جداسازی لاکتوباسیلوس پلانتاروم از ارقام مختلف زیتون بومی ایران و بررسی فعالیت ضد میکروبی آن بر دو باکتری بیماری ‏زای خانواده انتروباکتریاسه

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 دانشجوی دکتری میکروبیولوژی، عضو هیأت علمی واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

2 دانشجوی کارشناسی ارشد علوم گیاهی، دانشگاه پیام نور، اصفهان، ایران

3 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، واحد فلاورجان، دانشگاه آزاد اسلامی، اصفهان، ایران

چکیده

مقدمه: درمان با کمک میکروارگانیسم‏ها روشی نوین و در حال توسعه است که در این زمینه باکتری‏های پروبیوتیک به ویژه باکتری‏های اسیدلاکتیک نقش اساسی دارند. زیتون از گیاهان پربار و مفید بومی ایران و سرشار از باکتری‏های اسید‏لاکتیک است. در این مطالعه، تعدادی از سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم از ارقاممختلف زیتون بومی ایران جدا و برخی خواص پروبیوتیکی آن‏ها بررسی شد‏‏.
مواد و روش‏‏ها: ابتدا سویه‏های مختلف باکتری‏های اسید‏لاکتیک از سه رقم زیتون بومی ایران بر روی محیط کشت MRS آگار جداسازی شد و پس از شناسایی‏های بیوشیمیایی و مولکولی، برخی خواص پروبیوتیکی شامل: مقاومت به اسید، صفرا و آثار ضد‏میکروبی جدایه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم در برابر دو عضو بیماری‏زای خانواده انتروباکتریاسه شامل: اشریشیا کلی (PTCC1399) و شیگلا دیسانتری (PTCC1188) با استفاده از دو روش انتشار از چاهک و دیسک بررسی شد. به منظور کاهش خطا، هر آزمون سه بار تکرار شد. میانگین قطر هاله عدم رشد توسط سویه‏های مختلف جدا شده از طریق آزمون تحلیل واریانس یک‏طرفه مقایسه شد.
نتایج: از بین 28 سویه جداسازی شده، بر اساس نتایج آزمون‏های بیوشیمیایی، 57 درصد سویه‏ها لاکتوباسیلوس پلانتاروم شناسایی شدند. در بین این سویه‏ها، 75 درصد سویه‏ها در برابر شرایط اسیدی و 25/81 درصد در برابر نمک‏های صفراوی، مقاوم یا بسیارمقاوم بودند. در بررسی‏های مولکولی، در واکنش PCR، 6 سویه با آغازگرهای اختصاصی طراحی شده برای لاکتوباسیلوس پلانتاروم باند اختصاصی تشکیل دادند. نتایج، توصیف کننده آثار ضد میکروبی لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده از ارقام مختلف زیتون بومی ایران بر روی دو پاتوژن روده‏ای اشریشیا کلی و شیگلا دیسانتری بودند.
بحث و نتیجه ‏گیری: با توجه به وجود خواص پروبیوتیکی در سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده از زیتون‏های بومی ایران، استفاده از آن‏ها برای پیشگیری و درمان عفونت‏های شیگلا دیسانتری و اشریشیا کلی به‏عنوان راهکاری مهم و عملی قابل قبول است.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation of Lactobacillus plantarum from different varieties of Iranian native olives and investigation of their antimicrobial activity against two pathogenic members of Entrobacteriaceae

نویسندگان [English]

  • Zarrindokht Emami 1
  • Elham Khalilian 2
  • Maedeh Shahsanaei 3
1 Lecturer & P.hD. Student of Microbiology, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
2 M.Sc. Student of Plant Biology, Young Researchers and Elite Club, Payame noor University, Isfahan, Iran
3 M.Sc. of Microbiology, Young Researchers and Elite Club, Falavarjan Branch, Islamic Azad University, Isfahan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Treatment with microorganisms is a new developing method that in this field, probiotic bacteria, especially lactic acid bacteria have a significant role. Olive is a productive and useful Iranian native plant which is rich in lactic acid bacteria. In this study, a number of Lactobacillusplantarum strains were isolated from Iranian native olives and some of their probiotic properties were investigated.
Materials and methods: Atfirst, different strains of lactic acid bacteria were isolated from Iranian native olive on MRS agar medium, and after biochemical and molecular identification of bacteria, some probiotic properties such as acid and bile salt tolerance; and antimicrobial effects against two pathogenic species of Enterobacteriaceae, Escherichia coli (PTCC1399) and Shigella dysenteriae (PTCC1188) were studied by disk and well diffusion agar methods. According to error reduction, each test was performed in triplicate. Average zone of inhibition for each strain was compared by one-way ANOVA.
Results: According to biochemical tests, 57 percent of 28 isolated lactic acid bacteria were identified as Lactobacillus plantarum. Among these strains, 75 percent and 81.5 percent were acid and bile tolerance respectively. In the molecular analysis, 6 strains were shown specific bands in PCR reaction which performed by specific primers designed for Lactobacillus plantarum. The results described antimicrobial effects of Lactobacillus plantarum isolated from Iranian native olives on two enteric pathogens, Escherichia coli and Shigella dysenteriae.
Discussion and conclusion: According to probiotic properties of isolated Lactobacillus plantarum from Iranian native olives, using them is acceptable as an important and practical approach to prevent infectious disease and its treatment due to Escherichia coli and Shigella dysenteriae.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Lactobacillus plantarum
  • Probiotic
  • Olive
  • Enteric pathogens
  • Antimicrobial effect

مقدمه

استفاده از پروبیوتیک‏ها برای افزایش سلامتی و بهبود فعالیت دستگاه گوارش سابقه‏ای دیرینه دارد (2 و 1)، ولی اختصاص دومین رتبه بیماری‏ها به بیماری‏های حاد دستگاه گوارش نشان دهنده آن است که از این توانمندی استفاده چندانی نشده‏است‏ (3). مطالعات انجام شده در سراسر جهان نشان‏دهنده وجود فعالیت ضدمیکروبی پروبیوتیک‏ها دربرابر باکتری‏های بیماری‏زا‏ست‏ (5 و 4).

درمان بیماری‏ها با کمک میکروارگانیسم‏ها روشی نوین و درحال توسعه است که از باکتری‏های مفید به عنوان عوامل درمانی دراختلالات ایمنی و بیماری‏های عفونی استفاده می‏شود. ویژگی‏ مهم باکتری‏های پروبیوتیک، توانایی این باکتری‏ها در کاهش تعداد و کاهش قدرت بیماری‏زا‏یی موجودات بیماری‏زا‏ست‏ (2 و 6).

باکتری‏های اسید لاکتیک[1]‏ (LAB) گروهی از باکتری‏ها هستند که بر اساس مجموعه‏ای از ویژگی‏های‏ ریخت‏شناسی، متابولیکی و فیزیولوژیکی در یک گروه قرار می‏‏گیرند. از لحاظ ریخت‏شناسی باکتری‏های ‏گرم مثبت، بدون اسپور، کوکسی، کوکوباسیل یا میله‏ای ‏‏هستند که به طور معمول کاتالاز منفی و بی هوازی‏اند ‏‏و گلوکز را به اسید لاکتیک یا به اسید لاکتیک، اتانول و دی‏اکسید‏کربن تخمیر می‏کنند. این باکتری‏ها واجد سوپر اکسید دیسموتاز هستند و به طور متناوب رادیکال‏های ‏پراکسید را با استفاده از آنزیم‏های ‏پراکسیداز، سم‏زدایی می‏کنند. بنابراین، در حضور اکسیژن رشد می‏کنند و آئروتولرانت هستند. برخی گونه‏های ‏این باکتری‏ها به طور طبیعی جزو فلور نرمال دهان، روده‏ها و واژن پستانداران هستند (7). افزون بر آن، وجود باکتری‏های ‏اسید لاکتیک در انواع فرآورده‏های ‏غذایی تخمیری ثابت شده است‏ (8- 12). این باکتری‏ها نقش اصلی ‏‏در تخمیر میوه‏ها و سبزیجات از جمله دانه‏های ‏زیتون دارند‏ (13- 16). خواص پروبیوتیکی باکتری‏های ‏اسید لاکتیک با منشا جداسازی مختلف تا کنون بارها بررسی شده است‏ (7-9 و 17). یکی دیگر از موارد کاربرد این باکتری‏ها، استفاده از باکتری‏های ‏اسید لاکتیک به عنوان وکتورهای تحویل مخاطی آنتی‏ژن‏ها و سیتوکین‏هاست که تحویل دارو از طریق مخاط، از روش‏های ‏نوین تحویل دارو و واکسن است‏ (18).

