بررسی آثار بازدارندگی ترکیبات فورفورال و هیدروکسی متیل فورال در طی فرآیند تخمیر بر روی رشد و بازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی کارشناسی ارشد محیط زیست، دانشگاه تربیت مدرس، نور، ایران

2 دانشیار محیط زیست، دانشگاه تربیت مدرس، نور، ایران.

3 استادیار محیط زیست دانشگاه تربیت مدرس، نور، ایران.

چکیده

مقدمه: استفاده از فرآیند هیدرولیز به منظور آزاد‏سازی قندهای قابل احیا برای تولید اتانول از مواد پلی‏ساکاریدی، به‏ویژه در فرآیند هیدرولیز اسیدی باعت تولید ترکیبات بازدارنده رشد میکروارگانیسم‏ها مانند فورفورال و هیدروکسی متیل فورال می‏شود. وجود این ترکیبات در محیط کشت علاوه بر کاهش رشد میکروارگانیسم وکاهش گلوکز مصرفی موجب کاهش بازده اتانول تولیدی نیز می‏شود. به همین علت مطالعه حاضر تلاش در بررسی اثر این ترکیبات بر روی رشد مخمرساکاررومایسس سرویسیه دارد‏‏.
مواد و روش ‏‏ها: به منظور بررسی آثار بازدارنده دو ترکیب فورفورال وهیدروکسی متیل فورال بر روی رشد مخمر ساکارومایسس سرویسیه و بازده اتانول تولیدی توسط آن، 4 سری آزمایش با غلظت‏های صفر یا شاهد، 5/0، 1 و 2 گرم بر لیتر از هر ترکیب تهیه شد و آثار بازدارندگی آن‏ها بر روی رشد مخمر و بازده اتانول تولیدی توسط آن در مدت زمان 36 ساعت مطالعه شد.
نتایج: نتایج نشان داد که با افزایش غلظت دو ترکیب فورفورال و هیدروکسی ‏متیل فورال میزان بازدارندگی هر دو ترکیب افزایش می‏یابد به طوری که بیش‏ترین بازده اتانول تولیدی برای هر دو ترکیب فورفورال و برای هیدروکسی متیل فورال در نمونه شاهد و غلظت 5/0 گرم بر لیتر به‏دست آمد. همچنین، نتایج نشان داد که ترکیب فورفورال به مراتب تأثیر بازدارندگی بیشتری نسبت به هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد مخمر ومتابولیسم آن دارد.
بحث و نتیجه ‏گیری: به طور کلی کاهش میزان گلوکز مصرفی با افزایش غلظت این ترکیبات گویای آثار منفی این دو ترکیب بر روی رشد و متابولسیم مخمر و در نتیجه کاهش بازده اتانول تولیدی است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Survey of the inhibitory effect on growth and ethanol yield in the fermentation process of baker’s yeast Saccharomyces cerevisiae

نویسندگان [English]

  • Masoud Hatami Manesh 1
  • Habibollah Younesi 2
  • Nader Bahramifar 3
1 M.Sc. Student of Environmental Sciences, Tarbiat Modares University, Noor, Iran.
2 Associate Professor of Environmental Sciences, Tarbiat Modares University, Noor, Iran.
3 Assistant Professor of Environmental Science, Tarbiat Modares University, Noor, Iran.
چکیده [English]

Introduction:The use of hydrolysis process in order to release reducing sugars of Polysaccharide materials for ethanol production, especially in acid hydrolysis process, causes the produce growth inhibitors compounds such as furfural and hydroxymethyl. Existing these compounds in culture medium, in addition to decrease microorganism growth and glucose consumption they cause the decrease efficiency of ethanol production.
Materials and methods: In order to investigate the effect of both inhibiting compounds hydroxymethyl furfural and furfural on growth, glucose consumption and ethanol production by Saccharomycescerevisiae yeast, four field experiments with different concentrations include 0orcontrol0.5, 1 and 2gl-1of each compound was prepared, and their inhibitory effects on yeast growth and ethanol production was studied in during 36 h.
Results: The results showed that with increasing concentration hydroxymethyl furfural and furfural, both compounds have inhibitory effect on growth yeast, glucose consumption and ethanol production, so that the maximum efficiency of ethanol production for two compounds (hydroxymethylfural and furfural), were observed at concentrations of 0 or control and 0.5 gl-1.The results showed that the furfural compound in comparison to hydroxymethylfural have more inhibitory effect on Saccharomycescerevisiae growth and ethanol production by it.
Discussion and conclusion: In general decrease in glucose consumption by increasing concentrations of these compounds showed the negative effects of these compounds on the growth and metabolism yeast, and therefore the ethanol production is reduced.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Ethanol
  • Cell biomass
  • Furfural
  • Hydroxymethyl fural
  • Saccharomyces cerevisiae

مقدمه

با توجه به کاهش منابع سوخت‏های فسیلی و آلودگی‏های زیست محیطی ناشی از انتشار گازهای
دی اکسیدکرین، دی اکسیدگوگرد و اکسیدهای نیتروژن نیاز به انرژی‏های تجدید پذیر، مناسب، غیر سمی و ارزان قیمت که آلودگی کمتری نسبت سوخت‏های فسیلی داشته باشند احساس می‏شود (1). استفاده از سوخت‏های زیستی به عنوان جایگزین سوخت‏های فسیلی به علت وجود اکسیژن در ساختار شیمیایی آن‏ها سبب بالا رفتن عدد اکتان سوخت و در نتیجه بهبود احتراق سوخت، کاهش انتشار مونواکسید کربن، مواد آلی فرار و هیدروکربن‏های اشباع که در واقع یکی از مهم‏ترین مشکلات استفاده از سوخت‏های فسیلی است، می‏شود (2).

