جداسازی و شناسایی مولکولی کلستریدیوم بای فرمانتانس از برکه‏ های بی‏ هوازی تصفیه‏ خانه فاضلاب

نوع مقاله: پژوهشی- فارسی

نویسندگان

1 استادیار میکروبیولوژی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران

2 کارشناس ارشد میکروبیولوژی، واحد دامغان، دانشگاه آزاد اسلامی، دامغان، ایران

چکیده

مقدمه: کلستردیوم بای فرمانتانس (Clostridium bifermentans)یک باکتری غیر بیماری‏زاست که نخستین بار توسط تیسیر و مارتلی در سال 1992 جدا‏سازی شد. این باکتری به لحاظ تاکسونومی رابطه خیلی نزدیکی با کلستردیوم سوردیلی دارد و قادر به تولید طیف وسیعی از متابولیت‏ها مانند اسید استیک، اسید لاکتیک، اسید فرمیک، اتانول، بوتانول، استن، کربن‏دی‏اکسید، نیتروژن و به ویژه هیدروژن به عنوان یک منبع انرژی پاک‏ است‏. هدف از این پژوهش‏ جداسازی و شناسایی مولکولیکلستردیوم بای فرمانتانس است‏‏.
مواد و روش‏‏ها: برای جداسازی کلستردیوم بای فرمانتانس، نمونه پساب از استخر بی‏هوازی تصفیه خانه فاضلاب مهدی‏شهر بر روی یک محیط سنتزیکمپلکس کشت داده شده و دردمای محیط وتحت شرایط بی‏هوازی قرار داده شد. از باکتری‏های ‏رشد کرده DNA کروموزومی جدا‏سازی و با کمک پرایمرهای اختصاصی، ژن 16S rRNA آن PCR شد‏. محصول PCR تخلیص و تعیین ترادف بازی شد. در نهایت، برای شناسایی دقیق باکتری جدا شده، ترادف بازی BLAST شد.
نتایج: باکتری جدا شده از نظر ماکروسکوپی بر روی یک محیط کمپلکس کلونی‏ سفید ایجاد کرد و از نظر میکروسکوپی گرم مثبت میله‏ای شکل و اسپردار بود. نتیجه بررسی تعیین ترادف بازی ژن 16S rRNA نشان داد که باکتری جدا شده به گونهکلستریدیوم با ی فرمانتانس متعلق است‏ که در بانک ژن جهانی با نام سویه IRI2 و شماره KC525132 ثبت شد‏.
بحث و نتیجه ‏گیری: در این پژوهش‏ سویه‏ای از کلستردیوم بای فرمانتانس جداسازی، شناسایی فیزیولوژیک و مقایسه مولکولی 16S rRNAشد. با توجه به توانایی این باکتری در تولید فرآورده‏های ‏مختلف صنعتی، از این باکتری می‏توان در تولید هیدروژن به عنوان یک بیوگاز استفاده کرد. 

کلیدواژه‌ها

موضوعات


عنوان مقاله [English]

Isolation and molecular identification of Clostridium bifermentans from anaerobic lagoons of wastewater treatment system

نویسندگان [English]

  • Majid Moghbeli 1
  • Mohammad Reza Shafaati 2
1 Associate Professor of Microbiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
2 M.Sc. of Microbiology, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran
چکیده [English]

Introduction: Clostridiumbifermentansis a non pathogenbacteria and first isolated by Tissier and Martelli in 1992. This bacteria with a view to taxonomy has a close relationship with the Clostridiumsourdilli and is able to produce a wide range of metabolites such as acetic acid, lactic acid, formic acid, ethanol, butanol, acetone, carbon dioxide, nitrogen and specially hydrogen as clean source energy. The aim of this study was to isolate and molecular identify Clostridium bifermentans.
Materials and methods: With aim to isolation of Clostridium bifermentans, the anaerobic wastewater samples from Mahdishahr sewage treatment laggons cultured on asynthetic complex medium and incubated anaerobically at room temperature. Chromosomal DNA isolated from grown bacteria and the 16s rRNA gene amplified with PCR. The PCR product was sequenced and purified.
Results: Isolated bacteria from a macroscopic view on the complex media has white colonies and from a microscopic view was rod-shaped Gram-positive and had spore. of the 16s rRNA gene sequencing, isolated bacteria belong to the species Clostridium bifermentanswhich is called IRI2 strain and were recorded in gene bank with acception number KC525132.
Discussion and conclusion: In this study a strain of Clostridium bifermentans was separated and identified with 16S rRNA sequencing method. With respect to the ability of this bacteria to produce various industrial products, this bacteria is to be used especially for production of hydrogen as biogas.