لاکتوباسیلوس‏ها باکتری‏های گرم مثبت، بدون اسپور، کاتالاز منفی و معمولاً بی‏حرکت‏اند ‏‏و به ندرت نیترات را احیا می‏کنند. این باکتری‏ها قادر به تخمیر گلوکز به شکل جور تخمیر یا ناجور تخمیر هستند. لاکتوباسیلوس‏ها مقاوم‏تر از سایر باکتری‏های اسید لاکتیک هستند و در منفی 4 درجه سانتی‏گراد قادر به رشدند‏ (7 و 10). لاکتوباسیلوس پلانتاروم[2]یکی از فراوان‏ترین باکتری‏های جنس لاکتوباسیلوس است که معمولاً در مواد غذایی تخمیری یافت می‏شود‏ (8 - 17 و 19). این باکتری گرم مثبت قادر به هیدرولیز ژلاتین است و در دمای 15 درجه سانتی‏گراد به خوبی رشد می‏‏کند ولی در دمای 45 درجه سانتی‏گراد قادر به رشد نیست. تولید مواد ضد میکروبی توسط لاکتوباسیلوس پلانتاروم به زنده ماندن این گونه در دستگاه گوارش کمک می‏‏کند‏ (20). مشخص شده است که این مواد ضد میکروبی آثار در خور توجهی بر باکتری‏های گرم مثبت و گرم منفی دارد. این باکتری تاریخچه‏ای طولانی از مصرف ایمن و طبیعی در انواع محصولات غذایی دارد. به همین علت‏ در حال حاضر فعالیت وسیع ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس پلانتاروم به عنوان یکی از مهم‏ترین عوامل دارای پتانسیل درمانی برای جلوگیری یا درمان عفونت‏ها مطرح است‏ (20). انواع سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم، پتانسیل بالقوه‏ای در معرفی به عنوان پروبیوتیک دارند. اگرچه با وجود آثار مفید بی‏شمار، گاه محدودیت‏هایی برای استفاده وجود دارد از جمله آن که بعضی نژادها باعث فساد مواد غذایی هستند یا حتی گاهی بیماری‏زا می‏شوند‏ (21).

زیتون یکی از محصولات مهم کشاورزی و گیاهان پربار و مفید بومی ایران است که سرشار از باکتری‏های اسید لاکتیک و به ویژه لاکتوباسیلوس پلانتاروم است و در حین مراحل تخمیر و تلخی‏زدایی از میوه زیتون‏ (13-16، 22) و برگ آن‏ (23) قابل جداسازی است. در سال 2013، خواص مولکولی باکتری‏های ‏اسید لاکتیکی که از دانه‏های ‏زیتون یونانی تخمیری جداسازی شده‏اند مطالعه شده است‏ (16) بررسی تنوع جمعیت باکتری‏های ‏دانه‏های ‏زیتون با روش‏های ‏مختلفی از جمله روش‏های ‏مولکولی نظیر تحلیل با [3]PCR-DGGE انجام شده است‏ (22). با توجه به تولید باکتریوسین‏هایی ‏نظیر پلانتاریسین توسط این باکتری‏ها، حضور باکتری‏هایی ‏نظیر لاکتوباسیلوس پلانتاروم در دانه زیتون می‏تواند به کنترل جمعیت میکروبی زنده[4] موجود در آن منجر شود‏ (20 و 24). با استفاده از توالی‏های ‏اختصاصی و منحصر به فرد موجود در این باکتری می‏توان پروب‏های ‏اختصاصی برای شناسایی لاکتوباسیلوس پلانتاروم در منابع مختلف طراحی کرد‏ (25).

از سوی دیگر خانواده‏ی انتروباکتریاسه[5] بزرگ‏ترین و نامتجانس‏ترین مجموعه‏ باسیل‏های گرم منفی با اهمیت در پزشکی هستند و شامل ارگانیسم‏هایی ‏می‏باشند که در همه جا حاضر هستند و در تمام جهان در خاک، آب و سبزیجات یافت می‏شوند و همچنین، به عنوان قسمتی از فلور روده ای نرمال در بیشتر حیوانات و انسان محسوب می‏شوند‏ (26). این باکتری‏ها عامل بیماری‏های مختلفی در انسان بوده و 35 درصد کل باکتریمی ها، بیش از 70 درصد عفونت‏های مجاری ادراری و بسیاری از عفونت‏های روده ای را به خود اختصاص داده‏اند. (7 و 26). بنابر آن چه گفته شد، پرداختن به روابط عملکردی بین پروبیوتیک‏ها و باکتری‏های خانواده انتروباکتریاسه امری مهم و جالب به نظر می‏رسد‏ (5، 27 و 28).

 در این پژوهش، ابتدا در بین سویه‏های ‏مختلف باکتری‏های ‏اسید لاکتیک جداسازی شده از ارقام مختلف زیتون بومی ایران، سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم شناسایی شد و از بین خواص پروبیوتیکی، عملکرد ضدمیکروبی سویه‏های انتخابی علیه دو باکتری از شایع‏ترین باکتری‏های پاتوژن دستگاه گوارش، اشریشیاکلی[6] (PTCC1399) و شیگلا دیسانتری[7] (PTCC1188) و نیز مقاومت به اسید و نمک‏های صفراوی آن‏ها ارزیابی شد.

 

.مواد و روش‏ها

.جداسازی باکتری‏های اسید لاکتیک از زیتون بومی ایران: سه نوع از ارقام مختلف زیتون بومی ایران شامل زیتون روغنی، زرد و ماری از باغ تحقیقاتی زیتون واقع در شهرستان طارم استان زنجان خریداری و به آزمایشگاه تحقیقاتی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان انتقال داده شد. روش جداسازی باکتری‏های ‏اسید لاکتیک بر اساس روش اصلاح شده راندازو[8] و همکاران‏ (22) و لاورمیکوکا[9]‏ (14) انجام شد. مرحله تلخی‏زدایی و فرایند تخمیر نمونه‏های ‏زیتون تهیه شده ابتدا در آب نمک و سپس، در آب نمک و سرکه انجام شد. در حین مراحل تخمیر، از آب نمک در شرایط استریل بر روی محیط MRSآگار[10] کشت چمنی انجام شد و بعد از 72 ساعت قرار دادن نمونه‏ها در انکوباتور و در دمای 27 درجه سانتی‏گراد، محیط کشت‏ها بررسی و کلونی‏‏های ‏سفید تا قهوه‏ای ‏‏روشن که مشخصه باکتری‏های اسید لاکتیک است شمارش شد. برای اثبات وجود لاکتوباسیلوس‏ها رنگ آمیزی گرم، آزمون کاتالاز و حرکت انجام شد و باکتری‏های میله‏ای شکل گرم مثبت، بدون اسپور، کاتالاز منفی و حرکت منفی به عنوان لاکتوباسیلوس در نظر گرفته شد‏ (7).

.شناسایی سویه‏های جداسازی شده:برای شناسایی سویه‏ها در حد جنس و گونه از آزمون‏های مختلف تخمیر کربوهیدرات‏ها، هیدرولیز ژلاتین و رشد در 15 و 45 درجه سانتی‏گراد استفاده شد‏ (7). به منظور شناسایی مولکولی، DNA باکتری‏ها با روش فنل-کلروفرم استخراج شد. واکنش زنجیره‏ای ‏‏پلی مراز، با آغازگر[11]های طراحی شده برای توالی ITS[12] + 16S rDNA لاکتوباسیلوس پلانتاروم، به روش PCR با افزایش تدریجی دما[13] انجام گرفت. توالی آغازگرهای مورد استفاده در جدول 1 نشان داده شده است.

 

جدول 1- توالی آغازگر‏های طراحی شده در این پژوهش

آغازگر

توالی

Flplan

5-ACGAACTCTGGTATTGATTGG-3

R1lplan

5-ACTTCACCCTAATCATCTGTC-3

R2lplan

5-GGTGTTCTCGGTTTCATTATG-3

 

آغازگر Flplan آغازگر رفت[14] و آغازگر R1lplan و آغازگر R2lplan هر دو برگشت[15] هستند. آغازگر R1lplan در داخل آغازگر R2lplan طراحی شده است که به تکثیر قطعه‏ای ‏‏اختصاصی‏تر منجر می‏‏شود. از این ویژگی آغازگرها می‏توان در مواقعی که PCR جواب نمی‏دهد استفاده کرد و با PCR آشیانه ای[16] امکان تکثیر قطعه و مشاهده باند مورد نظر را افزایش داد. آغازگر R2lplan قطعه‏ای با طول bp1650 و آغازگر R1lplan قطعه‏ای با طول bp1420 را تکثیر می‏کند.

همچنین، در این پژوهش از یک جفت آغازگر یاد شده در پایان نامه بالات[17] استفاده شد‏ (10). این آغازگرها و توالی آن‏ها در جدول2 نشان داده شده‏است. هر پنج آغازگر به شرکت سینا کلون تهران سفارش داده و تهیه شد.

 

جدول 2- آغازگر‏های اقتباس شده و توالی آن‏ها

آغازگر

توالی

F: EGE1

5-AGAGGTTTTGATCCTGGCTCAG-3

R: L1

5-CAAGGCATCCACCGT-3

 

.PCR با افزایش تدریجی دما[18]: این روش نوعی PCR است که درآن دما به تدریج بالا رفته و شرایط چسبیدن پرایمر‏ها به تدریج سخت‏تر می‏شود. بنابراین، محصولات اختصاصی‏تری تکثیر خواهند شد. برنامه PCR با افزایش تدریجی دما که به دستگاه ترموسایکلر داده شد تا قطعه بزرگ را تکثیر کند در جدول 3 آمده است. از هر دو پرایمر برگشت به طور جداگانه در انجام این PCR استفاده شد که البته نتایج کمابیش مشابهی به دست آمد.