در میان سوخت‏های زیستی مختلف، اتانول به دلایلی همچون، سادگی تولید، وجود انواع میکروارگانیسم‏های مختلف و مواد فراوان و ارزان قیمت برای تولید آن، بیش‏ترین توجه را در سراسر جهان به خود جلب کرده است به‏طوری که در چند دهه‏ اخیر بالای 90 درصد از سوخت‏های زیستی مصرفی جهان را به خود اختصاص داده است (3) . به طوری که می‏تواند به عنوان یک سوخت سازگار با محیط زیست که آلودگی کمتری نسبت به سوخت‏های فسیلی دارد، به شکل خالص به عنوان سوخت یا در ترکیب با بنزین به عنوان حامل اکسیژن به‏کار گرفته شود و محتوی اکسیژن آن را افزایش دهد. همچنین، سبب اکسیداسیون بهتر هیدروکربن‏ها و در نتیجه کاهش میزان آلودگی ناشی از آن‏ها شود (4).

امروزه در کشورهای مختلف به طور وسیعی از فرآیند تخمیر برای تولید اتانول ازمنابع مختلف قندی، نشاسته‏ای، سلولزی، لیگنوسلولزی و جلبک‏ها استفاده می‏شود (5). تخمیر اتانول یک فرآیند زیستی است که طی آن مواد آلی توسط میکروارگانیسم‏ها به ترکیبات ساده‏تر مانند قندها تبدیل می‏شوند. سپس، قندهای تولید شده طی فرآیند تخمیر به‏وسیله میکروارگانیسم‏ها به اتانول ودی اکسیدکربن تبدیل می‏شوند. به طور کلی در طول فرآیند تخمیر اتانول، دوگروه ازمیکروارگانیسم‏ها دخالت دارند گروه اول میکروارگانیسم‏هایی هستند که سوبستراهای تخمیرپذیر را به اتانول تبدیل می‏کنند و گروه دوم شامل میکروارگانیسم‏های تولیدکننده‏ آنزیم‏های کاتالیزکننده (مثل آنزیم آمیلاز وگلیکو آمیلاز) هستند که در واقع واکنش شیمیایی تجزیه سوبسترا به ترکیبات ساده‏تر مانند گلوکز را کاتالیز می‏کنند (6). در اصل تولید اتانول از مواد نشاسته‏ای مانند نشاسته گندم یا برنج یک فرایند دو مرحله‏ای است، مرحله اول فرایند ساکاریفیکاسیون (هیدرولیز) نام دارد که درطی آن نشاسته به کمک آنزیم یا اسید به قندهای ساده‏تر مانند گلوکز تبدیل می‏شود. در مرحله دوم قندهای حاصل از فرآیند ساکاریفیکاسیون توسط میگروارگانیسم‏های مناسب به اتانول تبدیل می‏شوند (فرآیند تخمیر) (7 و 8).

یکی از مهم‏ترین مسایل مربوط به تولید اتانول از مواد مختلف نشاسته‏ای، سلولزی و دیگر مواد پلی‏ساکاریدی در هنگام هیدرولیز این مواد، تشکیل مواد بازدارنده رشد میکروارگانیسم‏ها از قبیل اسیدهای ضعیف، مشتقات فوران، ترکیبات فنله و هیدروکسی متیل فورال[1]، به‏ویژه در هنگام هیدرولیز اسیدی این مواد است. در زمان هیدرولیز ترکیبات پلی‏ساکاریدی شامل نشاسته، سلولز و همی سلولز این مواد در ابتدا به قندهای ساده 5 کربنه و 6 کربنه تبدیل می‏شوند و سپس، در مرحله دوم این ترکیبات به شکل‏های دیگری همچون فورفورال[2] وهیدروکسی متیل فورال تبدیل می‏شوند که برای میکروارگانیسم‏ها به‏ویژه مخمرها سمی و مضر هستند. وجود این ترکیبات در محیط کشت مانع رشد و متابولیسم میکروارگانیسم‏ها شده و درنتیجه آن میزان اتانول تولیدی توسط میکروارگانیسم تخمیرکننده هم کاهش می‏یابد. بر این اساس پژوهشگران زیادی به بررسی آثار این ترکیبات بر روند رشد، متابولسیم، میزان گلوکز مصرفی واتانول تولیدی در هنگام تخمیر اتانول پرداختند. لارسون و همکاران[3] به بررسی تأثیر شدت هیدرولیز اسیدی چوب صنوبر با استفاده از سولفوریک اسید رقیق بر روی میزان قند مصرفی و تخمیر مخمر ساکارومایسس‏سرویسیه و ترکیبات بازدارنده مانند هیدروکسی متیل فورال پرداختند (9). مودیج[4]، به بررسی اثرفورفورال و هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد وفعالیت آنزیم‏های پیروات دی‏هیدروژناز[5]، الکل دی‏هیدروژناز[6] و آلدئید دی هیدروژناز[7]توسط مخمر ساکارومایسس‏سرویسیه پرداخت. نتایج پژوهش وی نشان داد که فورفورال تأثیر شدیدی بر روی دوآنزیم آلدئید دی هیدروژناز و پیروات دی‏هیدروژناز دارد اما بر روی الکل دی‏هیدروژناز تأثیر کمتری می‏گذارد، در حالی که هیدروکسی متیل فورال تأثیر کمتری نسبت به فورفورال بر روی دو آنزیم آلدئید دی هیدروژناز و پیروات دی‏هیدروژناز دارد اما بر روی الکل دی‏هیدروژناز تأثیری شبیه به ترکیب فورفورال به ترکیب فورفورال داشت (10). بر این اساس با توجه به تأثیر مهم این ترکیبات بر رشد و تولید اتانول، مطالعه حاضر به بررسی تأثیر ترکیبات فورفورال و هیدروکسی متیل فورال بر رشد و تولید اتانول توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه می‏پردازد.

.مواد و روش‏ها

مخمر ومحیط کشت: در این بررسی از مخمر ساکارومایسس‏ سرویسه ITCCبرای تولید اتانول استفاده شد که از وزارت علوم و تحقیقات فناوری، سازمان پژوهشی، علمی و صنعتی ایران (مرکز کلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های صنعتی و عفونی) به شکل یخ خشک تهیه شد و سپس، در محیط کشت استریل شد.