کلیدواژه‌ها [English]

  • Clostridium bifermentans
  • Wastewater
  • Identification
  • 16SrRNA

مقدمه

کلستردیوم بای فرمانتانس باکتری گرم مثبت بی‏هوازی و دارای تحرک است که نخستین بار توسط تیسیر و مارتلی در سال 1992 جدا‏سازی شد. این ارگانیسم به لحاظ تاکسونومی رابطه خیلی نزدیکی با کلستردیوم سوردیلی دارد (1). در اواخر سال 1962 این گونه به عنوان گونه‏ای جدید از جنس کلستردیوم مشخص شد (2 و 3). کلستردیوم سوردیلی به عنوان یک باکتری بیماری‏زا و کلستردیوم بای‏فرمانتانس به عنوان یک باکتری غیر بیماری‏زا مشخص شده‏اند (4). علاوه بر این، این دو باکتری می‏توانند بر اساس تولید اوره نیز از هم متمایز شوند (3). منبع اصلی این باکتری آب، خاک، فاضلاب، لجن و مدفوع حیوانات است (5). این باکتری قادر به تولید طیف وسیعی از متابولیت‏ها مانند اسید استیک، اسید لاکتیک، اسید فرمیک (6)، اتانول، بوتانول، استن (7)، کربن دی اکسید، هیدروژن و نیتروژن (3 و 8) است. با این حال تا کنون جزئیات بیشتری درباره مسیرهای متابولیکی این باکتری مشخص نشده است. از بارز‏ترین متابولیت‏های این باکتری می‏توان به هیدروژن اشاره کرد. هیدروژن به عنوان یک منبع انرژی پاک است. تبدیل بی‏هوازی توده‏های زیستی یکی از راه‏های دسترسی به این انرژی است. بستر‏های ‏مورد استفاده برای تولید هیدروژن عبارتند از: لجن فعال (9- 11)، زباله (11 و 12)، ملاس نیشکر (13). شیوه‏های ‏متفاوتی تا کنون برای تولید هیدروژن گزارش شده است که یکی از این روش‏ها تولید متان و سولفید هیدروژن در طی فرایند بی هوازی و سپس، تبدیل آن‏ها به هیدروژن است (13 و 14).

تولید مناسب هیدروژن در یک راکتور بی‏هوازی بستگی به روش‏های ویژه‏ای برای جلوگیری از شرکت متابولیت‏های ثانویه در طول واکنش دارد (15). بخش کمی از هیدروژن تولید شده در فاز گازی توسط باکتری‏های اسیدوژنیک و متاژنیک است‏ (11، 16 و 17). لجن فعال موجود در سیستم‏های تصفیه فاضلاب حاوی مواد آلی زیادی است در نتیجه یک بستر بالقوه برای تولید هیدروژن به حساب می‏آید. استفاده از سویه کلستردیوم به ویژه کلستریدیوم بای فرمانتانس برای تولید بیوهیدروژن، دارای بیش‏ترین راندمان و کم‏ترین هزینه است (18- 20). هدف از این مطالعه، جداسازی و شناسایی مولکولی کلستردیوم بای فرمانتانس است‏.

 

.مواد و روش‏ها

نمونه‏گیری: نمونه پساب از برکه بی‏هوازی تصفیه خانه فاضلاب مهدی‏شهر واقع در استان سمنان به وسیله نمونه‏گیر خاص از عمق حدود 2 متر تهیه شد و در ظروف شیشه‏ای استریل در کنار یخ به آزمایشگاه منتقل شد.