 

جدول 3- برنامه PCR با افزایش تدریجی دما

مرحله

دما‏ (درجه سانتی‏گراد)

زمان

1

94

6 دقیقه

2

94

30 ثانیه

3

50

40 ثانیه

4

72

2 دقیقه

5

15 بار تکرار، مراحل 2 تا 4

6

94

30 ثانیه

7

57

35 ثانیه

8

72

1 دقیقه و 35 ثانیه

9

20 بار تکرار، مراحل 6 تا 8

10

72

5 دقیقه

 

 

 

سپس، به منظور بررسی دقیق‏تر سویه‏ها و شناسایی تفاوت‏های بین آن‏ها، از روش RFLP[19] استفاده شد و تأثیر آنزیم‏های TaqI و HaeIII بر روی محصولات PCR بررسی شد. ویژگی آن‏ها در جدول 4 نشان داده شده است.

جدول 4- آنزیم‏های استفاده شده و ویژگی آن‏ها

نام آنزیم

توالی مورد اثر

بهترین دمای فعالیت‏ (درجه سانتی‏گراد)

Hae lll (Bsnl)

5…. GGCC…. 3

3…. CCGG…. 5

37

Taq l

5…. TCGA…. 3

3…. AGCT…. 5

65

 

برای انجام عمل RFLP، 5 میکرولیتر از DNA (محصول PCR) با 5/12 میکرولیتر آب مقطر تزریقی و 2 میکرولیتر بافر واکنش آنزیم مورد نظر و 5/0 میکرولیتر (5 واحد) از آنزیم مورد نظر مخلوط شد و در دمای مخصوص واکنش به مدت 16 ساعت انکوبه شد. برای مشاهده نتیجه هضم آنزیمی، تمام محصول هضم آنزیمی با 4 میکرولیتر بافر لودکننده[20] مخلوط شد و در ژل آگاروز 2/1 درصد بارگذاری شد. الکتروفورز در ولتاژ 70 ولت و به مدت 45 دقیقه انجام شد. پس از رنگ آمیزی با اتیدیوم برماید نتایج، مشاهده، عکس‏برداری و مطالعه شد.

.بررسی آثار ضد میکروبی: بررسی آثار ضدمیکروبی هر یک از سویه‏های ‏جداسازی شده طبق روش یاد‏ شده توسط بالات با برخی اصلاحات انجام شد‏ (10). آثار ضدمیکروبی سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده در برابر دو گونه پاتوژن دستگاه گوارش شامل اشریشیاکلی (PTCC1399) و شیگلا دیسانتری (PTCC1188) با استفاده از دو روش انتشار از چاهک و انتشار از دیسک بررسی شد. این دو سویه از کلکسیون قارچ‏ها و باکتری‏های صنعتی و بیماری‏زا‏ی ایران به شکل لیوفیلیزه تهیه شد و برای احیا بر روی محیط مایع واجد عصاره مغز و قلب[21] (BHI براث) کشت داده و به مدت 24 ساعت در شرایط هوازی و دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد.

همچنین، در این پژوهش از سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده از ارقام مختلف تخمیر شده زیتون بومی ایران در شرایط آزمایشگاه استفاده شد. برای این منظور ابتدا از سویه‏های خالص جداسازی شده در محیط MRS مایع[22] کشت داده شد و در دمای 27 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. پس از رسیدن کدورت باکتری‏ها به مقدار 108× 3 سلول در هر میلی‏لیتر‏ (جذب نوری[23]‏ OD 275/0 در 600 نانومتر معادل1 مک فارلند)، 500 میکرولیتر از هر محیط کشت در لوله‏های ‏اپندورف استریل ریخته شد و به مدت 5 دقیقه در 2000 دور سانتریفوژ شد. سپس، مایع رویی دور ریخته شد و از رسوب موجود در ته اپندورف‏ها پس از سه بار شستشو با سرم فیزیولوژی استریل برای انتقال به چاهک‏ها و دیسک‏های ‏بلانک استفاده شد.

در مرحله بررسی اثر مهاری، از هر یک از باکتری‏های پاتو‌‌ژن احیا شده سوسپانسیونی معادل نیم استاندارد مک فارلند[24] (108× 5/1 سلول در هر میلی‏لیتر‏ (جذب نوری 08/0 تا 1/0در 600 نانومتر) درمحیط [25]TSB تهیه شد و سپس، از این سوسپانسیون در پلیت‏های حاوی محیط کشت مولر هینتون آگار[26]‏ (MHA) کشت چمنی انجام شد. در روش انتشار از چاهک 40 میکرولیتر و در روش انتشار از دیسک 20 میکرولیتر از رسوب سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده بر روی کشت سویه‏های بیماری‏زا‏ قرار داده شد و پس از 24 ساعت قطر هاله عدم رشد باکتری‏های پاتوژن در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم اندازه گیری شد. به منظور کاهش خطا هر آزمون سه بار تکرار شد و و میانگین قطر هاله عدم رشد توسط سویه‏های مختلف جدا شده مقایسه شد. برای مقایسه داخل گروه‏ها از آزمون تحلیل واریانس یک طرفه[27] و برای مقایسه بین گروه‏ها از آزمون تعقیبی LSD استفاده شد.

.بررسی مقاومت به اسید: بررسی مقاومت به اسید هر یک از سویه‏های ‏جداسازی شده طبق روش یاد‏ شده توسط بالات انجام شد‏ (10). ابتدا یک میلی‏لیتر از کشت 24 ساعته هر کدام از سویه‏های جداسازی شده به10 میلی‏لیتر محیط MRS مایع تا میزان معادل تقریبی 106 واحد تشکیل دهنده کلونی‏ در هر میلی‏لیتر[28]‏ (cfu/ml) (OD برابر 132/0 در طول موج 600) تلقیح و به مدت 24ساعت انکوبه شد. از این لوله عنوان شاهد استفاده شد. برای بررسی مقاومت به اسید هر یک از سویه‏های ‏جداسازی شده، به10میلی‏لیتر از محیط MRS مایع با اسیدیته 2 و MRS مایع با اسیدیته 3 که با استفاده از اسید کلریدریک 3 مولار تهیه شده بود، یک میلی‏لیتر از کشت 24 ساعته هر کدام از سویه‏های جداسازی شده تا رسیدن کدورت این محیط به میزان معادل تقریبی 106 واحد تشکیل دهنده کلونی‏ در هر میلی لیتر‏ (OD برابر 132/0 در طول موج 600) تلقیح شد و به مدت 24 ساعت در 30 درجه سانتیگراد انکوبه شد. سپس، 1/0 میلی‏لیتر ازهر یک از سویه‏های جداسازی شده رشد یافته در اسیدیته 2 و 3 در محیط MRS آگار به شکل چمنی کشت داده شد و پس از 48 ساعت انکوباسیون، تعداد باکتری‏های ‏زنده مانده در هر یک از شرایط اسیدی مورد آزمایش شمارش و با شاهد مقایسه شد. بسته به تعداد کلونی‏ شمارش شده، واکنش سویه‏ها به شکل بسیار حساس، حساس، مقاوم و بسیار مقاوم گزارش شد. به طوری که تعداد کلونی‏ رشد یافته در سویه‏های ‏بسیار مقاوم غیر قابل شمارش بود. تعداد کلونی‏ بیشتر از 300 کلونی‏، سویه‏های ‏مقاوم، تعداد کلونی‏ بین 30 تا 300 سویه‏های ‏حساس و تعداد کلونی‏ کمتر از 30، سویه‏های ‏بسیار حساس نامیده شدند.

.بررسی مقاومت به صفرا: طبق روش انجام شده توسط بالات، از کشت 24 ساعته هر یک از سویه‏ها به میزان یک درصد به محیط MRS براث حاوی 3 درصد نمک هاى صفراوى‏ (اکسگال[29]) تلقیح شد. همچنین، تلقیح مشابهى به محیط MRS براث فاقد نمک‏هاى صفراوى به عنوان شاهد انجام شد. بعد از تلقیح تا 8 ساعت هر 30 دقیقه و بعد از 24 ساعت، میزان جذب نورى نمونه‏ها در طول موج 600 نانومتر تعیین شد‏ (10). تفاوت زمانى بر اساس دقیقه بین افزایش کدورت 3/0 واحدى در دو محیط یاد شده به عنوان زمان تاخیر رشد تعیین شد. ایزوله‏های بررسی شده بر اساس زمان تاخیر رشد در پنج گروه قرار گرفتند که در جدول 5 نمایش داده شده است.