شرایط انجام آزمایش: بعد از آماده شدن محیط کشت تکثیر مخمر ساکارومایسس سرویسیه حاوی ترکیبات گلوکز 15، عصاره مخمر 1، دی‏پتاسیم هیدروژن فسفات10، پتاسم دی هیدروژن فسفات 5، منیزیم سولفات 5/2، آمونیوم سولفات 9 (گرم بر لیتر)، محیط کشت آماده شده در اتوکلاو در دمای 120 درجه سانتی‏گراد و فشار 1 اتمسفر به مدت 20 دقیقه استریل شد. پس از استریل شدن محیط کشت و سرد شدن در دمای محیط در شرایط کاملا استریل و در نزدیک شعله عمل تلقیح مخمر به نسبت 3 درصد محیط کشت انجام شد (11). پس انجام عمل تلقیح محیط کشت حاوی مخمر در انکوباتور با دمای 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته برابر 5/4 در شرایط ساکن تا مرحله نمایی رشد مخمر و تزریق به محیط کشت نگهداری شد. همچنین، تنظیم اسیدیته با سولفوریک اسید 1مولار و سود (سدیم هیدورکسید) 1 مولار تهیه شده از شرکت تجاری مرک[8] انجام شد. در هر آزمایش 200 میلی‏لیتر از محیط کشت در ارلن‏های با حجم 500 میلی‏لیتر تهیه شد. از زمان صفر تا 36 ساعت، هر 4 ساعت 3 نمونه از محیط کشت برای اندازه گیری قند مصرفی، اتانول تولیدی و غلظت بیومس گرفته شد. برای تعیین اثر ترکیبات فورفورال وهیدروکسی متیل فورال بر رشد مخمر، روند گلوکز مصرفی و میزان اتانول تولیدی توسط آن، 4 سری آزمایش و با غلظت‏های صفر یا شاهد، 5/0، 1 و 2 گرم بر لیتر از محیط کشت مناسب رشد مخمر برای هر ترکیب به طور جداگانه تهیه شد. برای مطالعه تأثیر غلظت این ترکیبات بر روی رشد این میکروارگانیسم‏ و مصرف قند، اتانول تولیدی هر آزمایش 3 بار تکرار و میانگین آن گزارش شد. همچنین، برای بررسی رفتار اتانول تولیدی و رشد سلولی مخمر در طی فرآیند تخمیر به ترتیب از مدل سنتیکی رشد بیومس سلولی، تولید اتانول و گلوکز مصرفی استفاده شد (معادله 1، 2 و 3).

 (1)

در معادله 1 (مدل سنتیکی رشد سلولی)، زمان تخمیر بر حسب ساعت، X میزان وزن خشک سلولی در حال رشد بر حسب گرم بر لیتر، x0 غلظت اولیه وزن خشک سلولی بر حسب گرم بر لیتر، xm بیش‏ترین مقدار وزن خشک سلولی بر حسب گرم بر لیتر، mµبیش‏ترین شدت ویژه بر حسب (ساعت/1) است.

       (2)

در این رابطه t زمان تخمیر بر حسب ساعت،
 P غلظت اتانول تولیدی بر حسب گرم بر لیتر،
 Pm بیش‏ترین مقدار اتانول تولیدی برحسب گرم بر لیتر، Pr شدت ویژه تولید اتانول بر حسب (ساعت/1) و
P0 غلظت اولیه اتانول تولیدی بر حسب گرم بر لیتر است.

      (3) .

 

در معادله 3 (معادله سنتیکی مصرف گلوکز) YP/S و YX/S به ترتیب بازده محصول تولیدی برای اتانول و زیست توده بر حسب گرم، اتانول بر گرم گلوکز مصرفی و گرم وزن خشک سلولی بر گلوکز مصرفی، P و P0 به ترتیب میزان اتانول تولیدی نهایی و اولیه بر حسب گرم بر لیتر، x و x0 غلظت نهایی و اولیه زیست توده بر حسب گرم بر لیتر و در نهایت، S0 غلظت اولیه قند کل بر حسب گرم بر لیتر است.

.روش‏های تحلیل

.اندازه گیری قند، اتانول تولیدی و غلظت بیومس: در این بررسی برای تعیین تراکم سلولی یکی از نمونه‏های گرفته شده 3 برابر رقیق و میزان جذب آن در طول موج620 نانومتر با اسپکتروفتومتر تعیین شد. سپس وزن خشک سلولی با استفاده از نمودار کالیبراسیون (میزان جذب به‏دست آمده در 620 نانومتر در مقابل وزن خشک سلولی) به دست آمد. همچنین، در این مطالعه به منظور رسم محنی کالیبراسیون وزن خشک سلولی، ابتدا محیط کشت تهیه شده در بالا تا مرحله رسیدن به فاز رشد نمایی، در دمای 25 درجه سانتی‏گراد و اسیدیته برابر 5/4 نگهداری شد. سپس حجمهای مختلف 1 تا 10 میلیلیتر از محیط کشت در 10 سری لوله آزمایش ریخته و میزان جذب آن‏ها در طول موج 620 نانومتر با دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شد (از آب مقطر به عنوان شاهد استفاده شد). پس از آن تعداد 10 عدد فیلتر سرسرنگی با اندازه منافذ 23/0میکرومتر به مدت 16 ساعت در آون با دمای 80 درجه سانتی‏گراد خشک و پس از سرد‏سازی در دسیکاتور و رسیدن به دمای محیط، توزین شد. سپس، 10 میلیلیتر از هر یک از محلولهای مخمر رشد داده شده با غلظتهای مختلف توسط این فیلترهای از قبل وزن شده، صاف و دوباره به مدت 16 ساعت در داخل آون در دمای 80 درجه سانتی‏گراد خشک شد. وزن ثانویه آنها پس از خشک شدن دوباره اندازهگیری شد. با تفاضل وزن ثانویه از وزن اولیه فیلترها وزن خشک سلولی در غلظت‏های مختلف محیط کشت به‏دست آمد. برای تعیین غلظت قند احیا کننده از روش دی نیترو سالسیلیک اسید[9] (12) و همچنین، برای اندازه‏گیری غلظت اتانول تولیدی هر4 ساعت یک‏بار از محیط کشت به مدت 24 ساعت نمونه‏برداری و پس از سانتریفیوژ کردن نمونه به دستگاه کروماتوگرافی گازی تزریق شد. در این مطالعه، برای اندازه‏گیری غلظت اتانول از دستگاه کروماتوگرافی گازی مدل (فیلیپس 4400PU، اینگلند) مجهز به آشکارساز یونیزاسیون شعله‏ای و نرم افزار (Clarity 402, Data Apex, Czech Republic) استفاده ‏شد. همچنین، از ستون شیشه‏ای پر شده (فیلیپس PEG20M، USA) به طول 5/1 متر و و قطر داخلی 8/1 میلی متر با گاز حامل نیتروژن با جریان30 میلی‏لیتر بر دقیقه استفاده شد.