محیط کشت و شرایط رشد: برای تهیه محیط کشت ابتدا محلول‏های یاد شده در جدول 1 (21 و 22) تهیه و سپس، 4000 میلی‏لیتر ازمحلول A، 5 میلی‏لیتر از محلول B، 5 میلی‏لیتر از محلول C، 100 میلی‏لیتر از محلول D و 20 میلی‏لیتر از محلول E را با هم مخلوط کرده، میزان 15 گرم در لیتر به آن آگار اضافه کرده و حجم آن با آب مقطر به 5 لیتر رسانده شد. محیط آماده شده در لوله آزمایش به حجم 10 میلی‏لیتر تقسیم و توسط اتوکلاو استریل شد‏.

برای آماده‏سازی نمونه برای کشت، 50 میلی‏لیتر نمونه پساب در 5000 دور در دقیقه به مدت 15 دقیقه سانتریفوژ شده و رسوب به دست آمده در 5/0 میلی‏لیتر سرم فیزیولوژی استریل سوسپانسیون شد‏ و سپس، قبل از این‏که محیط سرد شده و ببندد، کل حجم باکتری‏های سوسپانسیون شده به محیط تلقیح شد. برای ایجاد شرایط بی‏هوازی کامل، از دو روش اضافه کردن پارافین مایع استریل بر روی سطح محیط در درون لوله و روش به‏کار بردن پیروگالول و سود 10 درصد استفاده شد‏. بعد از این که باکتری بر روی سطح شیب‏دار محیط کشت داده شد، یک در پوش پنبه‏ای ‏درون لوله قرار داده و دقیقا تا بالای سطح شیب دار محیط انتقال داده شد. سپس، فضای بین در پوش پنبه‏ای ‏تا سرلوله با کریستال‏های پیروگالول پر شده و 1 میلی‏‏لیتر NaOH 10 درصد به آن اضافه شد‏. درب لوله با درپوش پلاستیکی محکم بسته، لوله سریع بر عکس شده و نمونه‏ها ‏مدت 72 ساعت در دمای 30 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند (23). سپس، از لوله‏های ‏حاوی کدورت بر روی محیط یاد شده درون پلیت به شکل خطی کشت داده و در جار بی‏هوازی در دمای 30 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد‏.


.بررسی ماکروسکوپی و میکروسکوپی کلونی‏‏های ‏خالص: کلونی‏‏های ‏خالص از نظر خواص ماکروسکوپی (شکل ظاهری کلونی‏) نظیر رنگ، اندازه، شکل، مشخصات کناره کلونی‏، برجستگی، ویژگی نوری، بوی کلونی‏ و قوام کلونی‏ و سپس از نظر خواص میکروسکپی با تهیه لام از هر نوع کلونی‏ و رنگ آمیزی گرم و اسپر طبق روش‏های متداول آزمایشگاه میکروبیولوژی بررسی شدند.

.بررسی باکتری‏های جدا شده: با توجه به این‏که هدف انجام این پژوهش‏ جداسازی باکتری کلستردیوم بای فرمانتانس است، آزمون‏‏های بیوشیمیایی مربوطه بر اساس باکتری‏شناسی ‏برجی (24) با انتخاب یک کلونی‏ خالص از باکتری‏های جدا شده انجام شد. بعد از اطمینان از این که باکتری جدا شده یک باسیل گرم مثبت اسپردار بی هوازی مطلق است، از آزمون‏ اوره‏آز و آمین به عنوان آزمون‏ شاخص برای تمایز بین گونه‏های مختلف این باکتری استفاده شد (25).