 

.نتایج

در این مطالعه و در مرحله جداسازی 28 سویه باکتری‏های اسیدلاکتیک در طی مراحل تلخی‏زدایی و تخمیر زیتون، تعدادی در مرحله 8 ماه اول از آب نمک، تعدادی در مرحله دوم از آب نمک و سرکه و برخی از نمونه‏های زیتون بومی موجود در بازار جداسازی شدند. در جدول 6، منشأ جداسازی هر یک از سویه‏های ‏جداسازی شده نشان داده شده است.

 

جدول 5- گروه بندی واکنش باکتری‏ها در برابر نمک‏های ‏صفراوی براساس زمان تأخیر رشد

گروه

زمان تاخیر رشد

بسیار مقاوم

30-0 دقیقه

مقاوم

60-30 دقیقه

تحمل کننده

90-60 دقیقه

حساس

120-90 دقیقه

بسیار حساس

180-120دقیقه

 

جدول 6- بررسی سویه‏های 4 جدا سازی شده بر اساس نمونه زیتون و روش تلخی‏زدایی

 

نوع زیتون

روش تلخی زدایی

شماره سویه

نوع زیتون

روش تلخی‏زدایی

1

نمونه خریداری شده شیرین

-

15

نمونه خریداری شده شیرین

-

2

ماری

سود

16

ماری سالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

3

روغنی حد واسط

سوزن زنی و آب نمک

17

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

4

زرد

سوزن زنی و آب نمک

18

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

5

ماری

سود

19

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

6

روغنی

سود

20

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

7

نمونه خریداری شده

-

21

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

8

ماری سبز

سوزن زنی و آب نمک

22

نمونه خریداری شده تلخ

آب نمک

9

ماری

سود

23

ماری سالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

10

نمونه خریداری شده شیرین

-

24

ماری سالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

11

ماری سبز

سوزن زنی و آب نمک

25

ماری حد واسط

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

12

نمونه خریداری شده فله‏ای

-

26

ماری سالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

13

روغنی حد واسط

سوزن زنی و آب نمک

27

زرد ناسالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

14

نمونه صنعتی

روش صنعتی

28

ماری سالم

سوزن زنی، آب نمک و سرکه

 

 

از 28 سویه باکتری‏های ‏اسید لاکتیک جداسازی شده، 60 درصد از زیتون ماری، 11 درصد از زیتون روغنی، 4 درصد از زیتون زرد و مابقی از فرآورده‏های زیتون خریداری شده جداسازی شدند. پس از شناسایی اولیه، از آزمون‏های مختلف تخمیر کربوهیدرات‏ها برای شناسایی سویه‏های جداسازی شده استفاده شد.
 بر این اساس، 50 درصد از سویه‏های ‏جداسازی شده به عنوان لاکتوباسیلوس پلانتاروم شناسایی شدند که نتایج آن در جدول 7 آورده شده است. 67/46 درصد سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده از زیتون ماری، 20 درصد از زیتون روغنی و 67/26 درصد از فرآورده‏های ‏زیتون خریداری شده جداسازی شدند.

 

 

جدول 7- نتایج آزمون‏های ‏بیوشیمیایی و بررسی رشد سویه‏های جداشده از زیتون و فرآورده‏های تخمیری آن

شماره سویه

تخمیر قندها

رشد در 15 درجه

رشد در 45 درجه

هیدرولیز ژلاتین

باکتری شناسایی شده

گالاکتوز

سالیسین

د-سوربیتول

مانوز

تره هالوز

رافینوز

سلوبیوز

ریبوز

لاکتوز

1

-

-

-

-

+

+

+

-

+

+

-

+

unknown

2

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

3

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum

ATCC8014

5

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

6

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

7

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

8

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

10

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

12

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

13

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

20

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

21

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

22

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum ATCC8014

23

+

+

+

-

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum ATCC8014

25

+

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum

26

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

+

Lactobacillus plantarum LRV1

 

با توجه به اثبات خاصیت پروبیوتیکی لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده از زیتون در مطالعات قبلی، در این پژوهش علاوه بر روش‏های بیوشیمیایی، از روش‏های مولکولی نظیر PCR و RFLP برای شناسایی لاکتوباسیلوس پلانتاروم در بین سویه‏های جدا شده از زیتون بومی ایران استفاده شد. برای این منظور ابتدا استخراج DNA از نمونه‏های رشد کرده بر روی محیط کشت MRS آگار انجام شد. سپس، انواع روش‏های PCR مانند PCR با افزایش دما و PCR نیمه آشیانه ای[30] بر روی DNA استخراج شده، با پرایمر‏های اختصاصی طراحی شده برای لاکتوباسیلوس پلانتاروم انجام شد. هفت سویه 1، 6، 10، 12، 21، 9 و 16 تشکیل باند دادند که پنج سویه ی اول باند قوی و دو سویه ی 9 و 16 باند ضعیف تشکیل دادند. نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR با افزایش دما با پرایمرهای Flplan و R2lplan در شکل 1 نشان داده شده است.

 

 

شکل 1- نتایج حاصل از الکتروفورز محصولات PCR با افزایش دمای تعدادی از سویه‏ها با پرایمر Flplan و R2lplan بر روی ژل آگاروز یک درصد، از لدر 50 جفت بازی استفاده شده است. ستون 1: سویه 1، ستون 2: سویه 16، ستون 3: سویه 21، ستون 4: سویه 6، ستون 5: سویه 9، ستون 6: سویه 10، ستون 7: سویه 12

تکرارهای متوالی و تغییر شرایط PCR با هدف باند گرفتن از سویه‏های دیگر انجام شد ولی سویه‏های دیگر باند ندادند. برای مشاهده کردن باند اختصاصی در تعداد بیشتری از سویه‏ها، علاوه بر پرایمرهای قبلی از جفت پرایمر اقتباسی نیز استفاده شد. با این جفت پرایمر سویه شماره 5 باند قوی و سویه شماره 9 باند ضعیف تشکیل داد.

در ادامه روش RFLP بر روی DNA تکثیر شده، انجام شد. به این شکل که محصولات حاصل از PCR با آغازگرهای طراحی شده از هفت سویه 1، 6، 9، 10، 12، 16، 21 و سویه استاندارد، با آنزیم‏های محدودگر TaqI و Hae III به طور جداگانه هضم شدند. نتیجه الکتروفورز محصولات PCR هضم شده با آنزیم Hae III در ژل یک درصد در شکل 2 نشان داده شده است.

 

 

شکل 2- نتایج RFLP محصولات PCR هضم شده با آنزیمHaeIII ستون M: لدر bp50، ستون 1: سویه 1، ستون 2: سویه 16،
ستون 3: سویه 21، ستون 4: سویه 6، ستون 5: سویه 9،
ستون 6: سویه 10، ستون 7: سویه 12

 

محصول PCR یکی از نمونه‏ها (شماره 21) با هر دو آغازگر مربوطه تعیین توالی شد. توالی‏های ‏استخراج شده از کروماتوگرام‏های ‏حاصل از آغازگرهای رفت و برگشت، ابتدا اصلاح شد. برای آن که بتوان ترادف نهایی قطعه تکثیر شده را پیدا کرد باید هردو ترادف استخراج شده از توالی‏یابی با دو آغازگر رفت و برگشت به شکل رفت در بیایند. بدین منظور با استفاده از نرم افزار آنلاین موجود در اینترنت‏ (سایت بیوانفورماتیک[31]) ترادف R2lplan به صورت مکمل و برگشت شده در آمد. سپس، به منظور تصحیح توالی‏های ‏ابتدایی و انتهایی، هر دو ترادف رفت با هم مقایسه شد و نقاط مشترک که در انتهای ترادف Flplan و ابتدای ترادف R2lplan است تصحیح شد. بدین منظور دو ترادف در سایت [32] NCBI مقایسه شد و نتیجه با کروماتوگرام و توالی‏های استخراج شده مقایسه شد. ترادف صحیح در قسمت مشترک مد نظر قرار گرفت و دو قطعه‏ رفت از محل مشترک به هم متصل شد. پس از تصحیح و چسباندن دو قطعه‏ رفت به هم ترادفی حاصل می‏‏شود که در وسط هیچ خطایی ندارد. اما در دو انتها به علت مشکلات ترادف یابی ممکن است دچار خطا باشد. تعدادی از نوکلئوتید‏های ابتدایی و انتهایی این ترادف 1518 نوکلئوتیدی با مراجعه به کروماتوگرام و بررسی مجدد پیک‏ها و همچنین با بلاست کردن ترادف 1518 تایی با باکتری‏های راسته لاکتوباسیلال ها[33] حذف شد و ترادف 1435 نوکلئوتیدی به وجود آمد که توالی آن در جدول 8 آورده شده است.

 

 

جدول 8- ترادف 1435 نوکلئوتیدی نهایی حاصل از تعیین توالی محصول PCR سویه 21

 

 

 

 ترادف1435 نوکلئوتیدی در سایت NCBI با باکتری‏های راسته‏ لاکتوباسیلال بلاست شد. نتایج گویای آن است که ترادف حاصل با سویه‏های Lactobacillus plantarum همولوژی بالا دارد:

Max ident= 99 percent

Quary coverage= 96 percent

.بررسی مقاومت به اسید و صفرا: پس از رویارویی سویه‏های ‏جداسازی شده در برابر نمک‏های ‏صفراوی و شرایط اسیدی، مقاومت سویه‏ها پس از سه بار تکرار بررسی شد. نتایج در جدول 9 نشان داده شده است.