.اندازه‏گیری فورفورال وهیدروکسی متیل فورال: .در این مطالعه ابتدا استاندارد ترکیبات فورفوال و هیدورکسی متیل فورال (از شرکت سیگما) و موادی نظیر کلریدریک اسید و تیو باربیوتیک اسید از شرکت مرک تهیه شدند. سپس، استاندارد 100 میلی‏گرم بر لیتر از هر دو ترکیب، فورفورال و هیدروکسی‏متیل فورال به‏طور جداگانه تهیه شد. برای این منظور 01/0گرم از هر ترکیب در 100 میلی‏لیتر آب مقطر حل و سپس استاندارد 003/0 مولار از تیو باربیوتیک اسید تهیه شد. برای این منظور 4503/0 گرم از این ماده در 100 میلی‏متر آب مقطر حل و به مدت 20 دقیقه با دستگاه التراسونیک، (برای حل نمودن آن) التراسونیک شد.

برای رسم منحنی کالیبراسیون ترکیبات فورفورال و هیدورکسی‏متیل فورال، از محلول استاندارد 100 میلی‏گرم بر لیتر فورفورال و هیدروکسی متیل فورال با محلول‏های با غلظت استاندارد‏ 5/0، 1، 2، 3، 4 و 5 میلی‏گرم بر لیتر هر دو ترکیب در 6 سری بالن ژوژه 25 میلی‏لیتری تهیه شد. سپس، به هر یک از آن‏ها 5/8 میلی‏لیتر کلریک‏اسید به همراه 7 میلی‏لیتر معرف تیوباربیوتیک اسید با غلظت 003/ مولار اضافه ‏شد، همین کار با 1 میلی‏لیتر آب مقطر به عنوان نمونه شاهد نیز انجام شد. محلول‏های بالا به مدت 30 دقیقه در حمام آب با دمای 40 درجه قرار داده شدند و پس از سرد شدن تا رسیدن به دمای 20 درجه (برای متوقف کردن سرعت واکنش) میزان جذب آن‏ها با استفاده از برنامه مشتق‏گیری دستگاه اسپکتروفتومتر (جِن وی[10]6305، انگلستان) و در طول موج 414 نانومتر برای فورفورال و 436 نانومتر برای هیدروکسی متیل فورفورال با استفاده از مشتق مرحله اول قرائت شد (13).

تحلیل آماری: تحلیل‏های آماری با استفاده از نرم‏افزار ماکروسافت اکسل 2007انجام گرفت. نمودار مربوط به هر سه متغیر غلظت اتانول تولیدی، بیومس سلولی و قندهای احیا کننده در محیط اکسل رسم شد. همچنین برای بررسی مدل‏های سنتیکی متغیرهای نام برده شده از نرم‏افزار سیگما پلات 12 استفاده شد.

 

.نتایج

.اثر غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد، اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی: نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت ترکیب هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد مخمر، میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر نشان داد: با افزایش غلظت هیدروکسی متیل فورال به بیش از 1 گرم بر لیتر، میزان رشد مخمر، گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی کاهش می‏یابد. نتایج نشان داد که بیش‏ترین میزان وزن خشک سلولی در محیط کشت شاهد به میزان 37/4 گرم بر لیتر و محیط کشت حاوی هیدروکسی متیل فورال 5/0 گرم بر لیتر، به میزان 83/3 گرم بر لیتر وزن خشک در مدت زمان 20 ساعت پس از تلقیح مخمر به دست آمد. همچنین نتایج نشان داد که با افزایش غلظت میزان وزن خشک سلولی کم شده به‏طوری که کم‏ترین میزان وزن خشک در غلظت 2 گرم بر لیتر به میزان 8/2گرم بر لیتر به‏دست آمد. شکل 1 نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت ترکیب فورفورال بر روی روند رشد، میزان گلوکز مصرفی واتانول تولیدی به همراه نتایج مدل سنتیکی تولید اتانول و رشد بیومس سلولی را توسط مخمرساکارومایسس سرویسیه نشان می‏دهد.

 

 

 

شکل 1- نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی روند بیومس سلولی (الف)، گلوکز مصرفی (ب) و اتانول تولیدی (ج) توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه در طی فرآیند تخمیربه همراه مدل سنتیکی رشد و تولید اتانول و گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر

 

 

یافته‏های حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی میزان گلوکز مصرفی، اتانول تولیدی در طی فرآیند تخمیر نشان داد که افزایش غلظت هیدروکسی متیل فورال به بیشتر از 1 گرم بر لیتر، تأثیر بازدارندگی شدیدی بر روی میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی می‏گذارد. به‏طوری که بیش‏ترین میزان گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر و به میزان 2/39، 64/37، 83/33 و 5/30 بود (جدول 1). همچنین، نتایج حاصل از بررسی میزان بازده اتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر نشان داد که بین غلظت‏های صفر یا (شاهد) و 5/0 گرم بر لیتر تفاوت چندانی در میزان بازده اتانول تولیدی وجود ندارد ولی با افزایش غلظت به بیش از 1 گرم در لیتر، میزان بازده تولیدی به مقدار زیادی کاهش می‏یابد. به طوری‏که بیش‏ترین بازده اتانول تولیدی‏ به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر به میزان 43/0، 42/0، 38/0 و 36/0 گرم اتانول بر گرم گلوکز بود.