 

 

جدول 1- مواد لازم برای تهیه محیط کشت (21 و 22)

محلول A

محلول B

محلول C

محلول D

محلول E

25/1 گرم

CaCl2× 2H2O

002/0%

محلول ویتامین B12

3 گرم

Na2EDTA

50/7 گرم

NaHCO3

10 گرم

Na2S. 9H2O

70/1 گرم

KH2PO4

 

 

10/1 گرم

FeSO4. 7H2O

100 میلی‏‏لیتر

آب مقطر

100 میلی‏لیتر

آب مقطر

70/1 گرم

NH4Cl

 

 

190 میلی‏‏گرم

CoCl2. 6H2O

 

 

 

 

70/1 گرم

KCl

 

 

42 میلی‏‏گرم

ZnCl2

 

 

 

 

50/2 گرم

MgSO4

 

 

24 میلی‏‏گرم

NiCl2. 6H2O

 

 

 

 

4000 میلی‏لیتر

آب مقطر

 

 

18 میلی‏‏گرم

Na2MoO4. 2H2O

 

 

 

 

 

 

 

 

300 میلی‏‏گرم

H3BO3

 

 

 

 

 

 

 

 

2 میلی‏‏گرم

CuCl2. 2H2O

 

 

 

 

 

 

 

 

1000 میلی‏‏لیتر

آب مقطر

 

 

 

 

 


.جداسازی DNA ژنومی و شرایط PCR: جداسازی DNA ژنومی باکتری طبق روش چن[1] و همکاران (26) با تغییراتی به این شرح انجام شد. یک کلونی‏ از باکتری مورد نظر در داخل 5 میلی‏‏لیتر محیط کشت مایع تلقیح و به شکل بی‏هوازی به مدت 72 ساعت در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا کدورت مناسب از باکتری ایجاد شود‏‏. باکتری‏ها ‏به‏وسیله سانتریفوژ در 12000 دور در دقیقه و به مدت 3 دقیقه از محلول رویی جدا شده و در 300 میکرولیتر محلول شماره 1 (سوکروز 15درصد، تریس 04/0 مولار، EDTA 002/0 مولار، لیزوزیم 10 میکروگرم در میلی‏‏لیتر و RNAase 5 میکروگرم در میلی‏‏لیتر) سوسپانسیون شد. سپس به مدت 15 دقیقه در 37 درجه سانتی‏گراد قرار داده شده تا آنزیم لیزوزیم دیواره پپتیدوگلیکانی را تجزیه کند. به سوسپانسیون سلولی 600 میکرولیتر محلول شماره 2 (NaOH یک درصد و SDS یک درصد) اضافه و به آرامی هم زده شد تا سلول‏ها کاملا لیز شوند سپس سلول‏های لیز شده یک بار با دو حجم فنل و یک بار با دو حجم کلروفرم عصاره‏گیری شد‏. برای رسوب دادن DNA دو حجم اتانل 99 درصد اضافه و به آرامی هم زده شد تا رسوب DNA تشکیل شود‏‏. رسوب با سانتریفوژ در 12000 دور در دقیقه به مدت 5 دقیقه جدا شده و با اتانل 70 درصد شستشو شد‏ و بعد از خشک شدن آن، در 50 میکرولیتر آب مقطر حل شد‏.

کمیت و کیفیت DNA ژنومی جدا شده با اندازه‏گیری میزان جذب در طول موج 260 و 280 بررسی شد‏. ژن 16S rRNA به‏وسیله PCR با استفاده از پرایمرهای زیر تکثیر شد‏.

EC16-F 5'gTT-TgA-TCC-Tgg-CTC-A--3'

EC16-R5'–TAC-CTT-gTT-ACg-ACT-TC--3'

 

هر 25 میکرولیتر واکنش PCR حاوی 5/2 میکرولیتر بافر10X، انواع dNTP (شرکت کوثر، ایران) با غلظت نهایی 200 میکرو مولار، پرایمرها هر کدام با غلظت 2/0 میکرو مولار، MgCl2 با غلظت 2 میلی‏‏مولار و آنزیم Taq DNA Polymerase (شرکت کوثر، ایران) با غلظت 1 واحد و 1 میکرو لیتر از DNA استخراج شده به عنوان الگو است. این واکنش با شرایط دمایی واسرشت شدن ابتدایی در 94 درجه سانتی‏‏‏گراد به مدت 5 دقیقه و در ادامه 40 چرخه شامل واسرشت شدن در دمای 95 درجه سانتی‏‏‏گراد به مدت یک دقیقه، اتصال در دمای 50 درجه سانتی‏‏‏گراد و گسترش در دمای 72 درجه سانتی‏‏‏گراد هر کدام به مدت یک دقیقه و در نهایت، 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی‏‏‏گراد برای گسترش نهایی انجام شد‏. قطعه تکثیر یافته با استفاده از ژل آگاروز 1 درصد و رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید ارزیابی شد.