 

جدول 9- واکنش سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده در برابر نمک‏های ‏صفراوی و شرایط اسیدی

شماره سویه

واکنش به صفرا

واکنش به اسیدیته 2

واکنش به اسیدیته 3

1

تحمل کننده

نیمه مقاوم

نیمه مقاوم

2

تحمل کننده

مقاوم

بسیار مقاوم

3

مقاوم

مقاوم

بسیار مقاوم

5

مقاوم

بسیار مقاوم

مقاوم

6

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

مقاوم

7

مقاوم

نیمه مقاوم

نیمه مقاوم

8

مقاوم

مقاوم

نیمه مقاوم

10

بسیار مقاوم

مقاوم

مقاوم

12

بسیار مقاوم

مقاوم

مقاوم

13

مقاوم

نیمه مقاوم

مقاوم

20

مقاوم

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

21

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

22

مقاوم

مقاوم

بسیار مقاوم

25

تحمل کننده

مقاوم

بسیار مقاوم

26

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

بسیار مقاوم

28

بسیار مقاوم

حساس

حساس

.

بررسی اثر مهاری: پس از سه بار تکرار هر آزمون، قطر هاله‏های عدم رشد ایجاد شده هر پاتوژن در برابر هر یک از سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده بر حسب میلی متر اندازه گیری شد (شکل‏های 3 و 4). شکل‏های 5 و 6 به ترتیب نمودار میانگین سه بار تکرار قطر هاله عدم رشد اشریشیا کلی و شیگلا دیسانتری هر سویه را با دو روش انتشار از چاهک و انتشار از دیسک نشان می‏دهد و در جدول 10 نتایج آمار توصیفی قطر هاله عدم رشد باکتری‏های ‏اشریشیاکلی و شیگلا دیسانتری با دو روش انتشار از دیسک و چاهک در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده بر حسب میلی متر نشان داده شده است.

نتایج نشان می‏‏دهند که سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم دارای اثر مهاری بر روی اشریشیا کلی و شیگلادیسانتری هستند.

 

 

 

 

شکل 3- اثر مهاری سویه‏های جداسازی شده در برابر پاتوژن شاخص گرم منفی اشریشیا کلی در روش انتشار از چاهک

 

 

شکل 4- اثر مهاری سویه‏های جداسازی شده در برابر پاتوژن شیگلا دیسانتری

 

 

 

شکل 5 - نمودار مقایسه میانگین سه بار تکرار قطر هاله عدم رشد اشریشیا کلی در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده با دو روش انتشار از دیسک و چاهک

 

شکل 6 - نمودار مقایسه میانگین سه بار تکرار قطر هاله عدم رشد شیگلا دیسانتری در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده با دو روش انتشار از دیسک و چاهک

 

 

نتایج جدول 10 نشان می‏دهد که شیگلا دیسانتری در روش انتشار از چاهک با میانگین
69373/3 ±6260/10 میلی‏متر دارای بیش‏ترین حساسیت در برابر سویه های لاکتوباسیلوس پلانتاروم است و اشریشیا کلی با روش انتشار از دیسک با میانگین 76249/1 ±5/6 میلی‏متر کمترین حساسیت را به باکتری‏های ‏یاد شده نشان می‏دهد.

تحلیل واریانس یک طرفه نشان می‏دهد که به جز شیگلا دیسانتری در حالت انتشار از دیسک، اختلاف معناداری میان قطر هاله عدم رشد سویه‏های ‏بیماری‏زای مورد بررسی در مقابل سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم
 وجود دارد‏ (جدول 11، P value<0.01).

ضرایب همبستگی پیرسون در بررسی دو به دو نمونه‏ها نیز نشان داد که تنها درمورد شیگلا دیسانتری اختلاف معناداری در سطح 99 درصد میان استفاده از دو روش انتشار از دیسک و انتشار از چاهک وجود دارد. پس از تأیید وجود اختلاف بین هاله عدم رشد سویه‏های ‏پاتوژن در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم در آزمون تحلیل واریانس یک طرفه، به منظور بررسی دقیق‏تر بین سویه‏ها از آزمون تعقیبی LSD استفاده شد. خلاصه مهم‏ترین نتایج به دست آمده از این آزمون در جدول 12 نشان داده شده است.

 

 

جدول10- نتایج آمار توصیفی قطر هاله عدم رشد باکتری‏های ‏پاتوژن مورد بررسی در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده

انحراف معیار

میانگین‏ (میلی‏متر)

حداکثر

حداقل

تعداد

پاتوژن

75957/2

0417/10

16

5

48

اشریشیا کلی چاهک

76249/1

5/6

10

5

48

اشریشیا کلی دیسک

69373/3

625/10

20

5

48

شیگلا دیسانتری چاهک

26756/2

0833/7

12

5

48

شیگلا دیسانتری دیسک

 

جدول 11- مقایسه میانگین قطر هاله عدم رشد سویه‏های ‏پاتوژن در برابر سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم از طریق تحلیل واریانس یک طرفه‏ (ANOVA)

درجه اطمینان

F

میانگین مربعات

درجه آزادی

مجموع مربعات

 

000/0

229/14

750/20

15

250/311

بین گروه ها

اشریشیا کلی چاهک

 

 

458/1

32

667/46

داخل گروه ها

 

 

 

47

917/357

مجموع

000/0

096/4

400/6

15

000/96

بین گروه ها

اشریشیا کلی دیسک

 

 

563/1

32

000/50

داخل گروه ها

 

 

 

47

000/146

مجموع

000/0

076/8

817/33

15

250/507

بین گروه ها

شیگلا دیسانتری چاهک

 

 

188/4

32

000/134

داخل گروه ها

 

 

 

47

250/641

مجموع

098/0

714/1

178/7

15

667/107

بین گروه ها

شیگلا دیسانتری دیسک

 

 

188/4

32

000/134

داخل گروه ها

 

 

 

47

667/241

مجموع

 

جدول 12- معرفی مؤثرترین و بی‏اثرترین سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده در برابر پاتوژن‏های ‏مورد بررسی با مقایسه میانگین سه بار تکرار اندازه قطر هاله عدم رشد (بر حسب میلی متر) با استفاده از آزمون تعقیبی LSD

حداقل قطر هاله عدم رشد/میلی‏متر

بی اثرترین سویه ها

حداکثر قطر هاله عدم رشد/میلی‏متر

موثرترین سویه ها

پاتوژن مورد بررسی

0± 000/5

7 و 20 و22 و 26

57735/0 ± 3333/9

21 و 25

شیگلا دیسانتری دیسک

0± 000/5

5 و 22

04145/4 ± 3333/16

2

شیگلا دیسانتری چاهک

0± 000/5

1 و 2 و 20 و 22

57735/0 ± 3333/9

3 و 5

اشریشیا کلی دیسک

0± 000/5

20

1547/1 ± 6667/14

26

اشریشیا کلی چاهک

 


.بحث و نتیجه‏‏ گیری

افزایش بیماری‏ها و مسمومیت‏های ناشی از غذا به همراه مشکلات اقتصادی و اجتماعی حاصل از آن سبب گسترش مطالعات در زمینه تولید غذای سالم و به‏کار گیری ترکیبات ضدمیکروبی جدید شده است.

اسانس‏های حاصل از گیاهان و باکتریوسین‏های حاصل از باکتری‏های پروبیوتیک (به ویژه گونه‏های مختلف لاکتوباسیلوس‏ها) واجد آثار ضد میکروبی شناخته شده‏ای هستند که می‏توانند در جهت کنترل و جلوگیری از رشد باکتری‏های پاتوژن و عامل فساد منتقل شونده از مواد غذایی به جای نگهدارنده‏های شیمیایی و مصنوعی استفاده شوند (6).