 

 

جدول 1- نتایج رگرسیون و شاخص‏‏های سنتیکی رشد مخمر، تولید اتانول و گلوکز مصرفی (گرم بر لیتر) در طی فرآیند تخمیر در غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال

شاخص‏‏های فرآیندی

شاخص‏های سینیتیک

غلظت هیدروکسب متیل فورال (میلی گرم بر لیتر)

شاهد

5/0

1

2

رشد بیومس سلولی

x0 (گرم بر لیتر)

55/0

53/0

6/0

61/0

xm(گرم بر لیتر)

2/4

59/3

2/3

04/3

µm(ساعت/1)

16/0

21/0

22/0

14/0

R2

976/0

98/0

971/0

993/0

بازده سلولی (گرم بر گرم)

15/0

14/0

12/0

11/0

اتانول تولیدی

P0 (گرم بر لیتر)

81/0

7/0

74/0

04/1

Pm (گرم بر لیتر)

26/0

41/0

25/0

22/0

Pr (ساعت/1)

08/17

09/15

4/13

71/12

R2

998/0

989/0

986/0

98/0

بازده اتانول (گرم بر گرم)

43/0

42/0

38/0

36/0

گلوکز مصرفی

S0 (گرم بر لیتر)

40

40

1/40

40

YX/S گرم بر گرم

9/9

9/7

94/9

3/7

YP/S گرم بر گرم

2/12

6/8

6/7

3/6

R2

999/0

995/0

998/0

997/0

گلوکز مصرفی (گرم بر لیتر)

2/39

64/37

83/33

5/30

 


.بررسی اثر غلظت‏های مختلف فورفورال بر روی رشد، میزان اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی: نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف ترکیب فورفورال بر روی رشد، میزان گلوکز مصرفی وبازده اتانول تولیدی نشان داد که با افزایش غلظت فورفورال، میزان رشد مخمر، گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی کاهش می‏یابد. همچنین، نتایج حاصل از بررسی اثر غلظت‏های مختلف فورفورال بر میزان گلوکز مصرفی و اتانول تولیدی در طی فرآیند تخمیر نشان داد که افزایش غلظت فورفورال به بیشتر از 5/0 گرم بر لیتر تأثیر بازدارندگی شدیدی بر روی میزان گلوکز مصرفی و بازده اتانول تولیدی می‏گذارد (جدول 1)، به‏طوری که بیش‏ترین میزان گلوکز مصرفی در طی فرآیند تخمیر به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 گرم در لیتر به میزان 39/0، 5/34، 33 و 2/29 گرم بر لیتر به‏دست آمد. همچنین، بیش‏ترین بازده اتانول تولیدی به ترتیب در غلظت‏های صفر، 5/0، 1 و 2 به ترتیب به میزان 42/0، 40/0، 37/0 و 34/0گرم اتانول بر گرم گلوکز مشاهده شد (شکل 2). نتایج حاصل از بررسی میزان وزن خشک سلولی نشان دادکه با افزایش غلظت فورفورال میزان وزن خشک سلولی به میزان زیادی نسبت به نمونه شاهد کاهش می‏یابد. به‏طوری که بیش‏ترین و کمترین وزن خشک سلولی به ترتیب در نمونه شاهد و2 گرم در لیتر به میزان 9/3 و 7/2 گرم بر لیتر به‏دست آمد (شکل 2).

 

 

 

 

شکل 2- نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف فورفورال بر روی روند رشد بیومس سلولی (الف)، اتانول تولیدی (ب) وگلوکز مصرفی (ج) توسظ ساکارومایسس سرویسیه در طی فرآیند تخمیر همراه مدل سنتیکی آن‏ها

 

جدول 2- نتایج رگرسیون و شاخص‏‏های سنتیکی رشد مخمر، تولید اتانول و گلوکز مصرفی (گرم بر لیتر) درطی فرآیند تخمیر در غلظت‏های مختلف فورفورال

شاخص‏های فرآیندی

شاخص‏‏های سینیتیک

غلظت فورفورال (میلی گرم بر لیتر)

شاهد

5/0

1

2

رشد بیومس سلولی

x0 (گرم بر لیتر)

9/3

61/3

29/3

8/2

xm(گرم بر لیتر)

65/0

78/0

8/0

54/0

µm(ساعت/1)

15/0

13/0

14/0

21/0

R2

987/0

978/0

987/0

996/0

بازده سلولی (گرم بر گرم)

14/0

13/0

123/0

106/0

اتانول تولیدی

P0 (گرم بر لیتر)

1/1

97/0

66/0

4/0

Pm (گرم بر لیتر)

25/

29/0

34/0

29/0

Pr (ساعت/1)

88/16

57/14

66/11

59/10

R2

98/0

989/0

981/0

991/0

بازده اتانول (گرم بر گرم)

42/0

4/0

37/0

34/0

گلوکز مصرفی

S0 (گرم بر لیتر)

40

3/40

02/40

40

YX/Sگرم بر گرم

6/3

9/4

9/2

6/1

YP/S گرم بر گرم

2/12

39/9

6/8

7/6

R2

987/0

993/0

999/0

997/0

گلوکز مصرفی
(گرم بر لیتر)

8/38

5/36

33

2/29

 