.تعیین ترادف بازی[2] و تحلیل آن: برای شناسایی کامل باکتری جدا شده، محصول PCR خالص شده توسط شرکت کره‏ای ماکروژن تعیین ترادف بازی شد‏. ترادف بازی به دست آمده با نرم افزار کروماس بررسی و سپس بعد از تصحیح‏های ‏مورد نیاز، در بانک ژن جهانی (NCBI) بلاست شد. با توجه به بلاست ترادف موجود با سکانس‏های 16S rRNA موجود در بانک ژن جهانی، بیش‏ترین شباهت‏ها بررسی و در نهایت باکتری مورد نظر تا حد گونه شناسایی شد‏.


.نتایج

.ویژگی‏های ماکروسکوپی و میکروسکوپی باکتری‏های جدا شده: از کشت نمونه پساب در محیط کشت کمپلکس، رشد مناسبی حاصل شد‏ (شکل 1). از لوله‏ها ‏به طور جداگانه نمونه برداشت کرده و رنگ آمیزی گرم انجام شد. هر دو لوله دارای مخلوطی از باکتری‏ها به شکل میله‏ای ‏گرم مثبت با قطرکمتر از یک میکرو متر، میله‏ای ‏گرم منفی با کمی انحنا با قطر بیشتر از یک میکرومتر، میله‏ای ‏گرم منفی و کوکوباسیل گرم منفی، بودند. در این پروژه هدف جداسازی باکتری‏های میله‏ای ‏گرم مثبت است‏ بنابراین، از هر لوله بر روی پلیت محیط کشت کمپلکس به شکل خطی کشت داده شد که 3 نوع کلونی‏ مختلف (شکل 2) با ویژگی‏های زیر ایجاد شد‏؛کلونی‏ شماره 1: سفید مایل به شیری، قطر حدود 7 میلی‏‏متر، مات، کناره‏ها ‏صاف، سطح صاف. کلونی‏ شماره 2: قرمز رنگ، قطر حدود 3 میلی‏‏متر، سطح محدب، نیمه شفاف، کناره‏ها ‏صاف، کلونی‏ شماره 3: شیری، قطر حدود 3 میلی‏‏متر، شفاف، سطح صاف، کناره‏ها ‏صاف. از کشت خالص و رنگ آمیزی گرم و اسپور مشخص شد‏ کلونی‏ شماره 1 از باکتری‏های میله‏ای ‏شکل گرم مثبت با قطر یک میکرو متر و طول حدود 2 تا 3 میکرومتر با دو انتهای گرد تشکیل شده است و دارای اسپور بیضی شکل نزدیک به انتهاست. کلونی‏ شماره 2 از باکتری‏های میله‏ای شکل کمی خمیده گرم منفی با قطر بیش از یک میکرومتر و فاقد اسپر است‏. کلونی‏ شماره 3 باسیل گرم منفی است. هر 3 کلونی‏ از نظر اکسیداسیون H2S مثبت بوده و کلونی‏‏های ‏1 و3 متحرک بودند.

 

شکل 1- رشد نمونه‏ها ‏در محیط کشت

 

 

شکل 2- کلونی‏‏های ‏مختلف رشد کرده بر روی پلیت

.بررسی ویژگی‏های بیوشیمیایی: با توجه به جدول ویژگی‏های بیوشیمیایی جنس کلستریدیوم در کتاب برجی و نتایج آزمون‏‏های ‏بیوشیمیایی باکتری گرم مثبت اسپردار (جدول 2)، این باکتری متعلق به گونه کلستریدیوم بای فرمانتانس است.


 

جدول2- نتایج آزمون‏‏های بیوشیمایی انجام شده، برای شناسایی باکتری

لسیتیناز

TSI

SIM

مانوز

فروکتوز

اوره

نیرات

لیپاز

لاکتوز

مانیتول

مانوز

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-


 

 

 

 

شکل 3- الکتروفورز DNA ژنومی باکتری

 

. .جداسازی DNA ژنومی: نتیجه الکتروفورز DNA ژنومی جدا شده در شکل 3 آمده است و همین‏طور که در شکل مشخص است نمونه جدا شده دارای باند شارپ و خالص است.

