است. ‏

بر اساس نتایج به دست آمده توئین 80 و گلیسرول در ترکیبات محیط میدلبروک 7H9 بر رشد مایکوباکتریوم مارینوم CCUG 20998 بهترین اثر را دارند؛ اما در مقایسه اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز اثر مهمی بر روی رشد نمی‏گذارد و از آن‏جا که این ترکیب گران است، می‏توان آن را از ترکیبات محیط کشت حذف کرد. در زمینه تشکیل بیوفیلم نتایج نشان دادند که بیش‏ترین میزان رشد در غلظت 4/0 درصد توئین 80 رخ می‏دهد. تغییر غلظت اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز تأثیر چندانی بر روی رشد این باکتری ندارد. کاهش گلیسرول به میزان در خور توجهی موجب کاهش رشد می‏شود. بیش‏ترین میزان تشکیل بیوفیلم هنگامی است که در محیط کشت توئین 80 و اولئیک آلبومین دکستروز کاتالاز وجود نداشته باشد و غلظت گلیسرول 35 درصد باشد. ‏

.تشکر و قدردانی

از حوزه معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد لاهیجان برای در اختیار قرار دادن تجهیزات آزمایشگاهی برای انجام این پژوهش تشکر و قدردانی می‏شود. ‏



[1]- Mycobacterium marinum

[2]- Non tuberculosis Mycobacteria (‏NTM) ‏

[3]- Mycobacterium tuberculosis

[4]- Mycobacterium leprae

[5]- Schulze- Robbecke

[6]- Falkinham

[7]- M. ulcerans

[8]- M. ‏marinumCCUG 20988

[9]- Mycobacterium marinum CCUG 20988

[10]- Culture Collection, University of Goteborg, Sweden

[11]- Middlebrook 7H9 Medium

[12]- nuncTM

[13]- Microplate reader- DANA:
 مدل 3200 سیستم میکروپروسسوری و فتومتریک

[xiv]- Bacillus subtilis

[xv]- Dubos

[xvi]- Middlebrook

[xvii]- OADC

[xviii]- M. bovis

[xix]- Carter

[xx]- PVC

[xxi]- M.‏ avium 

(1)               Lederberg J. Encyclopedia of Microbiology. 2th Ed. New York: Academic Press; 2000.

(2)               Falkinham III JO. The biology of environmental mycobacteria. Environmental Microbiology Reports 2009; 1 (6): 477- 87.

(3)               Hall-Stoodley L., Brun OS., Polshyna G., Barker LP. Mycobacterium marinum biofilm formation reveals cording morphology. FEMS Microbiology letters 2006; 257 (1): 43- 9.

(4)               Zambrano MM., Kolter R. Mycobacterial biofilm: a greasy way to hold together. Cell 2005; 123 (5): 762- 4.

(5)               Gilbert P., Das J., Foley I. Biofilms susceptibility to antimicrobials. Advances in Dental Research ‏1997; 11 (1): 160- 7.

(6)               Ren H., Dover LG., Islam ST., Alexander DC., Chen JM., Besra GS., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology 2007; 63 (5): 1345- 59.

(7)               Hall-Stoodley L., Lappin-Scott H. Biofilm formation by the rapidly growing mycobacterial species Mycobacterium fortuitum. FEMS Microbiology Letters 1998; 168 (1): 77- 84.

(8)               Chavant P., Gaillard-Martinie B., Talon R., Hebraud M., Bernardi T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. Journal of microbiological methods 2007; 68 (3): 605- 12.

(9)               Falkinham III JO., Norton CD., LeChevallier MW. Factors influencing numbers of Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, and other mycobacteria in drinking water distribution systems. Applied Environmental Microbiology 2001; 67 (3): 1225- 31. ‏

(10)           Musk DJ., Banko DA., Hergenrother PJ. Iron salts perturb biofilm formation and disrupt existing biofilms of Pseudomonas aeruginosa. Chemistry &. Biology 2005; 12 (7): 789-96.‏

(11)           Ojha AK1., Baughn AD., Sambandan D., Hsu T., Trivelli X., Guerardel Y., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms contatining free mycolic acids and harbouring drug- tolerant bacteria. Molecular Microbiology 2008; 69 (1): 164-74. ‏

(12)           Schulze-Robbecke R., Janning B., Fischeder R. Occurrence of mycobacteria in biofilm samples. Tubercle and Lung Disease ‏1992; 73 (3): 141- 44.

(13)           Carter G., Wu M., Drummond DC., Bermudez LE. Characterization of biofilm formation by clinical isolates of Mycobacterium avium. Journal of Medical Microbiology 2003; 52 (9): 747- 52. ‏