.بحث و نتیجه ‏‏گیری

امروزه یکی از معمول‏ترین روش‏های هیدرولیز و پیش تصفیه در فرآیند تولید اتانول از مواد مختلف نشاسته‏ای، سلولزی و لیگنوسلولزی هیدرولیز اسیدی است. در زمان هیدرولیز اسیدی ترکیبات پلی‏ساکاریدی شامل نشاسته، سلولز و همی سلولز ابتدا به قندهای ساده 5 کربنه و 6 کربنه تبدیل می‏شوند. سپس، در مرحله دوم این ترکیبات به شکل‏های دیگری مانند فورفورال و هیدروکسی متیل فورال یا دیگر ترکیبات تبدیل می‏شوند. این ترکیبات برای میکروارگانیسم‏ها به‏ویژه مخمرها سمی و مضر هستند. وجود این ترکیبات در محیط کشت در هنگام فرآیند تخمیر موجب کاهش رشد مخمر، کاهش گلوکز مصرفی ودر نتیجه کاهش بازده اتانول تولیدی در حین انجام فرآیند تخمیر توسط میکروارگانسیم‏ها می‏شود (14). از جمله مهم‏ترین این ترکیبات می‏توان به فورفورال، هیدورکسی متیل فورال، فرمیک اسید، اسیدهای چرب واستیک اسید اشاره کرد. اگر چه مخمر ساکارومایسس سرویسه در طی فرآیند تخمیر توانایی تبدیل فورفورال و هیدروکسی متیل فورال به ترکیباتی مانند فورال الکل و دیگر ترکیبات را دارد، اما وجود این ترکیبات در محیط کشت تخمیر تأثیرات بازدارنده مهمی بر روی متابولیسم آن و در نتیجه بر روی رشد ومیزان اتانول تولیدی توسط آن می‏گذارد (15).

.اثر ترکیب هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد، گلوکز مصرفی و بازده اتانول تولیدی: نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف ترکیب هیدروکسی متیل فورال بر روی رشد مخمر نشان داد که با افزایش غلظت آن در محیط کشت میزان رشد مخمر کاهش می‏بابد. درمحیط کشتی که عاری از فورفورال بود در ساعت‏های اولیه پس از تلقیح مخمر، میزان بیومس سلولی به شدت افزایش یافت ولی با گذشت زمان میزان تغییرات بیومس کمتر شد. در حالی که با افزایش غلظت هیدروکسی متیل فورال به میزان بیش از 1 گرم در لیتر، کاهش قابل ملاحظه‏ای در رشد مخمر مشاهده شد. نتایج حاصل از بررسی غلظت‏های مختلف هیدروکسی متیل فورال بر روی گلوکز مصرفی نشان داد که بیش‏ترین میزان گلوکز مصرفی در محیط کشت بدون هیدروکسی متیل فورال و 5/0 گرم در لیتر، به میزان 8/97 و 95 درصد است. همچنین در غلظت‏های 1و2 از هیدروکسی متیل فورال، گلوکز مصرفی ترتیب به میزان 84 و76 درصد کاهش نشان داد. عدم مصرف کامل گلوکز موجود در محیط کشت و کاهش میزان بیومس سلولی در محیط کشت‏های باغلظت بالاتر هیدروکسی متیل فورال گویای تأثیرات بازدارنده این ترکیب بر روی رشد مخمر و میزان اتانول تولیدی می‏باشد. به طور کلی یافته‏های حاصل از بررسی تغییرات گلوکز مصرفی گویای آن است که بین دو نمونه عاری از هیدروکسی متیل فورال و 5/0 گرم بر لیتر، تفاوت چندانی وجود ندارد. همچنین، نتایج حاصل از بررسی مدل سنتیکی تولید اتانول، رشد بیومس سلولی و گلوکز مصرفی نشان داد که مدل‏های مورد مطالعه به‏خوبی توانسته اند رفتار تولید اتانول و رشد سلولی را توجیه کنند. همان‏طور که در جدول 1 مشاهده می‏شود، مقادیر ضریب تبیین (R2) بالای 97/0برای تمام شاخص‏ها و همچنین، مقدار F- valueبالا نشان از معنا‏داری مدل‏های به‏کار گرفته شده دارد. ویکندری و همکاران[xi] به بررسی اثر فورفورال، هیدروکسی متیل فورال و اسید استیک بر روی رشد میکروارگانیسم‏های بومی جدا شده برای تولید اتانول پرداختند. نتایج پژوهش آن‏ها نشان داد که در محیط کشت عاری از ترکیبات بازدارنده و غلظت‏های کمتر از 5/0گرم بر لیتر، میزان گلوکز موجود کمابیش به‏طور کامل مصرف شده است (15). همچنین، یافته‏های آن‏ها نشان داد با افزایش غلظت فورفورال وهیدروکسی متیل به بیش از 5/0 گرم در لیتر، میزان بازده اتانول تولیدی به‏طور قابل ملاحظه‏ای کاهش می‏یابد. به طوری که در محیط کشت با غلظت 1گرم بر لیتر، میزان بازده اتانول تولیدی به میزان 26 و 45/18 درصد به ترتیب برای فورفورال وهیدروکسی متیل فورال کاهش می‏یابد.

یافته‏های حاصل از این مطالعه نشان داد که حضور ترکیب هیدروکسی متیل فورال در محیط کشت بر روی میزان بازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه و رشد آن در غلظت‏های بالاتر از 1 گرم بر لیتر تأثیر قابل ملاحظه‏ای می‏گذارد. که این موضوع با نتایج حاصل ازمطالعه آلوز و همکاران[xii]مبنی بر کاهش رشد سلولی و میزان اتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر مخمر ساکارومایسس سرویسیه، با غلظت 1 گرم بر لیتر هیدروکسی متیل فورال، مطابقت دارد (16).