بررسی کمی و کیفی DNA کروموزومی جدا شده: جذب رقت یک به صد نمونه در طول موج 260 برابر 112/0 و در طول موج 280 برابر 064/0 است. نسبت این دو جذب برابر 75/1 است؛ بنابراین، این DNA از نظر کیفی برای PCR مناسب است. با توجه به این‏که هر OD 1 جذب در طول موج 260 برابر با 50 میکروگرم DNA در میلی‏‏لیتر است، غلظت نمونه جدا شده 560 نانوگرم در میکرولیتر می‏باشد.

.اختصاصیت PCR: الکتروفورز 5 میکرولیتر از محصول PCR در کنار نشانگر 1kb[3] (فرمنتاس) بر روی ژل آگاروز‏‏‏ 1 درصد مطابق انتظار یک باند اختصاصی حدود 1500 جفت باز حاصل شد (شکل 4).

 

شکل 4- الکتروفورز محصول PCR. لاین 1: کنترل منفی،
لاین 2: مارکر، لاین3: محصول PCR

 

.نتایج تعیین ترادف محصول PCR: نتیجه تحلیل‏‏‏ و بلاست ترادف 16S rRNA نشان داد که این باکتری به جنس کلستریدیوم متعلق بوده و 99 درصد شباهت به گونه بای فرمانتانس دارد. با توجه به عدم شباهت 100 درصد، باکتری جدا شده سویه جدیدی است و کلستریدیوم بای فرمانتانس سویه IRI2 نام گذاری و در بانک ژن جهانی با شماره KC525132 ثبت شد‏. درخت فیلوژنتیکی به دست آمده براساس ژن 16S rRNA (شکل5) نشان می‏دهد که این سویه با توجه به عدم شباهت 100 درصد در شاخه جداگانه قرار دارد، که با توجه به قرار گرفتن آن بعد از کلستردیوم دیفیسیل و کلستردیوم سوردیلیسویه جدیدی از جنس کلستردیوم است.

 

 

شکل5- درخت فیلوژنتیک ترسیم شده برای کلستردیوم بایفرمانتانس و قرارگیری آن در شاخه‏ای جدا گانه که دلالت بر سویه‏ای جدید دارد.

 