بر طبق گزارش سازمان جهانی بهداشت و غذا[xxxiv] باکتری‏های لاکتیک اسید دارای تاریخچه ی طولانی در فرآورده‏های تخمیری هستند و به طور طبیعی ساکن لوله گوارشی انسان می‏باشند‏ (21). این باکتری‏ها به علت‏ ایجاد آثار مثبت در روند سلامتی افراد دارای اهمیت هستند‏ (14). ممانعت از فعالیت پاتوژن‏ها توسط پروبیوتیک‏ها می‏تواند تأثیر مهمی در سلامتی فرد در مقابل عفونت با پاتوژن‏های شایع دستگاه گوارش‏ داشته باشد‏ (5 و 29). در واقع امروزه پروبیوتیک‏ها به عنوان عوامل مدیریتی عفونت‏های روده‏ای شناخته شده‏اند. آن‏ها با مکانیسم‏های متعددی شامل ترشح مواد ضدمیکروبی و آثار آنتاگونیستی با پاتوژن‏ها در اتصال به جایگاه‏ها و کلونیزاسیون در سطوح مخاطی روده که به رقابت در کسب مواد غذایی و تکثیر بین پروبیوتیک و پاتوژن منجر می‏شود، فعالیت می‏کنند. این باکتری‏ها با آثار باور[xxxv] بر افزایش تولید آنتی بادی، تحریک پاسخ ایمنی ترشحی یا عمومی، حذف رقابتی، تغییر شرایط دستگاه گوارش با تاثیر بر روی اسیدیته، تولید اسید‏های چرب زنجیرکوتاه و تولید باکتریوسین‏ها به‏طوری که برای پاتوژن‏ها مطلوب نباشد، تغییر سایت‏های اتصال توکسین‏ها، تغییر فلور دستگاه گوارش، اتصال به موکوس دستگاه گوارش و جلوگیری از اتصال پاتوژن‏ها برای رقابت در کسب مواد غذایی باعث جلوگیری از عفونت‏های دستگاه گوارش می‏شوند‏ (6). نتیجه این واکنش‏ها تعدیل سیستم ایمنی و سودمندی مجموعه‏ پروبیوتیک‏ها بر سلامتی میزبان است (29). اگرچه این آثار با نتایج مشهود از آزمایش‏های ‏متعدد در شرایط آزمایشگاه و مطالعات حیوانی تأیید شده است ولی تاکنون بیشتر توصیه‏های پزشکی ثبت شده در استفاده از پروبیوتیک‏ها همراه با مشکلات و عوارض‏ گوارشی مانند عدم تحمل لاکتوز، اسهال ناشی از مصرف آنتی‏بیوتیک‏ها و اسهال‏های باکتریایی و ویروسی بوده است. افزون بر این، اساس مطالعات کلینیکی بر روی پروبیوتیک‏ها به عنوان یک روش جدید در درمان بیماری‏های آلرژی به ویژه در کودکان و در درمان و جلوگیری از بیماری‏های التهابی روده بوده است. البته لازم است یادآوری شود که تمام سویه‏های اسید لاکتیک آثار پروبیوتیکی از خود نشان نمی‏دهند. مقایسه مستقیم سویه‏ها، گونه‏ها و جنس‏ها به ندرت انجام گرفته است و تعمیم آثار پروبیوتیک‏ها در سطح جنس و گونه غیر ممکن است. بنابراین در این پژوهش، از بین خواص پروبیوتیکی، خواص ضدمیکروبی سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده از زیتون بومی ایران بررسی شده است و همانگونه که در ادامه بیان خواهد شد، تفاوت چشمگیر حتی بین خواص ضدمیکروبی سویه‏های ‏مختلف یک گونه در برابر یک نوع پاتوژن وجود دارد.

با استفاده از روش‏های فنوتیپی و ژنوتیپی باکتری‏های مولد اسید لاکتیک جدا شده از انواع مواد غذایی شامل لبنیات، سبزیجات، میوه‏ها، غذاهای فرآوری شده و نوشیدنی‏های تخمیری شناسایی شده‏اند ‏‏(8- 12، 17، 22، 24، 25 و 27). در ایران نیز تاکنون مطالعات متنوعی بر روی جداسازی باکتری‏های ‏مولد اسید لاکتیک از منابع مختلف و بررسی خواص پروبیوتیک آن‏ها انجام شده است. نوروزی[xxxvi] و همکاران در سال1380، 16 لاکتوباسیل مختلف را از فرآورده‏های ‏لبنی شهر تهران جداسازی و و شناسایی کردند و نشان دادند که این باکتری‏ها دارای خاصیت ضدمیکروبی در برابر سوموموناس آئروژینوز[xxxvii]ا، استافیلوکوکوس اورئوس[xxxviii]، اشریشیا کلی، سالمونلا انتریکا‏موریوم[xxxix]، باسیلوس سوبتیلیس[xl] و باسیلوس سرئوس[xli] هستند. 25 درصد از لاکتوباسیلوس‏های ‏جداسازی شده در این مطالعه لاکتوباسیلوس پلانتاروم بوده است‏ (8). در سال 1386 تاج آبادی ابراهیمی[xlii] و همکاران ویژگی‏های پروبیوتیکی لاکتوباسیلوس‏های ‏جداسازی شده از محصولات لبنی تخمیری لیقوان رابررسی و 56 ایزومر باکتری اسید لاکتیک متحمل شرایط اسیدی را جداسازی کردند که 48 سویه جنس لاکتوباسیلوس شناسایی شد و مقاومت به اسید و صفرای این باکتری‏ها ارزیابی شد. از این تعداد 18 سویه توانایی جذب کلسترول را نیز داشتند. نتایج به دست آمده از این پژوهش نشان می‏دهد پنیر و ماست لیقوان دارای پتانسیل پروبیوتیکی هستند‏ (9). لطفی[xliii] و همکاران در 1389 باکتری‏های ‏با پتانسیل پروبیوتیکی را از محصولات لبنی و سراب جدا کردند. در این مطالعه برای شناسایی مولکولی سویه‏ها از آغازگرهای اختصاصی ژن
16S rDNA استفاده و 15 سویه لاکتوباسیلوس به عنوان فلور میکروبی طبیعی در محصولات لبنی این مناطق گزارش شد (17). در پژوهشی که در کشور ترکیه در سال 2003 انجام شده است باکتری‏های مولد اسید لاکتیک شامل 113 نوع باکتری کروی و 21 نوع لاکتوباسیل که به عنوان استارتر در تولید پنیر کاربرد دارند با روش‏های غیر مولکولی و روش‏های مولکولی با استفاده از بررسی توالی 16S rDNA و RFLP-PCR با آنزیم‏های TaqI و Hae III، شناسایی شدند‏ (10). در بین گونه‏های ‏مختلف باکتری‏های ‏اسید لاکتیک، Lactobacillus plantarum نقش مهمی در تخمیر و فرآوری زیتون ایفا می‏‏کند و به عنوان یک پروبیوتیک از اهمیت ویژه‏ای برخوردار است (15 و 20). در بین همه باکتری‏های اسید لاکتیک جدا شده از زیتون در الجزیره، پرتغال، اسپانیا و ایتالیا گونه لاکتوباسیلوس پلانتارومگونه غالب معرفی شده است، هر چند گونه‏های ‏لاکتوکوکوس لاکتیس[xliv] و گونه‏های ‏انتروکوکوس[xlv] در الجزیره‏ (15)، و گونه‏های ‏لوکونوستوک مزنتروئیدس[xlvi] و دیگرگونه‏های ‏لوکونوستوک[xlvii] ، انتروکوکوس فاسیوم[xlviii] و لاکتوباسیلوس کازئی[xlix] نیز جزو سایر موارد شناسایی شده در اسپانیا و ایتالیا بودند‏ (14 و 22).

با توجه به موارد یاد شده سویه‏های
Lactobacillus plantarum که از زیتون ایران جداسازی و شناسایی شده‏اند ‏‏می‏‏توانند به عنوان پروبیوتیک‏های بالقوه در نظر گرفته شوند. حضور این باکتری‏ها در محصولات فرآوری شده زیتون، ارزش غذایی محصول را بالا می‏برد و در کنار زیتون که سرشار از مواد مغذی است خواص ارزشمند پروبیوتیکی را به محصول اضافه می‏‏کند.

در این پژوهش، پس از جداسازی اولیه سویه‏های ‏باکتری‏های ‏اسید لاکتیک از زیتون بومی ایران، علاوه بر روش‏های بیوشیمیایی، از روش‏های مولکولی نظیر PCR و RFLP برای شناسایی لاکتوباسیلوس پلانتاروم استفاده شد. پس از انجام PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی گونه و هضم آنزیمی آن، الگوی باندی تشکیل شده در الکتروفورز محصولات هضم آنزیمی، در هفت سویه یاد شده و سویه استاندارد، شبیه هم بودند‏ (شکل 2). این نتایج بیانگر آن است که سویه‏های 1، 6، 10، 12 و 21 کاملاً مشابه همدیگر هستند و تفاوت‏های ژنتیکی در آن‏ها در سطح این دو آنزیم به چشم نمی‏خورد. از طرفی می‏‏توان گفت برای آن که تفاوت بین سویه‏ها به خوبی در عمل RFLP آشکار شود نیاز به استفاده از تعداد بیشتری آنزیم با اثر محدود است و دو آنزیم استفاده شده کافی نیستند. مقالات مختلف بیان می‏‏دارد در روش RFLP گاهی از دو آنزیم Taq I و Hae III (10) و گاهی از دو آنزیم Acc II و Hae III (11) استفاده شده است، در صورتی که در بعضی پژوهش‏ها از سه آنزیم Acc II , Hae III, Alu I (27)، سه آنزیم Acc II, Hae III, Msp I (11) و یا سه آنزیم Mbo I, Hha I, Hinf I (28) استفاده شده است. استفاده از تعداد آنزیم بیشتر می‏‏تواند تفاوت بین سویه‏ها را بهتر آشکار سازد.