.اثر ترکیب فورفوال بر روی رشد، گلوکز مصرفی و .بازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه:فورفورال یکی از مهم‏ترین ترکیبات بازدارنده رشد میکروارگانیسم‏ها در فرآیند تخمیر اتانول است. اگرچه تأثیر فورفورال بر روی رشد و متابولسیم مخمرها هنوز به‏طور کامل شناخته نشده است، اما به هر حال وجود این ترکیب در محیط کشت اثر بازدارندگی‏ قابل ملاحظه‏ای بر روی روند رشد میکروارگانیسم، گلوکز مصرفی و میزان اتانول تولیدی می‏گذارد. نتایج حاصل از مطالعه حاضر گویای آن است که با افزایش غلظت فورفورال، علاوه بر کاهش میزان بیومس سلولی مخمر، میزان بازده اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی توسط آن کاهش چشم‏گیری می‏یابد. به طوری که بیش‏ترین وکم‏ترین میزان گلوکز مصرفی به ترتیب 02/39 و 4/26 گرم بر لیتر در محیط کشت شاهد و محیط کشت با غلظت2 گرم بر لیتر فورفورال مشاهده شد. نتایج نشان داد که بیش‏ترین میزان بازده اتانول تولیدی علاوه بر نمونه کنترل به ترتیب در غلظت 5/0، 1 و 2 گرم بر لیتر فورفورال به میزان 4/0، 36/0 و 34/0 گرم اتانول بر گرم گلوکز به‏دست آمد. همچنین، نتایج حاصل از بررسی مدل سنتیکی تولید اتانول و رشد بیومس سلولی نشان داد که مدل‏های مورد مطالعه به‏خوبی توانسته اند رفتار تولید اتانول، رشد سلولی و گلوکز مصرفی را توجیه کنند. همان‏طور که در جدول 2 مشاهده می‏شود، مقادیر ضریب تبیین (R2) بالای 97/0 برای تمام شاخص‏ها و همچنین مقدار F- value بالا نشان از معنا‏داری مدل‏های مورد به‏کار گرفته شده است. در واقع نتایج به‏دست آمده نشان می‏دهد که مدل‏های مورد بررسی به خوبی توانسته‏اند رفتار رشدسلولی، اتانول تولیدی و گلوکز مصرفی را در طی فرآیند تخمیر در حضور ترکیبات بازدارنده توجیه کنند. به طور کلی کاهش میزان گلوکز مصرفی و بازده اتانول تولیدی در طی فرآیند تخمیر با افزایش غلظت فورفورال گویای تأثیر بازدارندگی این ترکیب بر روی رشد ومتابولیسم مخمر و در نتیجه میزان اتانول تولیدی است. اگرچه بیشتر میکروارگانیسم‏ها به‏ویژه مخمر ساکارمایسس سرویسیه توانایی تبدیل فورفورال به الکل فورال یا فوریک اسید توسط آنزیم‏های الکل دهیدروژناز و آلدهیددهیدروژناز آنزیم را دارند، اما این ترکیبات در محیط کشت باعت کاهش رشد، میزان گلوکز مصرفی واتانول تولیدی طی فرآیند تخمیر می‏شوند (17).

توفیقی و همکاران[xiii] بیان کردند حضور ترکیبات بازدارنده همچون فورفورال در محیط کشت مخمر ساکارومایسس سرویسیه باعت کاهش عملکرد تولید اتانول و ایجاد ضعف در مخمر می‏شود. بنابراین، برای تولید بهینه اتانول از مواد نشاسته‏ای، سلولزی ولیگنوسلولزی علاوه بر پیدا کردن میکروارگانسیم‏های مناسب، بررسی مقاومت آن‏ها در برابر شرایط محیطی از جمله ترکیبات بازدارنده بسیار مهم واساسی است (14). نتایج آن‏ها گویای این است که با افزایش غلظت فورفورال میزان بیومس سلولی، رشد مخمر و همچنین، میزان اتانول تولیدی کاهش می‏یابد. همچنین آن‏ها بیان داشتند که در محیط کشت بدون فورفورال و محیط کشت‏ با غلظت‏های 4، 5 و 6 گرم بر لیتر به ترتیب 93، 60، 51 و33 درصد، میزان گلوکز توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه مصرف شده است (14). همچنین در مطالعه دیگری، ویکندری و همکاران[xiv] بیان داشتند که با افزایش غلظت فورفورال از 25/0 گرم بر لیتر به بیش از 5/0 گرم بر لیتر، میزان گلوکز مصرفی به‏طور قابل ملاحظه‏ای کاهش می‏یابد. آن‏ها بیان داشتند که افزایش غلظت به بیش از 5/0 گرم بر لیتر، میزان بازده اتانول تولیدی از 44/0گرم اتانول بر گرم گلوکز به 40/0 گرم اتانول برگرم گلوکزکاهش می‏یابد. علاوه بر این، یافته‏های آن‏ها نشان داد که افزایش غلظت فورفورال در محیط کشت با غلظت 5/0 گرم بر لیتر نسبت به نمونه شاهد، باعث کاهش 5/7 درصدی بازده اتانول تولیدی می‏شود. در حالی افزایش غلظت آن به بیش از 5/0 گرم بر لیتر باعث کاهش 26 درصدی اتانول می‏شود (15).

به طور کلی نتایج حاصل از بررسی اثر دو ترکیب فورفورال وهیدروکسی متیل فورال بر روی رشد، میزان گلوکز مصرفی وبازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسسیه نشان داد که فورفورال نسبت به هیدروکسی‏متیل فورال تأثیر بازدارندگی بیشتری بر روی مخمر می‏گذارد. در مطالعه دیگری آلمارسدوتیر و همکاران[xv] اثر مهارکنندگی دو ترکیب فورفورال و هیدروکسی‏متیل‏فورال در طی فرآیند تخمیر اتانول توسط سویه باکتریترمانرو باکتریوم AK1[xvi]را بررسی کردند. یافته‏های آن‏ها نشان داد که در غلظت 5/0گرم بر لیتر، فورفورال وهیدروکسی متیل به ترتیب موجب کاهش 15 و 17 درصدی اتانول می‏شود. همچنین، آن‏ها بیان داشتند فورفورال در غلظت 2 گرم بر لیتر کمابیش باعت کاهش 50 درصدی در میزان تولید اتانول می‏شود. اما برای هیدروکسی متیل فورال کاهش خیلی کمی با افزایش غلظت آن مشاهده شد (18). با توجه به نفوذپذیری کم غشای سلولی مخمر نسبت به هیدروکسی متیل فورال در مقایسه با فورفورال می‏توان این احتمال را داد که تأثیر بازدارندگی کمتر هیدروکسی متیل فورال نسبت به فورفورال ناشی از این عامل باشد. لارسون[xvii] و همکاران بیان داشتند اگرچه مخمر ساکارومایسس سرویسیه توانایی تبدیل هیدروکسی متیل فورال به 5 هیدروکسی فورفورال الکل را دارد، اما سرعت تبدیل آن نسبت به فورفورال کمتر است که این می‏تواند ناشی از نفوذ پذیری کم غشای سلولی آن نسبت به فورفورال باشد (9).