.بحث و نتیجه‏‏ گیری

آب‏های راکد و سیستم‏های تصفیه فاضلاب به علت غنی بودن از مواد آلی باعث ایجاد شرایط مساعد رشد برای طیف وسیعی از باکتری‏ها از جمله شیمیوارگانوتروف‏های بی‏هوازی می‏شود‏‏. جنس کلستردیوم در این میان دارای وسیع‏ترین طیف است‏. تنوع متابولیکی این جنس سبب شده تا این باکتری ساپروفیت، نقش اصلی در تخریب مواد آلی در طبیعت داشته باشد (27). باکتری‏های متعلق به جنس کلستردیوم از منابع مختلف از جمله: خاک، کود، فاضلاب و آب‏های راکد، روده انسان و حیوانات جدا شده‏اند (2، 5، 28 و 29). با توجه به این‏که استخر‏های بی هوازی تصفیه فاضلاب دارای شرایط بی‏هوازی و مقادیر بالایی مواد آلی هستند، در این مطالعه برای جدا‏سازی کلستریدیوم بای فرمانتانساز نمونه فاضلاب استخر‏های بی‏هوازی مهدی‏شهر استان سمنان استفاده شد‏. در مطالعات مختلف از محیط‏های اختصاصی نظیر PCE، PYG، PYC، M63 و CM برای جداسازی استفاده شده است (14، 21 و 29). ولی در این مطالعه از یک محیط کمپلکس استفاده شد‏. بر روی این محیط یک باکتری شیمیوارگانوتروف بی‏هوازی، گرم مثبت، میله‏ای شکل متحرک و دارای اسپور جدا شد‏ و با استفاده از روش 16S rRNA مشخص شد‏ با 99 درصد شباهت به گونه کلستریدیوم بای فرمانتانس متعلق است‏. ویژگی‏های ماکروسکوپی، میکروسکوپی و آزمون‏‏های بیوشیمیایی نیز تایید کننده این نتیجه بود. این نخستین مطالعه در نوع خود در داخل کشور، در خصوص جداسازی این باکتری از سیستم تصفیه فاضلاب است‏. این باکتری در کشور‏هایی نظیر بریتانیا، ایالات متحده امریکا، آمریکای جنوبی، استرالیا و روسیه جدا‏سازی شده است (29). در بسیاری از مطالعات نبود اکسیژن و وجود مواد آلی، عامل‏های اصلی رشد برای این باکتری شیمیوارگانوتروف شمرده شده است (5). در این مطالعه نیز این مطلب تأیید شد، زیرا در عمق پایین استخر‏های بی‏هوازی تصفیه فاضلاب از میزان اکسیژن خیلی کم و مواد آلی بالا برخوردار است. در این مطالعه یک سویه جدید از گونه کلستریدیوم بای فرمانتانس از استخر‏های بی‏هوازی تصفیه فاضلاب جدا و به عنوان یک سویه جدید در بانک ژن جهانی به شماره دسترسی KC525132 ثبت شد؛‏ که نخستین پژوهش‏ در خصوص جداسازی این گونه در ایران است. با توجه به توانایی این باکتری در تولید محصولات صنعتی مختلف نظیر: اسید استیک، اسید لاکتیک، اسید فرمیک، اتانول، بوتانول، استن، کربن دی اکسید، هیدروژن و نیتروژن، در مطالعات بعدی می‏توان از آن برای تولید این فرآورده‏ها ‏به ویژه تولید بیوهیدروژن استفاده کرد.



[1]- Chen

[2]- Sequencing

[3]- 1kb ladder 

(1)               Burkholder W., Breed RS., Murray EGD., Smith, NR. Genus Xanthomonas, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology 7th ed. Baltimore: Williams & Wilkins Co.; 1957.

(2)               Brooks ME., Epps H. Taxonomic studies of the genus Clostridium: Clostridium bifermentans and C. sordellii. Journal of general microbiology 1959; 21 (1): 144- 55.

(3)               Leja K., Myszka K., Czaczyk K. The ability of Clostridium bifermentans strains to lactic acid biosynthesis in various environmental conditions. Springer Plus. 2013; 2 (1): 1- 8.

(4)               Cabral JP. Water microbiology. Bacterial pathogens and water. International Journal of Environmental Research Public Health 2010;7 (10): 3657- 703.

(5)               Wang C., Chang C., Chu C., Lee D., Chang B-V., Liao C. Producing hydrogen from wastewater sludge by Clostridium bifermentans. Journal of Biotechnology 2003; 102 (1): 83- 92.

(6)               Zhang Y. Metabolic engineering of Clostridium tyrobutyricum for production of biofuels and bio-based chemicals: Chemical Molecular Engineering 2009; 2 (4) , 373- 382.

(7)               Alalayah W., Kalil M., Kadhum A., Jahim J., Zaharim A., Alauj N., et al. Applications of the Box-Wilson Design Model for Bio-hydrogen Production using Clostridium saccharoperbutylacetonicum N 1-4 (ATCC 13564). Pakistan Journal of Biological Science 2010; 13 (14): 674- 82.

(8)               Brooks J., Moss C., Dowell V. Differentiation between Clostridium sordellii and Clostridium bifermentans by gas chromatography. Journal of bacteriology 1969; 100 (1): 528- 30.

(9)               Sawayama S., Rao KK., Hall DO. Immobilization of Rhodobacter capsulatus on cellulose beads and water treatment using a photobioreactor. Journal of fermentation bioengineering 1998; 86 (5): 517- 20.

(10)           Bolliger R., Zürrer H., Bachofen R. Photoproduction of molecular hydrogen from waste water of a sugar refinery by photosynthetic bacteria. Applied microbiology biotechnology 1985;23 (2): 147- 51.