با بررسی نتایج مربوط به تعیین توالی محصول PCR سویه 21 با هر دو آغازگر مربوطه و بلاست ترادف نهایی 1435 نوکلئوتیدی که در سایت NCBI با کد lcl|4417 نام‏گذاری شده است می‏توان با اطمینان گفت سویه 21 که برای توالی‏یابی انتخاب شد یکی از سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم است. از مجموع PCRهای انجام شده مشخص شد که سویه‏های شماره 1، 6، 10 و 12 باندهایی مشابه سویه 21 و نمونه استاندارد لاکتوباسیلوس پلانتارومسویه 174S [l] تشکیل دادند. از نظر ریخت شناسی سویه‏های یاد شده (1، 6، 10، 12، 21) و سویه استاندارد باسیلی شکل هستند. بر اساس این یافته‏ها می‏توان نتیجه گرفت که سویه‏های 1، 6، 10، 12 و 21 قطعاً از گونه‏ لاکتوباسیلوس پلانتاروم هستند. این باکتری از نمونه‏های زیتون سایر نقاط دنیا از جمله الجزایر، اسپانیا، ترکیه و ایتالیا نیز جدا شده است و یافته‏های این پژوهش با نتایج یاد شده در منابع مختلف هم خوانی دارد.

ریخت‏شناسی سویه‏های 9 و 16 کوکوباسیل تشخیص داده شد که با سویه استاندارد و سویه شماره 21 (باسیل) متفاوت است. همچنین، باند ایجاد شده در واکنش PCR ضعیف‏تر از باند سویه‏های 1، 6، 10، 12 و 21 بود. بنابراین، در مورد این سویه‏ها نمی‏توان به طور قطع اظهار نظر کرد. علت این‏که سویه‏های دیگر در PCR تشکیل باند ندادند و در مورد هویت آن‏ها نمی‏توان اظهار نظر کرد آن است که آغازگرهای به کار رفته، نتوانستند به توالی هدف متصل شوند. ممکن است آغازگرهای به‏کار رفته برای 16S rRNA برای آن سویه مناسب نباشد یا اینکه امکان ایجاد پلی مورفیسم در ناحیه اتصال آغازگرها وجود دارد. نتایج مولکولی به دست آمده در این پژوهش با نتایج بیوشیمیایی‏ (آزمون تخمیر قند‏ها) هم‏خوانی دارد. آزمون تخمیر قند‏های سویه‏هایی که به عنوان لاکتوباسیلوس پلانتاروم تشخیص داده شدند تأیید کننده این مطلب است.

در این پژوهش با هدف بررسی خواص ضدمیکروبی به عنوان یکی از ویژگی‏های یک پروبیوتیک، میزان اثر ضدمیکروبی لاکتوباسیلوس پلانتاروم‏های ‏جداسازی شده بر روی برخی پاتوژن‏های شایع دستگاه گوارش ارزیابی شد‏ (2). توانایی باکتری‏های ‏اسید لاکتیک برای تولید اسید (30) و ترکیبات ضدمیکروبی از دیرباز برای نگهداری مواد غذایی مورد استفاده بوده است. تخمیر مواد غذایی توسط باکتری‏های ‏اسید لاکتیک مقدار کربوهیدرات‏های در دسترس را کاهش می‏دهد و به تولید انواعی از مولکول‏های با جرم مولکولی پایین منجر می‏‏شود که این ترکیبات فعالیت ضدمیکروبی از خود نشان می‏دهند‏ (6 و 30). از جمله این مواد می‏‏توان اسیدهای آلی نظیر: اسید لاکتیک (29 و 30)، اسید استیک، اسید پروپیونیک، پراکسید هیدروژن، دی اکسید کربن، دی استیل، ترکیبات با وزن مولکولی پایین نظیر: رئوترین و رئوتری سیکلین توسط لاکتوباسیلوس روتری[li]، 2-پیرولیدون -5- کربوکسیلیک اسید توسط استرپتوکوکوس بوویس[lii]، لاکتوباسیلوس کازئی زیرگونه سودوپلانتاروم[liii]، لاکتوباسیلوس کازئی زیرگونه کازئی[liv] و باکتریوسین‏ها نظیر نایسین[lv] و پلانتاریسین[lvi] را نام برد‏ (29). به تازگی کشت‏های آغازگر جدیدی از باکتری‏های اسید لاکتیک با مزایای کاربردی مهم در صنعت توسعه یافته‏اند ‏‏(19).

نتایج حاصل از پژوهش حاضر نشان می‏‏دهد که سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جدا شده دارای آثار ضدمیکروبی چشمگیری بر روی این پاتوژن‏های شایع می‏‏باشند. همانگونه که در جدول 12 نشان داده شده است، در مورد باکتری اشریشیا کلی در روش انتشار از چاهک، سویه 26 با میانگین 15470/1 ± 6667/14 میلی‏متر دارای بیش‏ترین خاصیت ضدمیکروبی است. این سویه در برابر نمک‏های ‏صفراوی بسیار مقاوم و نسبت به شرایط اسیدی در اسیدیته‏های ‏برابر 2 و 3 نیز بسیار مقاوم است‏ (جدول 9) و قابلیت استفاده به عنوان پروبیوتیک را دارد. در روش انتشار از دیسک، بیش‏ترین خاصیت ضدمیکروبی در برابر اشریشیا کلی به سویه‏های ‏3 و 5 با میانگین 57735/0 ± 3333/9 میلی‏متر متعلق است. این دو سویه نیز دارای مقاومت بالایی نسبت به صفرا و شرایط اسیدی هستند و می‏توانند به عنوان پروبیوتیک مصرف شوند. با توجه به این که میزان تلقیح سویه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده در هر چاهک دو برابر هر دیسک است، تفاوت در میانگین قطر هاله عدم رشد مشاهده شده در این روش قابل پیش‏بینی است.

در مورد باکتری شیگلا دیسانتری در روش انتشار از چاهک سویه 2 با میانگین قطر هاله عدم رشد
 04145/4 ± 33333/16 میلی‏متر، سویه 28 با میانگین 21455/3 ± 3333/15 میلی‏متر و سویه 6 با میانگین 52753/1 ± 33333/13 میلی‏متر دارای رتبه‏های ‏اول تا سوم هستند. با توجه به الگوی مقاومت به اسید و صفرا‏ (جدول 9) سویه 6 گزینه مناسب‏تری برای انتخاب به عنوان پروبیوتیک است. در روش انتشار از دیسک، سویه‏های ‏21 و 25 با میانگین 33333/9 میلی‏متر دارای بیش‏ترین خاصیت ضدمیکروبی هستند که سویه 21 با توجه به این که در مقابل نمک‏های ‏صفراوی و شرایط اسیدی بسیار مقاوم است ترجیح داده می‏شود.

با توجه به این که لاکتوباسیلوس پلانتاروم نقش مهمی در تخمیر و فرآوری زیتون ایفا می‏‏کند و به عنوان یک پروبیوتیک از اهمیت ویژه ا ی برخوردار است‏ (16، 20 و 24)، بنابراین سویه‏های لاکتوباسیلوس پلانتاروم جداسازی شده از زیتون بومی ایران می‏‏توانند به عنوان پروبیوتیک‏های بالقوه در نظر گرفته شوند. حضور این باکتری‏ها در محصولات فرآوری شده زیتون، ارزش غذایی محصول را بالا برده وخواص ارزشمند پروبیوتیکی را به محصول اضافه می‏‏کند. این مطالعه می‏تواند نخستین گزارش در مورد باکتری‏های اسید لاکتیک و پروبیوتیک جدا شده از زیتون ایران را ارایه دهد که با نتایج سایر کشور‏ها همخوانی دارد‏ (13- 16، 19، 20 و 22). هرتادو[lvii] و همکاران در سال2012 گونه‏های ‏لاکتوباسیلوس پلانتاروم و لاکتوباسیلوس پنتوسوس[lviii] را به عنوان گونه‏های ‏غالب در تخمیر زیتون معرفی کردند‏ (13).

با توجه به نتایج این پژوهش می‏توان ادعا کرد که استفاده از باکتری‏های لاکتیک اسید از جمله لاکتوباسیلوس پلانتاروم به عنوان پروبیوتیک می‏تواند دارای اثر درمانی و پیشگیری کننده در عفونت‏های روده‏ای ناشی از اشریشیا کلی و شیگلا دیسانتری باشد. هر چند که وسعت بخشیدن به طیف ضدمیکروبی پروبیوتیک‏ها مستلزم پژوهش و بررسی‏های بیشتری است.

.تشکر و قدردانی

این مقاله برگرفته از نتایج طرح پژوهشی "جداسازی باکتری‏های مولد اسید لاکتیک به عنوان پروبیوتیک از میوه زیتون بومی و فرآورده‏های آن در ایران و بررسی خواص ضد میکروبی آن‏ها" اجرا شده در دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان است. نویسندگان مقاله لازم می‏دانند از معاونت پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد فلاورجان، همچنین، دکتر کهین شاهانی پور، دکتر علی محمد احدی، خانم‏ها شادی شاهسار مهسا شفیقی و طاهره اسماعیلی برای همکاری در انجام مراحل مختلف این پژوهش، تشکر وقدردانی کنند.