مطالعه حاضر به بررسی تأثیر غلظت‏های مختلف دو ترکیب فورفورال وهیدروکسی متیل فورال بر روی رشد و بازده اتانول تولیدی توسط مخمر ساکارومایسس سرویسیه پرداخت. نتایج این مطالعه نشان داد با افزایش غلظت هر دو ترکیب، میزان بیومس سلولی و بازده اتانول تولیدی کاهش می‏یابد و روند کاهش میزان گلوکز مصرفی با افزایش غلظت این دو ترکیب گویای تأثیر منفی این ترکیبات بر روی رشد و متابولیسم مخمر است. همچنین، نتایج نشان داد که فورفورال نسبت به هیدروکسی متیل فورال به مراتب تأثیر بازدارندگی بیشتری بر روی رشد مخمر و بازده اتانول تولیدی دارد.



[1]- Hydroxymethyl furfural (HMF)

[2]- Furfural (FUR)

[3]- Larsson

[4]- Modig

[5]- Pyruvate dehydrogenase(PDH)

[6]- Alcohol dehydrogenase (ADH)

[7]- Aldehyde dehydrogenase  (AlDH)

[8]- Merck

[9]- DNS

[10]- Jenway 6305

[xi]- Wikandari

[xii]- Alves

[xiii]- Tofighi

[xiv]- Wikandari

[xv]- Almarsdottir

[xvi]- ThermoanaerobacteriumAK1

[xvii]- Larsson

 

(1)               Wang R., Domínguez‐Espinosa RM., Leonard K., Koutinas A., Webb C. The application of a generic feedstock from wheat for microbial fermentations. Biotechnology progress 2002; 18 (5): 1033- 8.

(2)               Demirbas A. Biofuels sources., biofuel policy., biofuel economy and global biofuel projections. Energy Conversion and Management 2008; 49 (8): 2106- 16.

(3)               Gohel V., Duan G. Conventional process for ethanol production from Indian broken rice and pearl millet. Bioprocess and Biosystems Engineering 2012; 35 (8): 1- 12.

(4)               Cardona Alzate C., Sanchez Toro O. Energy consumption analysis of integrated flowsheets for production of fuel ethanol from lignocellulosic biomass. Energy 2006; 31 (13): 2447- 59.

(5)               Demirbas A. Use of algae as biofuel sources. Energy Conversion and Management 2010; 51 (1). 2738- 49.

(6)               Lin Y., Tanaka S. Ethanol fermentation from biomass resources: current state and prospects. Applied Microbiology and Biotechnology 2006; 69 (6): 627- 42.

(7)               Oberoi HS., Vadlani PV., Brijwani K., Bhargav VK., Patil RT. Enhanced ethanol production via fermentation of rice straw with hydrolysate- adapted Candida tropicalis ATCC 13803. Process Biochemistry 2010; 45 (8): 1299- 306.

(8)               Sakthi SS., Saranraj P., Rajasekar M. Optimization for cellulase production by Aspergillus nigerusing paddy straw as substrate. International journal of Advanced Scientific and Te chnical Research 2011; 1 (1): 69- 85

(9)               Larsson S., Palmqvist E., Hahn-Hägerdal B., Tengborg C., Stenberg K., Zacchi G., et al. The generation of fermentation inhibitors during dilute acid hydrolysis of softwood. Enzyme and Microbial Technology 1999; 24 (3): 151- 9.

(10)           Modig T. Kinetics and inhibition effects of furfural and hydroxymethyl furfural on enzymes in yeast. Biochemical Journal 2002; 4 (2): 323- 8.

(11)           Chen HC. Non-aseptic, multi-stage, multi-feeding, continuous fermentation of cane mollasses to ethanol. Process biochemistry international. 1990; 25 (3); 254- 60.

(12)           Miller G. L. Useof dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry 1959; 31 (3); 426- 28

(13)           Duonan Tu ., Saifeng Xue ., Chunyuan Meng., Anunciacion Espinosa-Mansilla., Arsenio Munoz de la Pena., Lopez F. S. Simultaneous determination of 2-furfuraldehyde and5- (hydroxymethyl) -2-furfuraldehyde by derivative spectrophotometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry 1992; 40 (6): 1022- 25.

(14)           Tofighi A., Azin M., Mazaheri Assadi M., Assadi-rad M. H. A., Nejadsattari T., Fallahian M. R. Inhibitory effect of high concentrations of furfural on industrial strain of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Environmental Research 2010; 4 (1): 137- 42.

(15)           Wikandari R., Millati R., Syamsiyah S., Muriana R., Ayuningsih Y. Effect of furfural., hydroxymethylfurfural and acetic acid on indigeneous microbial isolate for bioethanol production. Agricultural Journal 2010; 5 (2): 105- 9.

(16)           Alves LA., Felipe MG., Silva JBAE., Silva SS., Prata AM. Pretreatment of sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate for xylitol production by Candida guilliermondii. Applied Biochemistry and Biotechnology: Springer 1998; 72 (1). 89- 98.

(17)           Taherzadeh MJ., Gustafsson L., Niklasson C., Lidén G. Conversion of furfural in aerobic and anaerobic batch fermentation of glucose by Saccharomyces cerevisiae. Journal of bioscience and bioengineering 1999; 87 (2): 169- 74.

(18)           Almarsdottir AR., Sigurbjornsdottir MA., Orlygsson J. Effect of various factors on ethanol yields from lignocellulosic biomass by Thermoanaerobacterium AK17. Biotechnology andBioengineering 2012; 109 (3): 686- 94.