(11)           Mizuno O., Dinsdale R., Hawkes FR., Hawkes DL., Noike T. Enhancement of hydrogen production from glucose by nitrogen gas sparging. Bioresearch Technology 2000; 73 (1): 59- 65.

(12)           Lay J-J., Lee Y-J., Noike T. Feasibility of biological hydrogen production from organic fraction of municipal solid waste. Water Research 1999; 33 (11): 2579- 86.

(13)           Tanisho S., Ishiwata Y. Continuous hydrogen production from molasses by fermentation using urethane foam as a support of flocks. International journal hydrogen energy 1995; 20 (7): 541- 5.

(14)           Sparling R., Risbey D., Poggi-Varaldo H. Hydrogen production from inhibited anaerobic composters. International journal hydrogen energy 1997; 22 (6): 563- 6.

(15)           Adams MW., Stiefel EI. Biological hydrogen production: not so elementary. Science 1998; 282 (5395): 1842- 3.

(16)           Guwy A., Hawkes F., Hawkes D., Rozzi A. Hydrogen production in a high rate fluidised bed anaerobic digester. Water Research 1997; 31 (6): 1291- 8.

(17)           Gurijala KR., Sa P., Mormile MR. Relative significance of environmental factors affecting hydrogen production from landfilled refuse samples. Waste Management and  Research 2000; 18 (5): 453- 61.

(18)           Mata-Alvarez J., Mace S., Llabres P. Anaerobic digestion of organic solid wastes. An overview of research achievements and perspectives. Bioresearch Technology 2000; 74 (1): 3- 16.

(19)           Cheng S., Bai M., Chang S., Wu K., Chen W., editors. Studies on the feasibility of hydrogen production hydrolyzed sludge by anaerobic microorganisms. The 25th Wastewater Technology Conference, Taiwan: Yunlin; 2000.

(20)           Chu C., Lee D., Chang B-V., You C., Tay J. “Weak” ultrasonic pre-treatment on anaerobic digestion of flocculated activated biosolids. Water Research 2002; 36 (11): 2681- 8.

(21)           Soto-Feliciano K., De Jesús M., Vega-Sepúlveda J., Ríos-Velázquez C. Isolation and characterization of purple non-sulfur anoxyphototropic bacteria from two microecosystems: tropical hypersaline microbial mats and bromeliads phytotelmata. Applied Microbiology and Biotechnology 2010; 2 (2): 109- 13

(22)           Leja K., Myszka K., Czaczyk K. The ability of Clostridium bifermentans strains to lactic acid biosynthesis in various environmental conditions. SpringerPlus 2011; 2: 8.

(23)           James G., Cappuccino, Sherman N. Microbiology: A Laboratory Manual. 10 ed: Washington DC: Tailor and Francis Group; 2013.

(24)           Bergey D., Harrison F., Breed R., Hammer B., Huntoon F. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: Williams and Wilkins Co; 1923.

(25)           Gibbs P. Factors affecting the germination of spores of Clostridium bifermentans. Journal general microbiology 1964; 37 (1): 41- 8.

(26)           Chen W., Kuo T. A simple and rapid method for the preparation of gram-negative bacterial genomic DNA. Nucleic Acid. Research. 1993; 21 (9): 2260.

(27)           Fletcher KE., Ritalahti KM., Pennell KD., Takamizawa K., Loffler FE. Resolution of Culture Clostridium bifermentans DPH-1 into Two Populations, a Clostridium sp. and Tetrachloroethene-Dechlorinating Desulfitobacterium hafniense Strain JH1. Applied and  Environmental. Microbiology 2008; 74: 6141- 3.

(28)           Biebl H., Spröer C. Taxonomy of the Glycerol Fermenting Clostridia and Description of Clostridium diolis sp. nov. Sys. Applied  microbiology 2002; 25 (4): 491- 7.

(29)           Myszka K., Leja K., Olejnik-Schmidt AK., Czaczyk K. Isolation process of industrially useful Clostridium bifermentans from natural samples. Journal of bioscience and bioengineering 2012; 113 (5): 631- 3.