 



[1]- Lactic acid bacteria‏ (LAB)

[2]- Lactobacillus plantarum

[3]- Polymerase Chain Reaction- Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

[4]- Microbiota

[5]- Entrobacteriaceae

[6]- Escherichia coli PTCC1399

[7]- Shigella dysenteriae PTCC1188

[8]- Randazzo

[9]- Lavermicocca

[10]- Man- Rogosa Sharpe Agar

[11]- Primer

[12]- Internal Transcribed Spacer‏ (ITS)

[13]- Touch up PCR

[14]- Forward

[15]- Reverse

[16]- Nested PCR

[17]- Bulut

[18]- Touch up PCR

[19]- Restriction Fragment Length Polymorfism

[20]- Loading buffer

[21]- Brain Heart Infusion Broth

[22]- Man- Rogosa Sharpe Broth

[23]- Optical Density

[24]- McFarland standard

[25]- Tryptic Soy Broth

[26]- Mueller Hinton Agar

[27]- ANOVA

[28]- Colony forming unit/milliliter‏ (cfu/ml)

[29]- Oxgall

[30]- Semi Nested PCR

[31]- Bioinformatics

[32]- http://www.ncbi.nlm.nih.gov

[33]- Lactobacillales

[xxxiv]- Food and Agricultural Organization-World Health Organization ‏(FAO/WHO)

[xxxv]- Adjuvant

[xxxvi]- Noroozi

[xxxvii]- Pseudomonas aeruginosa

[xxxviii]- Staphylococcus aureus

[xxxix]- Salmonella entericamurium

[xl]- Bacillus subtilis

[xli]- Bacillus cereus

[xlii]- Tajabadi Ebrahimi

[xliii]- Lotfi

[xliv]- Lactococcus lactis

[xlv]- Enterococcus spp.

[xlvi]- Leuconostoc mesenteroides

[xlvii]- Leuoconostoc spp.

[xlviii]- Enterococcus faecium

[xlix]- Lactobacillus casei

[l]- Lactobacillus plantarum 174S

[li]- Lactobacillus reuteri

[lii]- Streptococcus bovis

[liii]- L. casei ssp. psudoplantarum

[liv]- L. casei ssp. casei

[lv]- Nisin

[lvi]- Plantaricin

[lvii]- Hurtado

[lviii]- Lactobacillus pentosus

  

(1)             Sanders ME. Considerations for use of probiotic bacteria to modulate human health. The Journal of Nutrition 2000; 130‏ (2): 384- 90.

(2)             Reid G., Burton J. Use ofLactobacillus to prevent infectionby pathogenic bacteria. Microbes and Infection 2002; 4‏ (3): 319- 24.

(3)             Centers for Disease Control and Prevention. Preliminary FoodNet data on the incidence of foodborne illnesses--selected sites, United States. MMWR. Morbidity and Mortality Weekly Report 2003; 52‏ (15): 340- 43.

(4)             Vejdani R., Zali MR. Probiotics and their mechanism of action in the prevention and treatment of human diseases Journal of Research in Medical Science 2003; 72‏ (4): 319- 30. [In Persian].

(5)             Saavedra J. Probiotics and infectious diarrhea. The American Journal of Gastroenterology 2000; 95 (1 Suppl): S16-18.

(6)             Elmer GV. Probiotics: ‘Living Drugs’. American Journal of Health System Pharmacy 2001; 58‏ (12): 1101- 09.

(7)             Todar K. Lactic Acid Bacteria. In: Todar's online textbook of bacteriology. [Online]. 2009; Available from: http://textbookofbacteriology. net/lactics. html.

(8)             Noroozi J., Savadkoohi R., Jafari Nejad A., Nourbakhsh F. Isolation., Identification and Antimicrobial Activity of Lactobacillus from Dairy in Tehran- 1380. Iranian Journal of Infectious Diseases and Tropical Medicine 2004; 10‏ (28) 2- 6. [In Persian].

(9)             Tajabadi Ebrahimi M., Hejazi M., Anwari A. Probiotic Characterization of Lactobacillus isolated from Lighvan fermented dairy products. Journal of Science Kharazmi Universiiy 2007; 7‏ (3- 4): 941- 52. [In Persian].

(10)         Bulut C. Isolation and molecular characterization of lactic acid bacteria from cheese [dissertation]. Izmir, Turkey: Izmir Institute of Technology; 2003.

(11)           Chen H C., Wang S Y and Chen M J. Microbiological study of lactic acid bacteria in kefir grains by culture-dependent and culture-independent methods. Food Microbioly 2008; 25‏ (3): 492- 501.

(12)           Chen Y-S., Yanagida F and Hsu J-S. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from dochi (fermented black beans), a traditional fermented food in Taiwan. Letters in Applied Microbiology 2006; 43‏ (2): 229- 35.

(13)           Hurtado A., Reguant C., Bordons A and Rozès N. Lactic acid bacteria from fermented table olives. Food Microbiology 2012; 31‏ (1): 1- 8.

(14)           Lavermicocca P., Valerio F., Lonigro S L., Gobbetti M., Baruzzi F., Morea M. Olive fermentation using lactic acid bacteria isolated from olive phylloplane and olive brines. IV International Symposum on olive growing. Acta horticulturae 2002; 586: 621- 24.

(15)           Mourad K. Zadi-karam Halima and Karam Nour-Eddine. Isolation of lactic acid bacteria for its possible use in the fermentation of green Algerian olives. Grasas Y Aceites 2004; 55‏ (4): 385- 93.

(16)           Doulgeraki A I., Pramateftaki P., Argyri A., Nychas G-J E., Tassou C C and Panagou E Z. Molecular characterization of lactic acid bacteria isolated from industrially fermented Greek table olives. LWT-Food Science and Technology 2013; 50‏ (1): 353- 56.

(17)           Lotfi H., Hijazi MA., Maleki-Zanjani B., Barzegari A. Isolation, biochemical and molecular identification of bacteria with probiotic potential from dairy products of Harris and Sarab. Journal of Food Research (Agricultural Science) 2010; 3‏ (2): 1- 17. [In Persian].

(18)           Zarkesh Esfahani S H., Shaykh Baygloo N., Emami Karvani Z., Sedighy Khavidak S., Jenab A ., Naghoni A. Novel Drug and Vaccine Delivery Systems. Journal of Isfahan Medical School 2012; 30‏ (196): 972- 80. [In Persian].

(19)           Wouters D., Grosu-Tudor S., Zamfir M and De Vuyst L. Applicability of Lactobacillus plantarum IMDO 788 as a starter culture to control vegetable fermentations. Journal of the Science of Food and Agriculture 2013; 93‏ (13): 3352- 61.

(20)           Doulgeraki A I., Paraskevopoulos N., Nychas G-J E and Panagou E Z. An in vitro study of Lactobacillus plantarum strains for the presence of plantaricin genes and their potential control of the table olive microbiota. Antonie van Leeuwenhoek 2013; 103‏ (4): 821- 32.

(21)           Food and Health Agricultural Organization of the United Nations and World Health Organization (FAO-WHO). Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Washington, DC, 2002.

(22)           Randazzo C L., Ribbera A., Pitino I., Romeo F V and Caggia C. Diversity of bacterial population of table olives assessed by PCR-DGGE analysis. Food Microbiology, 2012; 32‏ (1): 87- 96.

(23)           Markin D., Duek L. Berdicevsky I. In vitro antimicrobial activity of olive leaves. Mycoses 2003; 46‏ (3-4): 132- 6.

(24)           Martinez RC., Wachsman M., Torres NI., LeBlanc JG., Todorov SD., Franco BD. Biochemical, antimicrobial and molecular characterization of a noncytotoxic bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum ST71KS. Food Microbiology 2013; 34‏ (2): 376- 81.

(25)           Ilenys M. Pe´rez-Dı´az. Putative and Unique Gene Sequence Utilization for the Design of Species Specific Probes as Modeled by Lactobacillus plantarum. Current Microbiology 2013; 66‏ (3): 266- 70.

(26)           Murray PR., Rosenthal KS., Pfaller MA. Entrobacteriaceae; In: Medical Microbiology. 5th ed. Philadelphia: Elsevier Mosby; 2006.

(27)           Yanagida F., Chen Y-S., Shinohara T. Isolation and characterization of lactic acid bacteria from soils in vineyards. The Journal of General and Applied Microbiology 2005; 51‏ (5): 313- 18.

(28)           Rafat A M., Scott P T., Trebbin A L. The genetic diversity of lactic acid producing bacteria in the equine gastrointestinal tract. FEMS Microbiology Letters 2005; 248‏ (1): 75- 81.

(29)           Collado MC., Meriluoto J., Salminen S. In vitro analysis of probiotic strain combinationsto inhibit pathogen adhesion to human intestinal mucus. Food Research International 2007; 40‏ (5): 629- 36.

(30)           Sarmast Ghahfarokhi E, Mobini Dehkordi M, Beheshtimaal K. Isolation and evaluation of lactic acid production content in native Lactobacillus of Chaharmahal va Bakhtiari province isolated from dairy products. Biological Journal of Microorganism 2012; 1 (3): 41-52.